Биокаталитическое окисление тиоанизола свободными и иммобилизованными клетками родококков
На правах рукописи
ЕЛЬКИН Андрей Анатольевич БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ТИОАНИЗОЛА СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ РОДОКОККОВ 03.02.03 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пермь 2011 2
Работа выполнена в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научные руководители:
член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна кандидат химических наук Гришко Виктория Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Соловых Галина Николаевна кандидат медицинских наук, доцент Коробов Владимир Павлович
Ведущая организация: Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань.
Защита состоится “_” февраля 2011 г. в_часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13.
Факс: (342)2808111.
Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан «»_2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Оптически активные (энантиомерно однородные, хиральные) органические сульфоксиды находят широкое применение в химической и фармацевтической практике. В асимметрическом синтезе сульфоксидная группа используется в качестве активного центра, способного с высокой степенью стереоселективности определять направление химических реакций. В современной медицине используются антибактериальные, противоязвенные, противовоспалительные и анальгетические препараты на основе сульфоксидсодержащих соединений. С учётом различия в скорости метаболизма (S)- и (R)-энантиомерных сульфоксидов антисекреторных средств (пантопразола, рабепразола, лансопразола, омепразола, тенатопразола и др.) разработаны современные эффективные лекарственные препараты на основе индивидуальных энантиомеров (Захарова, 2008;
Cotton et al., 2000;
Andersson et al., 2001).
Получение оптически активных сульфоксидов осуществляется в основном методами химического синтеза. Однако при получении энантиомерно чистых сульфоксидов химическим путем не всегда достигается высокая энантиоселективность реакций (Толстиков и др., 2003).
Альтернативой многостадийному химическому синтезу оптически активных соединений выступают биологические технологии, позволяющие существенно повысить уровень регио- и стереоселективности реакций (Careno, 1995;
Solladie et al., 1995;
Holand et al., 2002, 2003). В качестве биокатализаторов процесса окисления прохиральных сульфидов используются ферментные препараты (оксигеназы, пероксидазы) и целые микробные клетки. Однако промышленное использование чистых ферментов, несмотря на их высокую регио- и стереоселективность, ограничивается из-за проблем, связанных с очисткой, препаративным выделением и сохранением стабильности индивидуальных ферментов. Кроме того, спектр веществ, которые могут превращаться интактными микробными клетками, намного шире. Специфика многоцелевых оксигеназных ферментных систем, отсутствие проблемы с добавкой оксиданта и регенерацией кофермента, устойчивая активность в экстремальных условиях внешней среды обусловливают технологическую перспективность использования целых клеток микроорганизмов в процессах асимметрического окисления сульфидов.
В настоящее время в реакциях окислительной биотрансформации многих органических соединений алифатических и ароматических углеводородов, изопреноидов, стеринов, стероидов и их структурных аналогов всё чаще используются актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие высокой активностью оксигеназных ферментных комплексов (Larkin, Kulakov, Allen, 2006;
Martnkov et al., 2009). Родококки успешно применяются в качестве биокатализаторов процесса десульфуризации серосодержащих компонентов нефти, начальным этапом которого является образование сульфоксидов. Недавно показана технологическая перспективность использования цитохром P-450 зависимых монооксигеназ родококков в реакциях селективного биокаталитического синтеза арилалкилсульфоксидов (Liu et al., 2006;
Jackson et al., 2007;
Zhang et al., 2010). Вместе с тем, известны лишь единичные примеры использования представителей R. equi и R. erythropolis в реакциях окисления прохиральных сульфидов в оптически активные сульфоксиды. Низкая эффективность таких реакций обусловлена высокой концентрацией используемых субстратов и патогенностью культур R. equi (Ohta et al., 1984, 1985), либо низкой концентрацией трансформируемых сульфидов при высокой нагрузке биокатализатора (Holand et al., 2003). В связи с этим поиск новых культур родококков, катализирующих целевые реакции биотрансформации прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды является весьма актуальным.
Цель настоящей работы исследование возможностей использования актинобактерий рода Rhodococcus для эффективной окислительной биотрансформации прохирального фенилметилсульфида (тиоанизола).
Основные задачи исследования 1. Исследовать окисляющую активность коллекционных штаммов родококков разных видов в отношении арилалкильного сульфида тиоанизола.
2. Выявить оптимальные условия для окислительной биоконверсии тиоанизола с использованием свободных клеток родококков.
3. Провести сравнительное исследование каталитической активности свободных и иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков при биотрансформации тиоанизола.
4. На основе иммобилизованных клеток родококков разработать эффективный биокатализатор для окисления тиоанизола и его гомологов в оптически активные арилалкилсульфоксиды.
Научная новизна. Проведен сравнительный анализ биокаталитической активности коллекционных культур актинобактерий рода Rhodococcus в отношении арилалкильного сульфида тиоанизола. Выявлено, что родококки разных видов катализируют образование как (R)-, так и (S)-сульфоксида тиоанизола. Показано, что сульфидокисляющая активность родококков не является видоспецифичной и реализуется в присутствии дополнительных источников углерода. Наиболее эффективными ростовыми субстратами в процессе окислительной биотрансформации тиоанизола являются глицерин и н-гексадекан. Обнаружена обратная зависимость сульфидокисляющей активности родококков от концентрации н-гексадекана в среде их культивирования. Определены оптимальные условия направленного окисления тиоанизола в оптически активный (S)-сульфоксид с использованием иммобилизованных в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта (ПВС-криогеля) клеток родококков.
Экспериментально подтверждено, что иммобилизованные клетки родококков характеризуются высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию повышенных концентраций тиоанизола.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представление о возможности использования бактерий для регио- и стереоселективной биотрансформации прохиральных органических сульфидов в оптически активные сульфоксиды.
В результате проведенных исследований выявлены штаммы Rhodococcus spp., активно катализирующие направленное образование энантиомерно обогащенных сульфоксидов. На основе иммобилизованных в ПВС-криогеле клеток родококков разработан эффективный биокатализатор с высокой сульфидокисляющей активностью, обладающий длительной сохранностью функциональной стабильности и возможностью многократного использования для биотрансформации тиоанизола. Полученные экспериментальные данные представляют интерес для разработки биотехнологических способов получения практически значимых соединений сульфоксидсодержащих интермедиатов тонкого органического синтеза, оптически чистых изомеров лекарственных препаратов, а также биокатализаторов процессов селективного извлечения сероорганических примесей из различных фракций нефти. Полученная информация о наиболее активных бактериальных биотрансформаторах тиоанизола включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в каналах сети Интернет (www.iegm.ru/iegmcol).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Свободные клетки родококков катализируют селективное окисление тиоанизола с образованием целевого (R)- или (S)-сульфоксида в соокислительных условиях. Сульфидокисляющие свойства родококков не являются видовой характеристикой, а определяются специфичностью штаммов и условиями их культивирования.
2. Родококки наиболее активно трансформируют тиоанизол в присутствии н-гексадекана (0,1 об.%) при щелочных значениях рН (8,0) и оптимуме температуры 28оС.
3. Иммобилизация родококков в матрицу ПВС-криогеля повышает сульфидокисляющую активность бактериальных клеток при использовании тиоанизола и его гомологов и одновременно сокращает продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола по сравнению со свободными клетками в 4 раза.
4. Разработанный на основе иммобилизованных клеток родококков биокатализатор характеризуется высокой сульфидокисляющей активностью, возможностью эффективного использования для получения оптически активных (S)-арилалкилсульфоксидов на протяжении четырех последовательных циклов и высокой устойчивостью при хранении в течение 12 месяцев при пониженной температуре +4оС.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной конференции “Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал”, Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008;
VI и VII Международных конференциях “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии”, Минск, 2008 и 2010;
V Всероссийской молодежной школе-конференции с международным участием “Актуальные аспекты современной микробиологии”, Москва, 2009;
II Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов “Симбиоз-Россия 2009”, Пермь, 2009;
The XIII Annual Symposium for Biology Students of Europe, Kazan, 2009;
III Всероссийском конгрессе с международным участием студентов и аспирантов биологов “Симбиоз-Россия 2010”, Н. Новгород, 2010.
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в научных журналах “Прикладная биохимия и микробиология” и “Вестник Пермского университета”.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 11 таблиц и 24 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 128 наименований работ, в том числе 46 отечественных и 82 зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме “Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека” (номер госрегистрации 01.9.70 005279), Работа поддержана грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН “Биологическое разнообразие” (№ 09-П-4-1034, номер госрегистрации 01200963679), Президента РФ “Ведущие научные школы” (№ НШ 64403.2010.4), Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (№ 10 04-96032), а также Стипендией Пермского края для молодых ученых.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Рабочая коллекция бактериальных культур составила 146 штаммов родококков, принадлежащих к видам R. erythropolis (43), “R. longus” (7), R. fascians (20), R. opacus (15), R. rhodochrous (14) и R. ruber (47), поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур #768, www.iegm.ru/iegmcol).
Условия культивирования. Бактерии выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносили 100 мл минеральной среды.
Культивирование проводили на орбитальной качалке Certomat IS (“Sartorius”, Германия) (160 об/мин). В опытах по биотрансформации тиоанизола использовали минеральную среду следующего состава г/л: KNO3 – 1,0;
K2HPO4 – 1,0;
KH2PO4 – 1,0;
NaCl – 1,0;
MgSO4·7H2O – 0,2;
CaCl2·2H2O – 0,02;
FeCl3 – 0,001 (Каталог штаммов…, 1994). В среду добавляли 0,1% дрожжевого экстракта (“Микроген”, Россия) и раствор микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974). В качестве источника углерода и энергии использовали глюкозу (0,1 и 1,0 %), или ацетат аммония (0,1 и 1, %), или н-гексадекан, н-декан, н-нонан, н-ундекан или н-додекан (0,1 и 1, об.%). Кроме того, использовали глицеринсодержащую среду, которая включала г/л: (NH4)2SO4 – 2,0;
K2HPO4 – 2,0;
CaCl2·2H2O – 0,01;
FeSO4·7H2O – 0,01;
MgSO4·7H2O – 0,1;
глицерин – 1,0 или 10,0;
дрожжевой экстракт – 4, (Sojo et al., 1997). Тиоанизол (0,5, 1,0, 1,5 г/л) в культуральную среду добавляли в виде раствора в изопропаноле (1:10 v/v). В качестве посевного материала использовали клетки родококков, выращенные на МПА и отобранные в экспоненциальной фазе роста, при этом начальная 5,0±0,7х106 клеток/мл.
концентрация составляла Продолжительность процесса биотрансформации тиоанизола составляла от 1 до 5 сут.
Для индукции сульфидокисляющей активности родококков бактериальные клетки предварительно выращивали в глицерин- или гексадекансодержащей среде с добавлением 0,02 г/л тиоанизола. Через 2 сут культивирования клеточную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Осажденную биомассу трижды промывали 50 мМ Na-фосфатным буфером (рН 7,0), ресуспендировали в физиологическом растворе и использовали в качестве инокулята в экспериментах по биотрансформации тиоанизола.
Зависимость сульфидтрансформирующей активности штаммов родококков от температуры изучали при 18, 28, и 37оС;
кислотности среды в диапазоне значений рН от 6,0 до 9,0;
аэрации на орбитальной качалке 120, 160 и 200 об/мин. При оценке влияния физиологического состояния клеток родококков на их сульфидокисляющую активность тиоанизол вносили в среду в концентрации 0,5 г/л одновременно с инокулумом и в моменты времени, соответствующие стадиям роста культур: лаг-фазе (3 ч), экспоненциальной (24 ч), ранней стационарной (48 ч) и поздней стационарной (72 ч). Пробы отбирали каждые 24 ч в течение 120 ч культивирования родококков после добавления тиоанизола.
Цитоморфологические исследования проводили с помощью системы визуализации микроскопического изображения, включающей световой микроскоп Axiostar plus (“Carl Zeiss”, Германия), персональный компьютер, цветную цифровую систему ввода изображения PRO-150ES (“Pixera”, США).
Условия иммобилизации и определение дыхательной активности клеток родококков. В качестве носителя использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (ПВС). В работе применяли ПВС производства ПО “Азот”, Невинномысск, Россия. Для иммобилизации использовали клеточные суспензии R. rhodochrous ИЭГМ 66, полученные в глицерин- или гексадекансодержащей среде. Остаточное содержание глицерина или н-гексадекана составляло 0,1 об. %.
Иммобилизацию родококков, выращенных в гексадекансодержащей среде, осуществляли путём внесения клеточной суспензии в раствор ПВС согласно методике, описанной в работе (Kuyukina et al., 2006). Для иммобилизации родококков, выращенных в глицеринсодержащей среде, 2 сут культуру предварительно трижды промывали 50 мМ Na-фосфатным буфером (рН 7,0) и ресуспендировали в физиологическом растворе. Клеточную суспензию и раствор ПВС смешивали в соотношении 1:2 v/v. Последующие этапы гранулирования, замораживания и оттаивания осуществляли согласно указанной выше методике. Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0,5%-ном растворе NaCl в течение 24 ч и добавляли из расчета 200 гранул (5,0±0,6х106 клеток/мл) на 100 мл среды.
Дыхательную активность свободных и иммобилизованных в гелевом носителе клеток родококков оценивали с помощью респирометра Columbus (“Micro-Oxymax”, США).
Исследование продуктов биотрансформации. Продукты биотрансформации тиоанизола экстрагировали с помощью этилацетата.
Объединенные этилацетатные вытяжки обезвоживали над Na2SO4.
Растворитель удаляли в вакууме роторного испарителя (“Heidolph”, Германия).
Качественный состав продуктов биотрансформации контролировали методом ТСХ на пластинах с флуоресцентной добавкой (“Sigma-Aldrich”, США), фиксируя наличие продуктов окисления в УФ (254 нм) при сравнении с эталонными соединениями, в качестве которых использовали тиоанизол (“Sigma-Aldrich”, США) и его гомологи фенилэтил- (“Alfa Aesar”, США), п-толилметил- (“Alfa Aesar”, США), бензилметилсульфид (“Acros”, Бельгия).
Образцы продуктов окисления тиоанизола и его гомологов соответствующие сульфоксиды и сульфоны синтезировали с помощью метода химического окисления, используя перекись водорода в качестве окислителя.
Анализ продуктов биотрансформации осуществляли методом хромато масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа 6890N, Agilent, США с кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1 и квадрупольным масс спектрометром MSD 5973N в качестве детектора.
Продукты биоконверсии арилалкилсульфидов выделяли с использованием методов препаративной тонкослойной хроматографии на алюминиевых пластинах (“Sigma-Aldrich”, США) или колоночной хроматографии на силикагеле (“Merck”, Германия) при соотношении вещества и сорбента 1 : 12. В качестве элюента использовали смесь гексана с градиентом 540% этилацетата. Оптическое вращение D образцов арилалкилсульфоксидов в хлороформе, ацетоне или этаноле измеряли на поляриметре модели 341 (“Perkin-Elmer”, США) при длине волны 589 нм на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь.
Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6.0 (StatSoft Inc., 2001), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку.
Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование сульфидокисляющей активности родококков.
По нашим данным, исследуемые культуры родококков не используют тиоанизол (0,5 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии, о чем свидетельствует сохранение на постоянном уровне величины оптической плотности культуральной жидкости и содержания тиоанизола на протяжении 5 сут. Попытки индуцировать оксигеназный ферментный комплекс родококков в результате предварительного культивирования бактериальных клеток в присутствии 0,02 г/л тиоанизола не привели к положительному результату.
При подборе условий повышения биодоступности тиоанизола было установлено, что сульфидокисляющая активность исследуемых штаммов родококков индуцируется в присутствии дополнительных ростовых субстратов (ацетат аммония, глицерин, н-гексадекан, глюкоза). Скрининг сульфидокисляющей активности интактных клеток родококков осуществляли в соокислительных условиях с глицерином, при этом тиоанизол вносили через 2 сут роста бактериальной культуры. Установлено, что из исследованных культур родококков 48 штаммов в присутствии глицерина осуществляют полную биоконверсию тиоанизола с выходом от 36 до 100% соответствующего сульфоксида (рис. 1).
I 73-100 % II 36-73 % Рис. 1. Дендрограмма распределения штаммов Rhodococcus spp.
по кластерам в зависимости от их сульфидокисляющей активности.
В процессе исследований не выявлено зависимости сульфидокисляющей активности родококков от их видоспецифичности. Как видно из представленной дендрограммы (рис. 1), среди исследованных культур наиболее часто сульфидокисляющая активность регистрируется при анализе представителей видов R. rhodochrous и R. opacus (в сумме составляющие 74% кластера I). При этом исследованные штаммы родококков катализируют образование (R)- или (S)-сульфоксида тиоанизола (рис. 2).
O O S [O] [O] S S CH CH CH (S)-Сульфоксид тиоанизола Тиоанизол (R)-Cульфоксид тиоанизола O O S CH Сульфон тиоанизола Рис. 2. Окислительная биотрансформация тиоанизола родококками.
В табл. 1 представлены данные об оптической чистоте сульфоксида тиоанизола, образующегося в процессе биотрансформации соответствующего сульфида наиболее активными представителями родококков. По данным поляриметрии, высокой степенью стереоселективности в отношении тиоанизола характеризуются штаммы R. rhodochrous ИЭГМ 66 и R. opacus ИЭГМ 60.
Таблица Биотрансформация тиоанизола клетками родококков в присутствии глицерина Конфигура Содержание, % ция суль Штамм []D сульфоксида сульфона фоксида, р* +5,6о R. erythropolis ИЭГМ 682 100,0 (R), 3,8% -98,6о R. opacus ИЭГМ 60 85,8 14,2 (S), 73,2% +17,5о R. ruber ИЭГМ 94 89,4 10,6 (R), 12,0% +2,1о R. ruber ИЭГМ 381 76,5 23,5 (R), 1,4% -118,9о R. rhodochrous ИЭГМ 66 87,0 13,0 (S), 81,4% Примечание. * р Оптическая чистота.
В дальнейших экспериментах использовали штамм R. rhodochrous ИЭГМ 66, выбор которого был обусловлен наилучшим соотношением между химическим выходом (более 85,0 %) и оптической чистотой (81,4 %) сульфоксида тиоанизола (см. табл. 1), которые достигаются в течение 5 сут в глицеринсодержащей среде после добавления тиоанизола (0,5 г/л) через 2 сут после начала инкубации родококков.
Таблица Биотрансформация тиоанизола клетками R. rhodochrous ИЭГМ Содержание в сумме продуктов Концент Субстрат реакции, % рация, % Тиоанизол Сульфоксид Сульфон Биотический контроль 100,0 1,0 87,3 12, Глицерин 0,1 84,2 15, 1,0 100,0 Ацетат аммония 0,1 100,0 1,0 41,2 56,7 2, н-Гексадекан 0,1 93,6* 6, 1,0 30,0 40,2 29, Глюкоза 0,1 43,7 38,7 17, 1,0 62,7 25,8 11, н-Додекан 0,1 55,3** 32,1 12, 1,0 44,9 30,9 24, н-Ундекан 0,1 32,1** 40,2 29, 1,0 78,2 12,6 9, н-Декан 0,1 54,6** 32,1 13, 1,0 50,7 37,2 12, н-Нонан 0,1 42,9** 39,8 17, *Показатели статистически достоверно отличаются от результатов остальных вариантов опыта, p0,05. **Данные достоверно отличаются от результатов, полученных при использовании 1% концентрации питательного субстрата, p0,05.
Влияние условий культивирования на сульфидокисляющую активность R. rhodochrous ИЭГМ 66. При исследовании влияния природы и концентрации ростового субстрата на эффективность процесса биоконверсии тиоанизола при внесении сульфида через 2 сут роста бактериальных клеток выявлено, что наиболее высокий уровень сульфидокисляющей активности родококков регистрируется в присутствии глицерина и н-гексадекана (табл. 2).
Следует отметить, что в случае использования в качестве ростовых субстратов н-алканов, наблюдается тенденция обратной зависимости сульфидокисляющей активности родококков от концентрации питательного субстрата. При этом наиболее выраженный характер данной зависимости проявляется при снижении содержания в среде культивирования н-гексадекана.
Как видно из рис. 3, снижение уровня концентрации н-гексадекана приводит к 20 % увеличению сульфидокисляющей активности. Полная конверсия тиоанизола в соответствующий сульфоксид достигается в присутствии 0,1 об. % н-гексадекана на 5 сут инкубации родококков после добавления сульфида. Регистрируемый при этом уровень дыхательной активности бактериальных клеток обратно пропорционален концентрации н гексадекана в среде культивирования (рис. 4).
Тиоанизол, % Сульфоксид, % О2, мкл I II III *I 100 * 80 80 I II * II 60 60 III III 30000 IV 40 20 20 V 0 0 сут 3 4 5 6 7 cут 0 1 2 3 4 5 6 Рис. 3. Биотрансформация тиоанизола Рис. 4. Респираторная активность свобод (0,5 г/л) свободными клетками родококков в ных клеток родококков при окислении тиоанизола (0,5 г/л) в присутствии присутствии н-гексадекана в концентрации (об.%): I - 0,1;
II - 0,5;
III - 1,0. н-гексадекана в концентрации (об. %): I Тиоанизол вносили через 2 сут роста 0,1;
II - 0,5;
III - 1,0. IV – Биотический бактериальных клеток. *Данные достоверно контроль. V - Абиотический контроль.
отличаются от остальных вариантов опыта, Стрелкой указано время внесения тиоанизола.
p0,01.
Изучение влияния рН среды на эффективность процесса окисления тиоанизола родококками свидетельствует о том, что полная конверсия сульфидного субстрата протекает в условиях соокисления с н-гексадеканом при щелочной реакции среды (рН 8,0) в течение 4 сут при условии внесения тиоанизола через 2 сут (рис. 5).
* % 6 6,5 7 7,5 8 8, рН н-гексадекан глицерин Рис. 5. Влияние уровня рН среды на степень окисления тиоанизола (0,5 г/л) клетками R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 в присутствии:
н-гексадекана, глицерина.
Приведены данные после 4 сут культивирования родококков в присутствии тиоанизола. *Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта, p0,05.
При исследовании каталитической активности интактных клеток родококков при повышении концентрации тиоанизола в 2-3 раза установлено, что тиоанизол в концентрации 1,0 или 1,5 г/л ингибирует трансформирующую активность родококков при выращивании их в глицеринсодержащей среде. По данным ТСХ и хромато-масс спектрометрии, на 7 сут культивирования в такой среде регистрируется лишь тиоанизол.
О2, мкл I IV 20000 II, III V сут 0 1 2 3 4 5 6 Рис. 6. Респираторная активность свободных клеток R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 в присутствии глицерина и тиоанизола, используемого в концентрации (г/л): I – 0,5, II – 1,0, III – 1,5. IV – Биотический контроль.
V – Абиотический контроль.
Стрелкой указано время внесения тиоанизола.
Ингибирование биотрансформационного процесса высокими концентрациями сульфида сопровождается угнетением респираторной активности родококков (рис. 6) и формированием клеточных агрегатов (рис. 7).
Рис. 7. Клетки R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 в глициринсодержащей среде с добавлением 0,5 (А), 1,0 (Б) или 1,5 (В) г/л тиоанизола (фазово контрастная микроскопия, х1000).
Так, если при добавлении 0,5 г/л тиоанизола распределение клеток в среде остается однородным на протяжении всего инкубационного периода, то использование более высоких концентраций (1,0;
1,5 г/л) тиоанизола приводит к появлению в жидкой среде неоформленных агрегатов или агрегированных хлопьев (рис. 7).
В присутствии н-гексадекана реакция бактериальных клеток на введение тиоанизола в высоких концентрациях проявляется в снижении биотрансформирующей и респираторной активности родококков. Как видно из табл. 3, при внесении 1,0 и 1,5 г/л тиоанизола уровень биоконверсии сульфида через 4 сут составляет 18-25 %, и даже при увеличении продолжительности инкубации до 12 сут конверсия тиоанизола не превышает 50 %.
Таблица Биоконверсия тиоанизола свободными клетками R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 в присутствии н-гексадекана Степень биоконверсии тиоанизола, % Тиоанизол, г/л 4 сут 8 сут 12 сут 0,5 100,0* 1,0 24,7 35,4 49, 1,5 18,6 24,2 37, *Данные достоверно отличаются от остальных вариантов опыта, p0,05.
Иммобилизация клеток родококков в криогеле на основе ПВС. Для оптимизации процесса биоконверсии тиоанизола использовали прием иммобилизации клеток родококков в криогеле на основе ПВС. Необходимо отметить, что применение для иммобилизации клеток, предварительно выращенных в глицеринсодержащей среде, приводит к потере сульфидокисляющей активности родококков. Данный факт не находит объяснения, тогда как, по данным хромато-масс-спектрометрии, полная биоконверсия тиоанизола (0,5 г/л) в целевой сульфоксид достигается при использовании иммобилизованных бактериальных клеток, предварительно выращенных в присутствии н-гексадекана.
При использовании полученного биокатализатора уже через 1 сут регистрируется образование в минеральной среде целевого сульфоксида и сульфона тиоанизола в соотношении 3:1. Как видно из рис. 8А, в течение 1 сут параллельно с процессом окисления тиоанизола в целевой сульфоксид тиоанизола протекает активное окисление образующегося сульфоксида в сульфон. Почасовая динамика процесса окисления тиоанизола свидетельствует о том, что накопление сульфона протекает параллельно с образованием сульфоксида. При этом максимальная степень биоконверсии тиоанизола в сульфон достигается через 4 сут после начала эксперимента.
% Б А % 4 сут 0 1 2 3 4 сут 0 1 2 В % % Г 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4сут 0 1 2 3 4 сут - I, - II, - III Рис. 8. Биотрансформация тиоанизола (А, Б 0,5 г/л, В 1,0 г/л, Г 1,5 г/л) иммобилизованными клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66 в присутствии н-гексадекана (А) и глицерина (БГ): I тиоанизол, II сульфоксид тиоанизола, III сульфон тиоанизола.
Характер каталитической активности иммобилизованных клеток родококков меняется в условиях использования глицеринсодержащей среды.
При этом направленное окисление сульфида (0,5 г/л) в сульфоксид происходит через 1 сут, уровень образования побочного продукта окисления составляет не более 7% (рис. 8Б).
В глицеринсодержащей среде иммобилизованные клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 эффективно трансформируют тиоанизол в концентрации 1,0 и 1, г/л. При добавлении 1,0 г/л тиоанизола через 1 сут в среде культивирования регистрируется смесь целевого сульфоксида и остаточного тиоанизола в соотношении 4:1, на 2 сут в качестве продуктов реакции лишь целевой сульфоксид и побочный сульфон тиоанизола. На момент полного исчезновения тиоанизола концентрация сульфона не превышает 8% (рис. 8В).
При увеличении концентрации тиоанизола до 1,5 г/л полная биоконверсия сульфида достигается через 3 сут. При использовании данной концентрации сульфида среди продуктов реакции соответствующий сульфон не обнаруживается (рис. 8Г).
Оценка влияния срока хранения на функциональную активность биокатализатора и возможности его повторного использования.
В результате исследования сохранения сульфидокисляющей активности иммобилизованных клеток родококков в зависимости от продолжительности консервации гранул биокатализатора при пониженной температуре (4оС) установлено, что иммобилизованные в ПВС-криогеле клетки родококков сохраняют стабильную биокаталитическую активность в отношении сульфида после 12 мес хранения (табл. 4). Более длительная (24 мес) консервация приводит к увеличению продолжительности процесса трансформации тиоанизола в соответствующий сульфоксид. При этом в сумме продуктов реакции регистрируется более 10% сульфона тиоанизола.
Таблица Влияние продолжительности консервации на биокаталитическую активность клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66, включенных в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта Продолжитель- Время достижения (S)-Сульфоксид, Сульфон, Р, % ность консерва- полной конверсии % % ции, месяцы тиоанизола*, сутки 3 100,0 82, 12 3 100,0 81, 24 4 89,1 10,9 82, Примечание. *Содержание тиоанизола 1,5 г/л.
По нашим данным, биокатализатор на основе иммобилизованных клеток родококков может быть использован многократно. Установлено, что биоконверсия тиоанизола наиболее эффективно протекает в течение первых 4-х циклов (рис. 9). Последующая эксплуатация закрепленных в матрице ПВС-криогеля клеток родококков не целесообразна ввиду резкого снижения окислительной активности биокатализатора на 5 цикле замены сульфидного субстрата. Полная инактивация биокатализатора регистрируется после 7 циклов его применения.
тиоанизола, мг/(л*ч) Скорость окисления 1 2 3 4 5 6 7 Цикл Рис. 9. Сульфидокисляющая активность биокатализатора на основе иммобилизованных клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 при его многократном использовании в процессе биотрансформации тиоанизола.
Исследование эффективности биокатализатора в отношении гомологов тиоанизола. По нашим данным, разработанный биокатализатор на основе иммобилизованных в ПВС-криогеле родококков проявляет высокую эффективность в отношении гомологов тиоанизола фенилэтил-, п-толилметил- и бензилметилсульфидов. При этом химический выход и птическая чистота образующихся арилалкилсульфоксидов достигает 68-75% и 48-85% соответственно (табл. 5). Следует отметить, что использование биокатализатора, полученного на основе иммобилизованных клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66, обеспечивает направленное образование арилалкилсульфоксидов с (S)-конфигурацией асимметрического центра.
Таблица Энантиоселективное окисление арилалкилсульфидов (R1-S-R2) с использованием биокатализатора на основе иммобилизованных клеток R. rhodochrous ИЭГМ Конфигурация Выход R1 R2 Выход, % Р, сульфоксида сульфона, % % С6Н5 CН3 100,0 82,1 (S) С6Н5 C2H5 73,0 54,7 (S) 17, п-CH3С6Н4 CН3 68,0 48,3 (S) 9, С6Н5CH2 CН3 75,0 84,6 (S) 21, Таким образом, при исследовании сульфидокисляющей активности свободных и иммобилизованных клеток R. rhodochrous ИЭГМ установлено, что максимальную окислительную активность в отношении прохирального органического сульфида тиоанизола (0,5 г/л) свободные клетки родококков проявляют в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана при добавлении сульфида через 2 сут роста бактериальных клеток. Использование более высоких концентраций сульфида приводит к подавлению сульфидокисляющей активности родококков. Применение иммобилизованных бактериальных клеток исключает двухдневную стадию подготовки биокатализатора и позволяет достичь полной биоконверсии тиоанизола в течение 24 ч при одновременном введении биокатализатора и 0,5 г/л тиоанизола. Иммобилизованные в гелевом носителе клетки родококков обеспечивают конверсию тиоанизола и его гомологов в соответствующие (S)-сульфоксиды при использовании более высоких концентраций сульфидных субстратов (1,5 г/л) по сравнению с планктонными клетками. Разработанный биокатализатор перспективен для биотехнологического получения оптически активных органических сульфоксидов ключевых интермедиатов тонкого органического синтеза, оптически чистых изомеров лекарственных препаратов, для процесса селективной десульфуризации нефти и, возможно, утилизации запасов различных токсических серосодержащих соединений.
Выводы 1. Установлено, что родококки видов R. opacus и R. rhodochrous обладают выраженной способностью к окислению тиоанизола, которая проявляется в присутствии дополнительных ростовых субстратов. Наиболее высокий выход целевого (S)-сульфоксида тиоанизола достигается в присутствии н-гексадекана или глицерина.
2. Показано, что на эффективность процесса окисления тиоанизола родококками существенное влияние оказывают уровень рН среды и концентрация дополнительного ростового субстрата. Наиболее активно свободные клетки родококков трансформируют тиоанизол (0,5 г/л) в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана в течение 6 сут культивирования.
3. Обосновано, что клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные в криогеле на основе поливинилового спирта, характеризуются высокой метаболической активностью и устойчивостью к токсическому воздействию повышенных концентраций тиоанизола, На основе иммобилизованных клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 разработан эффективный биокатализатор, при использовании которого достигается полное окисление тиоанизола (1,5 г/л) в целевой (S)-сульфоксид в течение 3 сут.
4. Разработанный биокатализатор проявляет высокую сульфидокисляющую активность в отношении гомологов тиоанизола фенилэтил-, п-толилметил- и бензилметилсульфидов, характеризуется функциональной стабильностью в течение 12 месяцев хранения и возможностью его повторного эффективного использования на протяжении 4 циклов биотрансформации исследованных сульфидов.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Елькин А.А., Гришко В.В., Лозинский В.И., Ившина И.Б.
Биотрансформация арилалкилсульфидов с использованием целых клеток родококков//Материалы III Международной конференции “Микробное разхнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал”. – Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008. С. 147.
2. Гришко В.В., Елькин А.А. Биотрансформация тиоанизола клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66, иммобилизованными в криогеле поливинилового спирта: материалы//Материалы VI Международной конференции “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии”. – Минск, 2008. – Т. 2. – С. 234-236.
3. Елькин А.А., Гришко В.В., Ившина И.Б. Оптимизация процесса получения сульфоксида тиоанизола с использованием клеток алканотрофных родококков//Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз Россия 2009”. – Пермь, 2009. – С. 21-25.
4. Елькин А.А., Гришко В.В., Ившина И.Б. Окислительная биотрансформация тиоанизола актинобактериями рода Rhodococcus//Материалы V Молодежной школы-конференции с международным участием “Актуальные аспекты современной микробиологии”. Москва, 2009. С. 107-108.
5. Елькин А.А., Кылосова Т.И., Гришко В.В., Ившина И.Б.
Биокаталитический синтез оптически активных арилалкилсульфидов//Материалы III Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз-Россия 2010”. Н. Новгород, 2010.
С. 53-54.
6. Елькин А.А., Кылосова Т.И., Гришко В.В., Ившина И.Б.
Биотрансформация арилалкильных сульфидов целыми клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66//Вестник Пермского университета. Серия Биология.
2010. Вып. 1 (1). С. 27-31.
7. Елькин А.А., Кылосова Т.И., Гришко В.В., Ившина И.Б.
Энантиоселективное окисление тиоанизола иммобилизованными клетками родококков//Материалы VII Международной конференции “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии”.
Минск, 2010. С. 285-287.
8. Елькин А.А., Гришко В.В., Ившина И.Б. Окислительная биотрансформация тиоанизола клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66//Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 6.
С. 637-643.
ЕЛЬКИН Андрей Анатольевич БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ТИОАНИЗОЛА СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ РОДОКОККОВ Автореферат