Противоопухолевые липосомы с диглицеридными конъюгатами метотрексата и мелфалана: изучение стабильности и взаимодействий с компонентами крови

и ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

на правах рукописи

Кузнецова Наталья Ростиславовна ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ЛИПОСОМЫ С ДИГЛИЦЕРИДНЫМИ КОНЪЮГАТАМИ МЕТОТРЕКСАТА И МЕЛФАЛАНА: ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С КОМПОНЕНТАМИ КРОВИ Специальность 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2012

Работа выполнена в лаборатории химии липидов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный консультант: доктор химических наук, Водовозова Елена Львовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Торховская Татьяна Ивановна кандидат химических наук, доцент, Барсуков Леонид Иванович

Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « 16 » мая 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу:

117997, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « 16 » апреля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Применение липосом в качестве систем доставки лекарств сегодня является признанным подходом к повышению эффективности лечения. Включение ле карств в состав липосом способствует повышению переносимости инкапсулированного препарата пациентом, а также позволяет увеличить терапевтический индекс (соотношение терапевтического эффекта и токсично сти) лекарства. Липосомальные препараты, например, инкапсулированные доксорубицин (Doxil®, DaunoXome®, Caelyx®, Myocet®), амфотерицин B (Ambisome®), винкристин (Onco-TCS®), являются первыми нанолекарствами, предназначенными для системного введения и одобренными к применению в клинике в конце 1990-х–начале 2000-х годов.

Особенно актуально применение липосомальных препаратов в онкологиче ской клинике. В основе эффекта накопления (пассивного транспорта) частиц размера 50–150 нм в опухолях лежит дефектная архитектура образующейся de novo сосудистой системы — явление повышенной проницаемости капилляров и нарушенного лимфатического дренажа (EPR, enhanced permeability and retention;

Maeda et al., J. Contr. Rel. 2000). На сегодня единственным технологичным мето дом достижения высокой емкости наноразмерных липосом в отношении водорастворимых препаратов является метод так называемой активной загрузки (remote loading) (Barenolz et Haran, U.S. Patent 1993;

Zucker et al., J. Contr. Rel.

2009) — диффузии лекарств во внутренний объем липосом против градиентов концентраций солей аммония или ацетата кальция. Однако метод реализуем только для ограниченного числа субстанций, имеющих структуру амфифиль ных слабых кислот или оснований, например, доксорубицина и других антрациклиновых антибиотиков.

В лаборатории химии липидов ИБХ РАН разрабатываются липосомальные препараты, получаемые методом включения лекарств в состав липидного би слоя липосом в виде липидных биодеградируемых производных (липофильных пролекарств). К преимуществам такого подхода, по сравнению с инкапсулиро ванием во внутренний объем, относятся возможность создания наноразмерных липосом с приемлемой емкостью загрузки для широкого круга препаратов, уменьшение потерь препарата в кровотоке и при слиянии с клеткой, упрощение самой процедуры получения липосом, а также облегчение их внутриклеточной разгрузки за счет прямого трансмембранного переноса липофильных проле карств. После интернализации клеткой липофильный остаток должен отщепляться внутриклеточными ферментами, высвобождая активный агент.

Эффективность применения противоопухолевых средств в виде липофильных пролекарств в липосомальных формах подтверждена в ряде экспериментов in vivo на моделях опухолей мышей. Так, липосомы, сформированные из природ ных фосфолипидов и сложноэфирных липофильных конъюгатов цитотоксического агента сарколизина (D,L-мелфалана) или цитостатика мето трексата, показали значительное улучшение терапевтических свойств по сравнению с исходными лекарствами при лечении лейкоза Р-388 (Козлов и др., Бюлл. Экспер. Биол. Мед. 1997), аденокарциномы молочных желез (Vodovozova et al, Eur. J. Cancer 2000), острого Т-лимфолейкоза (Водовозова и др., Росс. Био терапевт. Журн. 2008). В то же время, исследований свойств данных липосом как супрамолекулярных систем доставки лекарств, то есть изучения их структу ры, стабильности, устойчивости липофильных пролекарств при введении липосомальных препаратов в кровоток, ранее не проводилось.

По сравнению с другими наноразмерными носителями липосомы отличают ся высокой биосовместимостью. Однако появляется все больше данных об иммуногенности некоторых липосомальных препаратов (Szebeni et al, Adv. Drug Deliv. Rev. 2011). Реакции гиперчувствительности средней и тяжелой степени отмечены у части пациентов (до 45%) при внутривенном введении липосом Doxil®, Ambisome®, DaunoХome®. Такие реакции связаны с активацией липосо мами системы комплемента. В связи с этим актуальными представляются исследования взаимодействий разрабатываемых липосомальных препаратов с компонентами крови.

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы — исследование свойств липосом с липофильными пролекарствами мелфалана и метотрексата как новых систем доставки лекарств, то есть изучение физико-химических характеристик препаратов и исследование их взаимодействий с компонентами крови человека в условиях, близких к фи зиологическим.

В рамках работы предполагалось решить следующие экспериментальные за дачи: 1) синтезировать диглицеридные сложноэфирные конъюгаты метотрексата и мелфалана (липофильные пролекарства);

2) определелить харак теристики липосомальных препаратов, получаемых на основе природных фосфолипидов и липофильных пролекарств: степень включения пролекарств в липосомы заданного состава, размеры и заряд липосом, стабильность диспер сий липосом и пролекарств в составе липосом;

3) исследовать гемосовместимость препаратов липосом;

4) исследовать взаимодействия липо сом с отдельными компонентами плазмы крови человека.

Научная новизна Впервые детально исследованы физико-химические свойства новых потен циальных систем доставки лекарств — липосом, нагруженных сложноэфирны ми конъюгатами противоопухолевых препаратов метотрексата и мелфалана с rac-1,2-диолеоилглицерином (MTX-DOG и Mlph-DOG). Ранее, при разработке структур молекул пролекарств, они были сконструированы таким образом, что бы минимально нарушать упаковку липидного бислоя. В данной работе впер вые показано, что пролекарства действительно эффективно встраиваются в липидный бислой, образуя в ходе экструзии вместе с матричными липидами — яичным фосфатидилхолином и фосфатидилинозитом из S. cerevisiae — монола меллярные липосомы среднего диаметра 100 нм. Впервые исследована стабиль ность дисперсий наноразмерных лекарственных липосом. Показано, что коллоидные растворы можно хранить не менее 1 месяца при 4С. Показана воз можность длительного хранения дисперсий путем замораживания в жидком азоте — липосомы полностью регенерируются после размораживания и крат ковременной ультразвуковой обработки. Установлено, что липофильные проле карства в липосомальных формах стабильны в плазме крови человека не менее суток, то есть липосомы защищают сложноэфирные связи пролекарств от гид ролиза эстеразами плазмы.

Впервые установлено в тестах in vitro, что препараты исследуемых липосом, в целом, являются гемосовместимыми системами доставки лекарств. Более того, показано, что наличие на поверхности липосом адресных тетрасахарид ных лигандов селектинов SiaLeX/A не влияет на гемосовместимость. Однако, в отличие от Mlph-липосом, препараты с MTX-DOG вызывали активацию систе мы комплемента, а также незначительное замедление коагуляции. Обнаружено, что модификация поверхности липосом при встраивании в бислой того или иного пролекарства определяет набор белков плазмы крови, вовлеченных во взаимодействие с липосомами, что, в свою очередь, отражается на функциони ровании протеолитических каскадов систем комплемента и коагуляции.

Показано, что в случае МТХ-липосом снижение нагрузки бислоя пролекарством полностью восстанавливает инертность липосом.

Практическая значимость Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о перспективно сти исследованных липосомальных препаратов как новых наноразмерных систем доставки лекарств для противоопухолевой терапии. Коллоидные раство ры препаратов в солевом буфере достаточно стабильны;

более того, их можно длительно хранить после низкотемпературного замораживания (подобно плазме крови доноров). Такие растворы содержат достаточные концентрации проле карств, чтобы оказывать терапевтический эффект при системном введении. Ста бильность пролекарств в составе липосом к преждевременному гидролизу эстеразами плазмы должна способствовать увеличению времени циркуляции пролекарств в кровотоке и улучшению фармакокинетики препаратов.

Показано, что MTX-DOG в липосомальной форме способен преодолевать устойчивость клеток лейкемии к метотрексату, обусловленную нарушением ак тивного транспорта аналогов фолатов. Полученные данные представляют практический интерес, так как эффективность лечения метотрексатом ограни чивается частым развитием резистентности, связанной, главным образом, именно с нарушением транспорта в клетку.

Использование природного фосфатидилинозита в качестве компонента, стабилизирующего липосомы в кровотоке (Gabizon and Papahadjopoulos, PNAS 1988), позволяет избежать побочных эффектов, связанных с иммуногенностью и токсичностью конъюгатов полиэтиленгликоля (ПЭГ) с фосфолипидами (Moghimi et al, FASEB J. 2006). Установлено, что липосомы с Mlph-DOG и MTX DOG гемосовместимы, то есть не оказывают отрицательного влияния на компо ненты крови — эритроциты и тромбоциты, а также протеолитические каскады системы комплемента и коагуляции.

Связь работы с научными программами Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 06-04 49432-а), FEBS (программа Collaborative Experimental Scholarships for Central & Eastern Europe, 2009) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа У.М.Н.И.К.-2011).

Апробация работы Основные результаты работы были представлены автором в виде устных докладов на следующих конференциях: XIV Международная конференция сту дентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2007”, секция “Химия” (Москва, 2007), XXII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2010), 2ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах.

Безопасность и наномедицина» (Москва, 2011). Результаты также были пред ставлены на конференциях 6th International Workshop on Drug Delivery Systems for Nanomedicine (Liblice Castle, Czech Republic, 2008), 2nd European Summer School in Nanomedicine (Cascais–Lisboa, Portugal, 2009), Международная науч ная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения акад. Ю.А. Овчин никова (Москва–Пущино, 2009), 4th Liposome Advances Conference (London, UK, 2009), 3rd International NanoBio Conference (Zurich, Switzerland, 2010), XXIII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-хими ческой биологии и биотехнологии" (Москва, 2011), Liposomes in Jerusalem– international conference (Jerusalem, Izrael, 2011), XXIV Зимняя молодежная науч ная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2012).

Структура диссертации Диссертационная работа изложена на 130 страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, вы водов, списка цитируемой литературы, включающего 243 наименования, и приложений. Диссертация содержит 23 рисунка и 4 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Синтез диглицеридных конъюгатов метотрексата и мелфалана Цитостатик метотрексат (МТХ, антиметаболит фолиевой кислоты) широко используется в клинике для лечения опухолей и аутоиммунных патологий, та ких как ревматоидный артрит, где на сегодня он остается «лекарством номер один». МТХ конкурентно ингибирует дигидрофолатредуктазу и лишает клетку тетрагидрофолата, необходимого кофактора биосинтеза тимидилата. Эффектив ность лечения МТХ ограничивается не только его системной токсичностью, но и частым развитием клеточной устойчивости (например, при острой лимфобла стоидной лейкемии до 30% случаев). Мелфалан (Mlph) и его рацемат сарколизин цитотоксические агенты алкилирующего типа, действующие не зависимо от стадии клеточного цикла и обладающие широким спектром противоопухолевой активности. Низкая стабильность при физиологических значениях рН и быстрое выведение из кровотока обусловливают необходимость введения высоких концентраций этих агентов, что сопровождается множеством побочных эффектов.

Диглицеридные конъюгаты метотрексата и мелфалана (MTX-DOG и Mlph DOG, Рис. 1) были синтезированы по разработанным ранее методикам (Водово зова и др., Биоорган. химия 1996;

Хим.-фарм. журн. 2007) в количествах, доста точных для изучения характеристик препаратов липосом и проведения серий экспериментов в биологических средах in vitro (более 100 мг каждого пролекар ства). Структуры липофильных пролекарств отвечают ряду требований:

диглицеридный мембранный якорь с двумя алифатическими ацильными це пями служит для надежного удерживания молекулы пролекарства в бислое;

в случае объемистой молекулы метотрексата предусмотрен -аланильный Рис. 1. Схематическое изображение конструкции липосом и структуры дигли церидных конъюгатов метотрексата и мелфалана (MTX-DOG и Mlph-DOG).

Липосомы получали стандартным методом экструзии: растворы смесей липи дов PC – PI – MTX-DOG/Mlph-DOG, 8 : 1 : 1 (мол.), в смеси хлороформ– метанол, 2 : 1, упаривали;

липидные пленки высушивали 30 мин при 5 Па, затем гидратировали 2 ч при 20°С в физрастворе, рН 7.0–7.2 (для определения соста ва липосом — буфер HEPES, в остальных случаях — фосфатный);

суспензию подвергали 5-ти циклам замораживания–оттаивания (жидкий азот/+40С) и продавливали 10 раз последовательно через поликарбонатные мембранные фильтры (Nucleopore, США) с размерами пор 200 и 100 нм на установке Mini extruder (Avanti Polar Lipids, США).

линкер, который в бислое располагается в области полярных головок фосфоли пидов, позволяя остаткам метотрексата расположиться на поверхности липосом и обеспечивая тем самым встраивание пролекарства в бислой с меньшим нару шением его структуры;

сложноэфирная связь между лекарством и остальной частью молекулы легко гидролизуется внутри клеток ввиду низкой субстратной специфичности эстераз.

Пролекарство Mlph-DOG получали исходя из мелфалана и rac-1,2-диолеоил глицерина (1,2-Ole2DOG) в три стадии: введение Boc-защиты аминофункции Mlph, реакция конденсации с использованием карбодиимидного метода и сня тие защиты трифторуксусной кислотой. Благодаря оптимизации отдельных процедур в ходе выполнения реакции выход составил 70%, что существенно превысило ранее полученные результаты. Синтез MTX-DOG из МТХ и 1,2 Ole2DOG включал 6 стадий, ключевой из которых является алкилирование це зиевой соли MTX йодацетатом п-нитрофенола и выделение моноэфира по СООН МТХ. Продукт конденсации 1,2-Ole2DOG с Boc--аланином (-аланил диглицерид) подвергали ацилированию активированным моноэфиром MTX.

Целевой продукт выделяли гель-фильтрацией на липофильном сефадексе с по следующей хроматографией на силикагеле. Вещества охарактеризованы методами 1Н-ЯМР, УФ- и масс-спектрометрии.

Получение и характеристика липосом, нагруженных липофильными пролекарствами метотрексата и мелфалана Липосомы (L;

Рис. 1) готовили методом экструзии. Основу бислоя липосом (90 мол. %) составляют фосфатидилхолин (РС) из яичного желтка и фосфатиди линозит (PI) из пекарских дрожжей. Фосфатидилинозит (10 мол. % в бислое) способен стабилизировать липосомы в кровотоке за счет высокогидратируемых остатков инозита. Жирнокислотный состав природных липидов обеспечивает относительно низкую температуру фазового перехода бислоя, что способствует эффективному включению липидных производных. Липофильные пролекарства являются компонентами бислоя и даже при его повреждении «не вытекают» в водную фазу.

Включение (про)лекарства в состав бислоя значительно упрощает процедуру приготовления липосомальных препаратов с эффективной концентрацией терапевтического агента, исключая необходимость отделения от невключенного лекарства (например, с помощью гель-хроматографии или диализа) и сопут ствующее разбавление дисперсии. При гидратировании липидных пленок задается концентрация пролекарств (~4 мМ) в конечных липосомальных дис персиях, приемлемая для внутривенного введения с точки зрения доза/объем.

Исходная смесь липидов содержит 10 мол. % конъюгата Mlph-DOG или МТХ-DOG.

Cостав липосом. Степень включения липофильных пролекарств в липосо мы определяли с помощью гель-хроматографии на сефарозе: фракции анализировали на содержание фосфолипидов и пролекарств. На Рисунке 2 при ведены хроматограммы препаратов после приготовления. Очевидно, что пики выходов фосфолипидов и пролекарств полностью совпали. Поскольку концен трации МТХ-DOG и Mlph-DOG в липосомальных дисперсиях практически соответствовали исходным количествам конъюгатов, взятым для приготовления липидных пленок (потери на мембранных фильтрах составляли не более 2–3 % в каждом случае), был сделан вывод о количественном включении конъюгатов в липосомы.

Размер липосом контролировали методами динамического лазерного свето рассеяния (dynamic light scattering, DLS), анализа траекторий наночастиц (nanoparticle tracking analysis, NTA) и электронной микроскопии (ЭМ).

Рис. 2. Гель-хроматография на колонке с сефарозой CL-4B липосом после при готовления. После разрушения липосом 5-кратным объемом этанола во фракциях определяли фосфолипиды элементным анализом на фосфор и конъю гаты (А) Mlph и (Б) МТХ — спектрофотометрически (MTX-DOG: макс. = 302 нм, ~ 25000;

Mlph-DOG: макс. = 258 нм, ~ 19700).

По данным измерений на приборе Brookhaven 90Plus (Brookhaven Instruments, США) средний размер свежеприготовленных липосом с пролекар ствами составляет около 90 нм (Таблица 1). Дисперсии характеризуются узким распределением по размерам, о чем свидетельствуют значения ширины пиков на половине высоты. Низкие значения индекса полидисперсности (PDI) под тверждают, что коллоидные растворы липосом монодисперсны. Размеры Mlph липосом в течение трех недель увеличиваются менее, чем на 5% (данные не приведены).

Данные прибора ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания;

Таблица 1) демонстрируют размеры липосом после транспортировки (в лабора торию проф. Я. Себени, Венгрия) для проведения дополнительных тестов на активацию системы комплемента. Больший диаметр MTX-L отражает несколько меньшую воспроизводимость размеров от серии к серии для этих липосом. Тем не менее, размеры МТХ-липосом всегда лежат в желаемом диапазоне 50–150 нм и сохраняются при среднесрочном хранении: после недели транспортировки в неконтролируемых условиях (в основном, при +20°С) препараты представляют собой монодисперсные коллоидные растворы с узким распределением по разме рам. Через месяц хранения и транспортировки средний размер MTX-L в данной партии составил 113.2 ± 5.0 нм (PDI = 0.074 ± 0.027), то есть увеличился менее, чем на 14 % (данные установки Photocor, Photocor Instruments, США, снабжен ной автокоррелятором Brookhaven BI9000). Очевидно, свободные -СООН группы остатка MTX, экспонированные на поверхности липосом, при длитель ном хранении конкурируют за связывание катионов металлов Men+ с Таблица 1. Размер липосом с пролекарствами метотрексата (MTX-L) и мелфалана (Mlph-L) NTA, DLS, Brookhaven 90Plusа DLS, Malvern Zetasizerб NanoSight D, нм H1/2, нм PDI D, нм H1/2, нм PDI D, нм 20.9 ± 0.056 ± 17.5 ± 0.038 ± Mlph-L 90.4 ± 1.0 90.7 ± 0.4 89 ± 2.9 0.014 3.0 0. 15.9 ± 0.044 ± 24.7 ± 0.063 ± MTX-L 89.7 ± 1.3 99.4 ± 0.6 83 ± 6.8 0.025 3.7 0. D — средний диаметр, H1/2 — ширина пика на половине высоты, PDI — индекс полидисперсности;

а — свежеприготовленные дисперсии липосом, б — дисперсии после недели хранения при +4 – +22°С.

присутствующим в буфере ЭДТА, что приводит к образованию «мостиков» между липосомами. При приготовлении МТХ-липосом, для предотвращения агрегации липидных бислоев, в буфер вводили 1 мМ ЭДТА (по нашим данным, такой буфер не токсичен при внутривенном введении крысам).

В отличие от метода DLS, где математический аппарат позволяет рассчитать коэффициент диффузии для ансамбля частиц из временной автокорреляционной функции интенсивности рассеяния, в случае NTA коэффициент диффузии рас считывается для индивидуальной частицы, поэтому NTA позволяет получить реальную картину распределения по размерам полидисперсных образцов (Filipe et al, Pharm. Res. 2010). Данные NTA (прибор Nanosight LM10HS, Вели кобритания;

Таблица 1) надежно свидетельствуют о том, что исследуемые липосомы монодисперсны.

Электронная микроскопия позволяет не только судить о размерах липосом, но и дает наиболее информативную картину их ламеллярности. На Рисунке Рис. 3. Электронные микрофотографии (А, Б) MTX-L и (В, Г) Mlph-L, полу ченные методом замораживания со скалыванием (вакуумный пост JEE-4C, JEOL, Япония, и электронный микроскоп LIBRA120, Сarl Zeiss SMT, Германия).

приведены микрофотографии поверхностей скола липосом, полученные через сутки после приготовления дисперсий. Образцы представляют собой монола меллярные везикулы диаметра 50–100 нм. Дисперсии также изучали с помощью негативного контрастирования. Микрофотографии (Рис. 4А,Г) подтверждают данные замораживания–скалывания и свидетельствуют о том, что препараты MTX-L и Mlph-L дисперсии везикул размера до 100 нм.

Определение -потенциала липосом проводили с помощью лазерной доп плеровской анемометрии, измеряя скорость движения рассеивающих частиц дисперсии, помещенной в электрическое поле.

Как и следовало ожидать, все Таблица 2. -потенциал липосом (Zetasizer липосомы на основе смеси PC–PI Nano ZS) характеризуются отрицательным потенциалом поверхности (Табли Образец липосом -потенциал, мВ ца 2). Наличие в бислое молекул PC/PI (без лекарства) –42 ± Mlph-DOG с катионной полярной Mlph-L –34 ± головкой частично компенсирует MTX-L –53 ± заряд. Напротив, чем больше MTX MTX-L-2.5* –45 ± 2 DOG присутствует в мембране, тем *Состав аналогичен образцу MTX-L, загрузка более отрицательный заряд несет MTX-DOG 2.5 мол. %.

поверхность липосом.

Длительное хранение липосом. По данным DLS дисперсии липосом в фи зиологическом растворе на фосфатном буфере (PBS), рН 7.0, могут сохраняться без существенной агрегации неделями. Однако сами лекарства в растворах столь долго не хранятся. Например, по данным ВЭЖХ мелфалан при инкубации в PBS, рН 7.0, 37°C, деградирует за 1 ч примерно на 20%, за 2 ч – на 40%, а за 18 ч – практически полностью. Для длительного хранения липосомальных пре паратов можно использовать лиофилизацию дисперсий в присутствии криопротекторов, как правило, углеводов (трегалоза, сахароза и др.). Однако по сле регидратации происходит укрупнение липосом, что нежелательно с точки зрения способности осуществлять пассивный транспорт лекарств в опухоли, а также частичное вытекание лекарств из водного объема липосом. Кроме того, дополнительная стадия лиофилизации делает технологию производства значи тельно более дорогой. При включении липидных аналогов в мембрану липосом трудно представить, чтобы в результате процедуры замораживания–оттаивания пролекарства смогли перераспределиться из липидного бислоя в водную фазу.

Мы исследовали возможность получения липосомальных препаратов длитель ного хранения путем низкотемпературного замораживания без криопротекторов. Дисперсии MTX- и Mlph-липосом замораживали в жидком Рис. 4. Электронные микрофотографии липосом (метод негативного контрастирования UO2(CH3COO)2, установка JEM 100CX11, JEOL). Свеже приготовленные Mlph-L (А) замораживали в жидком азоте и хранили при –70°С;

агрегаты липосом после размораживания при 40С (Б);

восстанавлив ление липосом после кратковременной обработки на ультразвуковой бане (В).

MTX-L после приготовления (Г) и после размораживания (без ультразвуковой обработки) (Д).

азоте и хранили при –70°С. После размораживания (+40°С) образовывались мутные дисперсии, что указывало на агрегацию везикул. Кратковременные ( 5 мин) обработки на ультразвуковом дезинтеграторе банного типа позволили получить слабо опалесцирующие дисперсии.

Результаты изучения размеров и степени агрегации липосом с помощью ЭМ методом негативного контрастирования представлены на Рисунке 4. Липосомы, содержащие Mlph-DOG, при размораживании частично образуют крупные плотные конгломераты (Рис. 4Б), которые диспергируются до исходных частиц ультразвуковой обработкой (Рис. 4В). Напротив, MTX-липосомы, при размора живании не образуют плотных агрегатов (Рис. 4Д). Это согласуется с данными DLS (не приведены), из которых следует, что MTX-L уже после первого цикла УЗ-обработки восстанавливают исходные размеры, в отличие от Mlph-L. По-ви димому, это объясняется экспонированием отрицательного заряда -карбоксила остатка MTX на поверхности липосом.

Состав липосом после размораживания и ультразвуковой обработки опреде ляли с помощью гель-хроматографии на сефарозе с последующим анализом фракций, как это описано для липосом сразу после приготовления. Результаты (не показаны), аналогичные приведенным на Рисунке 2, свидетельствуют о том, что выделения пролекарств из липидного бислоя липосом в отдельные агрегаты не происходит.

Рис. 5. А. Пример хроматограммы смеси стандартных растворов 2.5 мкг/мл MTX и 5 мкг/мл MTX-DOG в системе хлороформ–метанол, 75 : 25, колонка Luna Silica, 5 мкм, 4.6 250 мм (Phenomenex, USA). Б. Результаты анализа хлороформ–метанольных экстрактов из плазмы крови человека после инкуба ции с MTX-липосомами. Стрелка указывает на пик MTX-DOG.

Стабильность липофильных пролекарств в составе липосом в плазме крови человека in vitro. Для изучения устойчивости пролекарств по отношению к эстеразам плазмы крови человека нами разработаны методики определения MTX (Mlph) в смеси с его липидным производным с помощью ВЭЖХ. Основ ная трудность такого анализа связана с подбором системы для разделения веществ с принципиально отличающимися полярными свойствами. Широко применяемая хроматография на обращенной фазе в градиентной системе растворителей (вода–ацетонитрил, изопропанол и т.п.) не дала положительных результатов. В случае МТХ/MТХ-DOG была использована колонка с прямой фазой (силикагелем), а в качестве элюента смесь органических раствори телей в изократическом режиме.

Липосомы инкубировали с образцами свежей плазмы, полученной из сме шанных пулов крови доноров (случайная выборка). По данным двух независимых экспериментов (в двух повторах), MТХ-DOG в составе липосом в 90%-ной плазме крови человека не деградирует вплоть до 24 ч инкубации при 37°С (Рис. 5), о чем судили по отсутствию пика MTX и неизменной интенсивно сти пика MTX-DOG.

Разработка аналогичной методики ВЭЖХ-анализа смесей мелфалана с производным Mlph-DOG оказалась затруднена нестабильностью мелфалана как такового при инкубации в нейтральной водной среде при 37°С. Кроме того, хро матография на силикагеле осложнялась ионными эффектами свободной аминофункции Mlph-DOG (исходный мелфалан образует внутреннюю соль).

Поэтому одновременное определение мелфалана и Mlph-DOG проводили с по Рис. 6. Цитотоксичность МТХ (А) и МТХ-L (Б) в культурах клеток Т-лим фобластоидной лейкемии человека (СЕМ-CCRF) и МТХ-резистентной сублинии (CEM/MTX). Приведены средние значения ± SE двух независимых эксперимен тов (каждый проведен в двух повторах). Использована программа Origin 6. (MicroCal Software Inc., США).

мощью ВЭЖХ на обращенной фазе (С18) с использованием в системе ион-пар ного реагента1. При сравнении хроматограмм после инкубаций липосом в PBS и плазме крови человека при 37°С вплоть до 24 ч разницы между ними обнаруже но не было: оба пика исходного Mlph-DOG постепенно и пропорционально уменьшались (деградация остатка Mlph), причем появления новых пиков в дан ных условиях ВЭЖХ не наблюдалось (данные не приведены). Таким образом, можно сделать вывод, что эстеразы плазмы крови, как и в случае МТХ-липосом, не расщепляют Mlph-DOG в составе липосом с высвобождением мелфалана (или продуктов его гидролиза).

Цитотоксическая активность липосом с MTX-DOG в культуре мето трексат-резистентных клеток. Эффективность лечения метотрексатом ограничивается частым развитием резистентности, связанной, главным об разом, с нарушением активного транспорта в клетку. В связи с этим исследована способность конъюгата метотрексата в липосомальной форме преодолевать устойчивость опухолевых клеток к MTX, обусловленную нарушением импорта лекарства в клетку из-за пониженной функции белка-транспортера восстанов ленных фолатов (RFC). Было проведено сравнительное определение цитотоксической активности липосом с MTX-DOG in vitro в культурах клеток лейкемии человека с различной чувствительностью к МТХ: Т-лимфобластоид ной линии CEM-CCRF и сублинии CEM/MTX, устойчивой к МТХ из-за дефицита RFC. Цитотоксическую активность (концентрацию, вызывающую ин 1) Линейный градиент B в A 30100% за 11 мин;

А: 20 мМ гексилсульфоната натрия в H2O, 1% монохлоруксусной кислоты, B: AcCN – AcOH, 9 : 1.

Таблица 3. Результаты тестов на гемосовместимость липосом с пролекарствами Кол-во и распре деление по раз АЧТВ/ C3a SC5b-9 CH50 Образец липосом мерам эритро- Гемолиз ПТ ИФА ИФА тест цитов и тром боцитов Mlph-L – – – – – – Mlph-L-SiaLeА* – – – – н.д. н.д.

Mlph-L-SiaLeX* – – – – – – Mlph-L-SiaLeА\PI** – – – – н.д. н.д.

MTX-L – ++/+ – ++ – ++ MTX-L-SiaLeА* – ++/+ – ++ – ++ MTX-L-10* – ++/+ – ++ н.д. н.д.

MTX-L-2.5* – +/+ – + – – Контрольный – – – – н.д. н.д.

раствор MTX Примечания: –, слабый эффект или его отсутствие, +, эффект средней интенсивности, ++, сильное влияние на показатели крови, н.д., нет данных;

*, адресные липосомы, несущие 2 мол. % липофильного конъюгата SiaLeX/А;

**, образец, идентичный Mlph-L-SiaLeА, но без PI;

CH50 — тест на остаточную гемолитическую активность.

гибирование пролиферации клеток на 50%, IC50) МТХ (Рис. 6А) и липосом с MTX-DOG (Рис. 6Б) в культурах клеток CEM/MTX и родительской линии МТХ чувствительных клеток лейкемии СЕМ-CCRF определяли стандартным для MTX образом по включению трипанового синего. Для МТХ IC50 составляла 16.4 ± 4.9 и 0.075 ± 0.005 мкМ в культурах CEM/MTX и СЕМ-CCRF, соответ ственно;

для MTX-DOG 1.68 ± 0.05 и 0.88 ± 0.07 мкМ. Следовательно, резистентность (отношение IC50 CEM/MTX к IC50 CEM-CCRF) уменьшилась от значения 218 до 1.9 (в 114 раз) при переходе от МТХ к липосомальной форме MTX-DOG.

Исследование взаимодействий липосом с компонентами крови Тесты на гемосовместимость. В кровотоке липосомы контактируют как с белками плазмы, так и с клетками крови, и могут вызвать нарушения в их функ ционировании. С помощью панели тестов in vitro мы исследовали гемосовместимость липосом с пролекарствами Mlph-DOG и MTX-DOG соглас но требованиям стандартов Международной организации по стандартизации ISO 10993-4. Также были проанализированы образцы адресных липосом, несу щих тетрасахаридные лиганды селектинов1 сиалил Льюис Х и А (SiaLeX/A).

1) Селектины — Са2+-зависимые трансмембранные гликопротеины, экспрессирующиеся на поверхности активированных лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток;

они яв ляются перспективной мишенью для селективной доставки терапевтических агентов в сосу ды опухолевой ткани (Barthel et al, Expert. Opin. Ther. Targets, 2007).

Рис. 7. А. Степень гемолиза эритроцитов в присутствии липосом определяли с использованием реагента Драбкина;

белые столбцы соответствуют конеч ной концентрации липосом в крови 0.4 мМ по пролекарству, черные — 0.04 мМ, за исключением образцов MTX-L-10 и MTX-L-2.5 (0.1 мМ). Отрица тельный контроль — PBS, положительный — сапонин, 2 мг/мл (в комплексе с холестерином вызывает образование мембранных пор и, как следствии, гемо лиз);

приведены средние значения двух измерений ± SE. Фотографии мазков крови после инкубации с Mlph-L (0.4 мМ по пролекарству;

Б) или PBS (В).

Исследовано влияние липосом на целостность, морфологию, распределение по размерам и количество эритроцитов и тромбоцитов, активацию системы комплемента и каскада коагуляции. Результаты обобщены в Таблице 3.

Согласно полученным данным, ни один из препаратов липосом не приводил к изменению морфологии эритроцитов (например, см. Рис. 7Б,B). Значения кон центрации гемоглобина в плазме во всех испытанных образцах находились на фоновом уровне, то есть липосомы не вызывали гемолиза эритроцитов (Рис. 7).

Инкубация с липосомальными препаратами не влияла на численность эритро цитов и тромбоцитов, равно как и на их распределение по размерам (Coulter Multisizer IIS, Сoulter Electronics;

данные не приведены).

Таким образом, можно констатировать инертность Mlph- и MTX-липосом по отношению к основным клеткам крови. Это наблюдение особенно ценно по от ношению к тромбоцитам, так как, будучи ответственными за поддержание гемостаза, они являются более чувствительными к чужеродным поверхностям, вызывающим их активацию и агрегацию. Помимо этого, инертность SiaLeX/А липосом косвенно свидетельствует о том, что они направлены именно на клет ки, участвующие в патологических процессах (селектины экспрессируются только на стимулированных клетках).

Влияние липосом на свертывание крови. Два взаимодополняющих клини ческих теста были использованы для оценки влияния липосом на функционирование системы коагуляции: активированное частичное тромбопла стиновое время (АЧТВ) и протромбиновый тест (ПТ). В первом случае оценивали эффективность внутреннего (контактного) пути активации коагуля ции по времени образования фибринового сгустка в рекальцифицированной плазме после добавления контактного активатора (суспензия каолина) и фосфо липидов (фосфатидилэтаноламин). В контрольном эксперименте без добавления каолина к плазме образования сгустка не наблюдалось, то есть по верхность липосом не инициирует внутренний путь коагуляции.

Протромбиновый тест служит мерой активности внешнего пути активации свертывания крови. Измеряют время образования сгустка после добавлении к рекальцифицированной плазме крови тканевого фактора.

В Таблице 4 представлены результаты тестов АЧТВ и ПТ, выполненных с об разцами плазмы, полученными после инкубации липосом с кровью и отделения клеточных компонентов. Приведенные величины соответствуют свертывающей способности того или иного образца относительно стандартной плазмы крови человека (100%). Чем быстрее образовывался сгусток, тем больше свертываю щая способность. В целом, Mlph-липосомы влияли на скорость тромбообразования в пределах нормы, в то время как липосомы с MTX-DOG вызывали значительное увеличение времени коагуляции.

Образцы MTX-L-SiaLeA и MTX-L вызывали увеличение времени тромбооб разования в тесте на АЧТВ на ~55 и 15% при концентрациях MTX-DOG в крови 0.4 мМ и 0.04 мМ соответственно. Эти образцы также вызывали снижение способности к тромбообразованию в плазме, хотя и менее значительное, в тесте ПТ: на 33 и 7%, соответственно.

Чтобы лучше понять природу наблюдаемого явления, мы уменьшили кон центрацию пролекарства, вводимого в контакт с кровью, в 4 раза (0.1 мМ после разбавления кровью) за счет (а) использования менее концентрированной дис персии липосом, как и прежде с 10 мол. % MTX-DOG (образец MTX-L-10), и (б) уменьшения нагрузки бислоя до 2.5 мол. % (образец MTX-L-2.5). Для такого промежуточного значения концентрации пролекарства (0.1 мМ после разбавле ния кровью) значения времени тромбообразования в обоих тестах (АЧТВ и ПТ) составили среднее между двумя разведениями образцов MTX-L и MTX-L SiaLeA (0.4 и 0.04 мМ) первого эксперимента. Интересно, что во второй серии образцов менее концентрированная по липидам дисперсия (то есть создающая меньшую по площади поверхность) более значительно ингибировала коагуля Таблица 4. Влияние липосом на время коагуляции в стандартных клинических тестах, выполненных после инкубации липосом кровью человека in vitro* АЧТВ ПТ внешний путь внутренний путь Образец липосом Конечная концентрация пролекарства в крови 0.4 mM 0.04 mM 0.4 mM 0.04 mM Mlph-L 100.0 96.7 86.2 81. Mlph-L-SiaLeA 100.0 100.0 89.8 95. Mlph-L-SiaLeX 100.0 100.0 89.8 100. Mlph-L-SiaLeA\PI 83.7 н.д. 93.5 н.д.

MTX-L 45.7 86.7 67.1 93. MTX-L-SiaLeA 42.6 83.1 67.1 93. MTX-L-10 52.5 н.д. 75.4 н.д.

MTX-L-2.5 68.0 н.д. 79.9 н.д.

Контрольный раствор MTX 100.0 100.0 101.6 98. “–” контроль 100.0 100.0 99.1 97. *Приведена относительная способность образца к коагуляции по сравнению с таковой стандартного образца плазмы человека, %, определенная на коагулометре Dade Behring. н.д., нет данных.

цию, чем образец с большей общей концентрацией липидов, но меньшей плот ностью остатков MTX на поверхности. Ингибирование обоих путей коагуляции может быть следствием неспецифической адсорбции белков-участников каскада на поверхности материала, контактирующего с плазмой, в том числе ключевых факторов гуморальных реакций крови фибриногена, факторов IX и X, протром бина и антитромбина III (Yancheva et al, Macromol. Biosci., 2007).

Активация системы комплемента. Влияние липосом на систему компле мента (СК) исследовали на разных этапах активации с помощью трех методов:

определения количества образуемого фрагмента C3a в крови и комплекса SC5b 9 в сыворотке с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и определения остаточной гемолитической активности системы комплемента после инкубации сыворотки крови с липосомами. Активации СК по любому из трех основных путей классическому (при участии специфических антител, а также без них), лектиновому (посредством лектина, связывающего маннозу) или альтернатив ному приводит к образованию С3-конвертаз С4b2a и С3bBb, которые гидролизуют фактор С3 c высвобождением фагмента C3a. Количество образую щегося С3а позволяет судить о возможном анафилактическом эффекте препарата. Терминальной стадией активации СК является образование мембра ноатакующего комплекса (МАК) C5b-9. В отсутствие липидной мембраны C5b 9 образует комплекс SC5b-9 с водорастворимым S-белком (витронектином);

об Рис. 8. Результаты оценки степени активации СК в присутствии липосом in vitro. А. Количество стабильного метаболита С3a — C3a-desArg, — определяе мое методом ИФА;

обозначения см. в подписи к Рисунку 7А. Б. Остаточная гемолитическая активность сыворотки крови после инкубации с липосомами (конечная концентрация по пролекарству 1 мМ). Отрицательный контроль — плазма крови после инкубации с PBS, положительный зимозан (суспензия по лисахаридов, выделенных из клеточной стенки S. cerevisiae, 2 мг/мл);

приведены средние значения минимум двух измерений ± SE.

наружение SC5b-9 в ИФА свидетельствует об активации всего каскада СК. На конец, остаточная гемолитическая активность является исчерпывающим и надежным методом определения активации СК, свободным от ограничений и артефактов, возможных в случае использования ИФА для определения одного из факторов каскада.

Судя по количеству высвобождаемого С3а (Рис. 8А), Mlph-L ускоряли акти вацию СК менее, чем в 1.5 раза по сравнению с контролем. Вероятность того, что подобная активация системы комплемента in vivo приведет к клинически выявляемым последствиям, мала. Во всяком случае, определение количества SC5b-9 с помощью ИФА в образцах сыворотки крови после 10 мин инкубации с липосомами Doxil® in vitro позволяло достоверно (p 0.05) прогнозировать ак тивацию СК in vivo только в том случае, если in vitro детектировали значения, превышающие нормальный уровень SC5b-9 в 2–4 раза (Szebeni et al, in Liposome Technology, 2007).

Напротив, MTX-L вызывали высвобождение значительных количеств C3a (Рис. 8А) и заметное истощение системы комплемента в целом (Рис. 8Б).

Уменьшение концентрации липосом в 4 раза приводило к снижению активации системы комплемента в 1.2–1.5 раз. Ещё больший эффект достигался за счет уменьшения количества пролекарства в бислое липосом с 10 до 2.5 мол. %.

Природа высокой степени активации СК образцом MTX-L-SiaLe X в тесте на остаточную гемолитическую активность (Рис. 8Б) неясна. Как правило, ре зультаты этого теста хорошо коррелируют с результатами определения продуктов активации СК. В нашем случае наличие SiaLeX/А лиганда как такогого не влияло на гемореактивность липосом, выявляемую методом ИФА С3a, а так же в тесте на остаточную гемолитическую активность в случае образцов Mlph L-SiaLeX/А и MTX-L-2.5. Возможно, наблюдаемая активация СК образцом MTX L-SiaLeX связана с особенностями взаимного расположения остатков MTX и тетрасахарида SiaLeX на поверхности липосом, что в свою очередь влияет на связывание тех или иных компонентов терминального пути СК и/или регулятор ных факторов.

Наличие или отсутствие PI, фактора, стабилизирующего поверхность липо сом (образцы Mlph-L-SiaLeА и Mlph-L-SiaLeА\PI), не влияло на реактивность липосом.

При измерении количества SC5b-9 комплекса, образуемого в 75% сыворотке в присутствии липосомальных дисперсий, 1-мМ по пролекарствам, значитель ного увеличения концентрации этого маркера по сравнению с контролем не наблюдалось (данные не приведены). Это кажущееся противоречие между ре зультатами оценки активации системы комплемента по выработке C3a и SC5b-9, по-видимому, объясняется следующим образом: поверхность MTX-липосом действительно активирует СК, однако образующийся МАК предпочитает встроиться в мембрану липосом, и образования комплекса SC5b-9 в жидкой фазе не происходит.

Отметим, что образцы раствора MTX в равной по лекарственному началу концентрации не вызывали нежелательных эффектов ни в тестах на активацию коагуляции, ни в тестах на активацию СК (Таблица 4 и Рис. 8). В случае MTX-L каждая молекула пролекарства в бислое экспонирует на поверхности пару аро матических NH2-функций, а также свободный -карбоксил. Экспонированные же NH2 (и OH) группы, расположенные особым образом относительно друг дру га, могут вызывать активацию СК, предположительно, посредством нуклеофильной атаки на внутреннюю тиоэфирную связь фрагмента C3b, что приводит к ускорению спонтанного гидролиза С3 и активации альтернативного пути.

Прямой и очевидный способ разрешить проблему реактивности MTX-липо сом уменьшить концентрацию пролекарства в бислое. С точки зрения потенциальной эффективности лечения это возможно, так как наименьшая кон центрация, исследованная в данной работе и вызвавшая лишь незначительные эффекты со стороны биологических каскадов, 40 мкМ MTX-DOG в крови Рис. 9. А. Профили элюции липосом и белков при выделение гель-хроматграфи ей колонке с сефарозой CL-4B липосом-белковых комплексов после инкубации липосом (на примере Mlph-L) с 80% плазмой в течение 15 мин при 37С. Иден тификация пролекарства — УФ-спектр, белка — модифицированный метод Лоури. Б. Сравнение профилей элюции белков после инкубации препаратов ли посом с плазмой и контрольного образца плазмы после инкубации с PBS.

В. Результат разделения белков, ассоциированных с липосомами, с помощью электрофореза по Лэммли. Наносимые образцы содержали равное количество липидов (дорожки 2–5). Дорожка 1 – образец плазмы после инкубации с PBS, 6 – плазма в разведении 1/500.

соответствует терапии лейкемии низкими дозами MTX1. Дозировку липосо мальной формы для внутривенного введения ещё предстоит оптимизировать, однако ожидается, что она не превысит используемые количества интактного лекарства.

Идентификация белков плазмы, ассоциированных с лекарственными ли посомами. Комплексы липосом с ассоциированными белками выделяли после 15 мин инкубации в 80%-ой плазме с помощью гель-хроматографии на сефаро зе, одновременно контролируя во фракциях содержание белка и пролекарства.

Фракции с наибольшим содержанием пролекарства объединяли, делипидизиро вали и анализировали с помощью электрофореза в ПААГ по Лэммли (Рис. 9А).

Как MTX-, так и Mlph-липосомы связывали значительное количество белка (~80 г белка/моль липидов;

Рис. 9Б), однако даже неспецифически окрашенный гель демонстрирует различия в наборе белков плазмы, вовлеченных во взаимо действие с липосомами разного состава (Рис. 9В). Для всех липосомальных препаратов доминирует полоса, соответствующая молекулярной массе 66 кДа и, по-видимому, представляющая собой сывороточный альбумин (он составляет ~60 % суммарного белка плазмы), для которого характерно активное связывание с поверхностью липосом. Полоса с массой около 55 кДа, скорее всего, соответ ствует мономеру фибриногена также одного из основных по содержанию 1) Из расчета средней дозы в 20–60 мг/м2 для человека среднего роста 1.60–1.70 м и веса 60– 70 кг с 5 л крови.

Рис. 10. Идентификация белков, ассоциированных с липосомами, методом им муноблоттинга с использованием антител к белкам плазмы человека:

компонентам системы комплемента С3 (А) и фактору Н, fH (Б), а также апо липопротеину Е, ApoE (В).

белков плазмы. Другие выраженные полосы предварительно были отнесены к -, 2- и -цепям фактора комплемента C3 (~130, 45 и 73 кДа, соответственно), тяжёлой цепи IgG (~50 кДа), IgM (75 кДа) и С4b-связывающему белку (~75 кДа).

С помощью метода иммуноблоттинга было обнаружено, что Mlph-L и MTX L в равной мере связывали один из регуляторных белков СК С4b-связываю щий белок (не показано). Однако только в составе комплексов белков с MTX-L были обнаружены значительные количества фрагментов компонента C3 и фак тора H (fH) (Рис. 10А и Б) регуляторного компонента альтернативного пути СК (ингибиурет амплификацию сигнала за счет петли усиления альтернативно го пути активации). По-видимому, активация СК приводит к гидролизу субъединицы компонента С3 с высвобождением анафилотоксина С3а (который мы детектировали с помощью ИФА в плазме в присутствии MTX-липосом, см. выше, Рис. 8А), и фрагмента С3b (субъединицы ' + ). Фрагмент С3b свя зывается с поверхностью MTX-L и в присутствии fH, также сорбированном на поверхности, расщепляется под действием фактора I еще одного белка-регу лятора каскада СК. Образующийся фрагмент iC3b остается связанным с поверхностью. Важно отметить, что ни фрагменты C3, ни fH не были обнаруже ны среди белков плазмы, связанных с липосомами с пониженным содержанием MTX-DOG (образец MTX-L-2.5). Это может объясняться принципиально иной архитектурой поверхности MTX-L-2.5 липосом, свободной от напряжений и де формаций в строении бислоя, предположительно свойственных MTX-DOG липосомам с 10 мол. % пролекарства.

В условиях эксперимента не удалось обнаружить связывание с липосомами таких активных неиммунных опсонизирующих агентов, как фибронектин (Fne) и аполипопротеин AI (ApoAI;

данные не приведены). Таким образом, можно констатировать по крайней мере, что концентрирования Fne или ApoAI на по верхности липосом по сравнению с раствором в плазме не происходит. Поэтому вряд ли эти белки активно участвуют в выводе липосом из кровотока.

Аполипопротеин Е (ApoE;

34 кДа) является основным компонентом хило микронов и липопротеинов промежуточной плотности. Благодаря высокому сродству к семейству рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), ApoE играет ключевую роль в транспорте и метаболизме богатых триглицери дами липопротеиновых фракций. Наблюдаемое связывание ApoE со всеми образцами липосом (Рис. 10В, дорожки 2–5) может свидетельствовать о том, что в кровотоке липосомы будут направляться к тканям и органам, экспрессиру ющим рецепторы ЛПНП, в том числе и в опухоли.

Таким образом, на примере идентифицированных белков показано диффе ренциальное связывание белков плазмы липосомами разного состава.

Обнаруженные различия в связывании факторов СК позволяют сделать предпо ложения о механизме наблюдаемой в тестах in vitro активации системы комплемента MTX-липосомами.

ВЫВОДЫ 1. Исследованы физико-химические свойства новых систем доставки ле карств липосом, нагруженных липофильными пролекарствами противоопухолевых препаратов метотрексата и мелфалана (MTX-DOG и Mlph DOG). Показано, что пролекарства сложноэфирные конъюгаты с rac-1,2-ди олеоилглицерином эффективно встраиваются в липидный бислой моноламеллярных липосом среднего диаметра 100 нм, сформированных на основе природных фосфолипидов (фосфатидилхолина и фосфатидилинозита) методом экструзии.

2. Установлено, что дисперсии липосом, содержащие релевантные для си стемного введения в организм концентрации пролекарств (при нагрузке липосом 10 мол. %), стабильны не менее 1 месяца при 4°С. Показана возмож ность длительного хранения дисперсий после замораживания.

3. Установлено, что липофильные пролекарства в составе липосом стабиль ны в плазме крови человека не менее суток, следовательно, высвобождения исходных лекарств не происходит.

4. Показано, что MTX-DOG в липосомальной форме способен преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток к метотрексату.

5. В серии тестов in vitro установлена гемосовместимость липосом с Mlph DOG, то есть отсутствие влияния на морфологию эритроцитов и тромбоцитов, а также функционирование систем комплемента и коагуляции. Наличие на по верхности липосом адресных тетрасахаридных лигандов селектинов SiaLeX/А не влияет на гемосовместимость.

6. Обнаружено, что липосомы с MTX-DOG, в целом, гемосовместимые, вы зывают активацию системы комплемента и незначительное замедление коагуляции. Нежелательные эффекты сводились к минимуму при уменьшении нагрузки липосом пролекарством до 2.5 мол. % (что соответствует режиму низ кодозовой терапии метотрексатом).

7. Исследованы in vitro белки плазмы крови человека, ассоциирующие с ли посомами. Обнаружено, что связывание фрагментов компонента С3 и фактора Н системы комплемента человека характерно только для липосом с 10 мол. % MTX-DOG. Различия в профилях связывания белков коррелируют с данными об активации системы комплемента в тестах in vitro.

Автор выражает благодарность д.б.н. В.А. Кадыкову (ИБХ РАН) и С.С. Хуцяну (Институт биологии клетки РАН, Пущино) за проведение исследований с помощью электронной микроскопии, к.б.н. Г.П. Гаенко (ИБХ РАН) за проведение экспериментов с клетками, проф. К. Гранфису (Prof. C. Grandfils, The Interfacultary Centre of Biomaterials (CEIB), University of Lige, Belgium) за сотрудничество и возможность выполнения части работ в его лаборатории, проф. Я. Себени, (Prof. J. Szebeni, Nanomedicine Researh and Education Center, Semmelweis University, Budapest, Hungary) за сотрудничество, к.х.н. А.Г. Востровой (ИБХ РАН) и И.А. Вострову (Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова) за помощь в проведении ВЭЖХ анализа, к.х.н.

Н.В. Проказовой (Институт экспериментальной кардиологии, Российский кардиологи ческий научно-производственный комплекс, Москва) за предоставленные образцы плазмы крови человека, к.х.н. С.В. Сизовой (ИБХ РАН), д.х.н. Н.С. Мелик-Нубарову (Химический факультет МГУ) за предоставление возможности работать на приборах и ценные советы, к.х.н. Е.Г. Евтушенко (Химический факультет МГУ) за помощь в из мерении размеров липосом методом NTA, к.б.н. Е.П. Копанцеву и к.б.н.

Е.В. Свирщевской (ИБХ РАН) за помощь в проведении иммуноблоттинга, проф.

Р. Брауну (Prof. R. Brown, Hormel Institute, Minnesota University) за любезно предостав ленные препараты антител.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Гаенко Г.П., Молотковский Юл.Г. Липосомы с 1.

диглицеридным конъюгатом метотрексата: активность в культуре метотрексат резистентных клеток лейкемии // Биоорганическая химия. 2007. T. 33, № 4. C. 470– 473.

2. Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Кадыков В.А., Хуцян С.С., Гаенко Г.П., Молотковский Юл.Г. Липосомы как нано-носители липидных конъюгатов противоопухолевых агентов мелфалана и метотрексата // Российские нанотехнологии.

2008. Т. 3, № 3–4. C. 162–172.

3. Кузнецова Н.Р., Гаенко Г.П., Хайдуков С.В., Бовин Н.В., Водовозова Е.Л.

Влияние углеводных лигандов на цитотоксичность липосом с диглицеридным конъюгатом метотрексата в культурах клеток острой лейкемии человека // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35, № 4. С. 542–549.

4. Kuznetsova N., Kandyba A., Vostrov I., Kadykov V., Gaenko G., Molotkovsky J., and Vodovozova E. Liposomes loaded with lipophilic prodrugs of methotrexate and melphalan as convenient drug delivery vehicles // Jоurnal of Drug Delivery Science and Technology. 2009. V. 19, № 1. P. 51–59.

5. Kuznetsova N., Sevrin C., Lespineux D., Bovin N., Vodovozova E., Mszros T., Szebeni J., and Grandfils C. Hemocompatibility of liposomes loaded with lipophilic prodrugs of methotrexate and melphalan in the lipid bilayer // Journal of Controlled Release.

2012. Doi:10.1016/j.jconrel.2011.12.010 [in press].

Тезисы Kuznetsova N., Kandyba A., Vostrov I., Kadykov V., Khutsyan S., Gaenko G., 6.

Vodovozova E. Characteristics of liposomes loaded with diglyceride esters of methotrexate and melphalan //

Abstract

book of the 6th International Workshop on Drug Delivery Systems, Liblice Castle, Szech Republic, October 3–6, 2008, p. 24.

7. Кузнецова Н.Р., Кандыба А.Г., Бовин Н.В., Севрин Ш., Леспино Д., Гранфис К., Водовозова Е.Л. Противоопухолевые липосомы с диглицеридными конъюгатами метотрексата и мелфалана: изучение стабильности и взаимодействий с компонентами крови // Сборник тезисов международной научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «IХ чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова», Москва–Пущино, 28 сентября–2 октября 2009, Т. 2, стр. 113.

8. Kuznetsova N., Kandyba A., Bovin N., Severin C., Lespineux D., Grandfils C., Vodovozova E. Liposomes Loaded with Diglyceride Esters of Methotrexate and Melphalan:

Studies on Stability and Hemocompatibility // Abstracts of the 4th Liposome Advances Conference, The School of Pharmacy, University of London, London, UK, December 12– 15, 2009, p. 81.

9. Kuznetsova N., Sevrin C., Lespineux D., Bovin N., Grandfils C., Vodovozova E.

Hemocompatibility of liposomes loaded with diglyceride esters of methotrexate and melphalan // Abstracts of the 3rd International NanoBio Conference, ETH Zurich, Switzerland, August 24–27, 2010 (http://www.ecmjournal.org/journal/supplements/ vol020supp03/pdf/v020supp03a152.pdf).

10. Kuznetsova N., Sevrin C., Lespineux D., Grandfils C., Vodovozova E. Liposomes loaded with lipophilic prodrugs of methotrexate and melphalan in the lipid bilayer:

physicochemical properties and hemocompatibility // Abstracts of the Liposomes in Jerusalem–2011 International conference, Izrael, May 15–19, 2011, p. 197.

11. Кузнецова Н.Р., Севрин Ш., Леспино Д., Гранфис К., Водовозова Е.Л. Физико химические свойства противоопухолевых липосом с липофильными пролекарствами метотрексата и мелфалана и их гемосовместимость // 2-ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина», пансионат «Заря», Московская область, 19–24 сентября 2011, стр. 51.

12. Кузнецова Н.Р., Свирщевская Е.В., Водовозова Е.Л. Исследование взаимодействий липосом, нагруженных липофильными пролекарствами мелфалана и метотрексата, с белками плазмы крови // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии" Москва, 7–9 февраля 2012, стр. 93.