Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплексов с аминами в присутствии белков
на правах рукописи
ПОНОМАРЕВА ВИКТОРИЯ ДМИТРИЕВНА ИНГИБИРОВАНИЕ ДИОКСИДОМ УГЛЕРОДА ВОЗДУХА ОБРАЗОВАНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА ИЗ КОМПЛЕКСОВ С АМИНАМИ В ПРИСУТСТВИИ БЕЛКОВ Специальность 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в лаборатории регуляции биосинтеза белка Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН.
Научный консультант: доктор биологических наук А.Г. Малыгин
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А.А. Ревина доктор биологических наук Н.А. Чеботарева
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
Защита состоится «24» марта 2011 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.
Автореферат разослан «21» февраля 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Частицы серебра с размерами от 1 до нанометров находят применение в различных областях науки и техники.
Особый интерес представляет их использование в биологии и медицине.
Свойство некоторых химических групп органических соединений инициировать образование светопоглощающих наночастиц серебра обеспечивает высокую чувствительность серебряных методов окрашивания тканевых структур в гистологии и биополимеров в полиакриламидном геле (ПААГ). Чувствительность этих методов многократно превосходит чувствительность методов, основанных на избирательной сорбции как обычных, так и флюоресцирующих органических красителей. В то же время, методы окраски серебром имеют недостаток, который не удается преодолеть на протяжении более ста лет – они плохо воспроизводимы. Нестабильность результатов проявления серебром, связана с тем, что не выявлены и поэтому не контролируются все существенные параметры, влияющие на процесс образования наночастиц серебра.
Способность серебра избирательно поражать микроорганизмы, оставляя при этом нетронутыми клетки хозяина, давно применяется для создания дезинфицирующих растворов, антибактериальных и противовирусных препаратов широкого спектра действия. Однако в отношении оценки эффективных доз этих препаратов в литературе сохраняется большая неопределенность.
Обнаруженный в Лаборатории регуляции биосинтеза белка эффект ингибирования восстановления серебра из его комплексов с аминами (Малыгин и Султанова, 2002) низкими концентрациями диоксида углерода (СО2) позволил предположить, что колебания концентрации СО2 в воздухе могут быть причиной плохой воспроизводимости известных методик окрашивания серебром в биологических исследованиях, а также отражаться на его бактерицидных свойствах.
Актуальность темы диссертации обусловлена необходимостью систематического исследования эффекта ингибирующего действия СО2 на образование наночастиц серебра и выявления тех областей практического использования коллоидного серебра, где этот эффект следует учитывать.
Цели и задачи исследования. Целью работы было систематическое исследование ингибирующего эффекта низких концентраций СО2 на инициируемое белками образование наночастиц серебра из комплексов с аммиаком и с различными органическими аминами. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
1. Разработать простой химический метод для точного определения абсолютного содержания СО2 в воздухе.
2. Изучить влияние воздуха, содержащего CO2, на окрашивание белков в ПААГ методом восстановления серебра из комплекса с алифатическими аминоспиртами и аммиаком.
3. Исследовать в гомогенной системе эффект ингибирования низкими концентрациями диоксида углерода образования наночастиц серебра из комплексов ионов серебра с аминами.
4. Исследовать влияние СО2 на окрашивание серебром гистологических препаратов мозга крысы и на образование наночастиц серебра из комплексов с биогенными аминами: норадреналином, серотонином и гистамином.
5. Выяснить влияние СО2 на бактерицидные свойства серебра на примере Escherichia coli.
Научная новизна работы. Подтверждено, что свободный контакт воздуха, содержащего 0,06 – 0,08 объемных % СО2, с раствором комплекса серебра с аммиаком, используемого на первой стадии методики проявления белков в ПААГ, ингибирует восстановление серебра формальдегидом на последней стадии проявления. В прямых опытах доказано, что низкие концентраций СО2 в воздухе ингибируют образование наночастиц серебра из комплексов с аммиаком и алифатическими аминоспиртами: этаноламином и 3 аминопропанолом-1 - в гомогенных растворах белка. Продемонстрировано ингибирующее действие СО2 на восстановление серебра из комплексов с биогенными аминами нервной ткани: норадреналином, серотонином, гистамином - в растворе белка. Получены кинетические кривые ингибирования диоксидом углерода образования наночастиц серебра из комплексов с аминами и рассмотрен возможный механизм этого процесса.
Показано, что колебания содержания СО2 в воздухе могут быть причиной недостаточной воспроизводимости серебряных методов окрашивания срезов тканей мозга. Обнаружено, что повышенные концентрации СО2 в воздухе усиливают токсичное действие серебра на клетки бактерии E.coli.
Научно-практическая ценность работы. Разработан простой химический метод определения низких концентраций СО2 в воздухе и способ оценки точности метода при помощи калибровочных смесей с переменной концентрацией СО2. Метод может быть использован как для определения низких концентраций СО2 в воздухе с погрешностью до 0,002 объемных %, так и для контроля и градуировки инструментальных методов определения содержания газообразного СО2. Результаты исследования ингибирования диоксидом углерода образования наночастиц серебра в ПААГ позволяют решить проблему недостаточной воспроизводимости методик окрашивания гелей серебром. Данные об ингибировании диоксидом углерода восстановления серебра из комплексов с биогенными аминами и о влиянии СО2 на окрашивание серебром срезов мозга, могут быть использованы для совершенствования соответствующих методик в гистологии. Усиление бактерицидного действия серебра повышенными концентрациями СО2 в газовой фазе может учитываться при применении соединений серебра для дезинфекции в пищевой промышленности, ветеринарии и медицине.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях. В частности, соискателем они доложены на: III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004);
International Meeting «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of Photosystems» (Pushchino, 2006);
IV Международной научной конференции «Биотехнология – охране окружающей среды» (Москва, 2006);
III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007);
VIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007);
X Молодежной конференции по органической химии (Уфа, 2007);
XX Зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008);
Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, 10 тезисов в материалах конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( 223 источников). Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 4 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дана общая характеристика диссертационной работы и обоснована актуальность темы.
В первой главе представлен обзор литературы. В обзоре литературы дана общая характеристика биологического действия серебра, изложены современные представления о бактерицидном действии ионного и наноразмерного серебра. Рассмотрено развитие методов окрашивания серебром в биологических исследованиях. Дан краткий обзор фотохимических свойств серебра. Рассмотрен механизм образования серебряных кластеров, предшественников светопоглощающих частиц серебра. Описан процесс окрашивания серебром белковых зон в ПААГ.
Приведены полученные ранее в лаборатории данные по влиянию СО воздуха на проявление белков серебром в ПААГ. Проведен сравнительный анализ существующих способов определения концентрации СО2 в воздухе.
Во второй главе представлены материалы и методы исследования.
Материалы и методы исследования.
Электрофорез сыворотки крови в ПААГ. Электрофорез белков в ПААГ осуществляли по частично модифицированному методу Лэммли (Малыгин, 1993;
Laemmli, 1970).
Проявление белковых зон в ПААГ серебром. Белки в ПААГ проявляли по несколько измененной методике Рея (Wray, 1981). Проявление осуществляли в три стадии: 1) стадия насыщения полосок геля (150х9х1,5 мм) в течение часа раствором, содержащим 3 мМ AgNO3, 9 мМ NH4OH, 2,4 мМ NaOH;
2) стадия отмывки бидистиллированной водой - 20 минут;
3) стадия восстановления 72 мМ раствором формальдегида и 0,17 мМ раствором лимонной кислоты - около 10 мин. Объем растворов на всех стадиях составлял 25 мл. Проявление осуществляли параллельно в четырех стеклянных кюветах. Чтобы ограничить проникновение в растворы СО2 из окружающего воздуха, кюветы закрывали пришлифованными стеклянными пластинами. Концентрация СО2 в воздухе в процессе осуществления эксперимента составляла 0,06 - 0,08 объемных %.
Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с этаноламином и 3-аминопропанолом-1. Для получения комплекса серебра с этаноламином к 8 мл 0,1 М раствора AgNO3 добавляли 230 мкл 50% этаноламина. К приготовленному раствору добавляли 0,4 мл раствора белка в воде (альбумина или гексокиназы) с концентрацией 1 мг/мл. Полученный раствор разливали в пробирки по 1 мл в каждую. Раствор изолировали от контакта с воздухом атмосферы резиновыми пробками. В случае 3-аминопропанола- используемая концентрация серебра была в два раза ниже.
Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с аммиаком. К 7,6 мл 0,2 мг/мл раствора одного из названных ниже белков добавляли мкл смеси, содержащей 40 мМ AgNO3 и 40 мМ (NH4)2SO4. Раствор перемешивали и разливали в пробирки по 480 мкл. Оптимальный объем смеси 50 мМ Na2CO3 и 50 мМ NaHCO3, добавляемый в каждую пробирку, для альбумина составлял 21 мкл (конечная концентрация 1,2 мМ), для гексокиназы - 35 мкл (2,3 мМ), для гиалуронидазы - 28 мкл (1,8 мМ), для глюкозоксидазы - 21 мкл (1,2 мМ). Реакцию запускали добавлением в пробирки по 250 мкл 7,3 мМ свежеприготовленного раствора формальдегида.
Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с серотонином, норадреналином и гистамином. К 7,6 мл 0,2 мг/мл раствора гексокиназы добавляли 105 мкл раствора 40 мМ AgNO3 и 105 мкл 40 мМ раствора креатининсульфатного комплекса серотонина или гистамина или 210 мкл мМ раствора артеренол битартратмоногидрата (норадреналин). Полученную смесь перемешивали и разливали в полистирольные пробирки по 960 мкл.
Щелочную среду создавали добавлением эквимолярного раствора Na2CO3 и NaHCO3. Оптимальный объем смеси 50 мМ Na2CO3 и 50 мМ NaHCO3 для серотонина составлял 45 мкл (конечная концентрация 1,5 мМ), для гистамина - 30 мкл (2 мМ). Для норадреналина использовали смесь 25 мМ Na2CO3 и мМ NaHCO3 объемом 20 мкл (0,5 мМ). В пробирки добавляли по 500 мкл 7, мМ свежеприготовленного раствора формальдегида (в случае норадреналина - дистиллированной воды).
Импрегнация серебром образцов тканей мозга по методу Гольджи.
Образцы ткани мозга крысы обрабатывали по методу Гольджи в модификации Антоновой (Антонова, 1967).
Определение влияния СО2 на токсичность серебра в отношении культуры клеток Е.coli. Использовали штамм Escherichia coli (Е.coli) BL21, производный штамма B, культивируемый в жидкой среде LB. Выращенную до стационарной фазы культуру Е.coli с титром 108 – 109 клеток/мл разливали по 10 мкл в стерильные пробирки объемом 10 мл, содержащие по 2 мл стерильной дистиллированной воды. В пробирки, если необходимо, добавляли различные объемы 0,2 мМ раствора AgNO3 и закрывали пробками.
Требуемая концентрация СО2 создавалась введением в пробирки необходимого объема чистого СО2. После инкубации в течение часа при температуре 15С исследуемые культуры E.coli разбавляли в 100 и 1000 раз стерильной дистиллированной водой и высевали на чашки Петри с LB агаром. Колонии растили при температуре +32°С и подсчитывали.
Электронная микроскопия. Препараты коллоидного серебра или его конъюгатов наносили на сеточки, покрытые формваровой пленкой.
Изображения наночастиц получали с помощью электронного микроскопа CX-100 («Jeol», Япония).
Спектральные исследования. Спектры оптического поглощения растворов наночастиц серебра в видимой области (30-14 х 1000см-1) снимали при комнатной температуре на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия).
Получение СО2. Получение СО2 осуществляли разложением гидрокарбоната натрия серной кислотой (Карякин и Ангелов, 1974) в газометре.
Получение и воздуха, очищенного от СО2. Очистку воздуха от СО осуществляли выдерживанием над 3 - 5% раствором едкого калия в газометре в течение 20 - 30 минут. В результате содержание СО2 в газометре не превышало 0,001%.
Получение и очистка от СО2 кислорода. Кислород получали разложением KMnO4 при нагревании и очищали от примеси СО2 пропусканием через гранулы КОН.
В третьей главе приводятся собственные результаты и их обсуждение.
Результаты исследования и их обсуждение 1. Разработка метода определения низких концентраций СО2 в воздухе.
Для исследования процесса ингибирования восстановления серебра низкими концентрациями СО2 необходимо точно контролировать эти концентрации в воздухе. Поэтому важную часть исследования составляла разработка простого химического метода определения низких концентраций СО2 в воздухе. В основе метода лежала реакция нейтрализации насыщенного водного раствора Ва(ОН)2 содержащимся в воздухе СО2:
Ва+2 + 2ОН- + СО2 = ВаСО3 + Н2О ВаСО3 + СО2+ Н2О = Ва2+ + 2НСО3 Объем воздуха, соответствующий точке эквивалентности между количеством поглощенного СО2 и исходным количеством катионов Ва2+ в первой реакции, определяли по минимуму электропроводности в процессе пропускания через раствор воздуха, содержащего СО2.
Устройство прибора и методика определения СО2.
Основной функциональной частью прибора (рис. 1) служит стеклянная трубка, в которой происходит поглощение СО2 из воздуха. В центральную часть трубки впаяны два платиновых электрода. В нижнюю часть трубки помещается необходимый объем раствора Ва(ОН)2. Диоксид углерода сорбируется на внутренней поверхности трубки, смачиваемой столбиком раствора Ва(ОН)2, который перемещается вверх по трубке по мере поступления в нее воздуха. По достижении верхних полостей трубки столбик жидкости разрушается и его содержимое стекает по стенкам трубки навстречу поступающему воздуху, создавая эффект поглощения в противотоке. Электропроводность жидкости в трубке измеряли кондуктометром. Объем прошедшего через трубку воздуха определяли по объему вытесненной им воды из перевернутого мерного цилиндра.
Рис. 1. Прибор для определения СО2 в воздухе: 1 - сорбционная трубка;
2 - аликвота раствора Ba(OH)2 известной концентрации;
3 - платиновые электроды;
4 ребра жесткости;
5 - стеклянный капилляр;
6 - мерный цилиндр;
7 стеклянная трубка внутри цилиндра;
8 - склянка для уравновешивания давления;
9 шланги из красной резины;
10 кондуктометр. Стрелками указано движение анализируемого воздуха в приборе.
Для точного вычисления объемных процентов СО2 в пересчете на сухой воздух использовали формулу:
С = 100/(PVkh/ (RT[Ba(OH)2]VBa(OH)2)+1). (1) Если концентрация СО2 в воздухе не превышала 0,1% по объему, то концентрацию СО2 вычисляли по упрощенной формуле:
С = 100[Ba(OH)2]VBa(OH)2RT /(PVkh), (2) где V – кажущийся объем поступившего в цилиндр воздуха, измеренный по градуировке цилиндра без учета объема трубки внутри цилиндра (в литрах);
[Ba(OH)2] – исходная концентрация Ba(OH)2 в растворе (в молях);
VBa(OH)2 объем раствора Ва(ОН)2, помещаемого в сорбционную трубку (в литрах);
k=1-d2/D2;
d - внешний диаметр трубки внутри цилиндра;
D - внутренний диаметр цилиндра;
h=(1-pн/P);
pн – давление насыщенных паров воды (находилось по справочнику);
P - атмосферное давление (в атмосферах);
R универсальная газовая постоянная (0,08206 л•атм/моль•град);
T - абсолютная температура (в градусах Кельвина).
Способ приготовления градуировочных смесей с переменной концентрацией СО Для оценки точности метода определения низких концентраций СО2 в воздухе были использованы воздушные градуировочные смеси с изменяющейся концентрацией СО2. Для их приготовления разработали устройство, в котором через заполненный воздухом сстеклянный сосуд с заданной начальной концентрацией СО2 пропускали очищенный от СО воздух. Очищенный воздух по мере поступления в колбу перемешивался с ее содержимым. При этом концентрация СО2 на выходе описывалась обратной экспоненциальной зависимостью от объема пропущенного воздуха, которую при заданных начальных условиях выводили теоретически. Значения средних теоретических концентраций СО2 вычисляли по формуле, полученной делением интеграла этой зависимости на объем пропущенного воздуха:
C'ср=100V'СО2(exp(-Vnkh/(Vк(1-C'n/100)))–exp(-Vn+1kh/(Vк(1 C'n+1/100))))/((Vn+1/(1-C'n+1/100)-Vn/(1-C'n/100))kh), (3) где V'СО2 - начальный объем вводимого в колбу СО2 (в литрах);
Vк – объем колбы;
Vn – начальный объем градуировочной смеси;
Vn+1 – конечный объем градуировочной смеси;
C'n – начальная концентрация СО2 в колбе (в объемных %);
C'n+1 - конечная концентрация СО2 в колбе.
Вычисления и построение графиков осуществляли при помощи программы OriginLab.
Оценка точности определения концентраций СО2 в воздухе разработанным методом.
Результаты сравнения теоретических значений (вычисленные по формуле 3) с экспериментально полученными (вычисленные по формуле 2) для концентраций СО2 в интервале от 0,02 до 0,1% показывают, что расхождение между ними не превышает 2% (рис. 2а), а в интервале концентраций от 0,1 до 0,9 % (вычисленные по формуле 1) - не превышает 1% (рис. 2б) от исходно заданной концентрации СО2 (C'0).
Рис.2. Сравнение средних экспериментальных значений концентраций СО2 с теоретическими в порциях градуировочной смеси в интервале концентраций:
а) от 0,01 до 0,11% и б) от 0,1 до 0,9%.
Разработанный метод в техническом оформлении проще и доступнее всех ранее описанных методов определения абсолютных концентраций СО2 в воздухе c погрешностью измерения до 1 - 2% от его содержания.
Для проведения непрерывного измерения СО2 в воздухе использовали коммерческий газоанализатор ПКУ-4-Р-МК («ПрактикНЦ», Россия), который был откалиброван с применением разработанного нами метода определения СО2. Установлено, что систематическое отклонение показаний газоанализатора ПКУ-4-Р-МК, которое необходимо учитывать, меняет свой знак в зависимости от интервала измерения. При этом, в интервале от 0,01 до 0,05% СО2 максимальное отклонение составляет +40% от измеряемой величины, а в интервале от 0,05 до 0,8% СО2 достигает –20%.
2. Ингибирующее действие контакта воздуха с раствором комплекса [Ag(NH3)2]+ на проявление белков в ПААГ серебром.
В работе (Малыгин и Султанова, 2002) описано ингибирование восстановления серебра в ПААГ при свободном контакте проявляющих растворов с воздухом, содержащим CO2. При этом продемонстрированы результаты опытов с использованием комплекса ионов серебра с этаноламином и лишь упомянуто об аналогичных результатах при использовании комплекса [Ag(NH3)2]+. Поскольку при проявлении белков в гелях обычно используют раствор комплекса [Ag(NH3)2]+, то в настоящей работе более детально изучено влияние контакта этого раствора с воздухом на процесс проявления. Закрытые кюветы с растворами, в которые были помещены гели, открывали на разных стадиях проявления для свободного контакта растворов с воздухом. Показано, что контакт раствора с воздухом, содержащим 0,06 – 0,08% СО2, на первой стадии проявления (насыщение гелей комплексом [Ag(NH3)2]+) ингибирует процесс проявления. В то время как на других стадиях (отмывание водой и восстановление серебра формальдегидом) контакт с воздухом не оказывает заметного влияния на проявление (рис. 3).
Рис. 3. Результаты проявления белков сыворотки крови в полосках ПААГ с использованием комплекса [Ag(NH3)2]+ в кюветах, открытых только на стадии насыщения гелей раствором [Ag(NH3)2]+ (1;
2), только на стадии отмывания водой (3;
4), только на стадии восстановления формальдегидом (5;
6) - и в кюветах, закрытых на всех стадиях (контроль) (7;
8).
1 2 3 4 5 6 7 Полученный результат можно объяснить тем, что СО2 ингибирует на первой стадии проявления (насыщение гелей раствором [Ag(NH3)2]+) образование кластеров серебра, инициирующих процесс восстановления серебра, и не влияет на рост кластеров до размеров светопоглощающих наночастиц серебра на последующих стадиях (отмывка водой и восстановление формальдегидом).
3. Изучение влияния СО2 воздуха на восстановление Ag+ в гомогенной системе.
Чтобы упросить изучение процесса ингибирования диоксидом углерода проявления белков в ПААГ серебром, были исследованы условия осуществления этого процесса в гомогенной системе с комплексами Ag+ с этаноламином, 3-аминопропанолом-1 и аммиаком.
Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплексов серебра с алифатическими аминоспиртами.
Ингибирование диоксидом углерода осаждения металлического серебра на стенках пробирок, которое было ранее продемонстрировано в системе с нелетучим этаноламином (Малыгин и Султанова, 2002), сочетающим в себе функции лиганда в комплексе с Ag+ и восстановителя, нельзя считать достаточным доказательством участия СО2 в ингибировании инициирования восстановления серебра белками в геле. Кроме того, образование в реакции нерастворимой фазы металлического серебра затрудняет исследование процесса ингибирования. Поэтому в настоящей работе для инициации образования наночастиц серебра в объеме раствора в систему восстановления Ag+ из комплекса с этаноламином вводили различные белки в низких концентрациях.
На рис. 4 видно, что ингибирование образования наночастиц серебра из комплекса Ag+ с этаноламином происходит при контакте растворов с воздухом и отсутствует при изолировании этих растворов от контакта с воздухом. При этом в присутствии глюкозоксидазы реакция восстановления серебра более выражена, чем в присутствии гиалуронидазы.
Рис. 4. Влияние контакта с воздухом на Ag+ восстановление из комплекса с этаноламином в присутствии глюкозоксидазы (1-4) и гиалуронидазы (5-8). На вторые сутки инкубации в закрытых пробирках серебро восстанавливалось (1;
2;
5;
6), в то время как в открытых – реакция была подавлена (3;
4;
7;
8).
1 2 3 4 5 6 7 Таким образом, установлено, что, хотя различные белки с разной эффективностью инициируют восстановление серебра в растворе, ингибирование этого процесса контактом с воздухом, содержащим СО2, не зависит от природы белка.
Представленные на рис. 5 спектры поглощения растворов наночастиц серебра, образующихся при восстановлении Ag+ из комплекса с этаноламином в присутствии гексокиназы, подтверждают вывод, что контакт с внешним воздухом подавляет образование наночастиц серебра в растворе.
O.E.
0, 0, Рис. 5. Спектры поглощения в видимой 0, области (30-14 х 1000см-1) коллоидного 0, раствора серебра, полученного при 0, восстановлении Ag+ из комплекса с 0, этаноламином в присутствии 0,2 гексокиназы в закрытых пробирках (1) и 0, в открытых пробирках (2).
0, 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 x 1000 см - При изучении скорости восстановлении Ag+ из комплекса с этаноламином в присутствии альбумина (рис. 6) обнаружено, что зависимость увеличения оптической плотности раствора наночастиц серебра от времени в закрытых пробирках носит явно выраженный двухстадийный характер. В первой стадии осуществляется процесс образования центров инициации (кластеров), подобно тому, как это происходит при кристаллизации веществ из растворов. На второй стадии, при достижении кластерами критической величины, происходит лавинообразный рост размера частиц, заканчивающийся исчерпанием растворенного вещества.
(1) 1,4 (2) Рис. Изменение оптической 6.
плотности от времени окрашенных 1, коллоидов серебра, образующихся при О.Е. 450 нм 1, восстановлении Ag+ из комплекса с 0, этаноламином в присутствии альбумина 0, в условиях свободного контакта 0, раствора с воздухом (1) и изоляции от 0, воздуха (2).
0, 0 10 20 30 время, час В сходных опытах с алифатическим гомологом этаноламина – 3 аминопропанолом-1 были получены аналогичные результаты.
Прямым доказательством участия СО2 в ингибировании образования наночастиц серебра было замедление потемнения растворов комплекса серебра с этаноламином в пробирках с добавленным СО2 по сравнению с пробирками, в которые СО2 не добавляли. Отсутствие градиента оптической плотности раствора образующихся наночастиц серебра в длинных пробирках (35см) указывало на то, что скорость диффузии СО2 в растворе намного превышает скорость восстановления Ag+ и на нее существенно не влияет.
Высокая скорость диффузии СО2 в системе также подтверждается кривой поглощения СО2 из воздуха. На рис. 7 видно, что достижение равновесия между газовой фазой и раствором занимает не более 15 мин, в то время как для завершения реакции восстановления серебра из комплекса с этаноламином требовалось более суток.
0, Рис. 7. Кинетика уравновешивания (1) концентрации СО2 в воздухе с (2) 0, раствором, содержащим комплекс Ag+ CO2 % объемн.
с этаноламином, в замкнутом объеме 0, при соотношении объемов раствора и воздуха 2/3. Кривая (1) - поглощение 0, СО2 из воздуха при начальной концентрации 0,036%;
кривая (2) 0, последующее выделение СО2 из 0 10 20 30 раствора в воздух, очищенный от СО2.
время, мин Таким образом, в простой гомогенной системе показано, что СО воздуха ингибирует инициируемое белками образование наночастиц серебра из комплекса с алифатическими аминами.
Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+.
Для доказательства того, что СО2 ингибирует образование наночастиц серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ использовали систему с формальдегидом в качестве восстановителя. Источником аммиака в системе служил раствор нелетучего сульфата аммония в щелочной среде. Количество щелочного буфера в виде эквимолярной смеси NaHCO3 и Na2CO3 подбирали так, чтобы скорость восстановления серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ была сопоставима со скоростью реакции восстановления Ag+ из комплекса с этаноламином. Эксперименты в закрытых и открытых полистирольных пробирках со всеми используемыми белками (альбумин, гексокиназа, глюкозоксидаза, гиалуронидаза) дали сходные результаты: в закрытых пробирках образуется гомогенный раствор коллоидного серебра, в то время как в открытых – реакция подавляется, как это показано на рис. 8.
Рис. 8. Влияние контакта с воздухом на восстановление Ag+ из комплекса [Ag(NH3)2]+ в присутствии глюкозоксидазы и (1-4) гиалуронидазы (5-8). На вторые сутки инкубации растворы в закрытых пробирках окрашивались интенсивнее (3;
4;
7;
8), чем в открытых (1;
2;
5;
6).
1 2 3 4 5 6 7 Как видно из сравнения рис. 5 и 9, спектры поглощения продуктов реакции в гомогенной системе в видимой области имеют одинаковый колоколообразный вид с максимумом поглощения при длине волны около 450 нм. Это говорит о схожести процессов, идущих как в системе с этаноламином, так и при замене последнего на аммиак.
O.E.
0, Рис. 9. Спектры поглощения в 0, 0, видимой области (30-14 х 1000см-1) 0,45 коллоидного раствора серебра, 0, полученного при восстановлении Ag+ 0, 0, [Ag(NH3)2]+ из комплекса в 0, присутствии гексокиназы в закрытых 0, 0, (1) и открытых (2) пробирках.
0, 0, 0, 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 x 1000 см - Из рис. 6 и 10 следует, что свободный контакт с воздухом, содержащим СО2, растворов комплекса [Ag(NH3)2]+ (рис. 10) и комплекса Ag+ с этаноламином (рис. 6) приводит к ингибированию реакции образования наночастиц серебра.
(1) (2) 0, Рис. Изменение оптической 0,6 10.
плотности от времени окрашенных 0, коллоидов серебра, образующихся при О.Е. 450 нм 0, восстановлении Ag+ из комплекса 0, [Ag(NH3)2]+ в присутствии гексокиназы в условиях свободного контакта 0, раствора с воздухом (1) и изоляции от 0, воздуха (2).
0, 0 10 20 30 40 50 время, час.
В опытах с [Ag(NH3)2]+ был показан лишь факт ингибирования реакции восстановления серебра при контакте реакционной смеси с атмосферным воздухом, содержащим СО2. В радиохимии при синтезе кластеров серебра обычно проводят деаэрацию растворов, предполагая, что на ход реакции влияет кислород воздуха (Henglein, 1991;
Ershov, 1998). Для доказательства того, что в гомогенной системе ингибирующим фактором является не кислород, а содержащийся в воздухе СО2, были проведены прямые опыты с добавлением в систему различных количеств СО2 и очищенного от СО кислорода. Опыты проводили с глюкозоксидазой и гексокиназой.
Результаты других опытов (рис. 11) показывают, что свободный контакт содержимого пробирок с воздухом (0,08% СО2), а также 2, мкмолей (капилляры на 60 мкл) и 5,36 мкмолей (капилляры на 120 мкл) СО в пробирках полностью ингибируют образование наночастиц серебра в системе, в то время как количество СО2 в воздухе, ограниченном объемом пробирок (0,11мкмолей), не оказывает заметного ингибирующего действия.
Очищенный кислород также не обнаруживает ингибирующих свойств.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 Рис. 11. Прямое доказательство участия Рис. 12. Ингибирующее влияние малых СО2 в ингибировании восстановления количеств СО2 воздуха на серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ в восстановление серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ в присутствии гексокиназы присутствии глюкозоксидазы (через часа). В открытых пробирках (1;
2), в (через 12 часов). В пробирках (1;
2), пробирках с капиллярами на 60 мкл (3;
4) и соединенных с пробирками без Ва(ОН)2, с капиллярами на 120 мкл (5;
6), реакция подавлена. В пробирках (3;
4), заполненными СО2 - реакция подавлена. В соединенных с пробирками, закрытых пробирках, заполненных содержащими 1 мл 0,08 М раствор воздухом (7;
8) и заполненных очищенным Ва(ОН)2, наблюдали образование от СО2 кислородом (9;
10), наблюдали наночастиц серебра. Исходная концентрация СО2 в пробирках - 0,08%.
образование наночастиц серебра.
Чтобы доказать, что ингибирование образования наночастиц серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ может происходить и при более низких концентрациях СО2, провели сравнение развития реакции в системе, заполненной воздухом (0,22 мкмолей СО2 в пробирке), и в системе, где СО удалялся раствором Ва(ОН)2 (рис. 12). Опыты проводились с гексокиназой и гиалуронидазой. В результате установлено, что СО2 ингибирует образование наночастиц серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ не только при неограниченном поступлении из воздуха помещения, но и при его весьма малых количествах, ограниченных объемами пробирок, при той же концентрации СО2.
Чтобы получить сопоставимые результаты исследований процессов в гомогенной системе и в геле, скорость образования наночастиц серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ была увеличена в гомогенной системе посредством повышения рН и буферной емкости растворов заменой смеси NaHCO3 и Na2CO3 на раствор Na2CO3. Повышение скорости реакции, сократило время опыта с 60 до 3 часов (рис. 10, 13) и таким образом помогло установить, что добавление СО2 в систему увеличивает время задержки образования наночастиц серебра, но не влияет на скорость их образования после начала процесса.
Рис. Изменение оптической (1) 13.
4,0 (2) плотности окрашенных коллоидов 3, серебра от времени, образующихся при 3, восстановлении Ag+ из комплекса 2, [Ag(NH3)2]+, в условиях увеличения О.Е. 410 нм 2, буферной емкости и pH системы в 1, присутствии гексокиназы в условиях 1, свободного контакта раствора с 0, воздухом (1) и изоляции от воздуха (2).
0, 0 50 100 150 время (мин) Этот факт согласуется с приведенным выше наблюдением, что ингибирование проявления белков в геле происходит при свободном контакте с воздухом только на первой стадии проявления, когда образуются кластеры серебра, выполняющие функции затравок, в то время как на процесс формирования наночастиц серебра более крупного размера, осуществляющийся на второй и третьей стадиях проявления, контакт с воздухом не оказывает влияния.
Этот вывод подтверждается электронномикроскопическим исследованием размеров наночастиц серебра (рис. 14). Изолирование раствора от контакта с внешним воздухом способствует формированию и росту наночастиц серебра, в то время как свободный контакт с воздухом и особенно ввод в пробирки дополнительного количества СО2 замедляет рост наночастиц и, соответственно, заметно уменьшает их размеры.
А Б В 100нм 200нм 100нм Рис. 14. Наночастицы серебра, образующиеся при восстановлении Ag+ из комплекса [Ag(NH3)2]+ в присутствии гексокиназы в закрытых от воздуха пробирках (А), открытых (Б) и закрытых с 4% СО2 (5,41 мкмолей) (В).
Известно, что концентрация СО2 в результате жизнедеятельности человека в закрытом помещении может изменяться на два порядка (от 0,03 до 3%). Поскольку выше было показано, что низкие концентрации СО ингибируют восстановление серебра в ПААГ и серебросодержащих растворах, то необходимо было оценить, как меняется концентрация СО2 в зоне работы экспериментатора.
Измерение концентрации СО2 в воздухе на разных расстояниях от лица экспериментатора показало пятикратное увеличение концентрации на расстоянии 30 см, полуторократное - на расстоянии 50 см и пренебрежимо малое - на расстоянии 1 м (рис. 15).
CO2 об.% Рис. 15. Результаты замеров 0, концентрации СО2 на рабочем 0, месте экспериментатора.
0, Замеры при удалении лица 0, экспериментатора на 50 и 0, см. Фоновая концентрация СО2 в помещении 0,08%.
0, 0, фон1 м 0,5м 0,3 м 0, 20 40 60 80 100 120 мин Из опытов, проведенных с использованием гомогенной системы следует, что уже пятикратное увеличение концентрации СО2 по сравнению с фоновым вызывает значительное подавление восстановления серебра. Таким образом, колебания концентрации СО2 в воздухе могут являться главным неконтролируемым параметром, влияющим на воспроизводимость методик проявления серебром белков в ПААГ.
Возможный механизм ингибирования диоксидом углерода образования наночастиц серебра из комплексов с аминами.
Поскольку диоксид углерода легко образует с аминами в щелочной среде карбонаты, гидрокарбонаты, а также соли карбаминовых кислот, то можно было предположить, что ингибирование восстановления серебра осуществляется не свободным СО2, а его производными. Однако наши опыты и опубликованные ранее данные (Малыгин и Султанова, 2002) показывают, что Na2CO3 не только не ингибирует, а напротив, ускоряет реакцию восстановления серебра из комплексов с аминами. Опыты с NaНCO3 и карбаматом аммония также не подтвердили их ингибирующее действие.
Другое, на первый взгляд очевидное предположение состоит в том, что СО2 закисляет реакционную среду и посредством этого тормозит реакцию восстановления серебра. Действительно, увеличением рН среды посредством замены смеси NaHCO3 и Na2CO3 на Na2CO3 и двукратным увеличением буферной емкости раствора удалось многократно увеличить скорость реакции восстановления серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ (рис. 10 и 13), что свидетельствует в пользу механизма ингибирования восстановления серебра за счет закисления реакционной среды. Однако в прямом опыте при эквимолярной замене CO2 на серную или уксусную кислоту ингибирование реакции восстановления серебра из комплекса с этаноламином было менее выражено, чем в случае использования газообразного CO2. Последнее обстоятельство ставит под сомнение механизм ингибирования + восстановления Ag за счет закисления среды диоксидом углерода и допускает возможность прямого участия молекулярного CO2 в процессе ингибирования. Если предположить, что в восстановлении Ag+ участвует (CO2·-), анион-радикал диоксида углерода согласно описанной радиохимиками равновесной реакции (Ershov et al., 1993) Ag+ + CO2· - Ag0 + CO2, которая открывает каскад реакций, приводящих к последующему образованию описанных в литературе кластеров: Ag2+, Ag32+, Ag42+, Ag82+ и далее наночастиц серебра (Ершов, 2002), - то обращение этой реакции при избытке CO2 в системе должно приводить к перехвату Ag0, ингибированию каскада реакций и, как следствие, торможению образования наночастиц серебра.
Таким образом, содержащийся в воздухе СО2 на первой стадии проявления белков в ПААГ препятствует образованию кластеров, инициирующих осаждение серебра. При этом амины, связывая Ag+, обращают реакцию восстановления Ag+ ананион-радикалом CO2·- и тем самым способствуют превращению продукта реакции - CO2 в ее ингибитор.
4. Влияние СО2 воздуха на образование наночастиц серебра из комплексов серебра с серотонином, норадреналином и гистамином, а также на окрашивание серебром препаратов мозга крысы.
Поскольку в гистохимии методы с применением серебра используются для выявления в нервной ткани биогенных аминов (Луппа, 1980), то прежде чем выяснить влияние СО2 на окрашивание серебром препаратов тканей мозга, было изучено ингибирующее действие СО2 на образование наночастиц серебра в пробирках из комплексов ионов серебра с биогенными аминами:
серотонином, норадреналином и гистамином.
Опыты с норадреналином показали, что серебро в пробирках, заполненных воздухом с начальной концентрацией СО2 0,05%, восстанавливалось быстрее, чем в пробирках с начальной концентрацией СО 4% (рис. 16 А). В опытах с серотонином, где в отличие от опытов с норадреналином восстановителем служил не сам амин, а добавленный в систему формальдегид, результаты были аналогичными (рис. 16 Б). Сходные результаты были получены при восстановлении серебра из комплексов с гистамином в присутствии формальдегида.
А Б O.E.
O.E.
1, 0, 1, 0,3 1, 1 0, 0, 0, 2 0, 0, 0, 0, 0, -0, 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 х1000 см -1 х 1000 см- Рис. 16. Спектры поглощения в видимой области (30-14 х 1000см-1) коллоидных растворов серебра, полученных при восстановлении Ag+ из комплексов: с норадреналином (А) и с серотонином (Б) в присутствии гексокиназы в закрытых пробирках, заполненных воздухом с начальной концентрацией СО2 0,05% (1) и с начальной концентрацией СО2 4% (2).
В гистологии различают два типа окрашивания серебром:
аргентаффинное, при котором окрашивание структур ткани происходит без участия внешнего восстановителя, и аргирофильное, требующее присутствия внешнего восстановителя. Образование наночастиц серебра из комплексов с норадреналином и алифатическими аминоспиртами (этаноламин и 3 аминопропанол-1) соответствует аргентаффинному типу окрашивания, тогда как из комплексов с серотонином, гистамином и аммиаком – аргирофильному. Поэтому результаты, представленные на графиках (рис.
16), позволяют сделать вывод, что СО2 ингибирует как аргентаффинную, так и аргирофильную реакции восстановления серебра в тканях.
Чтобы выяснить влияние СО2 на окрашивание серебром нервной ткани, препараты ткани мозга крысы окрашивали серебром по методу Гольджи (методика Антоновой, модифицированная), причем стадию пропитки образцов раствором AgNO3 осуществляли при разных концентрациях СО2 в воздухе над раствором.
В результате обнаружено, что при изменении концентрации СО окрашивание серебром структурных элементов ткани происходит неодинаково.
Таблица. Зависимость окрашивания серебром структурных элементов препаратов мозга крысы от концентрации СО2.
Начальная концентрация СО2 Среднее число Площадь, занимаемая (над раствором AgNO3 в окрашенных нейронов на окрашенными мм воздухе пробирки)в об.% капиллярами 0,07 ± 0,04* 0,37 ± 0,07* 0,06 % 0,96 ± 0,20 0,06 ± 0, 4% Примечание: * p0,05 (степень окрашивания в среде с 0,06% СО2 против 4% СО2).
Подсчет производили в области сенсомоторной коры больших полушарий мозга при толщине срезов 90 мкм и площади исследуемой зоны 1200 мм2.
Как видно из таблицы и рис. 17, при обработке препаратов мозга азотнокислым серебром в присутствии 0,06% СО2 окрашиваются преимущественно капилляры, в то время как в присутствии 4% СО интенсивнее окрашиваются нейроны.
А Б Рис. 17. Результаты окрашивания серебром (метод Гольджи) нервной ткани крыс при разных концентрация СО2 в воздухе: А – при экспонировании с 0,06% СО (окрашены капилляры);
Б – при экспонировании с СО 4% (окрашены нейроны).
Полученные результаты можно объяснить сорбцией и восстановлением ионов серебра стенками капилляров при низкой концентрации СО2 (0,06%), вследствие чего ионы серебра не достигают нейронов, которые остаются неокрашенными. В случае повышенной концентрации СО2 (4%) центры инициации на стенках капилляров подавляются, и ионы серебра беспрепятственно диффундируют к нейронам, которые, восстанавливая Ag+, окрашиваются.
Таким образом, установленный факт усиления окрашивания серебром нейронов и ослабления окрашивания капилляров в гистологических препаратах мозга крысы диоксидом углерода объясняется ингибирующим действием СО2 на образование наночастиц серебра. Это указывает на общность эффекта влияния СО2 на окрашивание тканевых препаратов серебром в гистологии с ингибированием диоксидом углерода окраски серебром белков в ПААГ. Следовательно, как и в случае проявления белков в ПААГ, колебания СО2 в воздухе могут быть причиной нестабильности результатов окрашивания серебром гистологических препаратов.
5. Влияние СО2 на токсичность серебра в отношении клеток Escheriсhia coli.
Учитывая описанный выше эффект ингибирования образования наночастиц серебра низкими концентрациями СО2, логично было предположить, что СО2 может влиять на токсические свойства серебра по отношению к микроорганизмам. Для выяснения этого в качестве объекта исследования использовали клеточную культуру Е.coli.
Культуру Е.coli разливали по пробиркам, содержащим стерилизованную дистиллированную воду, и добавляли раствор AgNO3.
Были подобраны такие концентрации AgNO3, которые приводят к частичному снижению выживаемости клеток Е.coli. В пробирки добавляли необходимые количества СО2 и закрывали. Пониженная температура (+15С) и низкий титр бактерий (108–109 клеток/мл) в инкубационной среде способствовали сведению к минимуму концентрации эндогенного СО2 и тем самым уменьшали его влияние на токсичность растворенного серебра. После серии разведений культуры Е.coli из пробирок высевали на чашки Петри с агаром LB. Число образовавших колонии клеток подсчитывали через двое суток.
Как следует из рис. 18, выживаемость бактерий в присутствии 0,01 мМ AgNO3 снижается до 44%, по сравнению с пробами, где серебро отсутствует.
Увеличение токсического действия 0,01 мМ AgNO3 на клетки Е.coli начинает проявляться при концентрации СО2 в воздухе равной 1% и достигает максимума при 6 % (рис. 19). В контрольных опытах изменение концентрации CO2 над суспензией Е.coli в отсутствии Ag+ в пределах ошибки опыта не влияет на выживаемость бактериальных клеток. Из этого следует, что наблюдаемое увеличение цитотоксичности обусловлено не СО2 как таковым, а его взаимодействием с серебром.
Рис. 18. Выживаемость клеток E.coli, инкубированных в течение часа в чистой воде и в воде с добавкой Отношение числа выживших клеток к контролю в % AgNO3, при обычной и повышенной концентрациях СО2 в воздухе.
1) Среднее число образующих колонии клеток после инкубации при 0,06% СО в отсутствии АgNO3 (контрольный опыт) принято за 100%. Число образующих колонии клеток после инкубации бактерий в условиях: 2) 6,0% СО2;
3) 0,07% СО2 с 0,01 мМ АgNO3;
4) 6,0% СО2 с 0,01 мМ АgNO3.
1 2 Рис. 19. Зависимость выживаемости клеток E.coli, инкубированных в течение часа в 0,01 мМ водном растворе АgNO3, от начальной Отношение числавыживших клеток к контролю в % концентрации СО2 в пробирках над раствором.
Концентрация СО2 на оси абсцисс представлена в объемных процентах в логарифмическом масштабе. По оси ординат отложен средний процент числа образующих колонии клеток после инкубации бактерий в условиях возрастающих концентраций СО2 в присутствии 0,01 мМ АgNO3 от числа образующих колонии клеток после 0,1 1 CO2%v/v инкубации в чистой воде при 0,07% СО2.
Таким образом, на примере культуры E.coli показано, что СО усиливает токсическое действие серебра на клетки прокариот.
ВЫВОДЫ 1. Разработан простой химический метод определения низких концентраций СО2 в воздухе с точностью до 0,002%, а также способ оценки его точности при помощи калибровочных смесей с переменным содержанием СО2.
2. Подтверждено, что ингибирование проявления белков в ПААГ серебром происходит только при контакте содержащего СО2 воздуха с раствором комплекса ионов серебра с аммиаком на стадии насыщения им гелей и отсутствует при контакте воздуха с растворами на последующих стадиях обработки гелей.
3. Опытами по восстановлению ионов серебра из комплексов с аммиаком и органическими аминами в гомогенной системе доказано, что образование наночастиц серебра ингибируется содержащимся в воздухе СО2 в то время как кислород в этом процессе не участвует.
4. Показано, что ингибирование диоксидом углерода восстановления ионов серебра из комплексов с аминами в гомогенной системе происходит на стадии инициации образования наночастиц серебра.
5. Показано, что СО2 воздуха ингибирует восстановление серебра из комплексов с аминами нервной ткани: серотонином, норадреналином, гистамином – а также установлено, что СО2 усиливает окрашивание серебром нейронов и ослабляет окрашивание капилляров в гистологических препаратах мозга крысы.
6. Обнаружен эффект усиления токсических свойств серебра диоксидом углерода в отношении бактерии Еscherichia coli.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:
1. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Простой химический метод определения диоксида углерода в воздухе. // Журнал аналитической химии. 2007. Т. 62.
№1. С. 23-31.
2. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Диоксид углерода воздуха подавляет инициируемое белками образование наночастиц серебра в полиакриламидном геле и в растворе. // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34.
№6. С. 764-772.
3. Пономарева В.Д., Пшенникова Е.С., Малыгин А.Г. Диоксид углерода усиливает цитотоксическое действие серебра на бактерии E.coli. // Вода:
химия и экология. 2008. №5. С. 26-28.
Тезисы докладов:
4. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Низкие концентрации диоксида углерода ингибируют инициируемое белками образование коллоидов металлического серебра. // III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж.Тезисы докладов. Т I. С. 250-251.
5. V.D. Ponomareva and A.G. Malygin. Method of Carbon Dioxide Determination in Air Applicable in Investigations of Photosynthesis. // International Meeting «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of Photosystems». August 20-26 2006. Pushchino. Institute of Basic Biological Problems. Р. 224.
6. Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Общедоступный метод определения концентрации диоксида углерода в воздухе экосистем. // IV Международная научная конференция «Биотехнология – охране окружающей среды». 18- ноября 2006 г. Москва. МГУ. Тезисы докладов. Т. 39. С. 245.
7. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Простой химический метод определения абсолютного содержания диоксида углерода в атмосфере. // III Международная конференция «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии». 4-8 июня 2007 г. Московская обл., г. Пущино. ИФХ и БПП РАН. Тезисы докладов. С. 51.
8. Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования коллоидов металлического серебра, инициируемого белками. // III Российский симпозиум «Белки и пептиды». 16-21 сентября 2007 г. Московская обл., г. Пущино. ИБХ РАН. Тезисы докладов. С. 53.
9. Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Химический метод прямого определения низких концентраций диоксида углерода в воздухе. // VIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. 23-28 сентября 2007 г. Москва. Тезисы докладов. Т. 4. С. 199.
10. Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Проявление серебром белков, полученных методом электрофореза в полиакриламидных гелях, ингибируется диоксидом углерода воздуха. // X Молодежная конференция по органической химии. 26-30 ноября 2007 г. Уфа. Тезисы докладов. С. 243.
11. Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Диоксид углерода воздуха как перспективный регулятор реакции образования наночастиц серебра в растворе и в полиакриламидном геле. // XX Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии». 11-15 февраля 2008 г. Москва.
ИБХ. Тезисы докладов. С. 101.
12. Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Диоксид углерода воздуха, как перспективный регулятор обеззараживания воды наночастицами серебра. // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 11-13 марта 2008 г. Москва. Тезисы докладов. С. 357.
13. Филиппович С.Ю., Пшенникова Е.С., Бачурина Г.П., Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Чувствительность гриба и бактерии к токсическому действию серебра при различных концентрациях диоксида углерода. // Тезисы в журнале «Иммунопатология, аллергология, инфектология». 2010. №1. С. 231 232.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-00864).
Работа отмечена:
Дипломом на XX Зимней международной молодежной научной школе направления физико-химической биологии и «Перспективные биотехнологии». 11-15 февраля 2008 г. Москва.
Медалью и дипломом на Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 11-13 марта 2008 г. Москва.