Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса
На правах рукописи
КАЛЁНОВ Сергей Владимирович КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ И ГАЛОБАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ КОНТРОЛИРУЕМОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА Специальность: 03.00.23 - Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
Москва 2007 2
Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева на кафедре биотехнологии
Научный консультант: Кандидат технических наук, доцент А.Е. Кузнецов
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Галина Ивановна Эль-Регистан Доктор технических наук Виталий Викторович Лалов
Ведущая организация:
ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва 2007 г. в 1030 часов на заседании диссер
Защита состоится " 29 " мая тационного совета ДМ.212.204.13 в Российском химико-технологическом уни верситете им. Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., 9) в ауд. МАЗ.
С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном цен тре РХТУ им. Д.И. Менделеева
Автореферат разослан " 26 " апреля 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, ДМ.212.204.13 И.В. Шакир
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Совершенствование традиционных и разработка новых способов культивирования микроорганизмов является основой для получения продуктов их биосинтеза и использования специфических микробных процессов в отдельных областях биотехнологии.
Постоянное внимание уделяется поиску средств, позволяющих поддерживать необходимые ростовые и биосинтетические характеристики микробных продуцентов на протяжении опреде ленной ферментационной стадии или всего жизненного цикла. Широко применяются такие ме тоды как иммобилизация клеток, управляемое культивирование с использованием современных оперативных средств и математических моделей, направленное вмешательство в метаболиче ские процессы и др. Отклонение сбалансированного процесса микробного синтеза от заданных оптимальных параметров ведет к ухудшению показателей биосинтеза, а нарушение этих пара метров индуцирует развитие в клетках микроорганизмов состояния стресса. Состояние стресса понимается как совокупность ответных реакций, направленных на преодоление неблагоприят ных изменений окружения, вызванных стрессорным воздействием.
Длительное время считали, что стресс неблагоприятно воздействует на микроорганизмы, что выражается в подавлении их физиологической активности, снижении эффективности био синтеза. Однако, в последние годы появилось много данных, свидетельствующих о том, что в оп ределенных условиях воздействие оптимальных доз стрессорных факторов (стрессоров) приводит к улучшению ростовых характеристик микроорганизмов, стимуляции биосинтетических процес сов, повышению скорости биотрансформации и разложения загрязнений [Davies et al., 1995, Саф ронов, 2002, Сорокодумов, 2005].
Таким образом, воздействие определенными дозами стрессора приводит к мобилизации фи зиологических и генетических резервов клетки [Hange-Arronis, 2000]. В этой связи целесообразно использовать понятие контролируемого стресса, при котором развивающаяся устойчивость к стрессорному воздействию проявляется как стимуляция метаболизма. Контроль количества и каче ства стресс-факторов, избирательное усиление или подавление действия их на клетки микроорга низмов может быть эффективным средством совершенствования процессов управляемого культи вирования микроорганизмов в лабораторных и промышленных условиях.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было выяснить закономерности изменения биосинтетических и ростовых характеристик модельных микроорганизмов в усло виях контролируемого окислительного стресса для совершенствования ферментационных про цессов и разработки новых подходов управляемого культивирования промышленно важных микробных продуцентов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1 – разработать стендовую установку и программное обеспечение для исследования про цессов культивирования модельных микроорганизмов в условиях контролируемого окисли тельного стресса;
2 – исследовать изменения ростовых и биосинтетических характеристик модельных мик роорганизмов при воздействии УФ облучением и пероксидом водорода, подобрать оптималь ные дозы стрессоров;
3 – проанализировать действие факторов окружения, обладающих антистрессовым эф фектом при окислительном стрессе;
4 – исследовать устойчивость к факторам окислительного стресса микроорганизмов раз личного физиологического состояния;
5 – исследовать совместное действие стрессорных и антистрессорных факторов в процес сах культивирования модельных микроорганизмов;
6 – разработать методы, обеспечивающие поддержание состояния оптимального окисли тельного стресса для увеличения выхода целевого продукта;
7 – разработать автоматизированную систему культивирования и синтеза целевых про дуктов в условиях контролируемого окислительного стресса.
Научная новизна. На примере дрожжей Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae и га лобактерий Halobacterium salinarium показана перспективность использования контролируемо го окислительного стресса для повышения эффективности ферментации.
Обнаружено, что контролируемое совместное воздействие стрессоров (H2O2, мягкий ультрафиолет) и антистрессорных факторов (видимый свет низкой интенсивности, антиокси данты, удаление ингибиторов биосинтеза) улучшает ростовые и биосинтетические характери стики модельных микроорганизмов: повышает выход биомассы, удельную скорость роста, бро дильную активность и устойчивость к закислению у дрожжей, способствует поддержанию про дуктивности биореактора с высокоплотностной культурой дрожжей, повышает уровень накопле ния бактериородопсина при минимальном накоплении каротиноидов у галобактерий. Показано, что комбинированное действие ультрафиолета и видимого света или монохроматического из лучения может выступать в качестве инструмента для управления ростом гетеротрофных мик роорганизмов, не чувствительных в обычных условиях (без УФ облучения) к освещению.
Для дрожжей Saccharomyces cerevisiae показана целесообразность использования посев ного материала, предобработанного H2O2. Подобраны условия выращивания засевной культуры в условиях окислительного стресса (внесение H2O2 в предстационарной фазе роста разово в до зе 0,3–0,6 г/л при освещении суспензии фоновым дневным светом), обеспечивающие в основ ном процессе в аэробных или микроаэрофильных условиях увеличение удельной скорости рос та на 15–25%, выхода биомассы на 15–25%, сокращение лаг-фазы более чем в 2 раза;
в ана эробных условиях – увеличение удельной скорости роста на 30–50% и сокращение времени сбраживания субстрата на 30%.
Впервые установлено, что в процессе глубинного культивирования галобактерий (ГБ) H. salinarium рост культуры и синтез бактериородопсина (БР) в сильной степени зависят от на личия ингибиторов, предположительно продуктов химического и/или фотохимического окис ления компонентов среды, образующихся при ее хранении или использовании. С учетом этих факторов получен биосинтетически активный штамм галобактерий, подобраны оптимальные условия (среда, режим аэрации, подготовка посевного материала, освещение) и разработаны режимы культивирования (доливная культура, внесение антиоксидантов, обработка адсорбен тами), позволившие увеличить содержание бактериородопсина в клетках и его выход за цикл ферментации с 70–75 мг/л за 6–7 сут. до 1700–1750 мг/л за 8 сут. при одновременном повыше нии стабильности процесса и снижении содержания каротиноидов, что существенно упрощает процедуры выделения бактериородопсина и его очистки.
Практическая значимость. На основе выявленных закономерностей разработаны новые методы культивирования микроорганизмов в условиях контролируемого окислительного стрес са. Предложены система и аппаратура культивирования, названная «солнечным» биореактором, в котором среда освещается одновременно светом видимого и мягкого ультрафиолетового УФА, УФБ диапазонов, что имитирует действие излучения солнца на поверхности земли, или подвергается воздействию подобранных малых доз пероксида водорода и видимого света.
Вариант культивирования дрожжевой засевной культуры при одновременном воздейст вии пероксида водорода и видимого света предложен для улучшения показателей (жизнеспо собности, бродильной активности дрожжей) при получении спирта из зерносырья. Предложе ние вошло в план перспективных мероприятий Серебряно-Прудского биохимического завода (Московская обл.).
Для управления процессами ферментации галобактерий разработаны программное обеспе чение «BioDrome 1.0», автоматизированный комплекс и метод непрерывного контроля уровня накопления биомассы и бактериородопсина. Возможности комплекса позволяют регистрировать и регулировать параметры ферментации, работать в режимах культивирования с обратной связью по показаниям датчиков, а также следить за процессом в режиме удаленного доступа. Согласно предварительной технико-экономической оценке реализация предложенных решений на базе разработанного автоматизированного комплекса и методов культивирования галобактерий при промышленном получении бактериородопсина (в составе пурпурных мембран) позволит сни зить его стоимость с 500–5000 руб. за 1 мг (в зависимости от чистоты продукта) до 20–100 руб.
за 1 мг. Отдельные элементы комплекса и разработанное программное обеспечение используют ся в научных исследованиях на стендах ГУП НПО «Астрофизика», ВНИИ Молочной промыш ленности, а также в учебном процессе в РХТУ им. Д.И. Менделеева (каф. биотехнологии, каф.
процессов и аппаратов).
Разработанные новые способы культивирования микроорганизмов защищены патентами РФ.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на российских и ме ждународных научно-технических конференциях и конгрессах: Международная конференция «Успехи в химии и химической технологии» (Москва, 2002 г.);
конференция «Образователь ные, научные и инженерные приложения в среде LabView и технологии National Instruments» (Москва, 2003 г.);
V и VI Международный Форум «Высокие технологии XXI века» (Москва, 2004 г., 2006 г.);
European Symposium on Environmental Biotechnology (ESEB 2004, Oostende, Belgium);
Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006 г.);
I, II, III, IV Московский международный конгресс «Биотехнология:
состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005, 2007 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 7 статей, 8 тезисов сообщений, получен 1 патент РФ на изобретения и поданы 2 заявки на патентование.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав по результатам экспериментальной работы, выводов, списка использо ванной литературы, включающего 187 источников. Работа изложена на 195 стр. машинописно го текста, иллюстрирована 81 рисунками, 6 таблицами. В приложении представлены протоколы и акты внедрений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследований были дрожжи Candida tropicalis шт. СК-4 и Saccharomyces cerevisiae шт. SL-100 и Meyen расы Т 985. Дрожжи выращивали в колбах на стандартной мине ральной среде с сахарозой, в стандартных условиях культивирования, в асептических условиях.
О накоплении биомассы судили по изменению оптической плотности на КФК-3.01 (=540 нм, l=3 мм) с последующим пересчетом на сухой вес.
Содержание сахарозы определяли модифицированным методом Бертрана-Шарля. Содер жание НАД+ определяли спектрофотометрически по нарастанию поглощения при 340 нм в при сутствии этанола и алькогольдегидрогеназы. Содержание этанола определяли методом ГЖХ.
Бродильную активность определяли методом вытеснения.
Другим объектом исследований были галобактерии. Использовались штаммы Halobacte rium salinarium шт. 353П, ST-033, а также спонтанные мутанты, полученные из шт. ST-033 облу чением ультрафиолетом. Среда для выращивания галобактерий содержала, г/л: NaCl – 250, MgSO47H2O – 20, KCl – 2, цитрат Na – 3, CaCl2 – 0,2, триптон (пептон) – 5, дрожжевой экстракт – 2, глицерин – 4, вода – водопроводная. Состав и содержание органических компонентов среды варьировали. Культивирование в 100 мл колбах проводили в периодических условиях на качалке G10 (New Brunswick) при 150 об/мин, температуре 37–38 oC, объеме среды в колбах 25–75 мл.
Уровень аэрации регулировали степенью заполнения колб. Объем посевного материала (клетки стационарной фазы роста) составлял 2–20% об. Время культивирования – 3–8 сут, в зависимости от целей эксперимента.
Опыты в лабораторном биореакторе с обечайкой из стекла, рабочим объемом 3 л («Фер мус–3», НИЦ «Биоавтоматика», г. Н. Новгород) проводили при 37–38 oC в режиме глубинного культивирования в стерильных условиях с автоматическим контролем pH, pO2, Eh с использо ванием разработанного программного обеспечения «BioDrome 1.0» на базе инструментария LabView 7.0 фирмы National Instruments (США). Величина pH (6,8–7,2) регулировалась подтит ровкой NaOH, содержание кислорода поддерживалось и изменялось расходом подаваемого воздуха и/или интенсивностью перемешивания. В качестве источников мягкого УФА и УФБ излучения использовали лампы PHILIPS TL 20W/05 и ДРШ-100 со светофильтрами ФС-6 и УФС-8. В качестве источников лазерного излучения использовали He-Ne лазер и Аргон ионный лазер. Интенсивность освещения определяли с помощью люксметра – УФ-радиометра ТКА-01/3 (г. Санкт-Петербург). Облучение УФ в биореакторе проводили через выносной контур с кварцевой кюветой. Колбы и биореактор освещали лампами дневного света или светодиодными матрицами с интенсивностью 10-150 мВт/л (в пересчете на длину волны =555 нм).
При культивировании галобактерий использовали адсорбент (активированный уголь АГ-3) для удаления из среды инги биторов роста. Для повышения выхода биомассы ГБ и содержания БР в реактор вносили субстратную подпитку, пред ставляющую концентрированный раствор, содержащий триптон, дрожжевой экс тракт и глицерин. Содержание клеток оп ределяли турбидиметрически (спектрофо тометр Specord M40, =660 нм, l=10 мм).
Динамику накопления БР определя ли по разработанному экспресс-методу, основанному на цветовом анализе сус пензии без непосредственного выделения Рис. 1 Карта цвета для определения со БР: клеточная суспензия, прокачиваемая держания БР. Кривая – изменение цвета сус через кювету (l=10 мм) сканируется с по пензии по ходу культивирования.
мощью CCD матрицы сканера Epson Per fection 1270. Обработка производится в автоматическом режиме с применением разработанной системы «BioDrome 1.0» и использованием калибровки эталонов БР, построенной согласно [Oesterhelt and Stoeckenius, 1974]. Наличие БР и каротиноидов контролировали также по спек трам лизатов галобактерий (Specord M40, =400–620 нм).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Культивирование дрожжей Candida tropicalis в условиях окислительного стресса.
Ранее было показано, что умеренные дозы оксиданта, такого как H2O2 улучшают показа тели ферментационных процессов при культивировании дрожжей C. tropicalis на сахарозе [Сафронов, 2004], дрожжей S. cerevisiae на сахарозе и зерновом сусле [Сорокодумов, 2005], а также повышают эффективность биодеструкции фенола микробоценозами с доминированием дрожжей. Однако не была выяснена возможность использования других агентов окислительно го стресса, например УФ-излучения;
не изучены эффекты адаптации клеток к окислительному стрессу и продолжительность сохранения адаптивных свойств у дрожжевых популяций, а так же сочетание действия оксидантов с антистрессорными факторами для усиления позитивных эффектов у стресс-индуцированных культур. Выяснение особенностей физиологических реак ций у дрожжей в условиях окислительного стресса для выбора рациональных режимов их куль тивирования составило первое направление работы.
В качестве еще одного агента окислительного стресса, действие которого во многом анало гично действию H2O2, использовали ультрафиолетовое излучение ближних УФА и УФБ диапазо нов спектра. В клетках оба стрессора индуцируют одну и ту же систему антиоксидантного ответа на воздействие этих стресс-факторов.
В лабораторных экспериментах при выращивании дрожжей C. tropicalis в колбах при рас сеянном освещении и предварительно облученных УФ-излучением выявили стимулирующее действие мягкого ультрафиолета на скорость роста и выход дрожжей. Эффект зависел от физио логического возраста облучаемой культуры (удельной скорости роста и плотности дрожжевой популяции). Заметное положительное действие УФ-излучения проявлялось для активно расту щих культур (фаза экспоненциального роста). Оптимальный режим облучения при использова нии УФ-лампы «Филипс»: 1 мин для слоя суспензии толщиной 4 мм с ОП=0,7-1 при дозе излуче ния 1000 Дж/м2 (250 Дж/л). Режим был апробован при росте дрожжей в биореакторе (источник УФ-излучения – лампа ДРШ-100) в периодических условиях культивирования. О воздействии УФ-излучения на микроорганизмы судили по показателям концентрации растворенного кисло рода pO2, pH, Eh, выводимых непосредственно на монитор компьютера, и при сравнении кри вых роста биомассы. Так как в ответе микроорганизмов на окислительный стресс, индуцируе мый ультрафиолетом, может участвовать система фоторепарации, эксперименты проводили в двух вариантах: с освещением биореактора видимым светом и с затемнением.
Окислительный стресс вызывали в культуре дрожжей с ОП 0,3–3,0 облучением ультрафиоле том интенсивности 0,5–2 Вт/л при скорости вращения мешалки 150–370 об/мин. Освещение види мым светом интенсивностью 40 мВт/л производили через стеклянную обечайку биореактора.
В отмеченных условиях облучения дрожжи реагируют на действие УФ-излучения как при освещении биореактора, так и в темноте, при этом процесс роста становится чувствительным к действию видимого света. Изменение условий освещения индуцирует у культуры переходное со стояние, проявляющееся в преломлении кривой pO2: в ускорении или замедлении падения pO2, ко лебаниях в показаниях pO2. Такой переходный процесс длится 1–2,5 ч.
При освещении биореактора видимым светом включение УФ-облучения влияет положительно на дыхательную активность дрожжей, а отключение УФ-облучения снижает дыхательную актив ность. В темновом режиме УФ-облучение снижает дыхательную активность, а его отключение ли бо не влияет на изменение дыхания либо еще более замедляет падение pO2 по мере роста дрожжей.
В системе, постоянно облучаемой ультрафиолетом, подача света стимулирует дыха тельную активность, в то время как отсутствие света либо снижает, либо не влияет на нее. При этом в отсутствие УФ-облучения дрожжи нечувствительны к воздействию видимого света.
Отклик дрожжевой популяции на режимы УФ и светового облучения, определяемый по изменениям кривой роста, в целом, коррелировал с характером изменения величины pO2. По лученные данные позволяют заключить, что совместное действие оптимальных доз УФ излучения и видимого света стимулирует рост дрожжей C. tropicalis. Стимулирующий эффект был подтвержден в экспериментах, когда дрожжи выращивали при постоянном действии ульт рафиолета и света (на всем протяжении цикла развития). В этих условиях возрастала удельная скорость роста, а уровень накопления биомассы повышался на 15–20% по сравнению с вариан том без облучения. На величину стимулирующего эффекта влияли концентрации посевного ма териала и субстрата. Разница по выходу биомассы между облучаемыми УФ на свету и в темно те вариантами была больше при концентрации инокулята менее 0,15 г/л (по асд). В темноте при возрастании внесенной концентрации засевных дрожжей выше 5–6 г/л исчезает отрицательное действие примененных доз УФ-облучения;
в диапазоне концентрации дрожжей, чувствитель ном к воздействию ультрафиолета, положительный эффект УФ-облучения сохраняется при по вышении концентрации субстрата в среде;
с увеличением интенсивности видимого света поло жительный эффект существенно не меняется;
более интенсивное воздействие УФ-излучения лампы ДРШ на суспензию дрожжей – порядка 5–10 Вт/л – вызывает репрессию роста дрожжей независимо от того, освещается ли содержимое биореактора видимым светом или нет, при этом репрессирующий эффект сохраняется даже при высоких стартовых концентрациях дрожжей.
Из полученных данных следует важный вывод: гетеротрофные микроорганизмы, под вергнутые стрессовым воздействиям, приобретают чувствительность к видимому свету низкой интенсивности. При этом стрессовое состояние может быть вызвано различными стрессорами: ультрафиолетом, пероксидом водорода, механическим воздействием (заморажи ванием-оттаиванием) и другими.
Чувствительность стрессированных клеток к видимому свету может быть объяснена ин дукцией системы фоторепарации с фотолиазой в качестве ключевого фермента.
Таким образом, обнаружен новый подход к улучшению показателей микробных фермен таций, включающий одновременное воздействие на выращиваемую культуру стрессорного фактора, например, оптимальных доз мягкого ультрафиолета или пероксида водорода, и анти стрессового фактора – видимого света. Такое сочетание стрессорного-антистрессового воздей ствия можно охарактеризовать как контролируемый окислительный стресс, и использовать для управляемого культивирования гетеротрофных микроорганизмов. По-видимому, этот ме ханизм имеет место в природе.
Комбинированное воздействие видимого света и мягкого ультрафиолета в определенной степени имитирует природное солнечное излучение, имеющее не только видимую, но и УФА и УФБ-составляющую и воздействующее на микроорганизмы, обитающие на поверхности воды, почвы, растений.
Исследование роста дрожжей C. tropicalis при воздействии УФ-излучения и лазерного излучения видимого диапазона спектра.
Приведенные выше данные свидетельствуют, что в условиях окислительного стресса микроорганизмы приобретают чувствительность к воздействиям, которые принято относить к низкоэнергетическим, в частности к видимому свету низкой интенсивности (10–100 мВт/л).
Первичным рецептором этого воздействия может быть фотолиаза, входящая в систему фоторе парации, реагирующая на свет в диапазонах 370-390 нм – для фотолиазы 1-го типа и 430-450 нм – для фотолиазы 2-го типа [Eker et al., 1994, Kim Sang-Tae et al., 1993].
Для подтверждения предположения о чувствительности стресс-индуцированных дрожжей к низкоинтенсиному свету дрожжи облучали низкоинтенсивным светом лазеров (НИЛИ): ге лий-неонового (красный свет) и аргон-ионного (сине-зеленый свет).
В контроле – без индукции стресса ультрафиолетом не было значимых различий между вариантами облучения лазерами в темноте или при видимом свете. В опыте, – предварительно стрессированные ультрафиолетом дрожжи становились чувствительными к свету лазера. В вариантах облучения инокулята оптимальной дозой УФ последующее облучение He-Ne лазе ром с интенсивностью 3 мВт/л увеличивало прирост биомассы на 10–15%, при этом только при использовании в качестве инокулята клеток экспоненциальной фазы роста (но не стацио нарных). Аналогичные эффекты давало облучение сине-зеленым светом Ar-ионного лазера ин тенсивностью около 10 мВт/л.
Для суспензии дрожжевых клеток в лаг-фазе ОП 0,5-1,0 оптимальная доза предоблучения ультрафиолетом составляла около 1000 Дж/л, а для суспензии с ОП 10–100 – около 10000 Дж/л.
Для стимуляции роста дрожжей в ферментере можно рекомендовать режимы: предоблу чение ультрафиолетом с интенсивностью 10–100 мВт/л при последующем или одновременном немонохроматическом освещении видимым светом с интенсивностью 40 мВт/л, или 1–10 мВт/л – при освещении красным монохроматическим светом, или 5–50 мВт/л – сине-зеленым моно хроматическим светом, при дозе засевного материала в периодической культуре 0,08–0,8 ед.
опт. пл. (0,06–0,6 г асд/л).
Позитивное воздействие окислительного стресса на рост дрожжей р. Candida может от ражать их приспособленность к экологическим условиям обитания на поверхности растений, в ситуациях избытка углеводного субстрата, кислорода и одновременно освещенности солнеч ным светом.
2. Исследование процесса культивирования дрожжей-сахаромицетов в присутствии агентов окислительного стресса.
Природные условия обитания широко используемых в промышленности дрожжей сахаромицетов и дрожжей р. Candida схожи, однако в отличие от первых, представители р. Candida, в частности C. tropicalis не являются истинными бродильщиками. Однако в наших экспериментах наблюдалось повышение их бродильной активности после воздействия опти мальных доз факторов окислительного стресса. Поэтому было интересно исследовать воздейст вие окислительного стресса (пероксид водорода и мягкий ультрафиолет) на рост сахаромицетов.
В задачи входило более детальное выяснение особенностей отклика дрожжей на окисли тельный стресс с учетом возможного вклада фотореактивации и скорости адаптации дрожжей к воздействию разных стрессоров в условиях контролируемого освещения культур, а также по лучение разных линий дрожжей при последовательных пассажах в асептических условиях.
Дрожжи выращивали при освещении и без освещения. Варьировали: аэробные, микроаэро фильные, анаэробные условия роста при воздействии разных концентраций H2O2 (дозы мягкого УФ), количество инокулята и субстрата (сахарозы) в ферментационной среде.
В условиях освещения опыты выявили: чувствительность сахаромицетов к сублетальным дозам агентов окислительного стресса;
зависимость реакции клеток от фазы роста культуры и концентрации субстрата;
адаптацию дрожжей к стрессу при последовательных пассажах в усло виях воздействия сублетальных доз окислителей. При культивировании с малой концентрацией субстрата – 5 г/л клетки менее устойчивы к воздействию H2O2 и мягкого УФ, чем при его боль ших концентрациях – 30 г/л и 150 г/л, что проявляется в увеличении доли мертвых клеток. По мере адаптации дрожжей к H2O2 при последовательных пересевах доля мертвых клеток снижает ся. Так, при выращивании штамма Meyen T 985 при 30 г/л сахарозы и внесении H2O2 в концен трациях 0,6 г/л и 0,3 г/л (культура конца экспоненциальной фазы, содержание биомассы 2,2–2, г/л) в первом случае доля мертвых клеток снижалась с 70% в первом пассаже до 25% в десятом;
во втором – с 60% в первом пассаже до 35% в десятом, что говорит об адаптационных изменени ях. При содержании сахарозы 5 г/л количество мертвых клеток во всех пассажах остается прак тически неизменным.
Адаптированные к H2O2 линии дрожжей при последующем пересеве в свежую среду и культивировании без внесения пероксида имели более высокие показатели физиологи ческой активности, что проявлялось в повышении уровня накопления биомассы, скоро сти роста, устойчивости к низким pH. Так, при концентрации субстрата 30 г/л, внесении 0,3 г/л H2O2 и без подтитровки среды в первом пассаже к концу роста дрожжей pH достигал 2,35, в десятом – 2,12;
при внесении 0,6 г/л H2O2 в первом пассаже pH падал до 2,35, а в десятом – до 2,05. При этом уже в пятом пассаже во втором случае уровень биомассы составлял 2,7 г/л по сравнению с 2,2 г/л в первом пассаже. Скорость роста к концу перепассирования увеличива лась на 15–20%. Подобным же образом клетки дрожжей реагировали на облучение мягким УФ в пассажах.
При адаптации к H2O2 или к мягкому УФ решающее значение имел фактор освещения. В условиях полной темноты клетки не адаптировались ни к мягкому УФ, ни к пероксиду и при пересевах погибали. Однако достаточно было рассеянного дневного освещения (например, све та с интенсивностью 40 мВт/л), чтобы кардинально изменилась выживаемость культуры. Таким образом, свет в данном случае выступает как антистрессор, вероятно, через механизм фото репарации [Jagger et al., 1970, Eker, 1986]. Аналогичные вышеописанным эффекты адаптации к воздействию пероксида водорода наблюдали у штамма SL-100 при концентрации сахарозы г/л при росте дрожжей в аэробных условиях и в микроаэрофильном режиме. В анаэробных ус ловиях дрожжевые клетки не адаптировались к внесению пероксида: доля жизнеспособных клеток не возрастала.
Таким образом, выявлена корреляция между возрастанием числа жизнеспособных клеток, уровнем накопления биомассы, удельной скоростью роста и устойчивостью к неоптимальным pH в пересевах линий дрожжей, выросших при оптимальных условиях внесения H2O2 (или воз действия мягкого УФ). Адаптация выражалась также в повышении устойчивости клеток к внесе нию повышенных доз H2O2 – 1,8–2,4 г/л, тогда как в контрольных вариантах клетки погибали при дозе 1,2 г/л пероксида. Такая перекрестная адаптация дрожжей к H2O2, УФ и pH подтверждает ра нее полученные данные о позитивном эффекте предадаптации дрожжей к pH и пероксиду для по вышения их устойчивости к УФ- или гамма облучению [Singh et al., 1999].
При пересевах дрожжей, адаптированных к H2O2, на среду без пероксида водорода, устой чивость клеток к стрессорным воздействиям сохраняется лишь в первом пассаже. При 2-ом пере севе положительные эффекты (устойчивость к внесению H2O2) нивелируются и к 3-му – показа тели роста и активности культуры возвращаются к уровню контроля, то есть наблюдается быст рая деадаптация дрожжей. Возможно процессы адаптации обусловлены индукцией систем репа рации, помогающих клеткам преодолевать неблагоприятные воздействия, при этом, скорее всего, не происходит отбора относительно устойчивых субклонов на генетическом уровне, что согласу ется с литературными данными [Davies et al., 1995].
Следующий этап исследований включал культивирование дрожжей в лабораторном био реакторе с поддержанием pH (4–4,5), при достатке кислорода в среде, или в анаэробном режи ме, при уровне освещенности не менее 40 мВт/л или в темноте, при использовании в качестве инокулята неадаптированных (рис. 2A) или адаптированных к пероксиду (5-й и 10-й пассажи) дрожжей (рис. 2B, 2C). Основная задача – выяснение влияния предадаптации инокулята к стрессу на показатели роста и брожения основной культуры. В результате этой серии экспери ментов выявлено следующее:
1.) На свету по сравнению с контролем (рис. 2A) продолжительность лаг-фазы в культуре дрожжей с инокулятом 10-го пассажа (рис. 2C) снижается более чем в 2 раза.
2.) При освещении в культуре с предадаптированным к H2O2 инокулятом количество на копленной биомассы увеличивается по сравнению с контролем, а именно при использовании адаптированных дрожжей 5-го пассажа – на 11%, а 10-го пассажа – на 19%.
3.) Добавление пероксида в предстационарную фазу роста (на 17–22 ч культивирования) индуцировало автолиз клеток как в адаптированной затемненной (5 пассаж), так и неадаптиро ванной культурах (рис. 2А, 2B). Однако внесение Н2О2 при освещении не индуцировало гибель клеток у адаптированной линии (рис. 2B, 2C), то есть свет протектировал клетки при окисли тельном стрессе.
При добавлении Н2О2 во всех Биомасса на свету (40 мВт/л) A) Биомасса после пероксида на свету (40 мВт/л) вариантах опыта наблюдали резкое 3 Сахароза усиление дыхательной активности 28,5% 0,6 г/л H2O 2,5 (рис. 3), свидетельствующее о суще Биомасса, г/л Сахароза, г/л ственном изменении окислительно 2 восстановительного баланса клетки.
17,5% 1,5 Это могло приводить к изменению 7% 68,3% соотношения НАД+/НАДН по мере 25,7 24% адаптации к H2O2 в дрожжевых клет 0,5 ках, что косвенно было выявлено по 0 увеличению содержания в них НАД+ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 (рис. 4).
Время, ч Анализ количества НАД+ в Биомасса на свету (40 мВт/л) B) клетках адаптированных линий Биомасса после пероксида на свету (40 мВт/л) Биомасса после пероксида в темноте 3 30 дрожжей (инокулят 5-го и 10-го пас Сахароза сажей) через 3 ч после внесения H2O 0,6 г/л H2O 2,5 33% 24,2% показал, что в адаптированных лини Биомасса, г/л Сахароза, г/л 2 ях его было существенно больше чем 15,3% 4,9% в клетках неадаптированной линии.
1,5 73,4% Активация НАДН-зависимых систем 1 33,4% 32% в адаптированных линиях после вне 0,5 сения H2O2, может приводить к пере воду большей части НАДН в окис 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 ленную форму, чему дополнительно Время, ч способствует ингибирование при воз действии пероксида основных по Биомасса на свету (40 мВт/л) C) Биомасса после пероксида на свету (40 мВт/л) ставщиков НАДН: ЦТК и гликолиза.
Сахароза 3 Соответственно, наблюдаемое усиле 0,6 г/л H2O 2,5 20,9% ние дыхательной активности повы Биомасса, г/л шает баланс НАД+/НАДН [Godon, Сахароза, г/л 2 19,1% 4,5% 1998].
10,8% 1,5 В анаэробной культуре (рис.
1 10 5A), развивающейся в темноте, засе 24,8% 23,8% янной клетками адаптированной к 0,5 H2O2 линии дрожжей, выращенных в 0 аэробных условиях (инокулят линии 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 5-го пассажа, рис. 2B), клетки в лаг Время, ч Рис. 2. Накопление биомассы и потребление суб- фазе продолжали отмирать, лаг-фаза страта штаммом сахаромицетов Meyen Т 985 при росте составляла 47 ч, удельная скорость роста в экспоненциальной фазе 0, в аэробных условиях в биореакторе (сахароза 30 г/л). – A – неадаптированная к H2O2 культура (контроль);
ч, конечный выход биомассы был B – адаптированная к H2O2 линия 5-го пассажа;
С – низким (2,2 г/л), в середине экспо ненциальной фазы доля мертвых адаптированная к H2O2 линия 10-го пассажа.
Цифрами у стрелок указана доля мертвых клеток. клеток достигла 42%, а к концу куль тивирования 92% (рис. 5A), при этом бродильная активность была неве лика (рис. 6A), продолжительность брожения составила около 93 ч, а содержание этанола 4,1%.
В культурах, растущих при освещении (рис. 5C, D), засеянных клетками линий, адаптированных к H2O2, рост и брожение были суще ственно интенсивнее (рис. 5C, D;
6C, D) по сравнению как с преды дущим опытом, так и с контроль ной культурой, засеянной клетками, не подвергавшимися воздействию Рис. 3. Усиление потребления кислорода после пероксида водорода (рис. 5B, 6B).
Наибольшую удельную ско внесения H2O2 в культуру с адаптированным инокуля рость роста (0,067 ч–1) в экспонен том 10-го пассажа (см. рис. 2C).
циальной фазе и бродильную ак 1 – содержание кислорода, %;
2 – pH.
тивность имела культура с иноку лятом 10-го предадаптированного 3, 3, пассажа, далее (по убыванию) – ва 3, риант 5-го предадаптированного 2, пассажа (µ=0,059 ч–1) и контроль мг НАД+/г СВ 2, (µ=0,046 ч–1). Содержание спирта 2 по окончании брожения во всех ва риантах существенно не отличалось 1, и составило 6,2–6,4% масс. Все вы явленные закономерности наблю 0, дались и для штамма SL-100.
Таким образом, показана воз 5-ый пассаж 10-ый пассаж Контроль можность существенного улучше Рис. 4. Изменение содержания НАД+ в линиях ния показателей роста дрожжевых культур и процесса спиртового дрожжей по мере адаптации к пероксиду водорода, брожения при сочетанном воздей через 3 ч после внесения пероксида в культуру пред ствии на дрожжи оптимальными стационарной фазы.
дозами стрессорных факторов (пе роксида водорода или мягкого ультрафиолета) и антистресс-фактором, в частности, видимым светом, что позволяет предложить новый способ ведения процесса спиртового брожения. По предлагаемому способу для поддержания высокой физиологической активности дрожжей сахаромицетов посевной материал получают при росте дрожжей в аэробных или микроаэро фильных условиях и совместном воздействии видимого света и H2O2 или мягкого ультрафиолета диапазона УФА/УФБ.
Линию стресс-индуцированных дрожжей поддерживают путем пересевов на среду с содер жанием сбраживаемых углеводов 30 г/л и более, при периодическом внесении H2O2 в дозах 0,3–0, г/л, содержании дрожжевых клеток не менее 1–2 г/л, при освещении культуры видимым светом с интенсивностью около 40 мВт/л. Основной ферментационный процесс также необходимо вести в условиях освещения видимым светом той же интенсивности, но без внесения пероксида водорода.
Предложенный способ позволяет поддерживать высокую физиологическую активность клеток дрожжей и способствует повышению производительности процесса – сокращению вре мени брожения на 30%.
A) Биомасса в темноте Сахароза B) Биомасса на свету (40 мВт/л) Сахароза 2,5 150 5 2 120 4 Биомасса, г/л Биомасса, г/л Сахароза, г/л Сахароза, г/л 17,2% 92% 1,5 90 3 42% 73,4% 75,3% 28,5% 1 60 2 0,5 30 1 0 0 0 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 Время, ч Время, ч D) Биомасса на свету (40 мВт/л) Сахароза C) Биомасса на свету (40 мВт/л) Сахароза 5 5 4 Биомасса, г/л 4 Биомасса, г/л Сахароза, г/л Сахароза, г/л 9,3% 12% 61,4% 64,2% 3 3 2 2 1 1 30 20,9% 33% 0 0 0 20 40 0 20 40 Время, ч Время, ч Рис. 5. Динамика накопления биомассы и потребления субстрата клетками штамма Meyen Т 985 при анаэробном культивировании в биореакторе. A – адаптированная культура (инокулят – линия 5-го пассажа), рост в темноте;
B – неадаптированная культура (контроль), рост на свету;
C – адаптированная культура (инокулят – линия 5-го пассажа), рост на свету;
D – адаптированная культура (инокулят – линия 10-го пассажа), рост на свету.
D) Рис. 6. Бродильная актив ность при анаэробном культиви 800 ровании штамма сахаромицетов C) мл CO2/л*ч Meyen T 985 в биореакторе. A – B) адаптированная культура (иноку лят – линия 5-го пассажа), рост в A) темноте;
B – неадаптированная 200 культура (контроль), рост на све ту;
C – адаптированная культура (инокулят – линия 5-го пассажа), 0 20 40 60 80 рост на свету;
D – адаптирован Время, ч ная культура (инокулят – линия 10-го пассажа), рост на свету.
3. Модификация культивирования галобактерий для получения бактериородопсина.
Фототрофные галофильные бактерии р. Halobacterium являются практически важными про дуцентами бактериородопсина (БР) [Oesterhelt, 1971], находящего в настоящее время все более широкое применение в биомолекулярных устройствах [Birge, 1990, Wu et al., 2002, Seitz et al., 2000]. Среда обитания галобактерий – сильно минерализованные озера и лиманы, зачастую недос таток кислорода, интенсивное освещение, солнечная иррадиация способствовала выработке ими адаптивных механизмов экстремофилии. Исследования галобактерий могут служить основой для разработки более совершенных по сравнению с существующими способов культивирования.
Наблюдаемые при стандартном культивировании [Mukohata et al., 1982] неудовлетворитель ные воспроизводимость и нестабильность результатов, зачастую плохой рост галобактерий, вариа бильность в морфологии и цвете колоний и клеток могут быть обусловлены как свойствами штам мов, так и большой зависимостью от состава органических компонентов питательных сред и нали чия в них примесей. В нашей работе с использованием процедуры облучения ультрафиолетом бы ла получена серия мутантов, рост которых и способность к синтезу БР были исследованы на среде с триптоном (Serva) – 5 г/л, дрож жевым экстрактом (Organotechnie) – 4 0, 2 г/л и глицерином – 4 мл/л (рост в 3,6 0, 3,2 колбах). Был отобран наиболее пер 2C Содержание БР, г/л 0, 2, Биомасса, г/л спективный штамм UM-17, пока 1C 0, 2B 2, завший наибольшую способность к 2 0, 1B синтезу БР при приемлемых росто 1,6 1A 0, вых характеристиках.
1, 0,02 Характеристики роста 0,8 2A штамма UM-17 и накопление им 0, 0, БР были проверены при использо 0 вании с триптоном, пептоном, 0 40 80 120 Время, ч дрожжевым экстрактом различных Рис. 7. Сравнительная характеристика роста био- марок и варьировании их концен массы и накопления БР штаммом UM-17 на средах с раз- трации, а также варьировании ко личным составом органических компонентов. личества посевного материала. На A – 5,5 г/л дрожжевого экстракта (Organotechnie), 4 рис. 7 представлена динамика на мл/л глицерина;
B – 5 г/л триптона (Hispanlab), 2 г/л копления биомассы и синтеза БР дрожжевого экстракта (Organotechnie), 4 мл/л глицерина;
штаммом UM-17 на некоторых из C – 5 г/л триптона (Serva), 2 г/л дрожжевого экстракта сред. Среды, содержащие 5 г/л (Organotechnie), 4 мл/л глицерина. 1 – накопление био- триптона или пептона, 2 г/л дрож массы, 2 – накопление бактериородопсина. жевого экстракта и 4 мл/л глице рина, оказались наиболее предпоч тительны. Однако рост бактерий и синтез БР на них сильно зависели от марки используемых триптона или пептона. Наилучшим оказался триптон фирмы Serva (рис. 7, вариант C), на среде с которым конечный уровень биомассы составил 3 г/л, удельная скорость роста в экспоненциаль ной фазе – 0,054 ч–1, максимальное накопление БР – 75 мг/л. На среде с триптоном Hispanlab вы ход биомассы был выше – 3,7 г/л, удельная скорость роста – 0,1 ч–1, но накопление БР меньше – 43–44 мг/л. Марка дрожжевого экстракта (Hispanlab, Organotechnie, Difco) на рост галобактерий существенно не влияла. Рост штамма ST-033 на тех же питательных средах был аналогичен, од нако накопление им бактериородопсина составило лишь 55–60% от уровня штамма UM-17.
Как видно из динамики роста бактерий (рис. 7), в фазе линейного роста, обусловленной в том числе дефицитом кислорода, синтез БР продолжается, но до определенного момента, после которого на некоторых средах происходит падение содержания БР.
Качественные изменения в состоянии культуры хорошо прослеживаются по спектрам лиза тов галобактерий, выращенных на средах с триптоном разных марок (рис. 8). При использовании триптона Hispanlab ярко выраженные пики каротиноидов проявляются уже на 158 ч культивирова ния. Содержание БР к этому времени составляет 44 мг/л, а на 210 ч падает до 38 мг/л. При исполь зовании среды с дрожжевым экстрактом, но без триптона или пептона, пики каротиноидов прояв ляются еще раньше. Последующие опыты проводили со штаммом UM-17, растущим на среде, обеспечившей максимальный син 0, тез бактериородопсина (триптон 0, Опт. плотность (D), ед.
Serva с дрожжевым экстрактом Or ganotechnie и глицерином).
0, 4 Выбор направления даль 0,6 нейших исследований был осно 0, ван на наблюдениях, предпола 0,4 гавших наличие эффекта старения среды при ее хранении. Предпо 0, Пик БР ложительно старение могло быть 0, 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 связано с образованием продуктов химического и/или фотохимиче Длина волны, нм ского окисления органических Рис. 8. Изменения в спектрах лизатов клеток куль компонентов, способных ингиби тур штамма UM-17 разного возраста, выращенных на:
ровать рост бактерий и биосинтез 1–4 – среде с триптоном Serva, 5 – среде с триптоном БР. При культивировании на сре Hispanlab. Время культивирования: 1 – 45 ч;
2 – 93 ч;
3 – де, хранящейся при комнатной 162 ч;
4 – 210 ч, 5 – 158 ч.
температуре и дневном освещении в течение 2-х суток, наблюдались 3, ухудшение роста галобактерий и 3 накопления БР. Аналогичные, но более интенсивные процессы ста 2, Биомасса, г/л рения среды могут протекать, оче 3 видно, и в ходе культивирования 1,5 2 галобактерий (5–7 суток роста при температуре 37–38 oC и аэрации).
4 Известно, что такие соединения 0, как липиды, которые могут вхо дить в состав примесей исполь 0 30 60 90 120 150 зуемых органических субстратов Время, ч или экскретироваться, могут под вергаться перекисному окислению Рис. 9. Влияние «возраста» питательной среды на [Кудряшов, 2004] равно как и дру накопление биомассы штаммом UM-17, инокулят вноси гие соединения. Образовавшиеся ли в: 1 – свежеприготовленную среду, 2 – 2 сут. аэрации продукты окисления могут оказы и освещения среды до засева, 3 – 4 сут. аэрации и осве вать токсическое действие на клет щения среды до засева, 4 – 6 сут. аэрации и освещения ки, вызывать в них состояние окис среды до засева.
лительного стресса и индуцировать синтез веществ-антиоксидантов, участвующих в ответе бактерий на стресс-факторы. В частности, у галобактерий такими антиоксидантами являются каротиноиды [Карнаухов, 1988, Sies et al., 1992, Krinsky, 1998].
С целью выяснения роли «ста 3,5 рения» среды в опытах стерильную среду выдерживали в колбах на ка чалке без засева 2, 4, 6 суток при 2, Биомасса, г/л аэрации и освещении, после чего вносили инокулят (рис. 9).
4 Как видно из представленных 1, данных, уровень накопления био массы закономерно снижался по 0, мере «старения» среды перед засе 0 вом. К концу культивирования на 0 20 40 60 80 100 120 140 среде 6 суточного возраста накоп Время, ч ление биомассы составило лишь около 50% по сравнению с исполь Рис. 10. Динамика накопления биомассы штамма зованием свежеприготовленной UM-17 при внесении отработанной культуральной жид- среды. Содержание БР после 160 ч кости в питательную среду: 1 – контроль, без внесения культивирования галобактерий со ОКЖ, 2 – с внесением 1/5 части ОКЖ от общего объема, ставило: для свежеприготовленной 3 – 2/5 объема, 4 – 3/5 объема, 5 – 4/5 объема. Во всех ва- среды – 72 мг/л, при использова риантах среды содержали одно и то же количество орга- нии 2-суточной питательной среды нического субстрата. – 37 мг/л, 4-суточной – 22 мг/л, 6 суточной – 14 мг/л.
Таким образом, вероятно, в питательной среде протекают процессы химического или фо тохимического окисления ее компонентов, приводящие к ингибированию роста галобактерий, синтеза ими БР и индукции синтеза каротиноидов, что определяется по более раннему прояв лению пиков каротиноидов в спектрах лизатов. Можно предположить, что продукты окисления участвуют в регуляции синтеза каротиноидов и БР на клеточном уровне.
Накопление окисленных продуктов – ингибиторов роста и биосинтеза БР, при выращива нии бактерий на свежеприготовленной питательной среде происходит по ходу культивирова ния в результате упомянутых процессов, а также окисления образующихся при росте галобак терий метаболитов. Их совместное действие приводит к замедлению и торможению роста гало бактерий и накопления ими бактериородопсина. На рис. 10–12 представлены результаты опы тов с внесением отработанной культуральной жидкости (ОКЖ) в питательную среду. Сущест венное замедление роста наблюдается, когда содержание ОКЖ в исходной питательной среде составляет около половины общего объема среды (рис. 10).
Снижение в уровне накопления БР начинается уже при внесении ОКЖ в объеме 1/5 от общего объема питательной среды, а спектры лизатов клеток в этих вариантах демонстрируют, что с увеличением доли внесенной ОКЖ увеличивается содержание каротиноидов по отноше нию к содержанию БР (рис. 11,12).
Основываясь на полученных данных были предложены приемы культивирования, нивели рующие отрицательные воздействия продуктов окисления. Апробированы следующие подходы:
1 – культивирование при дефиците кислорода (для уменьшения количества окисленных про дуктов – ингибиторов);
2 – культивирование с доливом свежеприготовленной среды (за счет разбавления снижается содержание токсичных окисленных продуктов);
3 – внесение антиокси дантов;
4 – подбор условий освещения (стимулирование синтеза БР при одновременном уменьшении фотохимического воздействия на среду);
5 – селективное извлечение ингибиторов сорбентом в процессе роста куль туры.
0, Эксперименты проводились со Опт. плотность (D), ед.
0,35 штаммом UM-17 в колбах и биоре акторе.
0, Опыты в колбах показали, что 0, первые четыре подхода позволяют лишь незначительно повысить уро 0, вень накопления биомассы и бакте 0,15 Пик БР риородопсина без существенного уменьшения содержания кароти 0, 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 ноидов в клетках галобактерий. Так, внесение антиоксидантов (цистеина, Длина волны, нм токоферола, сульфита натрия) уве Рис. 11. Спектры лизатов биомассы штамма UM-17 личивает выход биомассы и БР на при культивировании с внесением отработанной культу- 10–15%. Изменение условий осве ральной жидкости в питательную среду: 1 – контроль, щения (интенсивности, длины вол без внесения ОКЖ, 2 – с внесением 1/5 части ОКЖ от ны) повысили выход биомассы не общего объема, 3 – 2/5 объема, 4 – 3/5 объема, 5 – 4/5 более, чем на 10%, а БР – на 22%.
объема. Во всех вариантах среды содержали одно и то же Самым действенным оказался количество органического субстрата. вариант с удалением ингибиторов роста галобактерий сорбентом непо средственно в ходе ферментации.
Применение сорбента позволило (рост в колбах) повысить выход биомассы на 45–50%, а БР – на 70– 75% по сравнению с контролем. На рис. 13 приведены результаты одно го из экспериментов при выращива нии штамма UM-17 в биореакторе с прокачкой ферментируемой культу ры через выносной контур с емко стью, содержащей сорбент для из влечения ингибиторов биосинтеза и доливом свежеприготовленной Рис. 12. Цвет суспензии и уровень накопления БР концентрированной питательной штаммом UM-17 при культивировании с внесением отра среды. Через 8 сут. культивирова ботанной культуральной жидкости в питательную среду:
ния галобактерий в этом режиме 1 – контроль, без внесения ОКЖ, 2 – с внесением 1/5 час удалось достичь конечного уровня ти ОКЖ от общего объема, 3 – 2/5 объема, 4 – 3/5 объема, накопления биомассы 45 г/л (по су 5 – 4/5 объема. Во всех вариантах среды содержали одно хому веществу) при суммарном со и то же количество органического субстрата.
держании бактериородопсина 1700– 1750 мг/л.
Крайне важно, что в этом варианте культивирования в спектре лизата клеток галобактерий практически полностью отсутствуют пики каротиноидов и проявляется только ярко выраженный пик БР (рис. 14). Это в дальнейшем Биомасса ГБ БР позволяет существенно облегчить 45 1, выделение БР из биомассы, очистку 40 1, Содержание БР, г/л 35 1,4 его от каротиноидов и обеспечит Биомасса, г/л 30 1, ВП получение относительно дешевых 25 препаратов БР.
ВП 20 0, ВП Для реализации такого спо 15 0, ВП Д ЗА соба культивирования (с доливом Д 10 0, среды и прокачкой через сорбент) 5 0, в автоматическом режиме нами 0 разработан метод экспресс анализа 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 содержания БР, позволяющий Время, ч сравнивать показатели текущего Рис. 13. Накопление биомассы при выращивании процесса культивирования с эта штамма UM-17 в биореакторе, предусматривающем из лонным вариантом и своевремен влечение ингибиторов биосинтеза сорбентом (ЗА – замена но заменять отработанный адсор адсорбента), долив среды в биореактор (Д) и внесение под бент. Метод основан на анализе питок (ВП).
цвета среды культивирования с клетками галобактерий с помощью CCD матрицы сканера Epson Per 0, Опт. плотность (D), ед.
fection 1270 и включает соответст 0, вующее разработанное программ 0, ное обеспечение.
0, Предварительная технико 0, экономическая оценка показала, что 0,35 получение БР (в составе пурпурных Пик БР мембран) по разработанной техно 0, логии позволит снизить стоимость 0, его с 500–5000 руб. за 1 мг (в зави 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 симости от чистоты продукта) до Длина волны, нм 20–100 руб. за 1 мг.
Рис. 14. Спектр лизата биомассы штамма UM- при культивировании с извлечением ингибиторов био синтеза.
Выводы.
1. Разработано аппаратурное оформление и программное обеспечение «BioDrome 1.0» для управляемого культивирования микроорганизмов в биореакторах. Система внедрена в РХТУ им. Д.И. Менделеева для проведения научных исследований и учебного процесса, а также в ГУП НПО «Астрофизика», ВНИИ Молочной промышленности (г. Москва).
2. Разработана концепция «солнечного биореактора», в котором культивирование микро организмов осуществляется при одновременном освещении рабочей зоны светом видимого и ультрафиолетового диапазона. На примере культивирования дрожжей C. tropicalis и S. cere visiae показано, что такой прием позволяет повысить выход биомассы с единицы субстрата на 10-20% без ухудшения производительности биореактора.
3. Предложено использование пероксида водорода или УФ-облучения для подготовки предадаптированного посевного материала S. cerevisiae с целью улучшения физиологических характеристик культуры. При выращивании посевного материала в аэробном или микроаэро фильном режимах пероксид водорода в пассажах лучше всего вносить в предстационарной фа зе роста в дозе 0,3–0,6 г/л при концентрации биомассы дрожжей 2,2–2,4 г/л в условиях освеще ния суспензии фоновым видимым светом.
4. Показаны адаптационные изменения культуры S. cerevisiae в пассажах при внесении пероксида водорода или воздействии УФ, которые нивелируются через определенное время по сле прекращения адаптационной обработки.
5. Отработаны варианты анаэробной ферментации дрожжей S. cerevisiae с использовани ем предадаптированного к пероксиду посевного материала, приводящие к интенсификации спиртового брожения и сокращению времени сбраживания субстрата на 30%.
6. Подобрана питательная среда, режимы аэрации и освещения для культивирования га лобактерий с целью получения бактериородопсина. Показана необходимость учета фактора «старения» питательной среды для обеспечения стабильности роста галобактерий и синтеза бактериородопсина.
7. Предложен режим культивирования галобактерий с доливом питательной среды и ис пользованием инкапсулированного адсорбента для уменьшения концентрации накапливаю щихся в среде ингибиторов роста, в том числе, продуктов абиотического окисления. Режим по зволяет получать до 1700–1750 мг/л бактериородопсина за 8 сут. культивирования при одно временном повышении стабильности процесса и минимизации содержания каротиноидов.
8. Предложен метод оценки результативности культивирования галобактерий в отноше нии накопления бактериородопсина. Метод основан на количественной оценке цветовой гаммы бактериальной суспензии с использованием фотосканера, включает обработку результатов и регулирование на их основе течения процесса, для чего создано программное обеспечение, ин тегрированное в общий пакет BioDrome 1.0.
Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:
1. Кузнецов А.Е., Неручев Ф.А., Карпов А.В, Каленов С.В., Сафронов В.В., Серегин А.М.
Исследование совмещенных гибридных процессов биодеструкции и биосинтеза на примере модельной системы роста дрожжей Candida tropicalis. – В сб. Биотехнология: состояние и пер спективы развития: Материалы 1-го Международного конгресса (Москва, 14-18 октября 2002г.). – М.: ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2002, с. 207,208.
2. Каленов С.В., Кузнецов А.Е., Косивцов Ю.Ю. Лабораторный биореактор с системой уда ленного доступа для сбора данных и контроля ферментационного процесса. – В сб. Биотехноло гия: состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Международного конгресса (Москва, 14-18 октября 2002г.). – М.: ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2002, с. 208,209.
3. Каленов С.В., Серегин А.М., Кузнецов А.Е., Солдатов В.И., Лалов В.В., Складнев Д.А., Страховская М.Г. Биотехнологический комплекс для исследования светочувствительных про цессов культивирования. – В сб. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материа лы 2-го Международного конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003г.). – М.: ЗАО "ПИК "Макси ма", 2003, т.1, с. 308-310.
4. Каленов С.В.. Кузнецов А.Е. Лабораторный биореактор с системой удаленного доступа для сбора данных и контроля ферментационных процессов на базе LabView фирмы "National Instruments". – В сб. трудов конф. Образовательные, научные и инженерные приложения в сре де LabVIEW и технологии National Instruments (Москва, 14-15 ноября 2003 г.) – М.: Изд-во РУДН, 2003, с. 138-141.
5. Серегин А.М., Солдатов В.И., Складнев Д.А., Кузнецов А.Е., Калёнов С.В. Использова ние лазерного излучения при культивировании галобактерий. – В сб. Высокие технологии XXI века: Материалы конференции V Международного Форума (Москва, 19-23 апреля 2004 г.). – М.: Российский Фонд развития высоких технологий (РФРВТ), 2004, с. 335-338.
6. Kouznetsov A.Y., Kalyonov S.V., Soldatov V.I., Seregin A.M., Strakhovskaya M.G., Sklad nev D.A. Light as an ambient control factor in the systems of microbiological cultivation and biodestruction. – European Symposium on Environmental Biotechnology (ESEB 2004), Oostende (Belgium), April 25-28, 2004, 4pp.
7. Kouznetsov A.Ye., Kalyonov S.V. Simultaneous hybrid processes as a way to improve char acteristics of cultivation of micro-organisms and biodestruction of pollutants. – European Symposium on Environmental Biotechnology (ESEB 2004), Oostende (Belgium), April 25-28, 2004, 4 pp.
8. Калёнов С.В., Неручев Ф.А., Карпов А.В., Кузнецов А.Е. Проведение совмещенных ферментационных и фотохимических процессов в гибридном лабораторном биореакторе. – В сб. Успехи в химии и химической технологии: Том XVI: N5. /РХТУ им. Д.И. Менделеева. М., 2002, с. 84-86.
9. Патент РФ № 2268924 с приоритетом от 23.11.2004. Способ получения биомассы дрожжей.
// Кузнецов А.Е., Сорокодумов С.Н., Винаров А.Ю., Кухаренко А.А., Каленов С.В., Крылов И.А.
10. Кузнецов А.Е., Сорокодумов С.Н., Калёнов С.В., Винаров А.Ю. Использование пере киси водорода для совершенствования процессов культивирования микроорганизмов. – В сб.
Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 3-го Международного конгрес са (Москва, 14-18 марта 2005г.). – М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", 2005, т.1, с. 335,336.
11. Калёнов С.В., Кузнецов А.Е., Складнев Д.А., Синайский В.В. Оптимизация процесса культивирования галобактерий с целью получения бактериородопсина. – В сб. Высокие техно логии XXI века: Материалы конференции VI Международного Форума (Москва, 24-28 апреля 2006 г.). – М.: Российский Фонд развития высоких технологий (РФРВТ), 2006.
12. Kouznetsov A.Ye., Kalyonov S.V. Simultaneous hybrid processes as a way to improve char acteristics of cultivation of micro-organisms and biodestruction of pollutants. // In New Research on the Environment and Biotechnology, Nova Science Publishers Inc, New York, 2006, pp. 99-104.
13. Suyasov N.A., Karetkin B.A., Kalyonov S.V., Shakir I.V. and Panphilov V.I. Increasing ef ficiency of biodegradation of fat-containing wastes of meat-processing industry. // In Industrial Appli cation of Biotechnology, Nova Science Publishers Inc, New York, 2006, pp. 105-113.
14. Калёнов С.В., Кузнецов А.Е., Складнев Д.А. Аспекты культивирования галобактерий, связанные с увеличением выхода бактериородопсина. – В сб. трудов Международной школы конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология” посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. – Москва-Пущино, 2006, с. 122-123.
15. Заявка на патентование № 20006118728 от 30.05.2006. Способ получения биомассы гало бактерий. // Калёнов С.В., Кузнецов А.Е.
16. Заявка на патентование № 20006118729 от 30.05.2006. Способ получения бактериородоп сина. // Кузнецов А.Е., Калёнов С.В.
17. Каленов С.В., Кузнецов А.Е.. Ресурсосберегающая технология получения бактериоро допсина на основе галобактерий. / Химическая промышленность сегодня, 2007, №3, с. 23-32.
18. Лосева С.А., Кузнецов А.Е., Каленов С.В. Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях окислительного стресса. – В сб. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 4-го Международного конгресса (Москва, 12-16 марта 2007г.). – М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", 2007, т.2, с. 76,77.