Масс-спектрометрия maldi-tof для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови
На правах рукописи
Торопыгин Илья Юрьевич Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови 03.01.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)
Научный консультант: доктор биологических наук Мошковский Сергей Александрович
Официальные оппоненты: Нарыжный Станислав Николаевич доктор биологических наук, ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики им.
Б.П. Константинова», зав. лабораторией Иванов Алексей Сергеевич доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лабораторией
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук
Защита состоится 12 декабря 2013 г. в 15 00 часов на заседании совета Д 001.010.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу 119121, г. Москва, Погодинская ул. д.10, стр.8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.
Автореферат разослан ”” ноября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.010. кандидат химических наук Карпова Е.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В настоящей работе в качестве экспериментального подхода для изучения протеаз использованы методы, основанные на времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией-ионизацией из матрицы, или MALDI-TOF (от англ. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight). В основе метода лежит особый вариант лазерной десорбции и ионизации, осуществляемой из объема специально подобранного вещества, обычно называемого матрицей. Для разделения ионов и их регистрации используется времяпролетный детектор. Этот способ анализа образцов обеспечивает определение молекулярной массы исследуемого соединения или молекулярных масс компонентов сложных смесей.
В случае исследования белков видов с известным геномом, несложная предварительная обработка образца, как правило, позволяет идентифицировать один или несколько белков в смеси. Кроме того, благодаря конструктивным особенностям ионного источника MALDI, имеется возможность работы с биологическим материалом без предварительной очистки или фракционирования образца, например, цельной сывороткой крови.
Возможность одновременного измерения молекулярных масс нескольких компонентов смеси позволяет наблюдать гидролиз природного субстрата или нескольких субстратов, например, по накоплению продуктов реакции. Однако, в условиях ионного источника MALDI, как и практически любого другого типа масс-спектрометра, в газовой фазе ионы различных пептидов образуются с неодинаковой эффективностью, поэтому MALDI в исходном варианте нельзя отнести к количественным методам и применять для точных количественных оценок. Для количественных измерений требуется использование специальных методов анализа, например введения изотопных меток.
В данной работе при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF были исследованы взаимодействия выделенных ферментов и субстратов, а также гидролиз экзогенных субстратов протеазами сыворотки крови и подавление активности экзогенного фермента ингибиторами протеаз сыворотки крови.
В первой части работы исследован гидролиз пептида Ab (1-16) белка амилоида бета, участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера (БА), ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ). То, что АПФ гидролизует амилоид-бета, было известно ранее, однако сайт гидролиза и влияние на гидролиз изомеризации аспарагиновой кислоты не были установлены.
Во второй части работы изучался гидролиз цельной сыворотки трипсином. В условиях in vitro, в системе из протеазы и субстрата содержащийся в низкой концентрации фермент способен гидролизовать многократно превышающее его собственное количество белка. Однако в крови этого не происходит, благодаря сбалансированной системе ингибиторов. При этом ингибиторы могут быть разделены на два типа. Ингибиторы первого типа, например, альфa-1-ингибитор протеиназ (1 ИП), известный как антитрипсин, полностью блокируют активность фермента, необратимо связываясь с ним.
Другой важный белок крови, альфа-2-макроглобулин (2 M) образует с протеазами комплекс, в котором активный центр фермента остается свободен, но пространственная структура образованного комплекса ограничивает взаимодействие с частью субстратов и ингибиторов, изменяя специфичность фермента. В зависимости от соотношений трипсина и ингибиторов в реакционной смеси должны наблюдаться различные продукты гидролиза.
Если ингибиторы связаны с патологическим процессом, то изменения регистрируемых продуктов не только указывает на наличие и относительную концентрацию ингибиторов, но и на развитие или состояние заболевания.
Возможности как метода инструментального MALDI-TOF-масс-спектрометрии анализа ограничены чувствительностью и динамическим диапазоном, что в итоге ограничивает информативность получаемых спектров. При этом, в случаях присутствия в образце протеазы, даже в недостаточном для выявления количестве, ее активность может приводить к образованию значительных количеств легко детектируемых продуктов, которые регистрируются на масс-спектрометрических профилях.
Цели и задачи Целью работы является разработка метода прямого масс MALDI-TOF спектрометрического анализа образцов сывороток крови с применением разных концентраций вводимого искусственно трипсина.
Основные задачи
исследования.
1. Используя модельную систему в составе пептида амилоида-бета Ab(1-16) в качестве субстрата и ангиотензинпревращающего фермента, определить сайты гидролиза пептида амилоида-бета Ab(1-16), определить каталитически активный домен и влияние природной модификации изомеризации остатка Asp-7 на эффективность гидролиза.
2. Осуществить масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF продуктов гидролиза плазмы крови различными концентрациями экзогенного трипсина (титрование трипсином).
3. Исследовать динамику накопления продуктов гидролиза трипсином сыворотки крови путем количественного анализа посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии и установить условия, необходимые гидролиза высококопийных (мажорных) сывороточных белков.
4. Сравнить профили MALDI-TOF-масс-спектрометрии плазмы крови при гидролизе экзогенным трипсином в норме и при раке яичника.
Научная новизна В работе впервые показано, что в N-домен АПФ специфично гидролизует пептид Ab (1-16) на два пептида, Ab-(1-5) и Ab-(6-16), при этом C-домен АПФ не гидролизует пептид Ab-(1-16). Кроме того, методом количественной масс-спектрометрии определено, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза Ab-(1-16), по сравнению с пептидом с нормальным остатком аспарагиновой кислоты.
Впервые установлено, что при гидролизе сыворотки трипсином, состав продуктов гидролиза меняется в зависимости от количества вносимого трипсина. При этом, при введении трипсина в концентрации меньше 2 мг/мл сыворотки, удается регистрировать масс-спектры, свободные от продуктов гидролиза так называемых мажорных белков, обычно целенаправленно удаляемых при проведении прямых масс-спектрометрических исследований.
Представлен новый метод регистрации изменений в составе ингибиторов протеаз крови с использованием прямой масс-спектрометрии. Концентрации ингибиторов повышаются, в том числе, при развитии онкологических заболеваний. Масс спектрометрическая регистрация таких изменений проводилась по изменению состава продуктов триптического гидролиза.
Впервые методом количественной масс-спектрометрии в условиях прямого масс спектрометрического анализа измерены скорости накопления отдельных продуктов гидролиза. Изменения скорости накопления продуктов отражают изменение активности ингибиторов, модифицирующих активность трипсина. Таким образом, при прямом масс спектрометрическом исследовании определено изменение концентраци й белков, - содержащихся в крови в концентрации порядка 10 M, недоступных для непосредственной регистрации методом прямого масс-спектрометрического исследования.
Практическая значимость работы Практическая значимость работы заключается в разработке методов анализа и измерения активности протеаз методом масс-спектрометрии MALDI-TOF с использованием нативных субстратов в сыворотке крови и in vitro. В работе также показана возможность использования функциональных свойств протеолитических ферментов и ингибиторов сыворотки крови для прямой масс-спектрометрии образцов крови и ее производных.
Показанные в работе особенности гидролиза АПФ пептида Ab (1-16), и его формы с изомеризованным остатком аспарагиновой кислоты, может указывать на потенциальную биологическую роль АПФ как фермента, связанного с развитием болезни Альцгеймера.
Это находит подтверждение в работах других авторов. Так, выявлены два полиморфных варианта гена АПФ связанных с увеличением накопления Ab (Kehoe PG 2009, Miners JS et al. 2010), со ссылкой на представленную работу.
Использование функциональных свойств протеаз и ингибиторов позволяет по изменениям в их активности при проведении прямого масс-спектрометрического профилирования (ПМСП) оценивать содержание белков присутствующих в концентрациях 10- порядка M, недоступных для непосредственной масс-спектрометрической регистрации, таким образом, продемонстрирована возможность использования молекулярных зондов при прямой масс-спектрометрии.
Положения, выносимые на защиту 1. N-Концевой домен ангиотензинпревращающего фермента специфично гидролизует пептид амилоида-бета Ab(1-16), с образованием двух пептидов Ab(1-5) и Ab(6-16), причем изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в 7 положении этого пептида приводит к 4 кратному увеличению скорости гидролиза АПФ. C-концевой домен не гидролизует пептид амилоида-бета Ab(1-16).
2. Состав продуктов гидролиза сыворотки трипсином зависит от количества вводимого фермента. При концентрациях трипсина около 8,5 мМ в спектрах представлены продукты отличные от пептидов альбумина.
3. Скорость накопления продуктов гидролиза трипсином, и минимальное количество трипсина, необходимое для начала гидролиза альбумина для образцов сыворотках больных аденокарциномой яичника выше, чем для образцов сыворотки крови здоровых доноров..
4. С использованием гидролиз сывороток концентрациями трипсина около 10 мкМ, возможно получение MALDI-TOF-профилей, позволяющих различать образцы сыворотки больных аденокарциномой яичника и здоровых доноров.
Апробация работы.
Результаты работы доложены 3-ей Международной школе семинаре «Масс спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, апрель 2007) на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2007), 6-м Всемирном Конгрессе HUPO (Сеул, Корея, октябрь 2007), 38-ом Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ, FEBS (Санкт Петербург, июль 2013).
Публикация работы.
По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе, 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1 патент на изобретение и 16 публикации в трудах конференций.
Индекс Хирша автора равен 7.
Структура и объем диссертации Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 136 источников. Работа иллюстрирована 24 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Образцы сывороток крови больных раком яичников и здоровых доноров предоставлены кафедрой акушерства и гинекологии лечебного факультета РНИМУ им.
Н.И.Пирогова (зав. кафедрой проф. Макаров О.В.). Синтетический пептид сывороточного амилоида А (SAA) 88-104, NH2 -SGKDPNHFRPAGLPEKY-CONH2 синтезирован и любезно предоставлен научным сотрудником лаборатории белковой инженерии ФГБУ «ИБМХ» РАМН к.х.н. Е.А. Алешиной. N- и C-домены бычьего соматического АПФ (N-АПФ и C АПФ) были предоставлены к.х.н. П.В. Биневским (МГУ, химический факультет).
В работе использован рекомбинантный белок сывороточный амилоид А (rSAA) USBiological (США).Синтетические пептиды, ацетилированные по N-концу и амидированные по C-концу, Ab-(1-16/Asp7), получены от Sigma-Genosys, США.
Вода H2 18 O, 95-98 % 18 O (Cambridge Isotope Laboratories Andover, MA, USA), -циано кислота 4-гидроксикоричная (HCCA) (Bruker Daltonics, Bremen, Germany), модифицированный свиной трипсин (Promega, Madison, WI, USA). Все другие реагенты Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Ферментативный гидролиз. Гидролиз каждого пептида, Ab-(1-16 /Asp7) или Ab-(1 16/isoAsp7), N- иди C-доменами АПФ проводили при 37 C в 20 мкл реакционной смеси.
Концентрации реагентов в смеси составляли: 20 мкМ пептида амилоида-бета, 0,02 мкМ домена АПФ, 150 мМ NaCl, в 50 мМ бикарбонатном буфере (pH 7,8). В экспериментах с лизиноприлом его концентрация в реакционной смеси составляла 10 мкМ. Для количественного анализа в заданные моменты времени из реакционной смеси отбирали по 5 мкл и добавляли к 15 мкл 0,5 % трифторуксусной кислоты (ТФУ).
Количественные измерения продуктов гидролиза АПФ. Количественные измерения продуктов гидролиза пептидов АПФ проводили без какой либо предварительной очистки, выделения или фракционирования с использованием MALDI TOF масс-спектрометрии и меченного O внутреннего стандарта. Для получения меченого стандарта проводили гидролиз исследуемых пептидов в растворе 25 мкл воды H2 18 O содержащем 20 мкМ пептида Ab-(1-16/Asp7). Абсолютные концентрации исследуемого пептида вычисляли из соотношения интенсивностей изотопных сигналов смеси анализируемого пептида и его меченого O аналога известной концентрации.
Подготовку образцов сыворотки для масс-спектрометрического профилирования проводили согласно определенным в рамках данной работы условиям контролируемого протеолиза, Для этого сыворотку (2,5 мкл) смешивали с необходимым количеством (7, мкл) раствора трипсина в концентрации 25 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 2 часов при температуре 37°C. Такой вариант подготовки образов позволяет регистрировать продукты гидролиза белков, отличных от сывороточного альбумина.
Количественные масс-спектрометрические измерения проводили с использованием в качестве стандарта синтетического пептида SAA 88-104, амидированного по С-концевой аминокислоте, в результате чего его молекулярная масса была на 1 а.е.м. меньше молекулярной массы пептида, получающегося в результате гидролиза.
Исследование динамики накопления продуктов гидролиза SAA в сыворотке осуществляли, отбирая в заданные моменты времени аликвоты из реакционной смеси и смешивая их с раствором стандарта, после чего регистрировали масс-спектр полученной смеси. Необходимое количество вносимого стандарта определяли опытным путем.
Концентрацию природного пептида вычисляли из соотношений интенсивностей моноизотопных сигналов m/z 1913 и m/z 1912 и известной концентрации стандарта (рис. 1).
Масс-спектры зарегистрированы на MALDI-TOF масс-спектрометре Bruker Ultraflex TOF/TOF (Bruker Daltonics, ФРГ).
Масс-спектры фрагментации получены в тандемном режиме MALDI-масс спектрометра Ultraflex в режиме положительных ионов, при первом ускоряющем напряжении 8 кВ, втором ускоряющем напряжении 19 кВ и отражающем напряжении на рефлектроне 29 кВ.
Идентификацию белков проводили при помощи системы идентификации белков Mascot (MatrixSciense, Великобритания), по базе данных NCBInr Национального центра биотехнологической информации США (NCBI). Статистический анализ, построение функции классификации и определение параметров надежности и достоверности полученного классификатора выполнены с помощью программного пакета Bruker ClinProTools.
Рис 1. Спектр пептида SAA 88-104 в сыворотке пациента (A), синтетический амидированный пептид SAA 88-104 (B) и спектр сыворотки пациента с добавленным синтетическим пептидом РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
В работе с использованием масс-спектрометрии исследованы MALDI-TOF активности и субстратная специфичность протеаз крови, определены скорости гидролиза с использованием природных субстратов и стандартов с изотопной меткой, в системе in vitro и непосредственно в плазме и сыворотке крови. В работе также изучено изменение активности трипсина при гидролизе белков сыворотки крови содержащимися в ней ингибиторами.
Гидролиз пептида Ab (1-16) ангиотензинпревращающим ферментом и влияние изомеризации Asp7 на скорость гидролиза Взаимодействие в системе выделенных и очищенных доменов АПФ и синтетических пептидов и параметры реакции исследовали с помощью MALDI-TOF.
Параллельно проводили контрольные эксперименты с аналогичными условиями реакции, но с добавлением лизиноприла, известного как ингибитор ферментативной активности АПФ. Продукты всех реакций исследовали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Чтобы определить, какой из доменов отвечает за гидролиз фрагмента амилоида бета Ab (1 16) и его аналога с изоаспартатом в 7 положении (isoAsp7), а также чтобы определить сайты гидролиза, аликвоты каждого пептида инкубировали с N-АПФ и C-АПФ в течении различных промежутков времени от 10 до 130 мин при 37C. Кроме того, в качестве контроля проводили гидролиз с аналогичными условиями реакции, но с добавлением лизиноприла (концентрация 10 мМ), известного как ингибитор ферментативной активности АПФ. Продукты всех реакций были исследованы с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.
На рис. 2 показан масс-спектр образца из реакционной смеси Ab-(1-16/Asp7) инкубированной в присутствии N-АПФ в течение 20 мин. Кроме иона протонированного пептида (m/z 1995,9) и иона полученного в результате присоединения катиона натрия (m/z 2017,9), в спектре также зарегистрированы четыре других интенсивных сигнала, m/z 679,3, 701,2, 1335,6 и 1357,5. При этом m/z 679,3 и m/z 701,2 соответствуют однозарядному протонированному иону Ab-(1-5) и этому же пептиду с натрием, m/z 1335,6 и 1357, относятся к пептиду Ab-(6-16/Asp7). Спектр пептида с изомеризованной аспарагиновой кислотой Ab-(1-16/isoAsp7) после инкубации с N-АПФ содержит сигналы, соответствующие тем же самым массам, что и для неизомеризованного пептида Ab-(1 16/Asp7).
Рис 2. Масс-спектр MALDI-TOF образца реакционной смеси после 20 мин инкубации пептида Ab(1-16/Asp-7) с N-доменом АПФ.
Основываясь на этих данных, можно заключить, что N-домен АПФ специфично гидролизует пептидную связь Arg5-His6 Ab-(1-16) в условиях in vitro, в домене Ab-(1-16).
В результате гидролиза образуются два стабильных продукта, а именно Ab-(1-5) и Ab-(6 16) которые не подвергаются дальнейшему гидролизу в присутствии N-АПФ. В тех же условиях реакции, но с использованием C-концевого домена АПФ гидролиз связи Ab-(1 16/Asp7) или Ab-(1-16/isoAsp7) не обнаружен.
Чтобы оценить влияние изомеризации остатка аспарагиновой кислоты на эффективность гидролиза пептида Ab-(1-16) N-АПФ, проводили количественные измерения накопления продуктов гидролиза АПФ в каждой реакции. Методом MALDI TOF с использованием стандарта меченного O. Использование изотопной метки необходимо, так как интенсивность регистрируемого сигнала в условиях MALDI зависит от множества факторов, часть из которых не установлена.
В представленной работе показано, что N-АПФ гидролизует пептид Ab-(1-16) после остатка Arg5, образуя пептиды Ab-(1-5) и Ab-(6-16). Такая особенность гидролиза позволила нам использовать трипсин для получения изотопно-меченных стандартов, 18 O Ab-(1-5) и O-Ab-(6-16/Asp7). Стандарты получали путем исчерпывающего гидролиза трипсином предварительно точно измеренного количества пептида Ab-(1-16/Asp7) в воде H2 18 О. В результате гидролиза, дезамидирования С-концевой группы и одновременного обмена атома кислорода C-концевой карбоксильной группы и воды, получали 18 эквимолярные количества пептидов O-Ab-(1-5) и O-Ab-(6-16/Asp7). Каждый из них содержал один или два атома O, что было подтверждено масс-спектрометрией MALDI, которая показала замещение исходных пиков Ab-(1-5) и Ab-(6-16) с m/z 679,3 и 1335,6, пиками с одним замещенным изотопом кислорода, соответственно, m/z 681,3 и 1338,6 и двумя замещенными кислородами O, соответственно, m/z 683,3 и 1340,6. Химические свойства молекул, а следовательно и эффективность образования ионов, при замене одного изотопа другим не изменяются, однако, изменение атомной массы легко регистрируется масс-спектрометрически. Относительные изменения интенсивностей 3 и 5 пиков в изотопных пакетах рассматриваемых пептидов обусловлено введенным изотопом. По отклонению интенсивности этих сигналов от природного распределения интенсивностей пиков были вычислены относительные концентрации пептидов с одним и двумя замещенными O атомами, они составили 19% и 81% для Ab-(1-5) и для пептида Ab-(6-16) - 18,5% и 81,5%, соответственно. Необходимо отметить, что пептид O-Ab-(6-16/Asp7) был дезамидирован на C-конце, таким образом, его наиболее интенсивный пик в спектрах характеризовался m/z 1340,6 и соответствовал молекуле с двумя атомами О.
На рис. 3 показаны фрагменты масс-спектра MALDI-TOF – изотопные пакеты, соответствующих пептидам без метки Ab-(1-5) (рис. 3a) и Ab-(6-16/Asp7) (рис. 3e), 18 меченым стандартам O-Ab-(1-5) (рис. 3b) и O-Ab-(6-16/Asp7) (рис. 3f), и смесей анализируемых реакционных растворов со стандартами (рис. 3 c, d, g и h). Из соотношений изотопных пиков в этих спектрах вычисляли абсолютные концентрации соответствующих пептидов в реакционных смесях (Mirgorodskaya at al, 2000). Результаты рассчетов показаны в виде гистограмм на рис. 4.
Таким образом, установлено, что после 20 мин гидролиза 20 мкМ пептида Ab-(1-16/Asp7) N-АПФ в реакционной смеси содержалось 4 0,4 мкМ Ab-(1-5) и 4 0,4 мкМ Ab-(6 16/Asp7). Важно отметить, что при использования в качестве субстрата того же количества пептида с изомеризованным остатком аспарагиновой кислоты, Ab-(1-16/isoAsp7) N-АПФ гидролизовал пептид существенно более эффективно, а через 20 мин в реакционной смеси содержалось 131,3 мкМ Ab-(1-5) и 141,4 мкМ Ab-(6-16/isoAsp7). Из представленных результатов следует, что N-домен АПФ гидролизует пептид Ab-(1-16), и продуктами гидролиза являются два пептида, Ab-(1-5) и Ab-(6-16). При этом C-домен фермента не гидролизует пептид Ab-(1-16). Изомеризация остатка Asp7 исследованного пептида является важной модификацией, возможно, значимой в патогенезе болезни Альцгеймера.
Исследуя взаимодействие N-домена с двумя формами пептида мы показали, что Ab-(1 16/isoAsp7) гидролизуется N-доменом АПФ примерно в три раза более эффективно, чем Ab-(1-16/Asp7), если измерять накопление продуктов гидролиза в определенный момент времени (20 мин инкубации). Наблюдаемое явление может указывать на потенциальную биологическую роль N-домена АПФ как фермента, участвующего в удалении связываемой Рис 3. Фрагменты MALDI-TOF масс-спектров: изотопные пакеты, соответствующие пептидам без метки Ab-(1-5) (a) и Ab-(6-16/Asp7) (e), меченным стандартам 18 O-Ab (1-5) (b) и 18 O-Ab-(6-16/Asp7) (f), и смесей анализируемых реакционных смесей со стандартами (c, d, g, h) Рис 4. Концентрации пептидов Ab-(1-5) и Ab-(6-16) в реакционной смеси через мин инкубации с N-доменом АПФ: Ab-(1-16/Asp-7) (белые столбцы) и Ab-(1 16/isoAsp-7) (серые столбцы), с БА изоформы Ab. Таким образом, была показана эффективность использования масс спектрометрии MALDI-TOF для мониторинга реакций, идентификации субстрата и определения скоростей реакций. Проведенные эксперименты позволили выявить влияние на гидролиз Ab посредством АПФ изомеризации Asp-7, неферментативной модификации, по некоторым данным, связанной с возрастными изменениями при болезни Альцгеймера [Zirah et al, 2006].
Исследование особенностей ингибирования сывороткой экзогенного трипсина при различных количествах вводимого фермента с исследованием путем масс Гидролиз экзогенных субстратов, как и функционирование вводимых в сыворотку протеаз существенно отличается практически от любой системы in vitro тем, что реакции протекают в присутствии конкурирующих протеаз, субстратов и ингибиторов. Так как в работе гидролиз сывороточных белков проводился трипсином, то выбор условий проведения такого гидролиза основывается на литературных данных о составе и особенностях ингибиторов трипсина в крови, условно разделяемых на два типа.
Ингибиторы первого типа полностью инактивируют трипсин при связывании. В основном это антитрипсин (1 -ИП), концентрация которого в норме составляет в среднем 36 мкМ и меняется в зависимости от состояния организма в диапазоне от 2 до 70 мкМ.
Принципиально отличается по взаимодействию с протеазами 2 -макроглобулин (2 М), который способен связываться с протеазами всех классов. При этом характер взаимодействия 2 М с протеазами, в том числе и с трипсином, таков, что активный центр ферментов остается свободным. Показано, что в комплексе трипсин способен гидролизовать небольшие белки, например, протамины. Отметим также, что в комплексе с 2 М трипсин приобретает устойчивость к действию других белковых ингибиторов плазмы крови. Кроме того, 2 М характеризуется высоким сродством к трипсину, в 6-7 раз превышающим сродство к 1 ИП. Поэтому при введении в образец трипсина в первую очередь будет образовываться комплекс с 2 М и уже затем с 1 ИП. Только после исчерпывания 1 ИП в плазме начнется гидролиз основного его белка - альбумина. Таким образом, введение трипсина в плазму крови в концентрациях ниже концентрации 1 ИП будет приводить к образованию активной формы фермента, в концентрации, соответствующей концентрации 2 М. Полагалось, что образующиеся при патологии белки будут подвергаться гидролизу, и это удастся выявить с помощью масс-спектрометрии.
Так как предложенный метод предполагалось использовать для масс спектрометрического профилирования образцов сывороток крови больных раком яичника, регистрируемые масс-спектрометрические сигналы были подробно исследованы на примере сывороток крови здоровой женщины, пациентки с серозной цистаденомой и двух пациенток с диагностированной аденокарциномой яичника. В соответствии с разработанным протоколом осуществлен гидролиз сывороток трипсином в концентрации мкг/мл, незначительно превышающей концентрацию 2 М. Полученные спектры приведены на рисунке 5.
Среди зарегистрированных в образцах сигналов 31 характерен только для сывороток здоровых женщин, 58 уникальных сигналов обнаружено среди продуктов гидролиза сывороток больных раком яичника и 15 общих сигналов для здоровых и больных.
Время гидролиза сыворотки было выбрано равным 2 часам. Это время, за которое в спектрах образуется характеристическая композиция сигналов, было определено как оптимальное для получения спектров, пригодных для клинического использования в результате серии «кинетических экспериментов» на примере сыворотки №431.
Представляется интересным отметить спектры, получаемые при коротком времени гидролиза. Через 30 мин гидролиза в спектре наблюдается только два пика со значительной интенсивностью: m/z 1913 и m/z 1259 (рис. 6). Для этих пиков были Рис 5 Масс-спектры продуктов гидролиза трипсином сывороток крови a - здорового донора, b – больного с миомой матки, c и d– больных с аденокарциномой яичника.
Рис 6 Масс-спектр MALDI-TOF образца сыворотки пациентки с аденокарциномой яичника №431 через 30 мин гидролиза трипсином при 37C.
получены спектры фрагментации, и по полученным данным MS/MS с использованием Mascot они были достоверно идентифицированы как пептид сывороточного амилоида SAA (84-104) (m/z 1913) и фрагмент 2M VGFYESDVMGR (m/z 1259) (рис. 7). В соответствии с известными свойствами 2M при ингибировании им трипсина должен образовываться именно этот пептид (Sottrup-Jensen, 1989).
Через 2 часа гидролиза относительная интенсивность сигнала m/z 1259 значительно снижается, в то же время пик m/z 1913 входит в группу наиболее интенсивных сигналов состоящую из m/z 1456,7, 1465,7, 1514,7, 1550,7, 1612,8, 1913,0, 2178,0, причем эти массы не регистрируются в образцах, полученных от здоровой женщины.
Таким образом, как и предполагалось, в полученных спектрах не было обнаружено сигналов продуктов триптического гидролиза сывороточного альбумина. При этом общее число регистрируемых ионов в гидролизованных образцах возросло примерно в три раза по сравнению с контрольными образцами, инкубированными без трипсина. С использованием алгоритма SNAP при ограничении параметра сигнал/шум не менее 6, в диапазоне 900-2500 Да в масс-спектрах продуктов гидролиза сывороток больных детектировали около шестидесяти различных ионов, и около двадцати в контрольных.
Часть зарегистрированных сигналов удалось идентифицировать. Для этого был использован алгоритм идентификации белка по наборам масс продуктов гидролиза MOWSE с использованием поисковой системы MASCOT. Кроме того, пять пептидов этого белка были идентифицированы по спектрам фрагментации.
Проведенный анализ позволил идентифицировать одиннадцать пептидов как продукты трипсинолиза SAA. Идентифицированные сигналы и соответствующие им участки аминокислотной последовательности представлены на рис. Рис 7. Масс-спектр фрагментации пептида m/z 1259, отмечены соответствия с аминокислотной последовательностью пептида VGFYESDVMGR белка 2 М.
Сывороточный амилоид А (SAA) присутствует в крови серии вариантов из продуктов двух генов с высокой гомологией (saa1 и saa2, гомология более 90%). При этом в продуктах гидролиза преимущественно регистрируются триптические пептиды двух изоформ SAA А1 и SAA А2, как в виде исходных форм, так и без N-концевого аргинина.
Аминокислотные последовательности этих белков приведены на рис. 8 a и b.
Из приведенных результатов можно заключить, что удалось провести гидролиз в условиях, позволяющих избежать влияния на результат эксперимента присутствия в сыворотке большого количества альбумина и получить представительные и интенсивные спектры. При этом выявляли значительные различия в спектрах образцов больных и здоровых пациентов, и идентифицировали присутствие в образцах SAA. Как уже было указано, SAA является молекулярным маркером рака яичника, хотя и неспецифичным.
Тем не менее, предложенная методика подготовки образца позволяет дополнительно регистрировать около пятидесяти пептидов, что обеспечивает ее диагностический потенциал.
Рис. 8 Аминокислотные последовательности белков SAA А1а (a), SAA А2а (b) и rSAA (c) и их триптические пептиды, регистрируемые в масс-спектрах MALDI-TOF среди продуктов гидролиза сывороток.
Так как в данной работе впервые был обнаружен эффект гидролиза белков сыворотки низкими концентрациями трипсина, представлялось целесообразным более подробно исследовать образование и накопление продуктов при таком гидролизе.
Нами была исследована динамика накопления SAA 88-104 в ходе гидролиза. Для этого с помощью количественной масс-спектрометрии были определены изменения концентрации пептида SAA 88-104 в зависимости от времени реакции, что, в свою очередь позволяет судить об активности комплекса трипсина с ингибиторами сыворотки. Ввиду того, что регистрируемые масс-спектрометрически количества SAA были обнаружены нами только в сыворотке больных, для изучения гидролиза в сыворотке здоровой женщины использовали рекомбинантный белок SAA – rSAA, имеющий замены Asn 60 Asp и His 71 Arg а также на N-концевой Met, однако C-концевые участки обоих пептидов одинаковы, и, следовательно, одинаковы пептиды SAA 88-104.
Для проведения этих измерений использовали пептид SAA 88-104, амидированный по С-концевой аминокислоте, в результате чего его молекулярная масса оказывалась на а.е.м. меньше, чем у пептида, получающегося в результате гидролиза природного белка.
Исследовали динамику изменения концентрации этого пептида в реакционной смеси.
Измерения осуществляли путем отбора в выбранные моменты времени из реакционной смеси аликвот и их смешивания с раствором стандарта, после чего регистрировали масс спектр полученной смеси. Концентрация природного пептида вычислялась из интенсивностей моноизотопных сигналов m/z 1913 и m/z 1912.
Рис 9 Динамика накопления пептида, m/z 1913 rSAA в сыворотке больной аденокарциномой яичника (a-c) и миомой матки(d).
Измеренное содержание пептида SAA 88-104 в сыворотках в зависимости от времени представлено в виде диаграмм на рис. 9.
Сравнение количества пептида, образовавшегося в результате гидролиза за два часа, показывает, что в сыворотке больного раком яичника белок rSAA гидролизуется в три раза более эффективно, чем в сыворотке здорового человека, даже при том, что одновременно гидролизуется и природный SAA, а максимальная концентрация С-концевого пептида SAA 88-104 достигается к 2-4 часам. Необходимо отметить, что пептид SAA 88- содержит еще два сайта потенциального гидролиза трипсином, однако, его расщепление начинает наблюдаться только после 2-4 часов реакции. В сыворотке здоровой женщины максимальная концентрация при гидролизе достигается к 24 часам.
На основании полученных данных можно утверждать, что большая скорость в сыворотке больной с раком яичника обусловлена присутствием в ней большей концентрации 2 М и соответственно большей концентрации трипсина в виде комплекса с этим ингибитором.
Таким образом, оценкой скоростей гидролиза искусственного субстрата при контролируемом трипсинолизе можно масс-спектрометрически оценивать уровень 2-М, что при надлежащем образом выбираемой концентрации трипсина становится дополнительным параметром при масс-спектрометрическом профилировании. Стоит отметить имеющиеся в литературе сведения, что повышение уровня 2 М не только указывает на наличие онкологического заболевания, но и на присутствие метастазов.
Также известно, что заболевание раком характеризуется увеличением концентрации ингибиторов в сыворотке, в том числе уровня 1 ИП (Vlasova at al, 2006). Используя методы прямой масс-спектрометрии, также возможно оценить уровень ингибиторов трипсина в крови. Для этого сыворотки «титровали» трипсином для определения минимальной концентрации, при которой регистрируется характерный для гидролиза сывороточного альбумина набор масс-спектрометрических сигналов, то есть до начала гидролиза альбумина. По сути, альбумин является подходящим субстратом благодаря высокому содержанию в крови и простоте регистрации продуктов его гидролиза в сыворотке. Группу пептидов m/z 1467,8, 1623,8 и 1770,9 использовали как критерий начала гидролиза альбумина. Как указано ранее, характеристический набор пиков может быть зарегистрирован через 2 часа реакции. Через 24 ч инкубации интенсивность сигналов падает.
Эксперименты были проведены на трех образцах, двух сыворотках больных раком яичников (№411 и №431) и на одной сыворотки больной миомой матки (№417). Молярное отношение между трипсином и средним известным из литературы содержанием 1 ИП составляло 2:1. Все интенсивные ионы в сыворотке №417 относились к альбумину, покрывая 60% его последовательности (рис. 10 a). При этом в сыворотках №411 (рис. 10, b) и №431 (рис. 10, c) пиков, соответствующих альбумину не обнаруживалось, но сигналы пептидов SAA присутствовали. В этих сыворотках пептиды альбумина появлялись через часа реакции только при концентрации трипсина 200 мкМ в сывоторке №431 (5-кратное превышение нормального уровн6я 1 ИП, рис. 10d) и 400 мкМ в сыворотке 411 (10-кратное превышение, рис 10 e). Это указывает на значительно более высокое содержание ингибиторов трипсина в крови больных раком яичника. Таким образом, тестирование образцов сыворотки введением различных концентраций трипсина позволяет определять содержание ингибиторов протеаз (спектры представлены на рис. 10). Заметим, что таким способом показана продемонстрирована регистрация изменения эффективности ингибиторов протеаз крови, при том, что в силу низкой концентрации эти ингибиторы недоступны для исследования прямым масс-спектрометрическим анализом.
Для оценки возможности создания формального метода классификации пациентов – прототипа диагностики, был проведен гидролиз 10 сывороток больных с клинически диагностированной аденокарциномой яичника, 10 пациенток с диагностированными доброкачественными опухолями яичников и матки и 10 сывороток здоровых доноров.
Сыворотки были подвергнуты гидролизу трипсином по предложенному в работе методу, после чего были зарегистрированы масс-спектры продуктов реакции. Полученные масс Рис. 10 Масс-спектры трипсиновых гидролизатов сыворотки больной миомой матки №417 (a) и больных раком яичника №411 (b,d), №431 (c,e). Концентрация трипсина 2 мкM, концентрации в реакционной смеси 1 ИП 0,9 мкM (a-c), 0, мкМ (d) и 0,36 мкМ (e) (рассчитаны исходя из концентрации 1 ИП в сыворотке в норме 36 мкM) спектры были использованы для формализованного поиска закономерностей с использованием метода опорных векторов.
С помощью программы Bruker ClinProTools, где используется метод опорных векторов, для предложенного метода подготовки образцов плазмы к протеомному профилированию были построены классифицирующие поверхности. При этом точность классификации без перекрестной проверки составила 100%, а после этой проверки она составила 95,45%.
ВЫВОДЫ 1. Масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF с использованием изотопной метки О подходит для исследования сайтов и скорости гидролиза протеазой, что показано in vitro на модельной системе из ангиотензинпревращающего фермента и пептида амилоида бета Ab(1-16). Установлено, что N-концевой домен, но не С-концевой домен фермента специфично гидролизует пептид а Ab(1-16) с образованием двух пептидов Ab(1-5) и Ab(6 16), причем изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в 7 положении этого пептида с образованием изоаспарагиновой кислоты приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АПФ.
2. При введении в сыворотку крови экзогенного трипсина для протеомного профилирования состав регистрируемых путем MALDI-TOF масс-спектрометрии продуктов зависит от концентрации трипсина. При концентрации трипсина в сыворотке меньше 10 мкМ регистрируются масс-спектры, свободные от продуктов гидролиза высококопийных белков, например, альбумина, пептиды которого появляются при повышении концентрации фермента.
3. Регистрация в качестве первого по времени появления продукта гидролиза плазмы пептида 2 макроглобулина указывает на участие этого белка в изменении специфичности трипсина при титровании им плазмы крови.
4. MALDI-TOF-профиль продуктов гидролиза плазмы крови экзогенным трипсином отличается в норме и при раке яичников, по-видимому, вследствие разного уровня ингибиторов протеаз в плазме. Профили с контролируемым трипсинолизом использованы для диагностической классификации 30 образцов от пациентов с раком яичника и здоровых доноров, которая показала 95% точность диагностики.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. Lokhov P.G., Tikhonova O.V., Moshkovskii S.A., Goufman E.I., Serebriakova M.V., Maksimov B.I., Toropyguine I.Y., Zgoda V.G., Govorun V.M., Archakov A.I. Database search postprocessing by neural network: Advanced facilities for identification of components in protein mixtures using mass spectrometric peptide mapping. // Proteomics. 2004. V.4(3).
P.633-642.
2. Гоуфман Е.И., Мошковский С.А., Тихонова О.В., Лохов П.Г., Згода В.Г., Серебрякова М.В., Торопыгин И.Ю., Власова М.А., Сафарова М.Р., Макаров О.В., Арчаков А.И.
Протеомное исследование термостабильной фракции сыворотки пациентов с различными опухолями с применением двумерного электрофореза. // Биохимия. 2006.
Т.71(4). C.445-463.
2a. Goufman E.I., Moshkovskii S.A., Tikhonova O.V., Lokhov P.G., Zgoda V.G., Serebryakova M.V., Toropygin I.Y., Vlasova M.A., Safarova M.R., Makarov O.V., Archakov A.I. Two dimensional electrophoretic proteome study of serum thermostable fraction from patients with various tumor conditions. // Biochemistry (Mosc). 2006. V.71(4). P.354-360.
3. Морозов С.Т., Грибова И.Е., Клюшник Т.П., Сидякин А.А., Гнеденко Б.Б., Торопыгин И.Ю., Фадеев Д.А., Зозуля С.А., Коверная Е.Ж., Сарманова З.В. Влияние повышенного уровня антител к основному белку миелина у самок мышей на постнатальное развитие и поведенческие реакции потомства. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. №10. С.432-435.
4. Егоров Е.Е., Молдавер М.В., Вишнякова Х.С., Терехов С.М., Дашинимаев Э.Б., Чеглаков И.Б., Торопыгин И.Ю., Ярыгин К.Н., Чумаков П.М., Корочкин Л.И., Антонова Г.А., Рыбалкина Е.Ю., Сабурина И.Н., Бурнаевский Н.С., Зеленин А.В. Усиление контроля пролиферации в теломеризованных клетках. // Онтогенез. 2007. Т.38. №2. С.105-119.
5. Курбатов Л.К., Чеглаков И.Б., Ярыгин К.Н., Сухих Г.Т., Вартанян Г.В., Торопыгин И.Ю., Арчаков А.И. Сравнительный протеомный и транскриптомный анализ фетальной печени человека. // Биомедицинская химия. 2008. Т.54. №2. С.140-153.
6. Toropygin I.Y., Kugaevskaya E.V., Mirgorodskaya O.A., Elisseeva Y.E., Kozmin Y.P., Popov I.A., Nikolaev E.N., Makarov A.A., Kozin S.A. The N-domain of angiotensin-converting enzyme specifically hydrolyzes the Arg-5-His-6 bond of Alzheimer's Abeta-(1-16) peptide and its isoAsp-7 analogue with different efficiency as evidenced by quantitative matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. // Rapid Commun Mass Spectrom. 2008. V.22(2). P.231-239.
7. Манойлов А.В., Торопыгин И.Ю., Козьмин Ю.П., Краснов Н.В., Самус Н.Л., Новиков А.В., Бубляев Р.А., Миргородская О.А. Клиническая протеомика: новые диагностические возможности масс-спектрометрии. // Научное приборостроение. 2008.
Т.18, №4, С.16–23.
8. Манойлов А.В., Торопыгин И.Ю., Козьмин Ю.П., Новиков А.В., Бубляев Р.А., Миргородская О.А. Комплексный анализ лекарственных препаратов, содержащих стрептокиназу, с использованием масс-спектрометрии // Научное приборостроение.
2010. Т.20, №4, С.50–58.
9. Karpova M.A., Moshkovskii S.A., Toropygin I.Y., Archakov A.I. Cancer-specific MALDI TOF profiles of blood serum and plasma: biological meaning and perspectives. // J Proteomics. 2010. V.73(3). P.537-551.
10. Toropygin I.Yu., Mirgorodskaya O.A., Moshkovskii S.A., Serebryakova M.V., Archakov A.I.
Controlled trypsinolysis of human cancer and non-cancer sera for direct matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // International Journal of Mass Spectrometry. 2012. V.325-327. P.121-129.
Патент на изобретение 11. Пат. 2351932 Российская Федерация, МПК G01N 33/53 Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии. /Арчаков А.И., Иванов Ю.Д., Плешакова Т.О., Торопыгин И.Ю., Згода В.Г., Быков В.А. - №2006129865/15, Заявл. 18.08.2006, опубл. 10.04.2009, Бюл. № 10.
Материалы трудов конференций 12. Toropyguine I.Yu., Archakov A.I. Direct MALDI-MS Application for Different Disease Diagnostics. // Abstr. HUPO 3th Annual World Congress. Beijing, China. Molecular & Cellular Proteomics. 2004. V.3(10) (Supplement). P.S230.
13. Ярыгин К.Н., Егоров Е.Е., Чеглаков И.Б., Торопыгин И.Ю., Курбатов Л.К., Ярыгин В.Н. Пост-транскрипционная геномика в исследовании клеточных культур. // Материалы докладов конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении». Москва. 2006. С.4.
14. Торопыгин И.Ю., Серебрякова М.В., Миргородская О.А. Использование неполного протеолиза плазмы крови в диагностике рака яичника. // Материалы докладов VI Симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С.65.
15. Кугаевская Е.В., Елисеева Ю.Е., Торопыгин И.Ю., Миргородская О.А., Козин С.А.
Гидролиз характеристического для болезни Альцгеймера амилоидного пептида N доменом ангиотензин-ревращающего фермента. // Материалы докладов VI Симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С.165.
16. Торопыгин И.Ю., Хряпова Е.В., Серебрякова М.В., Козьмин Ю.П., Миргородская О.А.
Использование методов количественной масс-спектрометрии в изучении кинетических параметров ферментативных реакций. // Материалы докладов VI Симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С.166.
17. Торопыгин И.Ю., Серебрякова М.В., Хряпова E.B., Мирогородская O.A. Orpaниченный протеолиз сывороток крови для целей диагностической протеомики. // Мат. доклад 3-ей Международной школы-конференции молодых ученых «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». Звенигород. 2007. С.156.
18. Торопыгин И.Ю., Кугаевская Е.В., Миргородская О.А., Елисеева Ю.Е., Козьмин Ю.П., Попав И.А., Николаев Е.Н., Макаров А.А., Козин С.А. Определение эффективности гидролиза изоформ бета-маилоидного пептида болезни Альцгеймера N-доменом Ангиотензин-превращающего фермента. // Материалы докладов 3-ей Международной школы-конференции молодых ученых «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». Звенигород. 2007. С.133.
19. Toropygin I.Yu., Archakov A.I. Controlled trypsinolysis of normal and cancer sera for direct MALDI-MS profiling. // Abstr. HUPO 6th Annual World Congress. Seoul, Korea. 2007. HA 0460 P.150.
20. Кугаевская Е.В., Козин С.А., Торопыгин И.Ю., Миргородская О.А., Елисеева Ю.Е., «Ангиотензин превращающий фермент гидролизует амилоидный пептид, накапливающийся при болезни Альцгеймера». // Материалы докладов конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки".
Минск. 2007. С.67.
21. Moshkovskii S.A., Vlasova M.A., Toropygin I.Y., Pyatnitsky M.A., Archakov A.I. Plasma proteome profiling by MALDI-TOF-mass-spectrometry for cancer diagnostics. // Abstr. 4th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine". Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, Russia. 2008. P.17.
22. Toropygin I.Yu., Mirgorodskaya O.A. Controlled trypsinolisys // Abstr. 4th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine".
Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, Russia. 2008. P.10.
23. Moshkovskii S., Vlasova M., Pyatnitskiy M., Toropygin I., Archakov A. Analysis of peak intensity correlations to improve diagnostic accuracy and maximize biological meaning of mass-spectral diagnostics of ovarian and prostate cancer. // Abstr. HUPO 7th Annual World Congress. Amsterdam, Nederlands. 2008. P-TUE-165. P.111.
24. Yarygin K., Cheglakov I., Kurbatov L, Toropygin I, Archakov A, Sukhikh G, Vartanian G.
Comparative transcriptomics and proteomics of fetal and adult human liver. // Abstr. HUPO 7th Annual World Congress. Amsterdam, Nederlands. 2008. p-mon-353 P. 95.
25. Moshkovskii S.A., Karpova M.A., Toropygin I.Y., Archakov A.I. Proteome bar-code for cancer diagnostic: the state-of-the-art and prospects. // Abstr. 5th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine". Saint-Petersburg, Russia. 2010.
P.58.
26. Melnik S.A., Moshkovskii S.A, Karpova M.A. Sycheva A.M., Fomchenkova E.F., Yurasova O.V. Toropygin I.Y., Unanyan A.G., Sidorova I.I., Paulus A., Archakov A.I. 2D electrophoresis-baseo comparative stady of umbilical cord and maternal blood plasma. // Abstr. 5th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine". Saint-Petersburg, Russia. 2010. P.59.
27. Toropygin I.Yu., Mirgorodskaya O. A., Khrypova E.V. The use of peptide probes to prole protease activity in cancer and non-cancer sera. // Proc 38th FEBS Congress. St.Petersburg, Russia. 2013. P.637.
Благодарность Автор выражает глубокую признательность за обучение и помощь в планировании, проведении и обсуждении экспериментов доктору химических наук О.А. Миргородской (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава России, г. Санкт-Петербург).
Финансирование работы осуществлялось из средств программы Российской академии медицинских наук «Протеомика в медицине и биотехнологии», грантов Российского фонда фундаментальных исследований и государственных контрактов по заказу Министерства образования и науки Российской Федерации.