Экофизиологические и молекулярно-генетические свойства микроскопических грибов представителей группы aspergillus versicolor, выделенных из разных местообитаний
На правах рукописи
Фомичева Галина Михайловна ЭКОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГРУППЫ ASPERGILLUS VERSICOLOR, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ МЕСТООБИТАНИЙ Специальность 03.00.07 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2007
Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Научный консультант: доктор биологических наук О.Е. Марфенина
Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.И. Cидорова кандидат биологических наук Г.А. Кочкина Ведущее учреждение: Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН
Защита диссертации состоится 16 октября 2007 года в 15 часов 30 минут в аудитории 199 на заседании Диссертационного совета К 501.001.05 при МГУ им. М.В. Ломоносова;
119992, Россия, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, Ученый совет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведе ния МГУ Автореферат разослан « 14 » сентября 2007г.
Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах просим направлять по адресу: 119992, Россия, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультета почвоведения. Ученый совет.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук профессор Г.М. Зенова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Микроскопические грибы рода Aspergillus Mich. широко распространены в наземных экосистемах, но преимущественно являются типичными обитате лями южных почв (Domsch et al., 1993). В результате антропогенных измене ний в современной биосфере грибы рода Aspergillus приобретают более широ кое распространение в почвах северных и умеренных широт, в первую очередь, в городских экосистемах, рекреационных территориях, агроценозах (Марфенина, 2005). В последние десятилетия установлено, что многим видам рода Aspergillus принадлежит важная роль в заболеваниях человека, т.к. они могут быть аллергенами, возбудителями микозов, а также способны образовы вать микотоксины. Представители рода Aspergillus не являются облигатными патогенами человека и животных, а проявляют свойства оппортунистов, т.е.
могут развиваться во внешней среде как сапротрофы, но одновременно облада ют способностью вызывать вторичные микозы.
Для прогноза развития и предотвращения негативных эффектов от распро странения грибов рода Aspergillus в окружающей среде важно знать особенно сти их роста и репродукции в разных экологических условиях. Однако специ фика прохождения их жизненных циклов в разных средах обитания, в первую очередь в почвах, условия спорообразования, исследованы явно недостаточно и для небольшого числа видов (Иванушкина, 1984;
Попова, 1990). Безуслов ный интерес представляют и сведения о варьировании различных свойств (экологических, физиологических, молекулярно-генетических) штаммов видов микроскопических грибов, выделенных из различных местообитаний, в том числе из клинического материала.
Среди практически неисследованных с этих позиций широко распростра ненные в окружающей среде и известные как опасные для здоровья человека виды группы Aspergillus versicolor (Raper, Fennell, 1965), относимые по совре менной классификации (Samson, 1993) к роду Aspergillus, подроду Nidulantes, секции Versicolores - A. versicolor (Vuill.) Tiraboschi и A. sydowii (Bainier & Sar tory) Thom & Church.
Цель работы Изучение и сравнительный анализ экофизиологических и молекулярно генетических свойств микроскопических грибов представителей группы Asper gillus versicolor, выделенных из разных местообитаний.
Задачи исследования 1. Определение влияния температуры на рост и спорообразование штам мов видов A. versicolor, A. sydowii, выделенных из разных природных место обитаний и клинического материала.
2. Выяснение влияния влажности среды на рост и спорообразование штаммов видов A. versicolor, A. sydowii.
4. Определение молекулярно-генетических свойств и их отличий у штам мов видов A. versicolor, A. sydowii, выделенных из разных природных место обитаний и клинического материала.
Научная новизна Описаны экологические условия роста и спороношения двух широко рас пространенных и экотоксикологически значимых микромицетов A. versicolor, A. sydowii. Впервые показаны отличия этих двух близких видов по экологиче ским свойствам - температурным оптимумам и интервалам роста, выявлено, что вид A. sydowii является более термотолерантным. Впервые, на примере A.
sydowii установлены отличия сапротрофных и клинических штаммов грибов рода Aspergillus по экофизиологическим свойствам. Исследованные клиниче ские штаммы были способны активно расти в более широком интервале темпе ратур при пониженной влажности по сравнению с сапротрофными.
Получены данные о молекулярно-генетических свойствах (последовательности участков ITS1-5.8S-ITS2, D1/D2 28S рДНК) штаммов ви дов A. versicolor и A. sydowii, выделенных из разных местообитаний. Выявлен уровень внутривидовой и межвидовой молекулярно-генетической гетерогенно сти исследованных видов.
Практическая значимость Получены новые экологические и молекулярно-генетические данные, важ ные для идентификации видов A. versicolor и A. sydowii.
Международные базы генетических данных GenBank/EMBL/DDJB попол нены полученными последовательностями локусов рДНК для исследованных микроскопических грибов. Для вида A. versicolor полученные данные состави ли 40% всех имеющихся в международных банках генетических данных (GenBank) последовательностей для участков ITS1-5.8S-ITS2 этого вида и 50% на участке D1/D2 28S рДНК;
для A. sydowii 30% и 40% соответственно.
Показано, что вид A. sydowii обладает большим патогенным потенциалом (способность роста при 37С), чем A. versicolor, что необходимо учитывать при оценке присутствия опасных микроскопических грибов в окружающей среде.
Результаты работы используются в курсе лекции «Почвенная микология».
Публикации По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них в реферируе мых журналах – 2.
Апробация работы Материалы диссертации изложены на V, VII, VIII, IX Научно практических конференциях по медицинской микологии (Санкт-Петербург, 2002, 2004, 2005, 2006);
XIV Конгрессе европейских микологов (Украина, Ял та, 2003);
Юбилейной конференции посвященной 85-летию кафедры миколо гии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2004);
II, III, IV, V Все российских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007).
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемых лите ратурных источников, приложения. Работа изложена на 147 страницах текста, иллюстрирована 31 рисунком, включает 9 таблиц. Список литературы состоит из 232 источников, в том числе 197 на иностранных языках.
Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. О.Е. Марфениной за неоценимую помощь и поддержку на всех этапах работы, в.н.с. ГНЦ РАМН к.б.н. О.В. Василенко, который принимал участие в руководстве при выполнении молекулярно-генетических анализов, за получен ные знания, практические навыки и ценные научные консультации в этой об ласти, к.б.н. А.Е. Ивановой, д.б.н. И.И. Судницыну, д.б.н. И.Ю. Чернову, к.б.н.
А.М. Юркову, к.б.н. М.В. Горленко, а так же всему коллективу кафедры биоло гии почв МГУ за поддержку и ценные советы.
Автор выражает благодарность н.с. кафедры микологии и альгологии МГУ к.б.н. А.В. Александровой, с.н.с. ВКМ РАН к.б.н. Н.Е. Иванушкиной, с.н.с.
МНПЦБТ к.б.н. А.Б. Кулько, сотруднику РКПГ к.б.н Т.С. Богомоловой за пре доставление штаммов, использованных в работе.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования В работе были использованы 11 штаммов вида A. versicolor и 8 штаммов A. sydowii. Большинство сапротрофных штаммов были выделены нами из раз личных типов почв, другие, сапротрофные и клинические, были получены из российских и зарубежных коллекций (табл. 1). Культуральные и морфологиче ские свойства исследованных штаммов были описаны в соответствии со стан дартными рекомендациями (Raper, Fennel 1965;
Klich, Pitt, 1992;
).
В качестве показателя интенсивности роста штаммов определялась ради альная скорость роста колонии: Кr=r/t (мм/сут). Диаметр колонии измерялся в двух перпендикулярных направлениях в течение 10 суток.
Для изучения спорообразования у исследованных штаммов в разных усло виях культивирования производили посев 1 мл споровой суспензии (концентрация спор 1*106 спор/мл) на твердую среду Чапека в плоскодонные Табл. 1.
Штаммы A. versicolor и A. sydowii, использованные в работе.
В номерах штаммов, полученных из коллекций префиксы означают название коллекции: ВКМ—Всероссийская коллекция микроорганизмов, Москва;
РКПГ— Российская коллекция патогенных грибов НИИ медицинской микологии ГОУ ДПО СПбМАПО, Санкт-Петербург;
NRRL—National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service Culture Collection, USDA Peoria, Illinois, USA.
Рабо- Коды дос Номер штам- Географическое положе чий тупа в Вид Выделен из:
ма ние номер GenBank 20.1 Е43 Выщелоченный чернозем Воронежская область AJ Городская почва E60 Е60 AJ (урбанозем) г. Ростов-на-Дону Погребенная почва древне E61 Е61 AJ го города, 2,2 тыс. лет A. versicolor Многолетнемерзлые грун- Колымская низменность, ВКМ FW-681 Е75 AJ ты, возраст - 100 тыс. лет устье р. Чукочья A1 Е76 AJ о. Шемья, Алеутские о-ва, AJ A2 Е77 Торф, возраст - 7 тыс. лет США A3 Е78 AJ Бурая полупустынная со E79 Е79 Астраханская область AM лонцеватая почва Аллювиально-дерновая поч- AM Смоленская область, ар Е80 Е ва, погребенный палеогуму хеологический комплекс совый горизонт, возраст Гнездово E99 E99 1,2 тыс. лет NRRL 238 AF E87 Нет данных Нет данных AF (Type strain) Москва, Гематологиче Клинический изолят, легкие ский Научный Центр FC014 С14 AJ человека РАМН ВКМ F-441 E84 Дерново-подзолистая почва Московская область AM A. sydowii ВКМ F-968 E85 Вода Черное море AM ВКМ F-2488 E86 Лед Антарктика AM NRRL 254 Вейкросс, Джорджия, С93 Клинический изолят AM (Type strain) США AM Московский гоpодской AM FC095 С95 Клинический изолят, БАЛ научно-практический FC096 С96 Клинический изолят, БАЛ центр борьбы с туберку- AM Клинический изолят, слухо РКПГ 1241/797 С100 Санкт-Петербург AM вой канал колбы. После 14 суток инкубации споры смывали 50 мл воды с 0.05% Tween и подсчитывали их количество в камере Горяева.
Скорости роста колоний исследовали при различных значениях темпера туры: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 420C;
и влажности: 0,99, 0,95, 0,90, 0,85, 0,80 aw (что соответствует давлению влаги -1,4, -7,0, -14,4, -22,3, -30,6 МПа).
Интенсивность спороношения исследовали при тех же значениях влажности при температурах 15, 20, 25, 300C. Для создания заданных условии активности воды использовали среду Чапека с добавлением глицерина (Pitt, Hocking, 1977).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов Microsoft Excel 2002 (Microsoft Office XP) and Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., 1984 2001), в качестве алгоритма кластеризации использовали метод попарного вы числения расстояния арифметическим средним (UPGMA).
Для характеристики молекулярно-генетических свойств исследованных штаммов анализировали локусы ITS1, ITS2, и 5.8S, а так же D1/D2 регионы 28S рибосомальной ДНК, которые являются основными объектами молекуляр но-филогенетического анализа на видовом уровне. ПЦР проводили с прайме рами ITS1F (Gardes, Bruns, 1993) NL4 (O’Donnell, 1993). Секвенирование осу ществляли с праймерами ITS3, ITS4 (White et al., 1990), ITS1F, NL4.
Выделение ДНК, ПЦР и секвенирование производили согласно описанной стандартной процедуре (Фомичева и др., 2006). Анализ полученных последо вательностей и сборку общих контигов проводили с использованием програм мы Chromas 2.3. Кладистический анализ проводили методом ближайших сосе дей (neighbor-joining), доверительные значения для узлов вычисляли бутстрап пинг-анализом с количеством повторов 1000 при помощи программы ClustalX 1.83. Для визуализации кладограмм использовали программу TreeView 1.6.6. В качестве внешней группы при построении кладограмм использовали последо вательность локусов рДНК Emericella nidulans (штамм FE064 (Е64), код досту па в GenBank AJ937756.1). Поиск и ранжирование гомологичных нуклеотид ных последовательностей в международных базах данных (GenBank/EMBL/ DDJB, 2006) проводили в программе BLAST (NCBI, 2007).
Работа с клиническим штаммами и молекулярно-генетический анализ проводились на базе Гематологического Научного Центра РАМН.
Результаты и обсуждение Исследования штаммов вида Aspergillus versicolor Культурально-морфологические признаки (окраска колоний, наличие растворимых пигментов, характер поверхности;
размер и форма конидиеносца, апикального расширения, стеригм, конидий) исследованных штаммов A. versi color соответствовали характерным для данного вида и варьировали в описан ных пределах (Билай, Коваль, 1998;
Raper, Fennel 1965;
Klich, Pitt, 1992).
Экологические условия роста. При определении радиальной скорости роста штаммов A. versicolor при различных сочетаниях температуры и влаж ности было установлено, что все исследованные штаммы, выделенные из раз ных местообитаний, имеют температурный оптимум роста 25-27С (рис. 1 А, Б). Температурные оптимумы роста у штаммов, выделенных из разных гео графических регионов не отличались. Минимальная температура, при кото рой был возможен рост 5С, что наблюдалось только для одного штамма (штамм E78 из торфа Алеутских островов), при 10С отмечалось развитие всех исследованных штаммов. Верхний температурный предел роста A. versi color составил 39С, однако уже около трети исследованных штаммов не раз вивалось при 37С.
В целом все исследованные штаммы показали сходные реакции на изме нение температуры культивирования, однако можно отметить некоторые осо бенности отдельных штаммов по отношению к температурному фактору. Наи более устойчивыми к повышению температуры были штаммы Е87, Е99 — они были способны к росту при 39С и сравнительно активно развивались при 37С. Для штамма Е87 (типовой штамм A. versicolor) было характерно не которое смещение кривых роста в сторону повышенных температур, хотя оп тимум его роста так же отмечался при 25C. Наиболее чувствительными к не благоприятным температурам были штаммы из черноземных почв (Е43, Е60, Активность воды (aw) Температура, С Kr, мм/сут.:
Рис. 1. А. Радиальные скорости роста исследованных штаммов A. versicolor при разных температурах культивирования и активностях воды в среде.
Е61), при 10C и 35C их рост существенно замедлялся, а при 7C и 37C раз витие колоний не наблюдалось.
По отношению к влажности среды исследованные штаммы можно разде лить на 2 группы. I группа: штаммы Е43, Е60, Е61, Е79, выделенные из южных почв с засушливым режимами увлажнения, штамм Е75 из многолетнемерзлых Активность воды (aw) Температура, 0С Kr, мм/сут.:
Температура, 0С Рис. 1. Б. Радиальные скорости роста исследованных штаммов A. versicolor при разных температурах культивирования и активностях воды в среде.
грунтов и штамм Е80 из палеогумусового горизонта аллювиально-дерновой почвы — имели довольно четко выраженные оптимумы роста при активности воды 0,95 (рис. 1, А).
II группа (рис. 1, Б) - штаммы, выделенные из более влажных местообита ний: из глубоких слоев многолетнего торфа Алеутских островов (Е76, Е77, Е78), штамм Е99 из палеогумусового горизонта часто переувлажняемой пой менной почвы, и типовой штамм E имели максимальные скорости роста при более высокой влажности 0,97-0, aw. Однако при неблагоприятных темпе ратурных условиях (10-15С, 35-37С) оптимум влажности для штаммов II группы, как и для группы I, составлял 0,95 aw.
Разделение штаммов A. versicolor на две выраженные группы по отношению к активности воды подтверждается ре Рис. 2. Кластерный анализ штаммов зультатами кластерного анализа (рис.
A. versicolor, основанный на сравнении радиальных скоростей 2).
роста при различных сочетаниях температуры и активности воды. I – Минимальная влажность, при кото штаммы с оптимумом влажности 0,95;
рой был возможен рост исследованных II – штаммы с оптимумом влажности 0,97-0,99. штаммов A. versicolor - 0,83-0,85 aw.
При активности воды 0,80 прорастание спор и развитие колоний не наблюда лось.
Штаммы из разных местообитаний отличались по скоростям роста. II группа штаммов из влажных местообитаний, по сравнению с группой I имела более высокие скорости роста при оптимальных условиях температуры и влажности. Таким образом, ростовые характеристики штаммов A. versicolor, выделенных из разных почв и грунтов, в основном, соответствовали экологи ческим условиям местообитаний.
Спорообразование. Так как распространение микроскопических грибов в окружающей среде происходит преимущественно в виде спор (Gorny et al., 2001), для оценки возможности создания пула спор в определенных местооби таниях и/или распространения микромицетов, важно знать экологические ус ловия, способствующие их спороношению. Оптимальные условия спороноше ния также важно знать и с точки зрения здоровья человека, так как чем выше A 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 aw кол-во образованных спор на одну посеянную B Репродуктивный потенциал, 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 aw C 15 20 25 Т, 0С E43 E60 E61 E E76 E77 E79 E Рис. 3. Репродуктивный потенциал штаммов A. versicolor. A - 200С;
B - 250С;
C – 0.99 aw.
уровень накопления спор в окружающей среде, тем выше вероятность их попа дания в организм человека.
Для исследованных штаммов A. versicolor было показано, что оптималь ным для спороношения этого вида является температура 20-25С. (рис. 3).
Максимальные уровни репродуктивного потенциала при этих температурах для разных штаммов составляют от 60 до 370 вновь образованных спор на од ну материнскую. Наименьшие уровни спороношения отмечались у штаммов Е75 и Е43, наибольшие у штаммов E99, Е76, Е79. Четкой связи между местом изоляции штаммов и интенсивностью спороношения не прослеживалось.
При повышении температуры до 30С или понижении до 15С репродук тивный потенциал штаммов A. versicolor резко снижался, что было особенно выражено для штаммов с наибольшим спорообразованием.
Оптимальная для образования спор влажность была 0,99 aw, несколько меньшие уровни спороношения наблюдались при aw 0,90. В то время как при влажности, оптимальной для роста мицелия части штаммов (0,95 aw) их репро дуктивный потенциал был существенно ниже, чем при 0,9 и 0,99 aw.
Таким образом наиболее активный рост и максимальное спорообразова ние штаммов A. versicolor отмечались при разных уровнях активности воды в среде. Температурный оптимум спорообразования (20-25С ) также отличался от температурного оптимума роста (25-27С).
Молекулярно-генетические свойства. Для исследования различий штаммов на генетическом уровне были проанализированы последовательности участков ITS1, 5.8S, ITS2 и регионы D1/D2 28S рДНК. Для сравнительного анализа также использованы последовательности типового штамма Е87, пред ставленные в международном банке генетических данных (AF453926, AF454143 для участков ITS и AF454194 региона D1/D2 28S).
На исследованных участках выявленные нами различия между штаммами A. versicolor наблюдались исключительно на локусах ITS1, ITS2, последова тельности же более консервативного 5’-конца гена 28S-субъединицы рибосом были идентичны.
Последовательности локусов ITS1-5.8S-ITS2 рДНК штаммов из южных почв Европейской части России (чернозема – Е43, древне го урбанозема – Е61 и современ ного урбанозема – Е60) полно стью идентичны между собой (рис. 4). Также сходны последова тельности участков ITS штаммов Активность воды из древнего торфа Алеутских ост ровов (Е76, Е77, Е78) и штамма из погребенной почвы (Е99). Всего на 1 нуклеотид от этих штаммов Рис. 4. Кладограмма, построенная на отличается другой штамм из по основе последовательностей ITS1-5.8S ITS2 рДНК штаммов A. versicolor. Шкала гребенной почвы (E80). В целом соответствует 10 нуклеотидным заменам на эта группа штаммов (рис. 4) отли 1000 нуклеотидных позиций чается от I группы на 2 нуклеоти да на локусах ITS1-5.8S-ITS2 (сходство составляет 99,6%).
Последовательности участков ITS1-5.8S-ITS2 штамма из многолетнемерз лых грунтов (Е75) и типового штамма (E87) также полностью совпадают (группа III). Штамм из засоленной почвы (Е79) отличается от этих двух штам мов всего на 1 нуклеотид. Сходство этой клады с группой I cоставляет 98.4%, а с группой II - 97.9%.
Таким образом, по участкам ITS рДНК для исследованных штаммов A.
versicolor, были выделены сходные клады, что и по экологическим признакам – первая включает штаммы из южных почв, вторая – из погребенного торфа и из палеогумусового горизонта аллювиально-дерновой почвы.
Сравнительный анализ полученных последовательностей участков ITS изученных штаммов A. versicolor с последовательностями участков ITS этого вида, представленными в GenBank (рис. 5) показал, что часть полученных на ми последовательностей под держивает клады, образован ные последовательностями из банка генетических данных.
Последовательности участков ITS штаммов из погребенных почв и торфа образует новую самостоятельную кладу. По следовательности регионов D1/D2 28S штаммов A. versi color, представленные в Gen Bank идентичны между собой и совпадают с последователь ностями этих участков изу ченных нами штаммов.
Интересно отметить, что Рис. 5. Кладограмма, построенная на основе идентичные последователь последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 рДНК ности участков ITS принадле штаммов A. versicolor. Для последовательностей из GenBank представлены жат штаммам из географиче коды доступа. Шкала соответствует нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных ски отдаленных регионов.
позиций.
Так сходны по данным моле кулярно-генетического анализа штаммы A. versicolor из современных почв Ев ропейской территории России (Е43, Е60, Е61), Литвы (DQ093658), Испании (DQ865103), из воздуха помещения в Ирландии ( DQ426532).
С другой стороны прослеживается сходство генетических свойств штам мов выделенных из местообитаний со сходными экологическими условиями.
Гомогенную кладу по участкам ITS составляют штаммы из местообитаний c повышенным содержанием солей: из засоленной почвы Астраханской области (Е79) и штаммы из осадочных отложений различных частей Тихого океана (AM158229, AM158227, AM158226). Близок к ним галотолерантный штамм из солнечных солеварен Пуэрто-Рико ( DQ335982), а также штамм E75 из много летнемерзлых морских отложений.
В отдельную группу входят штаммы из погребенных почв и торфов:
штаммы из торфа Алеутских островов и погребенной почвы Смоленской об ласти (Е76, Е77, Е78, Е80, Е99).
Таким образом, штаммы, выделенные из определенного типа местообита ний (различных современных почв, погребенных почв возрастом несколько ты сяч лет, засоленных субстратов), были генетически сходны между собой.
Исследования штаммов вида Aspergillus sydowii При исследовании второго вида из группы A. versicolor - A. sydowii было установлено, что при высоком сходстве культурально-морфологических при знаков, он отличается от вида A. versicolor по своим экологическим характери стикам. Культуральные признаки этих видов — окраска колоний, растворимых пигментов, характер поверхности — очень близки, и указываемые в определи телях различия заключаются лишь, как правило, в наличии серо-синих оттен ков в окраске колоний A. sydowii и отсутствии таковых у A. versicolor (Raper, Fennel 1965;
Klich, Pitt, 1992). Морфологические характеристики также сходны — близки формы и характер поверхностей конидий и конидиогенных струк тур, а их размеры конидиогенных структур в перекрывающихся интервалах.
Культурально-морфологические признаки исследованных нами штам мов A. sydowii варьировали в пределах, описанных для данного вида (Билай, Коваль, 1998;
Raper, Fennel 1965;
Klich, Pitt, 1992;
de Hoog et. al., 2000).
Экологические условия роста. Температурный интервал, при котором был возможен рост исследованных штаммов A. sydowii, составлял 7С – 41С.
Максимальные скорости роста штаммов достигались при 27-30С (рис. 6). В отличие от штаммов A. versicolor все исследованные штаммы A. sydowii росли при 37С. Рост при 40С наблюдался для 3 штаммов из 8 исследованных.
Минимальный уровень влажности, при котором было возможно развитие колоний A. sydowii составлял 0,83-0,85 aw. Максимальные скорости роста штаммов отмечались при 0,97-0,99 aw.
Активность воды (aw) Температура, 0С Kr, мм/сут.:
Рис. 6. Радиальная скорость роста штаммов A. sydowii в исследованных интервалах температуры и активности воды. Е84, Е86, Е86—сапротрофные штаммы;
С14, С95, С96, С100, С93—клинические штаммы.
Сопоставление экологических свойств сапротрофных и клиниче ских штаммов. Одной из актуальных проблем современной микологии яв ляется определение отличий свойств сапротрофных и клинических штам мов одних и тех же видов грибов. На ми впервые был установлен ряд раз личий экофизиологических свойств сапротрофных и клинических штам мов грибов рода Aspergillus на приме Рис. 7. Кластерный анализ штаммов A. ре вида A. sydowii. У клинических sydowii, основанный на сравнении штаммов, имевших обычно меньшие радиальных скоростей роста при различных сочетаниях температуры и скорости роста (рис. 6), проявилась активности воды. I – группа способность лучше развиваться в бо сапротрофных штаммов лее неблагоприятных условиях (при пониженной влажности), по сравнению с сапротрофными. Для сапротрофных штаммов при понижении уровня активности воды до 0,90-0,85 aw интервал температур, благоприятных для роста, был более узким (30±2С), в то время как клинические штаммы при такой влажности сохраняли способность к ак тивному росту в широком интервале температур (25-35C).
Кластерный анализ на основе Kr для исследованных штаммов A. sydowii в разных условиях температуры и влажности также выделяет сапротрофные штаммы в отдельную кладу (рис. 7).
Спорообразование. Для исследованных штаммов A. sydowii не было от мечено общих оптимальных условий влажности и температуры для наиболь шего спороношения. Высокий репродуктивный потенциал отмечался у разных штаммов в интервале 20-30C и активности воды 0,85-0,99 aw.
При сравнении спорообразования у исследованных клинических и сапро трофных штаммов A. sydowii, для клинических штаммов (С14, С95, С96, С93) кол-во образованных спор/1 посеянную Репродуктивный потенциал, 0,80 0,85 0,90 0,95 1, С14 C93 C95 C96 aw Ряд Ряд 2 E84 E85 E Рис. 8. Репродуктивный потенциал штаммов A. sydowii при температуре 25 0С. Ряд 1 – клинически е штаммы, ряд 2 – сапротрофные штаммы.
был выявлен более высокий уровень репродукции при прочих равных услови ях (рис. 8). Подобное явление представляется важным при оценке возможно сти накопления и распространения в окружающей среде грибов потенциально опасных для человека.
Молекулярно-генетические свойства. Для исследования молекулярно генетических свойств нами были секвенированы последовательности участков ITS и D1/D1 28S рДНК изучаемых штаммов A. sydowii.
Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей участков ITS1 5.8S-ITS2 показало, что последовательности этих генов у штаммов Е85, Е86, С96 идентичны между собой. Так же полностью совпадают между собой по следовательности этих участков у штаммов С14, Е84, С95, С93, С100 и отлича ются на 3 нуклеотида от последовательностей первой группы.
В результате сравнения прочитанных нами ITS штаммов A. sydowii с по следовательностями, представленными для этого вида в GenBank построена кладограмма (рис. 9), на которой видно, что штаммы A. sydowii разделяются на две основные гомогенные клады. Последовательности исследованных нами штаммов Е85, Е86, С96 полностью совпадают с большинством последователь ностей, представленных в GenBank для этого вида (12 из 16;
дублированные последовательности для одного и того же штамма не рассматривались, так же исключены явно ошибочные последовательности). Таким образом, эти штам мы образуют центральную по количеству объектов кладу—группа I (рис. 9).
Нуклеотидные последовательности участков ITS штаммов С14, Е84, С95, С93, С100 идентичны между собой и совпадают с последовательностью из GenBank (AY373869) - группа II (рис. 9). Таким образом полученные нами дан ные подтверждают существование этой клады, которая отличается на 4 нуклео тида от группы I. В междуна родном банке генетических данных также представлено не сколько последовательностей участков ITS A. sydowii, кото рые не попадают в эти две кла ды и пока представляют само стоятельные монообъектные клады.
При этом важно отметить, что ни клинические, ни сапро трофные штаммы, отличаю щиеся по своим экофизиологи ческим свойствам, не составля ют единой клады, а образуют смешанные группы по изучен ным молекулярно-генети ческим признакам.
Рис. 9. Кладограмма, построенная на основе Сопоставление последова последовательностей ITS1-5.8S-ITS2 рДНК штаммов A. sydowii. Для последовательностей тельностей участка D1/D2 гена из GenBank представлены коды доступа.
28S-субъединицы рибосом так Шкала соответствует 10 нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных позиций.
же показало наличие двух групп штаммов. По этим участкам исследованные нами штаммы разделяются на те же клады, что и по участкам ITS. Отличие между кладами составил нуклеотид, что на данном участке расценивается как весьма значительное (Hinrikson et al.,2005). Таким образом A. sydowii можно рассматривать как гене тически гетерогенный вид.
Сравнение свойств видов A. versicolor и A. sydowii В результате исследования и сопоставления свойств штаммов A. versicolor и A. sydowii установлено, что эти два близких и морфологически трудно отли чимых вида различаются по экологическим свойствам. Температурный опти мум роста штаммов A. versicolor составляет 25-27С, в то время как для A. sy dowii он составляет 37-30С.
Способность к росту при температуре человеческого тела (37С) иногда рассматривают как «патогенный потенциал» (Teixeira et al., 2005), т.е. необхо димое условие для развития штамма как патогена теплокровных животных и человека. Для штаммов вида A. sydowii нами показана способность к активно му росту при 37С, в то время как штаммы A. versicolor при этой температуре 1. A.sydowii A.versicolor 1. Kr, мм/сут 0. 0. 0.8 0.85 0.9 0.95 1a w Рис. 10. Радиальные скорости роста при 37С видов A.
versicolor (n=11) и A. sydowii (n=8), среднее для исследованных штаммов Рис. 11. Кластерный анализ штаммов A. versicolor и A. sydowii, основанный на сравнении радиальных скоростей роста при различных сочетаниях температуры и активности воды.
растут плохо или не развиваются вообще (рис. 10). Таким образом, можно предположить, что вид A. sydowii может обладать большим патогенным потен циалом чем A. versicolor. Следует отметить, что все проанализированные нами клинические штаммы, выделенные в России (табл.1), по молекулярно генетическим свойствам были идентифицированы как A. sydowii.
В целом эти виды занимают несколько отличающиеся экологические ни ши по отношению к температуре и влажности, что подтверждает кладограмма (рис. 11), на которой четко прослеживается разделение штаммов по радиаль ным скоростям роста на две группы, соответствующие отдельным видам.
Уровни спорообразования исследованных видов A. versicolor и A. sydowii в условиях эксперимента были сопоставимы.
Получены новые данные о молекулярно-генетических различиях видов A.
versicolor и A. sydowii. По регионам D1/D2 28S рДНК эти виды различаются на Рис. 12. Кладограмма, построенная на основе последовательностей D1/D2 28S рДНК штаммов A. versicolor и A. sydowii. Для последовательностей из GenBank представлены коды доступа. Шкала соответствует 10 нуклеотидным заменам на 1000 нуклеотидных позиций.
4-5 нуклеотидов, сходство составляет 99,0-99,2% (рис. 12). Штаммы вида A.
versicolor по этим участкам образуют гомогенную группу, в то время как штам мы A. sydowii распадаются на две клады. По регионам ITS1-5.8S-ITS2 сходство двух исследованных видов составляет 97,7%-98,6%.
Таким образом виды A. versicolor и A. sydowii отчетливо различаются по экофизиологическим и молекулярно-генетическим свойствам.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что близкие по культурально-морфологическим свойствам виды A. versicolor и A. sydowii отличаются по экофизиологическим свойствам.
Штаммы A. sydowii имеют наибольшие скорости роста при более высокой температуре (30С), чем A. versicolor (25С) и способны к активному росту при 37С, т.е. обладают большим патогенным потенциалом.
2. У исследованных штаммов A. versicolor и A. sydowii не установлено темпе ратурной адаптации к условиям местообитания. Для штаммов одного вида выделенных в разных климатических зонах (арктическая — степная зона для A. versicolor;
Антарктика — субтропики, организм человека для A. sy dowii) показан один температурный оптимум роста.
3. В изученном интервале активности воды (0,80-0,99aw) показатели роста са протрофных штаммов A. versicolor коррелировали с условиями влажности местообитания штаммов. Штаммы, выделенные из более влажных место обитаний имели оптимумы роста при более высокой влажности по сравне нию со штаммами из южных и засушливых почв.
4. По молекулярно-генетическим свойствам (участки ITS рДНК) штаммы A.
versicolor, выделенные из определенного типа местообитаний (разнообразных современных почв, погребенных почв возрастом несколь ко тысяч лет, засоленных местообитаний) были сходны между собой.
5. Установлены отличия сапротрофных и клинических штаммов A. sydowii, которые выражались в более низких скоростях роста у клинических штам мов при исследованной температуре и влажности, но более высоких уров нях спорообразования, чем у сапротрофных штаммов. При этом по моле кулярно-генетическим свойствам (ITS, D1/D2 28S рДНК) сапротрофные и клинические штаммы образуют смешанные группы.
6. Подтверждено, что по молекулярно-генетическим свойствам (последовательностям участков D1/D2 28S рДНК) вид A. versicolor пред ставляет гомогенную группу, в то время как вид A. sydowii - гетерогенен.
Исследованные штаммы A. sydowii по данному участку разделяются на две клады.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Marfenina O.E., Ivanova A.E., Kislova E.E., Fomicheva G.M. What do we know about fungi of ancient cultural layers? / XIV CEM Abstracts. XIV Con gress of European Mycologists. Katsiveli, Yalta, Crimea, Ukraine. 22-27 Sep tember. 2003. P. 49-50.
2. Marfenina O.E., Ivanova A.E., Gorbatovskaja E.V., Fomicheva G.M. Prospects for mycological indication of ancient culture layers // Botanica Lithuanica.
2003. Vol. 9. N. 2. P. 121-126.
3. Фомичева Г.М. Сравнительные молекулярно-морфологические исследова ния штаммов вида Aspergillus versicolor / Микология и альгология – 2004.
Материалы юбилейной конференции посвященной 85-летию кафедры ми кологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова. – М: «Прометей» МПГУ, 2004. С. 141-142.
4. Василенко О.В., Фомичева Г.М., Марфенина О.Е. Сравнительные молеку лярно-морфологические исследования штаммов вида Aspergillus versi color / Успехи медицинской микологии. Т.3. Материалы второго Всерос сийского конгресса по медицинской микологии. М: Национальная Акаде мия Микологии, 2004. С. 11-12.
5. Марфенина О.Е., Василенко О.В., Фомичева Г.М. Сравнение эколого трофических свойств патогенного и сапротрофных штаммов Aspergillus versicolor // Проблемы медицинской микологии. 2004. Т. 6. №2. С. 98.
6. Марфенина О.Е., Фомичева Г.М., Кулько А.Б. Экологические условия раз вития потенциально патогенных мицелиальных грибов / Успехи медицин ской микологии. Т.5. Материалы третьего Всероссийского конгресса по медицинской микологии. М. Национальная Академия Микологии. 2005. С.
74-77.
7. Марфенина О.Е., Фомичева Г.М. Эволюция терморегуляции у животных и патогенные свойства грибов // Проблемы медицинской микологии. 2005. Т.
7. №2. С. 106.
8. Фомичева Г.М., Василенко О.В., Марфенина О.Е. Сравнительные морфо логические, экологические и молекулярные исследования штаммов Asper gillus versicolor (Vuill.) Tiraboschi, выделенных из разных местообитаний // Микробиология. 2006. Т. 75. №2. С. 228-234.
9. Марфенина О.Е., Наумова Е.М., Фомичева Г.М. Рост клинического и са протрофного штаммов Aspergillus sydowii при различных температурных режимах // Проблемы медицинской микологии. 2006. Т. 8. №2. С. 64-65.
10. Василенко О.В., Фомичева Г.М., Кулько А.Б., Кузьмин Д.Е., Марфенина О.Е. Проблемы использования высоковариабельных локусов ITS для иден тификации и генотипирования патогенных грибов на примере аспергил лов, близких к A. versicolor / Успехи медицинской микологии. Т.8. Мате риалы четвертого Всероссийского конгресса по медицинской микологии.
М. Национальная Академия Микологии. М. Национальная Академия Ми кологии, 2006. С. 106-107.
11. Марфенина О.Е., Фомичева Г.М. Потенциально патогенные грибы в среде обитания человека (анализ современных данных) // Успехи медицинской микологии. Т.9. Материалы пятого Всероссийского конгресса по медицин ской микологии. М. Национальная Академия Микологии. М. Националь ная Академия Микологии, 2007. С. 57-59.
12. Марфенина О.Е., Наумова Е.М., Фомичева Г.М. Динамика популяций кли нического и сапротрофного штаммов Aspergillus sydowii в почвах // Проблемы медицинской микологии. 2007. Т. 9. №2. C. 78.