Биологическая активность обогащенных пролином пептидов системы врожденного иммунитета
На правах рукописи
ЯМЩИКОВА Елена Владимировна БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ОБОГАЩЕННЫХ ПРОЛИНОМ ПЕПТИДОВ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2012 2
Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич кандидат биологических наук, доцент Шамова Ольга Валерьевна
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН руководитель лаборатории биогеронтологии Кветная Татьяна Викторовна Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет" профессор кафедры биохимии Кулева Надежда Владимировна
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Защита состоится «29» мая 2012 г. В 11 часов на заседании Диссертационного совета Д при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно 001.022. исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.
Автореферат разослан «28» апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Дыбан П.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Неотложная защита от патогенных микроорганизмов у человека и животных обеспечивается механизмами врожденного иммунитета в ходе реакций воспаления, фагоцитоза, секреции слизи и антимикробных факторов эпителиями барьерных органов (Пигаревский, 1978;
Маянский А., Маянский Д., 1989;
Корнева, 2003;
Кокряков, 2006;
Черешнев, Черешнева, 2011;
Segal et al., 2005;
Nathan, 2006;
Lehrer, Lu, 2012;
Hancock et al., 2012). Молекулярной основой системы врожденного иммунитета служит комплекс веществ, распознающих патогены и реализующих их элиминацию;
среди них важную роль играют катионные антимикробные пептиды (АМП) и белки, содержащиеся в нейтрофилах, моноцитах/макрофагах, клетках барьерных эпителиев.
АМП обладают различной первичной структурой и конформацией молекул, представляя несколько структурных семейств, отличающихся по спектру антимикробной активности и механизмам действия на микроорганизмы. Наряду с антибиотическими свойствами, АМП проявляют разнообразные эффекты в отношении и собственных клеток организма. Наиболее распространено и хорошо изучено семейство дефенсинов. Другим обширным структурным семейством АМП, хотя и значительно менее исследованным, являются обогащенные пролином пептиды, ОПП (или пролин-богатые пептиды - Proline-Rich Peptides, PRP). Эти пептиды обнаружены у животных различных таксономических групп – от беспозвоночных до млекопитающих. ОПП обладают высокой антимикробной активноcтью преимущественно в отношении грамотрицательных бактерий. Отличительным свойством пептидов этого семейства является низкая токсичность для клеток млекопитающих.
Наличие в структуре ОПП большого количества аминокислотных остатков пролина (до 50%) обусловливает их свойство легко вступать во взаимодействие с различными белковыми молекулами, в том числе участвующими в ключевых биохимических каскадах реакций, которые обеспечивают функционирование иммунной системы. При таком взаимодействии пептиды могут модулировать функциональную активность этих белков, что и обусловливает проявление многообразных эффектов ОПП в отношении собственных клеток организма. Так, PR-39 из лейкоцитов свиньи оказывает противовоспалительное действие, ингибируя активность NADPH-оксидазной системы нейтрофилов (Shi et al., 1996);
ускоряет заживление ран, стимулируя синтез синдеканов (Chan, Gallo, 1998);
влияет на рост сосудов (Li et al., 2000).
Наличие столь разнообразных функциональных свойств предполагает возможность использования подобных пептидов в практической медицине, однако работы, посвященные изучению ОПП, немногочисленны, хотя исследования в этом направлении несомненно актуальны.
Таким образом, высокая антимикробная активность в сочетании с низкой токсичностью для клеток макроорганизма, а также многообразие видов биологической активности, позволяют рассматривать ОПП как перспективную основу для создания новых антибиотических и иммуномодулирующих лекарственных препаратов для коррекции различных видов патологии, а детальное изучение биологических свойств различных представителей этого структурного класса пептидов является важным направлением исследований экспериментальной медицины.
В результате проведенных ранее исследований молекулярных факторов системы врожденного иммунитета животных и человека, обогащенные пролином катионные пептиды из семейства бактенецинов были обнаружены в нейтрофилах домашней козы (Capra hirca):
бактенецин 5 козы (ChBac5), мини-бактенецины 7.5 и (mini-ChBac7.5 и mini-ChBac7.5), бактенецин 3.4 (ChBac3.4) (Shamova O. et al., 1999;
2009). Структура и некоторые свойства этих бактенецинов были изучены, однако детальное их исследование не проводилось.
Перечисленные пептиды и явились объектами исследования в данной работе. Выбор этих пептидов в качестве объекта исследования был обусловлен не только интересом к ним, как к возможным прототипам для создания лекарственных препаратов, но и тем обстоятельством, что в нейтрофилах коз отсутствуют пептиды из семейства дефенсинов, которые играют важную роль в функционировании системы врожденного иммунитета у человека и многих видов млекопитающих. Таким образом, именно бактенецины у коз являются основными представителями АМП фагоцитов, и изучение свойств этих молекул представляется важным направлением и с точки зрения фундаментальных аспектов исследования молекулярных факторов врожденного иммуниета.
Дополнительными объектами исследования стали пептиды, представляющие собой различные участки молекулы ChBac5: N-концевой фрагмент (1-20), С-концевой фрагмент (20 43), фрагменты 7-22 и 7-14. Изучение фрагментов пептидных молекул дает возможность выявить наиболее значимые для проявления того или иного вида биологической активности участки и поволяет наметить пути для дальнейшего структурно-функционального анализа, направленного на создание лекарственного препарата на основе структуры природного пептида. В литературе имеются данные об антимикробной активности некоторых фрагментов молекулы бактенецина 5 быка - BtBac5 (Raj et al., 1996;
Tokunaga et al., 2001;
Gennaro et al., 2002), имеющего структурное сходство с ChBac5, хотя и несколько отличающегося по антимикробным эффектам. Однако, исследована, в основном, антимикробная активность фрагментов BtBac5, в то время как другие виды активности фрагментов BtBac5, как и бактенецинов из лейкоцитов козы, остаются практически не изученными.
Целью работы явилось изучение различных видов биологической активности обогащенных пролином пептидов из семейства бактенецинов: антимикробной, липополисахарид-связывающей, цитотоксической и ранозаживляющей.
Для достижения поставленной цели было намечено решение следующих задач:
1. Изучить антимикробную активность обогащенных пролином пептидов и фрагментов их молекул в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, и грибов.
Исследовать антимикробное действие пептидов при их использовании в комбинации с некоторыми другими антибиотическими соединениями.
2. Провести сравнительное изучение влияния исследуемых бактенецинов и фрагментов их молекул, обладающих антимикробной активностью, на проницаемость мембран E.coli ML35p для маркерных молекул.
3. Изучить липополисахарид-связывающую активность пептидов.
4. Оценить токсичность пептидов для эукариотических клеток (гемолитическую активность, цитотоксичнсть для нормальных и опухолевых клеток человека) и исследовать характер цитотоксического действия бактенецинов, для которых выявлено выраженное повреждающее воздействие на клетки.
5. Изучить влияние пептидов на пролиферацию фибробластов человека и динамику процесса заживления кожной раны у экспериментальных животных.
Научная новизна. Получены новые данные об антимикробной активности пептидов из семейства бактенецинов, в том числе об их действии в отношении антибиотикоустойчивых клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii.
Впервые выявлены синергические эффекты антимикробного действия исследуемых бактенецинов при их совместном применении с наночастицами серебра, а также с используемым в клинике антибиотиком - рифампицином.
Впервые изучена липополисахарид-связывающая активность бактенецинов ChBac3.4, mini-ChBac7.5 и фрагментов ChBac5.
Впервые исследованы механизмы цитотоксической активности бактенецина ChBac3.4. в отношении опухолевых клеток. Показано, что его повреждающее действие на клетки U-937 и K-562 сопровождается инициацией в них процесса апоптоза.
Впервые исследовано влияние бактенецина 5 из лейкоцитов козы (ChBac5) и его фрагментов, а также бактенецинов ChBac3.4 и mini-ChBac7.5 на пролиферацию фибробластов кожи человека;
впервые показано свойство ChBac5 ускорять заживление кожной раны, оцениваемое по снижению площади раневой поверхности у экспериментальных животных.
Теоретическое и практическое значение. Исследование направлено на изучение биологической активности обогащенных пролином антимикробных пептидов и их укороченных фрагментов: антимикробной, липополисахаридсвязывающей, цитотоксической и ранозаживляющей. В работе моделировали отдельные стороны иммунных и патофизиологических процессов, сопряженных с защитными противоинфекционными и противоопухолевыми реакциями. Изучение антимикробной активности пептидов in vitro помогает понять молекулярные основы функциональной активности этих соединений, реализующихся в фаголизосомах фагоцитов и на поверхности слизистых респираторного, пищеварительного и урогенитального трактов, а также кожных покровов. Изучение цитотоксической активности открывает возможности для оценки противоопухолевого действия этих соединений. Анализ воздействия этих пептидов на заживление кожных ран важен для понимания роли пептидов лейкоцитарного происхождения в репаративных процессах.
Проведенные исследования определяют направления для дальнейшего структурно функционального анализа, который позволит реализовать разработку на основе этих пептидов новых антимикробных лекарственных препаратов, активных в отношении антибиотикоустойчивых штаммов бактерий. Выявленные эффекты синергического действия пептидов с небелковыми антибиотическими агентами (наночастицы серебра, рифампицин) открывают новые возможности повышения активности препаратов, созданных на основе антимикробных пептидов при их сочетанном применении с другими лекарственными веществами.
Установленная в работе митогенная активность бактенецинов свидетельствует о перспективности разработки новых лекарственных препаратов с антимикробным и ранозаживляющим действием на основе структуры ChBac5.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Исследуемые обогащенные пролином антимикробные пептиды лейкоцитов козы ChBac5, ChBac3.4, mini-ChBac7.5 и mini-ChBac7.5 проявляют высокую антимикробную активность, в том числе и в отношении антибиотикоустойчивых штаммов бактерий. Антимикробное действие АМП может быть усилено при их совместном применении с другими антибиотическими агентами. Наиболее важным участком для проявления антимикробной активности ChBac5, является его N-концевой фрагмент 1-20.
2. Антимикробное действие mini-ChBac7.5 и mini-ChBac7.5, ChBac5 и его фрагментов реализуется без существенного нарушения барьерной функции цитоплазматической мембраны Е.coli ML-35p;
пептид ChBac3.4, который отличается повышенной гидрофобностью молекулы, имеет относительно более выраженное повреждающее действие на цитоплазматическую мембрану E.coli.
3. Изученные пептиды обладают липополисахарид-связывающей активностью.
4. Исследуемые пептиды имеют низкую гемолитическую активность в отношении эритроцитов человека.
5. В концентрациях, превышающих антимикробные, обогащенные пролином пептиды не проявляют токсических эффектов в отношении клеток макроорганизма, за исключением бактенецина ChBac3.4. Повреждающее действие этого пептида на клетки линий U-937 и К- сопровождается инициацией в них апоптоза.
6. Некоторые из исследуемых ОПП стимулируют пролиферацию фибробластов кожи человека и ускоряют заживление кожных ран, оцениваемое по снижению площади раневой поверхности у экспериментальных животных.
Личный вклад в проведенные исследования. Личный вклад автора в выполненную работу включал самостоятельное проведение большинства исследований, анализ полученных данных и их интерпретацию. Масс-спектрометрический анализ выполнялся в ЦКП «Аналитическая спектрометрия». Математическое моделирование структур пептидов выполнено И.А.Елисеевым на оборудовании Лаборатории прикладной математики и механики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета. Синтез наночастиц серебра и характеристика их физико-химических параметров были проведены сотрудником НИИ Химии силикатов РАН им. Гребенщикова к.х.н. О.Ю.Голубевой.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 25 января 2012 г. на заседании научной конференции отдела общей патологии и патологической физиологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (г. Санкт Петербург). Основные положения диссертации были представлены на международной научной конференции по биоорганическй химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящённой 75 летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, сентября – 2 октября 2009 г.);
на конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (Москва, 2010 г.);
на конференции молодых ученых и специалистов «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург, 2011 г.;
II и III международных симпозиумах “Interaction of the nervous and immune systems in health and disease”, проводимых 16-19 июня 2009 г. и 7-10 июня 2011 г., Санкт-Петербург;
на Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии “X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова” 14 – 17 ноября 2011 г. (Москва-Пущино).
По теме работы опубликовано 12 печатных работ, из них 4 оригинальных статьи в журналах, рекомендованных ВАК, одна статья в сборнике и 7 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, их обсуждения, общего заключения и выводов. В диссертации 13 таблиц и 23 рисунка. Прилагаемый список литературы содержит 229 наименований, в том числе 17 отечественных и 212 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Антимикробные пептиды. Структуры природных бактенецинов из лейкоцитов козы, являющихся объектами иследования:
ChBac3.4 RFRLPFRRPPIRIHPPPFYPPFRRFL-NH mini-ChBac7.5-N RRLRPRRPRLPRPRPRPRPRPR-COOH mini-ChBac7.5-N RRLRPRRPRLPRPRPRPRPRP-COOH ChBac5 RFRPPIRRPPIRPPFNPPFRPPVRPPFRPPFRPPFRPPIGPFP-NH Фрагменты ChBac5: ChBac5 (1-20) RFRPPIRRPPIRPPFNPPFR-COOH ChBac5 (20-43) RPPVRPPFRPPFRPPFRPPIGPFP-NH ChBac5 (7-14) RRPPIRPP-COOH ChBac5 (7-22) RRPPIRPPFNPPFRPP-COOH На основе приведенных структур с помощью химического синтеза были получены соответствующие пептиды, которые использовались в большинстве экспериментов. Однако, для подтверждения того, что биологическая активность химически синтезированных пептидов не отличается от активности пептидов, выделенных из лейкоцитов, проводили выделение и очистку ОПП из лейкоцитов козы и сравнивали их активность с синтетическими аналогами.
Химический синтез бактенецинов ChBac3.4, miniBac7.5N, ChBac5 и его фрагментов был выполнен сотрудником ГосНИИ ОЧБ к.х.н. Колодкиным Н.И.;
химически синтезированный miniBac7.5N был любезно предоставлен профессором Ральфом Хоффманом (Лейпцигский университет, Германия).
Выделение и очистку ChBac5 и ChBac3.4 из лейкоцитов козы проводили, как описанно ранее (Shamova et al., 1999), с использованием комплекса методов препаративной биохимии, включавшего экстракцию белков и пептидов из гомогенизированных лейкоцитов 10% раствором уксусной кислоты, разделения белковых фракций с помощью ультрафильтрации и препаративного электрофореза в кислой среде. Индивидуальные фракции пептидов получали с помощью обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Идентификацию и оценку чистоты препаратов осуществляли с помощью аналитического электрофореза в кислой среде (Panyim, Chalkley, 1969) и электрофореза в присутствии додецил-сульфата натрия (Schagger, Von Jagow, 1987), а также с использованием масс-спектрометрии MALDI TOF. Концентрацию белка в пробах определяли спектрофотометрическими методами, используя коэффициенты молярной экстинкции при длине волны 280 нм для ChBac3.4 и 257 нм для ChBac5, который из ароматических аминокислот содержит только фенилаланин. Кроме того, концентрацию белка определяли по методу Бредфорд.
Экспериментальные животные. Эксперименты выполнены на взрослых мышах-самцах гибридах 1 поколения (СВА x C57Bl6) F1, массой 18-22 г, полученных из питомника РАМН «Рапполово» (Санкт-Петербург). Условия работы с животными соответствовали правилам Европейской Конвенции ЕТ/S 129, 1986 и директивам 86/609 ЕSС.
Оценку антимикробной активности методом серийных разведений пептидов в питательной среде, содержащей микроорганизмы, проводили в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий (включая золотистый стафилококк, устойчивый к метициллину, и ряд антибиотикоустойчивых клинических изолятов бактерий), а также грибов рода Candida (метод в модификации Tossi et al., 1997). Штаммы микроорганизмов были предоставлены сотрудниками Калифорнийского университета Лос-Анджелеса (США), Университета г. Триеста (Италия), Отдела генетики микроорганизмов ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН, НИИ Травматологии и ортопедии им. Вредена РАМН, ВМА им. Кирова. В качестве питательной среды для бактерий использовали бульон Мюллера-Хинтон, для грибов - Сабуро.
Двукратные серийные разведения исследуемых препаратов проводили в 0.01 М натрий фосфатном буфере, рН 7.4 с 150 мМ NaCl и вносили в лунки планшетов, содержащие суспензии микроорганизмов - 1х104 КОЕ бактерий на лунку. Определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) - наименьшие концентрации пептидов, при использовании которой полностью подавлялся рост микроорганизмов в жидкой среде, и затем минимальные бактерицидные концентрации. Эксперименты проводили в помещениях, оснащенными всеми необходимыми средствами защиты для работы с используемыми штаммами микроорганизмов.
Результаты представлены, как медианы, полученные по данным 5-6 экспериментов, в которых имелось по 3 параллели для каждой пробы.
Метод радиальной диффузии пептидов в агарозных гелях, содержащих микроорганизмы (Lehrer et al., 1991), использовали для сравнения антимикробной активности природных, полученных из лейкоцитов козы, и химически синтезированных пептидов.
Пептиды в серийных разведениях вносили в лунки агарозных гелей, приготовленных на 0.01 М Na-фосфатном буфере, рН 7.4 и содержащих исследуемые микроорганизмы, инкубировали часа при 37оС, заливали агаром, содержащим триптический гидролизат сои, и инкубировали в тех же условиях еще 20 часов. Далее измеряли диаметр зон ингибирования роста микроорганизмов.
Изучение совместного антимикробного действия пептидов и других антибиотических агентов с целью выявления синергических эффектов осуществляли с помощью серийных разведений пептидов в среде, содержащей микроорганизмы, по методу «Шахматной доски» («Сheckerboard titrations») (Jacobs, 1996). После инкубации проб с микроорганизмами в течении 18 часов определяли индексы фракциональной ингибирующей концентрации (иФИК;
FIC index - fractional inhibitory concentration index) по формуле: ФИК индекс = ФИК A + ФИК B = (A)/ (МИК A) + (B)/ (МИК B), где А и В– концентрации веществ А и В, соответственно. При иФИК 0,5, совместное действие препаратов рассматривали, как синергическое, ФИК = 1, как аддитивное;
иФИК 1 – антагонистическое. Исследовали совместное действие обогащенных пролином пептидов и небелковых антибиотических соединений (оксациллина (Sigma, США)), гентамицина (Дальхимфарм, Россия), рифампицина (Sigma, США) и наночастиц серебра (предоставлены сотрудниками НИИ Химии силикатов РАН им. Гребенщикова). Размер наночастиц серебра составлял около 50 нм.
Оценка изменения проницаемости мембран E.coli ML35p для хромогенных маркеров под действием пептидов. Принцип метода и особенности штамма E.coli ML35p описаны ранее (Lehrer et al., 1989;
Артамонов и др., 2008). О состоянии внешней и цитоплазматической мембран E.coli ML35p судили по их проницаемости для хромогенных маркеров - нитроцефина (внешняя мембрана) и о-нитрофенил--D-галактопиранозида (ONPG) (цитоплазматическая мембрана). Состав проб в лунках планшета: 2.5 мМ ONPG (Sigma (США)) или 90 мкМ нитроцефина;
2,5 x 107 КОЕ/мл бактерии;
0.01 М Na-фосфатный буфер рН 7.4 с 100 mM NaCl;
0.03% триптический гидролизат сои;
пептиды в заданных концентрациях.
Измерение оптической плотности растворов при длине волны 486 нм и 420 нм проводили с помощью спектрофотометра SpectraMax 250 фирмы Molecular Devices при температуре 37оС и периодическом встряхивании планшетов. Данные обрабатывали в программе Sigma Plot9. На графиках представлены результаты типичного эксперимента, каждая точка является средним арифметическим из трех значений, полученных для параллельных проб. Эксперименты повторяли минимум 3 раза, характер кривых был аналогичным во всех проведенных сериях экспериментов.
Молекулярное моделирование. Математическое моделирование структур пептидов выполнено И.А.Елисеевым на оборудовании Лаборатории прикладной математики и механики Санкт Петербургского государственного политехнического университета. Гидрофобные свойства пептидов были оценены с помощью расчета разности свободных энергий в воде и в среде, моделирующей мембрану (н-октаноле) с использованием программы Matlab. Удельные разности свободных энергий для аминокислот с учетом пептидной связи взяты из работы Wimley, White, 1996.
Оценку липополисахарид-связывающей активности пептидов проводили с помощью Лимулюс теста (Quantitative Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate (LAL);
Lonza Walkersvile, США) с использованием методов и подходов, описанных в статье Turner et al., 1998. Cерийные разведения пептидов инкубировали с липополисахаридом E.coli O111:B4 в конечной концентрации 0.5 Ед/мл в течение 30 мин при 37 оС. Планшет инубировали при 37 оС, измеряя оптическую плотность раствора при 405 нм;
вычисляли разницу величин оптической плотности в начале инкубации и через 10 мин – OD405. Долю связанного ЛПС (в процентах) определяли по формуле: % связанного ЛПС = (ЛПС без пептида) –(ЛПС с пептидом) / (ЛПС без пептида), где = OD405(пептид (или вода) с ЛПС) - OD405(пептид (или вода) без ЛПС).
Строили кривые зависимости доли связанного ЛПС (в %) от концентрации пептидов в инкубационной среде (программа Sigma Plot 9) и определяли ЭК50 (эффективная концентрация 50% или концентрация пептидов, при которой 50% ЛПС находится в связанном состоянии).
Для анализа гемолитической активности пептидов использовали эритроциты человека, полученные по стандартной методике. К суспензии эритроцитов добавляли серийные разведения пептидов. Для получения положительного контроля (100 % лизис эритроцитов) к эритроцитам вместо пептидов добавляли 10% Triton X-100;
негативного контроля (0 % лизис) – забуференный физиологический раствор (ЗФР). Анализируемые растворы инкубировали при °С в течение 30 мин, затем пробы центрифугировали при 8000 g и измеряли оптическую плотность полученных супернатантов при длине волны 540 нм. Результаты представляли, как средние арифметические из трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.
Культивируемые клетки. В работе использовали следующие клеточные линии: клетки эритромиелоидной лейкемии человека К-562, клетки гистиоцитарной лимфомы человека U-937, клетки промиелоцитарной лейкемии человека HL-60, а также нетрансформированные клетки:
нормальные фибробласты кожи человека и фибробласты легкого эмбриона человека MRC-5.
Культура фибробластов кожи человека была любезно предоставлена сотрудником отдела иммунологии А.С.Трулевым, остальные клеточные линии были из коллекции клеточных культур ИНЦ РАН. Клетки суспензионных линий К-562, U-937, HL-60 культивировали в среде RPMI-1640, дополненной глутамином, гентамицином и 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки, образующие монослой, культивировали в среде ДМЕМ, содержащей те же добавки. Нейтрофилы и мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека получали из крови здоровых доноров по стандартной методике (Фримель, 1979).
Оценку жизнеспособности клеток и интенсивности их пролиферации исследовали с помощью МТТ-теста (Mossamann, 1983). Клетки монослойных культур (фибробласты кожи чело века, MRC-5) высеивали в планшеты (10000 клеток на лунку) за 20 часов до внесения пептидов, чтобы позволить клеткам сформировать монослой, клетки суспензионных линий вносили непосредственно перед добавлением к ним пептидов в разных концентрациях. Для построения графиков и расчета медианной ингибирующей концентрации пептидов (ИК50) использовали программу Sigma Plot 9. При проведении статистической обработки подсчитывали среднее арифметическое и среднеквадратичное отклонение. Кроме того, для оценки жизнеспособности клеток после их обработки пептидами применяли маркер клеточной гибели – краситель трипановый синий, подсчитывая число погибших клеток, включивших краситель, в камере Горяева.
Определение ферментативной активности каспазы 3 проводили колориметрическим методом по скорости расщепления синтетического субстрата Ac-DEVD-pNAс помощью набора «Caspase3 AssayKit, Colorimetric» («Sigma»). Клетки (1 млн/мл) инкубировали с разными концентрациями пептида в течение 3 часов при 37 оС в трех параллелях. По окончании инкубации клетки обрабатывали в соответствии с рекомендациями изготовителей набора.
Полученные пробы в 96-луночных планшетах инкубировали при 37 оС в течении 3 часов, затем оптическую плотность измеряли при 405 нм. На графиках результаты измерения активности представляли в процентах от контроля (клетки без пептида).
Оценку доли клеток, вступивших на путь апоптоза и некроза производили с помощью набора реагентов «Annexin V-Cy3 Apoptosis Detection kit» (Sigma, США). Клетки ( млн/мл) инкубировали с разными концентрациями пептида в течение 2 часов при 37 оС.
Контрольные пробы инкубировали в тех же условиях, но без добавления пептидов. По окончании инкубации клетки обрабатывали в соответствии с рекомендациями производителей набора и подсчитывали под люминесцентным микроскопом количество клеток, включивших тот или иной краситель, определяя, таким образом, количество живых клеток;
клеток, погибших по пути некроза;
и клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза. Анализировали несколько полей зрения, подсчитывая не менее 500 клеток. Результаты выражали в процентах от общего количества клеток и представляли как средние арифметические по данным трех экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.
Влияние пептидов на пролиферацию фибробластов кожи человека. Фибробласты кожи человека высеивали в стерильный планшет (“Orange Scientific”, Бельгия) по 10000 клеток на лунку в среде ДМЕМ с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой и добавляли серийные разведения пептидов в той же среде. Планшеты с клетками и пептидами инкубировали в CO инкубаторе в теченние 72 часов инкубации при 37оС, затем оценивали интенсивность пролиферации фибробластов с помощью МТТ-теста.
Влияние пептидов на процесс заживления кожной раны у мышей.
Экспериментальным животным под легким эфирным наркозом наносили по две полнослойные кожные раны в области спины, используя одноразовые круглые скальпели для биопсий диаметром 6 мм («Stiefel», Германия). В 1-й, 2-й, 4-й, 6-й и 8-й день эксперимента на поверхность ран наносили раствор ChВас5 в концентрации 2 или 10 мкМ;
животным контрольной группы по той же схеме наносили растворитель. Для определения площади раневой поверхности, начиная со второго дня после воздействия, животных фотографировали цифровой фотокамерой, изображения переносили на компьютер, калибровали и измеряли площадь раневого дефекта с помощью программы ImageJ 1.44p (NIH, USA). Результаты выражали в процентах от исходной площади в контрольной группе и представляли как среднее арифметическое значение и среднеквадратичное отклонение (n=6).
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов программ Excel, Statistica 6.0 и Sigma Plot 11. Для выявления различий между независимыми группами нормально распределенных величин использовали t-критерий Стьюдента;
различия между группами считали статистически достоверными при р0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие пептидов на микроорганизмы Антимикробная активность обогащенных пролином пептидов. Изучена антимикробная активность пептидов из семейства бактенецинов в отношении ряда грамотрицательных, грамположительных бактерий, а также грибов. В серии предварительных экспериментов показано, что антимикробная активность природных пептидов ChBac3.4 и ChBac5, выделенных нами из лейкоцитов козы, и активность химически синтезированных пептидов не различаются (Таблица 1).
Таблица 1. Минимальные ингибирующие рост микроорганизмов концентрации обогащенных пролином пептидов, мкМ (метод радиальной диффузии) Выделенные из лейкоцитов Химически синтезированные ChBac3.4 ChBac5 ChBac3.4 ChBac 0.8 ± 0.2 0.7 ± 0.2 0.7 ± 0.1 0.7 ± 0. Escherichia coli ML35p 0.9 ± 0.3 0.8 ± 0.1 1.0 ± 0.2 0.9 ± 0. Listeria monocytogenes EGD С использованием химически синтезированных пептидов показано, что бактенецины ChBac3.4, mini-ChBac7.5N, mini-ChBac7.5N и ChBac5 проявляют высокую антимикробную активность против грамотрицательных бактерий, причем активность этих пептидов в отношении клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp, Acinetobacter baumannii, устойчивых к ряду традиционно используемых в клинической практике антибиотикам, не отличается от таковой в отношении лабораторных штаммов (Таблица 2).
Таблица 2. Минимальные ингибирующие рост микроорганизмов концентрации обогащенных пролином пептидов, мкМ*.
mini- mini пептид ChBac ChBac ChBa ChBac5 ChBac5 ChBac5 ChBac5 ChBac 3.4 c (1-20) (7-14) (7-22) (20-43) микроорганизм 7.5N 7.5N грамотрицательные бактерии 2 1 1 2 8 32 32 E. coli ATCC E. coli M17 2 2 2 2 16 32 32 E. coli ML35p 2 1 1 2 4 32 32 Pseudononas aeruginosa 2 1 1 4 8 32 32 ATCC Pseudononas aeruginosa 1 1 1 2 8 32 32 клин. изолят Klebsiella spp. клин. изол. 4 1 1 4 8 32 32 Acinetobacter baumannii 4 1 4 1 - - - клин. изолят Acinetobacter baumannii 2 4 - 2 16 - - грамположительные бактерии Staphylococcus aureus 8 16 16 32 32 32 32 АТСС 8 32 32 32 32 32 32 MRSA ATCC Staphylococcus intermedius 16 32 32 32 32 32 32 клин. изолят 1 1 0,5 1 16 32 32 Micrococcus luteus Listeria monocytogenes ЕGD 1 1,25 1,25 1 8 32 32 грибы Candida albicans 820 16 32 32 16 32 32 32 Candida parapsilosis 32 32 32 32 32 32 32 клин. изолят * -метод серийных разведений антибиотических препаратов в питательной среде, содержащей микроорганизмы. Представлены медианы, полученные из 5-6 независимых экспериментов.
В результате исследования активности бактенецинов в отношении грамположительных бактерий показано, что ChBac5, mini-ChBac7.5N, mini-ChBac7.5N демонстрируют высокую активность против Listeria monocytogenes EGD и Miсrococcus luteus, но сниженную активность против исследованных штаммов стафилококков. Пептид ChBac3.4 обладает более высокой активностью в отношении стафилококков по сравнению с остальными пептидами.
Из исследуемых фрагментов молекулы пептида ChBac5 лишь N-концевой фрагмент 1- обладает антибактериальной активностью. Эти данные согласуются с результатами работ итальянских исследователей, полученными для бактенецина быка BtBac5 (Gennaro et al., 2002) и подтверждают важность присутствия первых трех аминокислотных остатков RFR в молекуле бактенецинов. Бактенецин быка BtBac5 имеет структурное сходство с ChBac5 из лейкоцитов козы, хотя их антимикробная активность несколько различается (Shamova et al., 1999). В нашей работе установлено, что, в отличие от бактенецина 5 быка, фрагмент 7-22 которого проявлял антигрибковую активность (Tokunaga et al., 2001;
Raj et al., 1995, 1996), в случае бактенецина козы ChBac5 фрагмент 7-22, хотя и имеет структурное сходство с таковым BtBac5, но не обладает антимикробной активностью. Таким образом, для проявления антимикробной активности ChBac5 бактерий важна N-концевая часть молекулы.
Минимальные бактерицидные концентрации пептидов в отношении большинства штаммов бактерий при использовании ChBac3.4 и ChBac5 в два раза, а в случае mini-ChBac7. и в 4-8 раз, превышали их минимальные ингибирующие концентрации.
При оценке антимикотического действия исследуемых пролин-богатых пептидов выраженного действия на грибы рода Candida выявлено не было.
Учитывая описанные в литературе данные об ингибирующем действии компонентов сыворотки крови на антимикробную активность большинства АМП, исследовали влияние добавления 10 % сыворотки коров в инкубационную среду на активность бактенецинов ChBac5, mini-ChBac7.5N, ChBac3.4 в отношении двух штаммов Acinetobacter baumannii.
Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3. Минимальные ингибирующие рост микроорганизмов концентрации (МИК) пептидов при их действии на бактерии в присутствии 10% сыворотки крови МИК (мкМ)* при инкубации с пептидами** Бактерия ChBac3.4 ChBac5 mini-ChBac 7.5-N -S +S -S +S -S +S Acinetobacter baumannii 4174 2 8 2 8 4 Acinetobacter baumannii (клин.изол.) 4 8 1 4 1 * - Представлены значения медиан, полученных после проведения 5 независимых экспериментов по изучению активности пептидов ** в среде, содержащей (+ S) и не содержащей (- S) 10 % эмбриональной сыворотки коров.
Показано, что антимикробная активность пептидов снижается в присутствии компонентов сыворотки крови, но не отменяется. Возможно, как и другие АМП, они связываются преимущественно с белками из семейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинами).
Совместное действие пептидов и других антибиотических агентов. Использование комбинаций лекарственных препаратов часто приводит к повышению эффективности их применения и снижает действующие концентрации, что позволяет уменьшить и вероятность проявления побочных эффектов. В данной работе использовали комбинации обогащенных пролином бактенецинов и небелковых соединений, обладающих антимикробной активностью (гентамицина, оксациллина, рифампицина и наночастиц серебра). Установлено, что при совместном применении ChBac3.4, в комбинации с наночастицами серебра наблюдаются синергические эффекты в отношении штаммов E.coli ML35p (индекс фракциональных ингибирующих концентраций (иФИК) – 0.5), E.coli ATCC 25922 (иФИК - 0.5) а также клинического изолята Pseudomonas aeruginosa, устойчивого к традиционно используемым в клинике антибиотикам (иФИК- 0.5). При использовании mini-ChBac7.5N в комбинации с наночастицами серебра также было показано наличие синергических эффектов в отношении этих штаммов микроорганизмов (иФИК - 0.5). В отношении штамма Staphylococcus aureus SG 511 установлено наличие аддитивного эффекта для комбинаций наночастиц серебра с ChBac3.4, и mini-ChBac7.5N с наночастицами серебра (иФИК - 1). При совместном действии mini-ChBac7.5N и рифампицина наблюдаются синергические эффекты в отношении штаммов E.coli ML35p (иФИК – 0.5) и E.coli ATCC 2592 (иФИК – 0.5). Но при совместном действии этого же пептида с гентамицином и оксациллином на те же штаммы синергическое действие не выявляется. При совместном действии ChBac3,4 и рифампицина в отношении штаммов E.coli ML35p и E.coli ATCC 25922 также обнаружено синергическое действие (иФИК – 0.5), но оно отсутствует при совместном применении исследуемого пептида с гентамицином и оксациллином на те же штаммы.
Влияние пептидов на проницаемость мембран E.coli ML35p для маркерных молекул. В результате исследования влияния пептидов на проницаемость внешней мембраны E.coli ML35p для хромогенного маркера нитроцефина показано (Рис. 1.А), что все исследуемые обогащенные пролином пептиды в той или иной степени вызывают увеличение ее проницаемости (о чем свидетельствует возрастание оптической плотности раствора, определяемое появлением в нем цветного продукта расщепления нитроцефина). Фрагменты бактенецина ChBac5(1-20) и ChBac5(20-43) тоже вызывают увеличение проницаемости наружной мембраны E.coli ML35p, хотя и менее выраженное, чем полноразмерный ChBac5.
Остальные фрагменты не использовали, так как они практически не обладали антимикробным действием в отношении этой бактерии. Действие исследуемых бактенецинов на цитоплазматическую мембрану бактерии носит иной характер (Рис. 1.Б): в присутствии ChBac3.4 (5 мкМ) увеличение проницаемости мембраны E.coli для маркерной молекулы ONPG наблюдается через 20 минут, в присутствии ChBac5 в той же концентрации эффект наблюдается лишь через 45-50 минут, а в присутствии пептидов mini-ChBac7.5N, mini ChBac7.5N и фрагмента бактенецина ChBac5(1-20) изменение проницаемости не отличается от проницаемости внешней мембраны бактерии в контроле (бактерия без пептида).
Рисунок 1.
Кинетика изменения проницаемости мембран для E.coli ML35p маркерных молекул при действии антимикробных пептидов (концентрации пептидов в два раза превышали их минималь ные ингибирующие концентрации для E.coli).
По оси ординат - оптическая плотность раствора, содержащего хромогенный маркер (продукт гидролиза ONPG - о-нитрофенол) при длине волны 420 нм;
по оси абсцисс – время инкубации Рисунок 2.. Кинетика пептидов с бактерией, в минутах. Контролем служили пробы, содержащие бактерии, но в изменения проницаемости которые вместо пептидов добавляли равные объемы буфера;
а также пробы, содержащие мембран E.coli ML35p для стандарт – мембранолитический пептид мелиттин.
хромогенного маркера при действии антимикробных Таким образом, ChBac3.4 проявляет более выраженный и быстро (концентрации пептидов реализующийся пептидов в два раза эффект в отношении мембран E.coli, чем ChBac5 и остальные изучаемые пептиды. Такое превышали их действие на бактериальные мембраны не характерно для описанных минимальные обогащенных в литературе ингибирующие пролином АМП. Чтобы выяснить причину различного действия пептидов на мембраны концентрации для E.coli).
бактерии проведено сравнение гидрофобных свойств молекул ChBac3.4 и ChBac5, так как определение этого параметра является одной из важных характеристик белковых молекул и позволяет сделать предположение о возможности встраивания этих молекул в липидные мембраны. Оценка гидрофобных свойств ChBac3.4 и ChBac5 была осуществлена в результате расчета разности свободных энергий в воде и среде, имитирующей липидный бислой мембраны (н-октаноле): для ChBac3.4 она имеет значение -16±5 Дж/моль, а для ChBac5 составляет 700±280 Дж/моль, что позволяет предположить большее сродство ChBac3.4 к липидным мембранам по сравнению с ChBac5. Таким образом, более выраженное действие пептида ChBac3.4, наблюдаемое в эксперименте, по-видимому, определяется гидрофобными свойствами его молекулы, обусловливающими его облегченное встраивание в липидные бислои, требующее значительно меньших затрат энергии, чем в случае ChBac5. Эти расчеты подтверждают предположение, что более высокая активность ChBac3.4 в отношении грамположительных бактерий по сравнению ChBac5 связана с его бльшим повреждающим действием на мембраны бактерий.
Оценка липополисахарид-связывающей активности пептидов. Одним из важных функциональных свойств антимикробных пептидов является их способность связывать бактериальный липополисахарид (ЛПС), являющийся ведущим структурным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Связывание антимикробных пептидов с ЛПС происходит на первой стадии контакта пептидов с микроорганизмами, и от эффективности этого связывания во многом зависит и эффективность антимикробного действия последнего. Для оценки ЛПС-связывающей активности пептидов использовали хромогенный Лимулюс-тест. Данные проведенного анализа представлены в таблице 4, как ЭК50, т.е. концентрации пептидов, при которых 50% ЛПС находится в связанном состоянии.
Таблица 4. Липополисахарид-связывающая активность пептидов (ЭК50, мкМ) mini-ChBac mini-ChBac ChBac5 ChBac ChBac 3.4 ChBac 7.5N 7.5N (1-20) (20-43) 8.3±1.2 33± 4.3 23.0±4.1 5.2± 1.0 40.6± 6.3 Липополисахарид-связывающая активность бактенецинов ChBac5 и ChBac3.4 несколько выше, чем активность mini-ChBac7.5-N и mini-ChBac7.5-N, а также фрагмента ChBac5(1-20).
С-концевой фрагмент ChBac5(20-43) проявлял низкую активность по сравнению с другими пептидами. Возможно, его низкая антимикробная активность обусловлена сниженной способностью связываться с бактериальным ЛПС, приводящей к нарушению контакта с бактериальной клеткой, который необходим для реализации антимикробного действия.
Действие пептидов на клетки млекопитающих К настоящему времени описано большое количество обогащенных пролином антимикробных пептидов, включая пептиды насекомых, ракообразных, млекопитающих. Для всех этих ОПП была показана низкая токсичность в отношении эукариотических клеток при использовании в диапазоне концентраций на два порядка превышающих микробоцидные. В задачи нашей работы входило изучение гемолитического действия пептидов из семейства бактенецинов, их эффектов в отношении культивируемых клеток – нормальных и опухолевых, а также исследование влияния пептидов на пролиферацию фибробластов кожи человека.
Гемолитическая активность. Оценка свойства биомолекул вызывать лизис эритроцитов позволяет сделать предположение о наличие повреждающего действия этих соединений на мембраны эукариотических клеток. В результате оценки гемолитической активности бактенецинов в отношении эритроцитов человека показано, что все исследуемые обогащенные пролином пептиды (как химически синтезированные, так и выделенные из лейкоцитов) не оказывают выраженного действия на эритроциты даже в концентрации 40-100 мкМ.
Оценка токсического действия обогащенных пролином пептидов на клетки человека в культуре. В то время как большинство изучаемых пептидов по результатам МТТ теста не проявляют существенных токсических эффектов в отношении исследуемых клеточных линий, эффект ChBac3.4 на эукариотические клетки отличен: пептид проявляет выраженное токсическое действие в отношении ряда культивируемых клеток (Таблица 5), причем его действие более эффективно в отношении опухолевых клеток (гистиоцитарной лимфомы человека U-937, эритромиелоидной лейкемии человека K-562, промиелоцитарной лейкемии человека HL-60) по сравнению с нетрансформированными клетками. При этом в присутствии сыворотки крови, токсическое действие пептида, хотя и снижается, но не отменяется полностью. Легочные эмбриональные фибробласты человека (MRC5), первичные фибробласты кожи человека устойчивы к действию пептида в исследуемом диапазоне концентраций. Однако нейтрофилы и клетки фракции мононуклеарных лейкоцитов человека несколько более чувствительны к повреждающему воздействию ChBac3.4, хотя в присутствии сыворотки крови токсический эффект не наблюдается.
Таблица 5. Цитотоксическое действие ChBac3.4 и ChBac5 на опухолевые и нетрансформированные клетки человека в культуре (МТТ-тест) ИК50 (мкМ)* при инкубации с пептидами** Клетки mini-ChBac mini-ChBac ChBac3.4 ChBac 7.5-N 7.5-N +S -S +S -S +S -S +S -S 8.6 ± 2.1 U937 24.4 ± 2.7 30 30 30 30 9.3 ± 1.4 # 25 # 21.6 ± 3.8 5.4 ± 0. K562 30 30 30 30 30 10.4 ± 3.4 4.8 ± 0. HL60 30 30 30 30 30 Нейтрофилы 20.1 ± 3. 30 30 30 30 30 30 крови человека Мононуклеары 16.4 ± 4. 30 30 30 30 30 30 крови человека MRC5 30 30 30 30 30 30 30 Фибробласты 30 30 30 30 30 25 # 25 # кожи человека * - Представлены медианные ингибирующие концентрации пептидов (ИК 50) в мкМ при их действии на клетки ** в среде, содержащей (+ S) и не содержащей (- S) 10 % эмбриональной сыворотки коров.
# - данные, полученные для пептидов, выделенных из лейкоцитов козы Таким образом, цитотоксическая активность бактенецина ChBac3.4 проявляется в большей степени в отношении опухолевых клеток, чем нормальных клеток человека. Причина наблюдаемых различий пока не ясна, возможно они связаны с несколько большим отрицательным зарядом на поверхности опухолевых клеток по сравнению с нормальными, что определяет повышенное сродство пептидов к поверхности этих клеток.
Некоторые механизмы цитотоксического действия ChBac3.4. Чтобы оценить, насколько быстро реализуются токсические эффекты ChBac3.4 на клетки-мишени, изучали динамику и эффективность его токсического действия в отношении клеток U-937 (клетки гистиоцитарной лимфомы человека) и К-562 (клетки эритромиелоидной лейкемии человека), инкубируя клетки-мишени с пептидом в течении раличных промежутков времени и оценивая количество живых и мертвых клеток с использованием витального красителя трипанового синего. Это, в отличие от МТТ-теста, давало возможность получить немедленный результат (Рис. 2 А и Б). При добавлении к клеткам U-937 бактенецина ChBac3.4 в концентрации 40 мкМ через 30 мин наблюдается снижение количества жизнеспособных клеток на 60 %, однако далее доля живых клеток изменяется менее заметно и через 3 часа полного подавления их жизнеспособности не установлено (Рис.2 А). В концентрациях 20 и 10 мкМ токсическое действие пептида более отсрочено, и выраженный эффект наблюдается лишь через 3 часа. В отношении клеток К-562 характер токсического действия пептида, в целом, сходный (Рис. 2. Б), хотя в концентрациях 40 и 20 мкМ его действие на клетки этой линии несколько более эффективно, чем в отношении клеток U-937. В более низких концентрациях действие пептида менее выражено.
40 mM А 20 mM Доля жизнеспособных клеток, % 120 10 mM Рисунок 2. Динамика токсического 5 mM действия пептида ChBac3.4, применяемого А в разных концентрациях, в отношении клеток U-937 (А) и К-562 (Б) в культуре (окраска клеток витальным красителем трипановым синим).
По оси Y – доля жизнеспособных клеток, в процентах (за 100 % принимали 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Время, мин Б значения для контрольных проб, не Доля жизнеспособных клеток, % 40 mM содержащих пептида и инкубировавшихся 20 M 10 M в тех же условиях, что и опытные пробы, и Б 5 M в течение того же промежутка времени);
по оси Х – время инкубации клеток при 37 оС, в минутах (n = 4-6).
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Время, мин Чтобы выяснить, вызывают ли пептиды клеточную гибель по пути некроза или в некоторых случаях действие пептидов на клетки-мишени сопровождается инициацией в них апоптоза, использовали два подхода: оценивали активность каспазы 3 – ключевой эффекторной каспазы, участвующей в реализации процесса апопотоза;
а также выявляли клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза с использованием набора реактивов, содержащего Аннексин V. После инкубации клеток U-937 в течении 3 часов в присутствии ChBac3.4 в концентрациях 40, 20, 10 и 5 мкМ активность каспазы 3 возрастает по сравнению с контрольными пробами (Рис. 3).
Рисунок 3. Активность каспазы Активность каспазы 3, % * U- клетках U-937 и К-562 при обработке K- ** * клеток бактенецином ChBac3.4 в течение 3 часов при 37 оС.
* * За 100% принимали величину * активности каспазы 3 в контроле контроль контроль клетках, инкубировавшихся в тех же условиях, но в отсутствии пептидов.
0 1.3 2.5 5 10 20 Концентрация пептидов, M В аналогичных экспериментах с клетками К-562 также наблюдается увеличение активности каспазы 3, хотя и в несколько меньшем диапазоне концентраций (10-40 мкМ).
Примение набора реагентов, содержащего Аннексин V, дало возможность установить, что при инкубации клеток U-937 с бактенецином в концентрации 20 мкМ около 42 % клеток находятся на ранней стадии апотоза (Рис. 4 А);
около 18 % клеток погибают путем некроза.
Остальные клетки оказались неповрежденными.
120 А Б живые живые некроз некроз (% от общего количества) 100 (% от общего количества) апоптоз апоптоз Количество клеток Количество клеток А Б 80 # + 60 + # # * * * * * + # * # + 20 0 10 мкМ 40 мкМ 20 мкМ 40 мкМ контроль 20 мкМ 10 мкМ контроль Рисунок 4. Оценка количества клеток U-937 (А) и К-562 (Б), находящихся на ранней стадии апоптоза или гибнущих по пути некроза, после их обработки пептидом ChBac3.4.
По оси Y – количество живых клеток или клеток, гибнущих по пути некроза, или апоптоза, в процентах от общего количества клеток. Различия достоверны - по сравнению с числом живых клеток (#), клеток с признаками некроза (+) и апоптоза (*) в контрольных пробах, где клетки инкубировали в тех же условиях, но без добавления пептидов (р0.05, t критерий Стъюдента, n=4).
При обработке клеток К-562 этим пептидом в концентрации 20 и 10 мкМ, тоже выявлялось значительное количество клеток, находящиеся на ранней стадии апоптоза (Рис. Б). При более высокой концентрации пептида (40 мкМ) значительно возрастает количество клеток, погибающих по пути некроза для обеих клеточных линий. К настоящему времени в литературе имеются лишь единичные работы, в которых описана способность антимикробных пептидов из нейтрофилов млекопитающих вызывать или модулировать процесс апоптоза клеток in vitro. Так, было показано, что линейный пептид из лейкоцитов быка ВМАР инициирует апоптоз опухолевых (K-562, U-937) и нормальных (активированных лимфоцитов человека) клеток (Risso et al., 2002);
есть данные о способности АМП человека LL- инициировать апоптоз в клетках эпителия дыхательных путей (Barlow et al., 2006), в то время как дефенсины человека вызывают клеточную гибель, в основном, не по пути апоптоза, а по пути некроза (Carlo et al., 2001). С другой стороны, есть работы, в которых сообщается о способности пептида LL-37 человека, а также пептида PR-39 свиньи ингибировать процесс апоптоза нейтрофильных гранулоцитов (Nagaoka еt al., 2006;
Ramanathan еt al., 2004), хотя механизм наблюдаемых явлений пока не ясен, и противоречивость данных, в некоторой степени объясняется тем, что в различных работах пептиды применяли в разных диапазонах концентраций, а также существенными различиями природы клеток-мишеней. Нами впервые продемонстрировано свойство пептида из семейства бактенецинов инициировать процесс апоптоза в клетках.
Влияние АМП на пролиферацию фибробластов человека. Для многих АМП показано, что в низких концентрациях они обладают митогенным действием. Так, обогащенный пролином PR-39 стимулировал пролиферацию клеток в культуре и ускорял процесс регенерации тканей у экспериментальных животных (Chan, Gallo, 1998). В данной работе изучено влияние ChBac3.4, mini-ChBac7.5-N, ChBac5 и его фрагментов на пролиферацию фибробластов кожи человека. По результатам МТТ-теста, пролиферативная активность клеток в пробах, инкубировавшихся в течение 72 часов в присутствии ChBac5 в концентрациях 1.25, 2.5, 5 и 10 мкМ, достоверно выше, чем в контрольных пробах, где клетки инкубировали без пептидов (Рис. 5). В присутствии mini-ChBac7.5-N в концентрации 10 мкМ (но не в концентрации 5, 2.5, и 1.25 мкМ) тоже наблюдается увеличение пролиферативной активности клеток. В случае применения ChBac3.4 достоверных различий с контролем не выявлено.
Пролиферативная активность клеток, % Рисунок 5. Пролиферация фибробластов * ** * кожи человека в присутствии ChBac3.4 и * ChBac5 (данные МТТ теста) при инкубации * пептидов с клетками 72 часа при 37 оС в атмосфере СО2.
контроль По оси Y – пролиферативная активность клеток, % от контроля (показатели, полученные для контроль клеток, которые инкубировали без пептидов).
По оси Х – концентрация пептидов в мкМ.
- ChBac3.4;
- ChBac5;
- mini-ChBac7.5-N * - р 0.05 по сравнению с контролем 0.625 1.25 2.5 0 (t-критерий Стьюдента).
Концентрация пептида, мкМ В молекуле ChBac5 присутствует участок RxxPxxP (7-13), имеющийся также у другого ОПП - PR-39 из лейкоцитов свиньи. Благодаря наличию этого участка, PR-39 способен связываться с SH3-доменами некоторых белков, что обусловливает проявление многообразных эффектов PR-39 в отношении эукариотических клеток и определяет его свойства влиять на пролиферацию эпителиальных клеток, ускорять заживление ран, стимулировать ангиогенез, оказывать противовоспалительное действие (Chan, Gallo, 1998;
Li et al., 2000;
Shi et al., 1996). В нашей работе изучены эффекты действия на пролиферацию фибробластов различных фрагментов бактенецина ChBac5, содержащих последовательность RxxPxxP (RRPPIRP), составляющую участок с 7 по 13 аминокислоты: N-концевого фрагмента ChBac5(1-20), фрагментов ChBac5(7-14) и ChBac5(7-22), а также С-концевого фрагмента ChBac5(20-43), не имеющего данного участка (Рис. 6). Интенсивность пролиферации клеток достоверно больше в присутствии N-концевого фрагмента молекулы бактенецина – ChBac5(1-20) (в концентрации 10 мкМ). Остальные фрагменты не проявляют стимулирующего действия в отношении фибробластов кожи человека.
Пролиферативная активность клеток,% Рисунок Пролиферация 6.
* фибробластов кожи человека в присутствии фрагментов ChBac (данные МТТ теста) при инкубации пептидов с клетками контроль часа при 37 оС в атмосфере СО2.
контроль По оси Y – пролиферативная активность клеток в процентах от контроля (фибробласты, которые инкубировали без добавления 1.25 2.5 5 пептидов). По оси Х – 0 0. Концентрация пептидов, мкМ концентрация пептидов в мкМ.
- ChBac5 (1-20);
- ChBac5 (7-14), - ChBac5 (7-22), - ChBac5 (20-43).
* - р 0.05 по сравнению с контролем, n=6 (t-критерий Стьюдента).
Эти данные согласуются с результатами, описанными в литературе для PR-39:
биологическая активность, показанная для полноразмерного PR-39, наблюдалась лишь для фрагментов его молекулы, содержащих, как SH3-связывающий участок, так и Пролиферация Рисунок7. N-концевые фибробластов кожи человека не в аминокислоты. Хотя механизм влияния ChBac5 на пролиферацию фибробластов пока присутствии фрагментов ChBac выяснен, полученные данные позволяют сделать заключение(данные МТТ N-концевогоинкубации о важности теста) при участка молекулы ChBac5 не только для проявления его антимикробной, но и митогенной72 часа при 37 оС пептидов с клетками активности.
Влияние бактенецина на процесс заживления кожной раныСО2мышей. Учитывая в атмосфере у.
полученные данные об эффектах действия бактенецина ChBac5 на пролиферацию фибробластов, возник вопрос, обладает ли этот пептид влиянием на процесс заживлния ран. Изучено влияние пептида на динамику изменения площади полнослойной кожной раны у мышей при обработке ран раствором ChВас5 (2 мкМ и 10 мкМ) в 1-й, 2-й, 4-й, 6-й и 8-й дни после воздействия (Рис. 7).
Рисунок 7. Заживление кожной раны у мышей при обработке ран Площадь раневой поверхности, бактенецином ChBac5.
По оси Y – площадь раневой % от контроля (2-й день) * поверхности в процентах от контрольного значения (площадь * раневой поверхности у животных, раны которых обрабатывали * раствором, не содержащим пептида), измеренного на 2-й день после * нанесения раны.
По оси Х – дни после нанесения полнослойной кожной раны.
6-й день 4-й день 2-й день 8-й день - ChBac5 (10 мкМ);
- ChBac5 (2 мкМ);
- контроль (без пептида).
Рисунок 8. Заживление кожной раны у * - р 0.05 по сравнению с контрольной группой, в которой измерения проводили в тот же мышей при обработке ран бактенецином день, что и в опытной, n=5 (t-критерий Стьюдента).
ChBac5.
Уже на второй день после нанесения ран площадь раневого площадь раневой поверхноси в у По оси Y – дефекта достоверно ниже мышей, раны которых обрабатывали пептидом в концентрации 10 мкМ (площадь раневой с процентах от контроля по сравнению контрольной группой, в которой раны обрабатывали тем же растворителем, нораны пептида.
поверхности у животных, без которых обрабатывали водным раствором, не Аналогичное действие пептида при его применении в концентрации 10 мкМ (но не 2 мкМ) содержащим пептида;
измерения проводили на 2-й день после нанесения раны). По оси Х – концентрация пептидов в мкМ.
наблюдается на 4-й, 6-й и 8-й дни после нанесения раны. Во всех группах животных раны заживали путем первичного натяжения, без нагноительных процессов. На 11 день площадь раневого дефекта была незначительна для всех исследуемых групп. На более поздних сроках наблюдения существенного образования рубцов в контрольных и опытных группах животных не выявлялось. Таким образом, показано, что применение ChBac5 влияет на динамику заживления ран у экспериментальных животных. Дальнейшее изучение этого эффекта даст возможность прояснить механизм действия пептида. Полученные данные позволяют предположить, что данный вид активности, описанный в литературе для PR-39, а также для структурно отличных АМП – дефенсинов, может играть важную роль в модуляции защитных реакций организма. Кроме того, ранозаживляющее действие бактенецина ChBac5 в сочетании с его антибактериальной активностью свидетельствует о перспективности изучения возможности применения этого пептида для коррекции патологических процессов, связанных с раневыми инфекциями.
Заключение. Среди различных классов АМП животного происхождения обогащенные пролином пептиды занимают особое место, определяемое особенностями их структуры и функциональных свойств. ОПП обладают избирательностью антимикробного действия и низкой цитотоксической активностью в отношении эукариотических клеток. В настоящей работе продемонстрировано, что минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в отношении грамотрицательных бактерий для исследованных ОПП находятся в диапазоне 1- мкМ, в то время как цитотоксическое действие в отношении эукариотических клеток, оцениваемое в ИК50, составляет более 30 мкМ. Антимикробные эффекты ОПП могут быть усилены антибиотиком рифампицином и наночастицами серебра, что открывает перспективы для их совместного использования в медицинской и ветеринарной практике.
Среди изученных нами ОПП выявлен пептид ChBac3.4, который, наряду с антибактериальной активностью, проявляет и повышенную цитотоксичность в отношении культуральных опухолевых клеток U-937, K-562 и HL-60, не свойственную другим ОПП.
Выявленная активность обусловлена особенностями строения этого пептида, обогащенного гидрофобными аминокислотами.
Важной фунциональной особенностью эндогенных пептидных антибиотиков, в том числе и ОПП, принципиально отличающей их от широко используемых антибиотиков микробного происхождения, являются иммуномодулирующая и усиливающая репаративные процессы активности. В частности, в настоящей работе продемонстрировано митогенное действие пептида ChBac5 в отношении фибробластов кожи человека и стимулирующее воздействие на заживление кожной раны экспериментальных животных.
Известно, что в нейтрофильных гранулоцитах содержится набор АМП с определенным спектром биологических эффектов, как в отношении микроорганизмов, так и клеток макроорганизма. При этом у человека и некоторых видов животных основную роль таких мультифункциональных молекул играют дефенсины, в то время как у других видов, в лейкоцитах которых отсутствуют дефенсины, аналогичными свойствами обладают пептиды с иными структурами, в частности ОПП. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что в лейкоцитах коз содержится набор пептидов, проявляющих разные виды биологической активности, причем каждый из изученных пептидов характеризуется различной степенью проявления того или иного вида активности (антимикробной, цитотоксической, ранозаживляющей). Настоящее исследование функциональной активности ОПП из семейства бактенецинов дополняет представления о биологической роли этих пептидов в реализации и регуляции различных защитных реакций организма и открывает перспективы их использования для коррекции различных дисфункций организма, вызванных такими патофизиологическими процессами, как воспаление, опухолевый рост и процесс заживления ран.
ВЫВОДЫ:
1. Исследуемые обогащенные пролином антимикробные пептиды бактенецины лейкоцитов козы - ChBac5, ChBac3.4, mini-ChBac7.5 и mini-ChBac7.5 проявляют высокую антимикробную активность в диапазоне концентраций 1-4 мкМ, в том числе и в отношении антибиотикоустойчивых штаммов (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii), и несколько более низкую в отношении стафилококков (МИК 8-32 и более 32 мкМ).
Из исследованных фрагментов ChBac5 наиболее высокую антимикробную активность проявляет пептид, представляющий собой N-концевой участок (1-20) молекулы.
Антимикробное действие пептидов может быть усилено при их совместном применении с другими антибиотическими агентами (рифампицином, наночастицами серебра).
2. Антимикробное действие исследуемых пептидов в концентрации, в 2-4 раза превышающей МИК, реализуется без существенного снижения барьерной функции цитоплазматической мембраны Е.coli ML-35p;
при этом из исследованных ОПП относительно более выраженное повреждающее действие на цитоплазматическую мембрану E.coli проявляет пептид ChBac3.4, который отличается более высокой гидрофобностью молекулы.
3. Бактенецины ChBac5, ChBac3.4, mini-ChBac7.5 и mini-ChBac7.5 обладают выраженной способностью связывать свободный липополисахарид.
Липополисахаридсвязывающая активность фрагментов ChBac5 значительно снижена по сравнению с полноразмерным пептидом, что свидетельствует о важности нативной структуры пептида для взаимодействия с отдельными компонентами клеточной стенки бактерий.
4. Исследуемые пептиды имеют низкую гемолитическую активность в отношении эритроцитов человека в концентрациях до 100 мкМ.
5. В концентрациях 1-30 мкМ обогащенные пролином пептиды не проявляют токсических эффектов в отношении культивируемых клеток человека, за исключением наиболее гидрофобного пептида ChBac3.4, который снижает жизнеспособность клеток гистиоцитарной лимфомы U-937, эритролейкемии К-562, миелогенной лейкемии HL-60, но не влияет на жизнеспособность нормальных фибробластов кожи человека в концентрации 30 мкМ.
Повреждающее действие пептида на исследованные клетки-мишени сопровождается преимущественной инициацией в них апоптоза при действии пептида в концентрациях 10- мкМ, а в концентрации 40 мкМ - некроза. Полученные результаты дают основание предположить, что повышение гидрофобности молекул обогащенных пролином пептидов сопряжено с нарастанием их токсичности в отношении клеток человека.
6. Бактенецины ChBac5, его фрагмент ChBac5 (1-20), mini-ChBac7.5, но не ChBac3.4, стимулируют пролиферацию фибробластов кожи человека. Полученные данные позволяют заключить, что для проявления анализируемого вида активности ChBac5, как и для реализации антимикробной активности, важен N-концевой участок его молекулы.
7. Обработка полнослойных кожных ран у мышей препаратом, содержащим 10 мкМ бактенецина ChBac5, приводит к более быстрому снижению площади раневого дефекта по сравнению с контрольными животными.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:
1. Орлов Д.С., Шамова О.В., Голубева О.Ю., Пазина Т.Ю., Ямщикова Е.В., Колодкин Н.И., Кокряков В.Н., Корнева Е.А. Действие комплексов природных антимикробных пептидов и наночастиц серебра на микроорганизмы // Цитокины и воспаление. - 2010. - том 9, № 2. - c. 32-36.
2. Шамова О.В., Орлов Д.С., Ямщикова Е.В., Кокряков В.Н. Изучение взаимодействия антимикробных пептидов с белками из семейства ингибиторов сериновых протеиназ // Фундаментальные исследования. - 2011. – № 9. – с. 344-348.
3. Ямщикова Е.В., Орлов Д.С., Пазина Т.Ю., Трулев А.С., Орлов С.Б., Григорьев А.В., Колодкин Н.И, Кокряков В.Н., Шамова О.В. Влияние антимикробного пептида бактенецина 5 и его укороченных фрагментов на пролиферацию фибробластов кожи человека, и на процесс заживления ран у экспериментальных животных // Современные проблемы науки и образования. – 2012. - № 3.- URL: www.science-education.ru/103.
4. Ямщикова Е.В., Орлов Д.С., Колодкин Н.И., Жаркова М.С., Пазина Т.Ю., Сакута Г.А., Трулев А.С., Кокряков В.Н., Шамова О.В. Биологическая активность обогащенных пролином защитных пептидов системы врожденного иммунитета // Цитокины и воспаление. – 2012. – том 11. – № 1. - с. 36-39.
Статья в сборнике:
5. O.Yu.Golubeva, O.V.Shamova, D.S.Orlov, E.V.Yamshchikova, A.S.Boldina, V.N.
Kokryakov. Synthesis and investigation of silver-peptide bioconjugates and investigation in their antimicrobial activity // in: Materials challenges and testing for supply of energy and resources (Ed. by T.Bollinghaus, J. Lexow, T.Kishi, M.Kitagawa). – Springer. – 2012. – P. 163-171.
Тезисы докладов:
6. Yamschikova E.V., Shamova O.V., Ovchinnikova T.V., Orlov D.S., Kokryakov V.N.
Antimicrobial activity of two proline-rich peptides from goat leukocytes // Abstracts of the International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Prof. Yu. Ovcinnikov. - Sept. 28- Oct. 2. – 2009. – Moscow. - P. 435.
7. Yamschikova E.V., Shamova O.V., Orlov D.S., Yuhnev V.A., Ovchinnikova T.V., Kokryakov V.N. Investigation of biological activity of proline-rich antimicrobial peptides // Abstracts of the II International Symposium “Interaction of the nervous and immune systems in health and disease”. - June16 – June 19. - 2009. - Saint Petersburg, Russia. - P. 75-76.
8. Ямщикова Е.В. Жаркова. М.А. Овчинникова Т.В. Кокряков В.Н. Шамова О.В.
Изучение бактерицидного действия пролин-богатых пептидов и их токсических эффектов в отношении клеток человека // Медицинский академический журнал. - 2010. - №5, том 10. - с. 43.
9. Ямщикова Е.В. Жаркова. М.А. Овчинникова Т.В. Кокряков В.Н. Шамова О.В.
Изучение антимикробной и липополисахарид-связывающей активности катионных пептидов из семейства бактеницинов // Тезисы конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов». – Москва.- 2010 г.- c. 82-83.
10. Yamschikova E.V., Orlov D.S., Kokryakov V.N., Shamova O.V. Investigation of an ability of proline-rich peptides to penetrate into eukaryotic cells // Abstracts of the III International Symposium “Interaction of the nervous and immune systems in health and disease”. - June 7–10. 2011. - Saint Petersburg, Russia. - P.72-73.
11. Ямщикова Е.В. Жаркова. М.А. Изучение антимикробного действия природных пептидов бактеницинов в комбинации с другими антибиотическими агентами // Cборник тезисов XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье», - 16 апреля. 2011 г. - Санкт-Петербург. – с. 311-312.
12. Ямщикова Е.В., Орлов Д.С., Кокряков В.Н., Шамова О.В. Влияние антимикробного пептида бактенецина 5 из лейкоцитов козы на пролиферацию фибробластов кожи человека, а также на процесс ранозаживления у экспериментальных животных // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии “X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова” Москва-Пущино. 14 – 17 ноября 2011 г. - с. 92.