Молекулярное моделирование пептидов в мембранах: от изучения механизмов связывания с бислоем к направленному изменению активности
На правах рукописи
Полянский Антон Александрович МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ В МЕМБРАНАХ:
ОТ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ СВЯЗЫВАНИЯ С БИСЛОЕМ К НАПРАВЛЕННОМУ ИЗМЕНЕНИЮ АКТИВНОСТИ Специальность 03.00.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
МОСКВА – 2006
Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Научный консультант:
Доктор физико-математических наук, доцент Р.Г. Ефремов
Официальные оппоненты:
Доктор физико-математических наук, профессор Г.Ю. Ризниченко Доктор химических наук, чл.-корр. РАН Ю.А. Чизмаджев
Ведущая организация:
Институт биологии гена РАН
Защита диссертации состоится 23 ноября 2006 г. в 14:00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, «Новая» аудитория
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им.
М.В. Ломоносова
Автореферат разослан « » 2006 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева Актуальность проблемы Мембрано-активные пептиды (МАП) представляют класс соединений, вы деленных из природных источников или синтезированных de novo, которые об ладают широким спектром биологической активности, часто связанной с изме нением физико-химических параметров клеточной мембраны. Действие таких агентов модулируется набором многих факторов (конформация пептида, мода связывания, pH, фазовое состояние и липидный состав мембраны, и др.). Пони мание структурных предпосылок, определяющих различные функциональные особенности МАП – одна из важнейших фундаментальных задач в изучении бе лок-мембранных взаимодействий. Помимо фундаментального значения, иссле дования в данной области важны для оптимизации и разработки новых соедине ний, имеющих практическое применение в современной биотехнологии и фар мацевтической промышленности (направленная доставка лекарств, генная тера пия, антимикробные и противоопухолевые препараты).
Наряду с экспериментальными методиками, в последние годы стало воз можным исследовать поведение МАП в мембранных системах с помощью тех ники компьютерного моделирования. Для решения подобных задач могут эф фективно применяться методы молекулярной динамики (МД) явно заданных гидратированных мембран (Forrest & Sansom, 2000), которые позволяют иссле довать картину взаимодействий на атомном уровне. Тем не менее, во многих со временных работах, посвященных моделированию МАП в мембранном окруже нии, ряд важных аспектов пептид-мембранных взаимодействий часто остается за рамками проводимых исследований. Например, роль различных а.к. остатков в дестабилизации бислоя, специфическое влияние пептидов на структурно динамические свойства мембраны («мембранный ответ»), гетерогенность по верхностных свойств границ раздела (интерфейсов) водно-липидных систем и др. Одним из возможных объяснений этому является сложность моделируемых объектов и отсутствие общих системных подходов к проблеме белок мембранных взаимодействий.
Цели настоящей работы:
- Разработка новых подходов в моделировании МАП, позволяющих детально описывать картину взаимодействия пептидов с водно-липидными системами;
- Применение полученных результатов в теоретическом изучении мембранного связывания ряда объектов, обладающих важной биологической активностью (фузионные, антимикробные пептиды и др.), и de novo дизайн МАП с направ ленно измененным функциональным действием.
На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:
1. Разработаны и оптимизированы методики исследования поведения пепти дов в явно заданных модельных мембранах, основанные на расчетах МД. Реали зованные новые подходы в анализе МД-данных с использованием процедур кар тирования различных структурно-динамических свойств поверхности мембран позволяют получать детальную картину мембранного ответа, вызванного встраиванием пептидов.
2. Характер связывания фузионного пептида E5, пептидного переносчика пе нетратина и антимикробного пептида Ltc2a является следствием их адаптации к различному мембранному окружению. Основными факторами служат: а) кон формационная подвижность пептида;
б) заряд, динамическое состояние и кри визна поверхности мембраны;
в) гидрофобная организация водно-липидного ин терфейса.
3. Дестабилизация мембран в процессе связывания ряда биологически актив ных пептидов происходит в результате образования специфических контактов аминокислотных остатков с полярными головками липидных молекул. а). Взаи модействие остатков глутаминовой кислоты фузионного пептида E5 c фосфати дилхолиновыми (ФХ) группами приводит к вытеснению липидов из плоскости мембраны. б). Формирование комплексов ароматических и катионных остатков пенетратина с молекулами фосфатидилсерина (ФС) способствует возникнове нию «гидрофобных дефектов» на поверхности мембраны.
4. Применение разработанных методик молекулярного моделирования по зволило предсказать аминокислотные замены (Ile7Gln, Phe10Lys) для антимик робного пептида Ltc2a, направленные на уменьшение его гемолитической актив ности. Экспериментальные данные биологического тестирования для синтезиро ванных аналогов Ltc2a продемонстрировали высокую эффективность предло женных мутаций.
Научное значение и новизна работы.
Все представленные выше результаты получены впервые. Показано, что встраивание вглубь интерфейса сопровождается реорганизацией пространствен ной структуры пептида в соответствии с аминокислотным составом и поверхно стным распределением его гидрофобных и гидрофильных свойств. Дополни тельное влияние на структуру пептида оказывают невалентные взаимодействия аминокислотных остатков внутри молекулы и с мембранным окружением. Эти данные расширяют традиционные представления о процессе сворачивания по липептидной цепи на границе полярной и неполярной фаз, основанные исклю чительно на амфифильных свойствах последовательностей. Установлено, что мембранный ответ на действие МАП имеет локальный характер: изменение структурно-динамических параметров наблюдается только в области контакта пептида с бислоем, не влияя на интегральные характеристики мембраны. Для разных МАП действие на мембрану характеризуется наличием как общих черт (уменьшение подвижности липидов в области контактов, нарушение характера их упаковки и др.), так и особенностей, связанных с функциональной активно стью пептида. При этом в дестабилизации мембраны ключевую роль часто иг рают специфические контакты остатков пептидов с липидными молекулами.
Указанные эффекты зависят от аминокислотного состава пептидов и химическо го строения полярных головок липидов. Это позволяет выявлять молекулярные основы селективности МАП к различным типам клеточных мембран.
В целом, широкое рассмотрение проблемы мембранного ответа на дейст вие биологически активных пептидов и сравнительное изучение разных мем бранных систем, проведенное в рамках настоящей работы, позволило сделать существенный шаг в понимании функционирования липидной составляющей клеточной мембраны, а также расширить представления о механизмах белок мембранных взаимодействий.
Практическое значение работы.
Полученные результаты могут стать необходимой теоретической базой для направленного дизайна пептидов, обладающих разной биологической активно стью (антимикробные, противораковые, переносчики и пр.), которые являются перспективными объектами для разработки новых лекарственных препаратов. В частности, на основании данных молекулярного моделирования были получены первые результаты по направленному изменению активности антимикробного пептида Ltc2a из яда паука Lachesana tarabaevi.
В настоящей работе представлен и подробно описан ряд новых методик анализа данных МД, позволяющих рассматривать различные аспекты белок мембранных взаимодействий. Кроме того, на основании систематизации полу ченных результатов создана технология, оптимизирующая задачу моделирова ния периферически связывающихся МАП в явно заданных мембрано имитирующих системах. Это позволяет существенно расширить применение in silico подхода в современной биотехнологии и молекулярной медицине.
Публикации и апробация.
Основные результаты работы изложены в 5 статьях, опубликованных в международных научных журналах. Материалы диссертации докладывались на 4-й и 5-й международных конференциях «Биоинформатика регуляции и струк туры генома» (Новосибирск, 2004, 2006), международной конференции «Взаи модействие пептид-мембрана» (Намюр, 2004), 18-м Франко-бельгийском кон грессе по фармацевтической химии (Люксембург, 2004), 5-м международном симпозиуме аспирантов, проводимом Европейской молекулярно-биологической лабораторией (Гейдельберг, 2004), Симпозиуме «Взаимодействие белков и пеп тидов с поверхностью мембран» в рамках 231-го конгресса Американского хи мического общества (Атланта, 2006).
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа имеет следующую структуру: Во Введении (Глава I) сформулированы основные цели и задачи и их взаимосвязь с общими тенден циями в изучении МАП. Глава II представляет собой обзор литературы, посвя щенный современным методам моделирования мембранных систем и их взаимо действий с МАП. Полученные результаты и их обсуждение приведены в Главе III, состоящей из шести разделов. В разделе III.1 описана разработка и оптими зация процедур и протоколов для расчета и анализа МД явно заданных гидрати рованных заряженных и нейтральных мембранных систем. В разделах III.2-III. приводятся примеры применения полученных наработок в исследовании пове дения различных МАП в модельных мембранах. В разделе III.6. содержится краткое описание разработанной технологии моделирования МАП. Содержание Главы IV (Заключение) составляет перечень основных результатов работы, об суждение их научно-практического значения и дальнейших перспектив исследо ваний в данной области. Описание методов, использованных в работе, дано в Главе V. Завершает диссертацию Список литературы. Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста, проиллюстрирована _ рисунка ми и _ таблицами. Список литературы включает _ источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
I. ВВЕДЕНИЕ В первой главе обосновывается необходимость применения методов моле кулярного моделирования для изучения поведения МАП в мембранах, сформу лированы направления и цели исследования.
II. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ В данной главе описаны современные методы моделирования поведения МАП в явно заданных гидратированных мембранных системах.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ III.1. Разработка моделей явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем.
В данном разделе приведено описание процедуры оптимизации методов моделирования явно заданных мембранных систем и создания базы данных (БД) липидных бислоев и мицелл разного липидного состава. Процедура отработки и тестирования методик проиллюстрирована на примере сравнительного модели рования заряженного (диолеилфосфатидилсерин – ДОФС) и цвиттерионного (диолеилфосфатидилхолин – ДОФХ) ненасыщенных бислоев (раздел III.1.1).
III.1.1 Роль заряда полярной головки в структурной организации модельной мембраны. Сравнительное моделирование заряженного и цвиттерионного бисло ев.
В результате проведенных расчетов МД получена модель заряженной мембраны ДОФС, для которой показано хорошее согласие с имеющимися экспе риментальными данными (табл.1). При этом установлено, что поведение систе мы существенно зависит от используемого алгоритма учета электростатических взаимодействий. Применение функций сферических отсечек приводит к ряду ар тефактов – моделируемый бислой оказывается менее упорядоченным по сравне нию с экспериментальными данными, имеет «размытый» водно-липидный ин терфейс, наблюдаются серьезные флуктуации толщины бислоя. При использова нии модифицированных алгоритмов суммирования по Эвальду (PME1) струк турные характеристики полученного бислоя хорошо согласуются с соответст вующими экспериментальными значениями. Для бислоя ДОФХ показано отсут ствие каких-либо расчетных артефактов при использовании функций отсечек, что позволяет применять данную схему учета электростатических взаимодейст вий в МД-расчетах цвиттерионных липидных систем. Сравнение результатов МД для модельных бислоев ДОФХ и ДОФС позволяет сделать вывод о том, что, в отличие от заряженной мембраны, цвиттерионная мембрана ДОФХ обладает PME – Particle-Mesh Ewald (англ.) менее структурированным интерфейсом. Это влияет на ряд ее интегральных ха рактеристик (характер упаковки липидов (AL, Dp-p, Scd), глубина проникновения воды и пр.).
Таблица 1. Равновесные макроскопические средние для бислоев ДОФС и ДОФХ: расчеты МД и экс периментальные данные.
ДОФС ДОФХ Параметр* Отсечки PME Эксперимент** Отсечки PME Эксперимент AL, 2 63.33±0.07 63.31±0.08 64 70.23±0.18 70.55±0.12 72. 37.7±0.6 39.0±0.2 39 36.2±0.2 35.8±0.2 36. Dp-p, 44 39 39 36.8 35.9 36. DHH., 0.15# 0.14в 0.10±0.03 0.14±0.05 0.11±0.04 0.10±0. Scd * Описание параметров: AL – средняя площадь на липидную молекулу;
Dp-p – средняя толщина бис лоя (расстояние между плоскостями атомов фосфора в разных монослоях);
DHH – расстояние между пиками электронной плотности для атомов фосфора;
Scd – средний параметр порядка ацильных це пей липидов;
** Petrache et al., 2004.
# Данные взяты для степени гидратации – 40 молекул воды на молекулу липида.
III.1.2. Создание БД модельных водно-липидных систем и изучение их струк турно-динамических свойств.
В данном разделе описано создание БД равновесных моделей гидратиро ванных бислоев и мицелл различного состава. При этом: 1) разработаны заново и/или оптимизированы топологические справочники для молекул липидов и де тергентов в силовых полях Gromos87/96;
2) оптимизированы вычислительные протоколы для моделирования МД явно заданных липидных бислоев на высоко производительных платформах с параллельной архитектурой – с использовани ем программного пакета GROMACS (Lindahl et al., 2001). Характерный размер систем: ~100-200 молекул липидов / ~5-7 х 103 молекул воды / ~100-200 ионов Na+ (в случае анионных липидов). Температуру в ячейке при расчете бислойных систем задавали с учетом данных о температуре фазового перехода гель-жидкий кристалл для моделируемого липида, чтобы мембрана находилась в жидкокри сталлическом состоянии. Число молекул детергента в ячейке (для мицелл) зада вали, исходя из экспериментальных данных о критической концентрации мицел лообразования.
Таблица 2. Структурные параметры бислоев и мицелл.
T,°C* AL, (2)** Dp-p, () Scd DI, () Бислой 42 (36) 47.1 41.23 0.326 12. Димиристоилфосфатидилсерин (ДМФС) 52 (24) 59.7 35.24 0.184 12. Димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ) 52 (41.5) 59.0 39.01 0.187 12. Дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) 39.43 0.185 / 0.176# Пальмитоилолеилфосфатидилглицерол (ПОФГ)288 42 (-4) 56.5 13. Пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (ПОФЭ)128 42 (26) 57.0 39.97 0.197 / 0.185 10. Пальмитоилолеилфосфатидилхолин (ПОФХ)128 27 (-3) 63.7 37.35 0.183 / 0.149 13. Пальмитоилолеилфосфатидилсерин (ПОФС)128 27 (14) 57.2 41.07 0.185 / 0.178 11. 27 (-22) 70.5 35.80 0.104 12. Диолеилфосфатидилхолин (ДОФХ) 27 (-11) 63.3 39.03 0.138 11. Диолеилфосфатидилсерин (ДОФС) T,°C AL, (2) Rs, () Scd DI, () Мицелла 27 91.5 20.90 0.106 0.064 5. Додецилфосфохолин (ДФХ) 50 77.2 19.20 0.146 0.091 5. Додецилсульфат натрия (ДСН) 42 100.6 24.01 0.060 0.101 5. Лизомиристоилфосфатидилглицерол (ЛМФГ) 42 105.3 24.56 0.070 0.070 4. Лизопальмитоилфосфатидилглицерол (ЛПФГ) Лизопальмитоилфосфатидилглицерол (ЛПФГ)125 42 86.7 29.37 0.072 0.086 6. * Температура моделирования, в скобках дана температура фазового перехода гель-жидкий кристалл ** Описание параметров: AL – площадь, приходящаяся на липидную молекулу;
Dp-p – толщина бислоя (расстояние между пиками электронной плотности по фосфору);
Scd – параметр порядка ацильных це пей липидов;
DI – ширина интерфейса;
Rs – радиус мицеллы;
– анизотропия мицеллы # Значения Scd даны для насыщенной и ненасыщенной ацильных цепей В результате серии расчетов МД длительностью ~20 нс был получен набор траекторий для бислоев, состоящих из основных природных липидов, и мицелл, наиболее широко используемых в экспериментальных исследованиях белок мембранных взаимодействий (табл. 2). На протяжении МД все исследуемые сис темы сохраняют бислойную (или мицеллярную) структуру, а полученные на равновесных участках траекторий МД (обычно последние 5 нс) макроскопиче ские средние значения (табл. 2) хорошо согласуются с имеющимися экспери ментальными данными.
Картирование поверхностных свойств модельных мембран позволяет де тально описывать мембранный ответ, вызванный встраиванием пептида, и ис следовать механизмы дестабилизации мембран. В основе подхода лежит расчет различных усредненных параметров на равновесных участках МД траекторий для каждой липидной молекулы и картирование полученных значений в плоско сти мембраны или на ее поверхности, доступной растворителю (ПДР).
Для анализа локального изменения толщины мембраны (отклонения от среднего значения Dp-p) использовали процедуру получения разностных двумер ных карт рельефа поверхности. На первом этапе рассчитывали ПДР для обоих монослоев мембраны, далее производили интерполяцию и сглаживание релье фов, а также их последующее вычитание. «Разностную» поверхность затем представляли в виде двумерной (2D) карты (рис. 1А).
Оценку динамической структуры интерфейса модельных мембран, а так же влияние МАП на подвижность липидных молекул осуществляли с помощью расчета эффективных значений флуктуаций полярных головок относительно их равновесных положений (RMSFmol). Для сравнительного анализа распределения динамических фракций липидов в бислоях разного состава использовали отно RMSFmol, сительную величину определяемую по формуле:
RMSF = RMSF max( RMSFpure ), где max( RMSFpure ) – максимум распределения mol mol mol mol значений RMSFmol липидов в модельном бислое (в случае моделирования МАП – в «чистом», то есть без пептида). Для построения 2D-карт использовали коорди наты атомов фосфора полярных головок. Процедуру проводили независимо для обоих монослоев (рис. 1Б).
Рис.1. Структурно-динамические свойства поверхности модельных мембран. А. Схема построения разностных карт рельефа поверхности модельных мембран на примере бислоя ДМФХ. Б. Ориентация полярных головок в бислое ДОФС (двумерная карта угла для монослоя). В. Поверхностное распреде ление динамических фракций липидов в бислое ДОФХ. Распределение эффективных значений флук туаций полярных головок – данные для бислоя (слева). Двумерная карта относительных подвижностей для монослоя (справа). Г. Гидрофобные и гидрофильные участки на поверхности бислоя ПОФГ. По верхность раскрашена в соответствии со значениями МГП, рассчитанными в каждой ее точке. Свет лым показаны гидрофильные области, темным – гидрофобные.
Ориентацию липидных головок оценивали по углу между нормалью к плоскости бислоя и вектором, образованным центральным атомом глицерола и С атомом в серине (для ФС) или аналогичными атомами в ФЭ, ФХ, ФГ (рис.
1В). При этом для каждой молекулы липида на равновесном участке МД опреде ляли среднее значение угла. Для построения 2D-карт использовали координаты атомов фосфора полярных головок. Процедуру проводили независимо для обоих монослоев. 2D-карты для углов позволяют выявить локализацию дефектов в упаковке липидных головок, вызванную, в частности, взаимодействиями с МАП.
Структура водно-липидного интерфейса в различных мембранных систе мах характеризуется гетерогенной организацией. В частности, нами было пока зано, что поверхность бислоев и мицелл не является полностью гидрофильной, а содержит гидрофобные участки (рис. 1Г). Одной из причин этого является дос таточно «рыхлая» структура мембранных интерфейсов. Для картирования гид рофобных и гидрофильных свойств ПДР в модельных бислоях и мицеллах ис пользовали метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП). Ранее этот метод успешно применялся для анализа свойств белков и ряда МАП (Efremov & Vergoten, 1995). Картирование осуществляется на основании расчета МГП в ка ждой точке ПДР. Под «нейтральными» понимаются значения МГП 0.00±0.02, бльшие и мньшие значения рассматриваются как «гидрофобные» и «гидро фильные», соответственно. Анализ гидрофобных свойств на равновесных участ ках МД для модельных бислоев и мицелл показал, что соотношения доли гидро фобной / нейтральной / гидрофильной поверхностей являются характеристиче скими параметрами модельных мембранных систем.
III.1.3. Создание смешанных бислоев, имитирующих клеточные мембраны.
Создание смешанных липидных бислоев, имитирующих по составу раз личные клеточные мембраны, является следующим шагом в повышении реали стичности моделирования МАП. В соответствии с данными о липидном составе и физико-химических свойствах мембран грам отрицательных (Грам-) бактерий и клеток млекопитающих (эритроциты) были созданы следующие бислойные липидные системы:
«Эритроциты» – ПОФХ114: ПОФЭ114:ХОЛ260 (80% ПОФХ+ПОФЭ, 20% ХОЛ в соответствии с липидным составом мембран эритроцитов);
«Грам-» – ПОФЭ200:ПОФГ88 (70% ПОФЭ, 30% ПОФГ – в соответствии с ли пидным составом мембраны E. coli);
Для получения равновесных структур разработанных модельных систем проведены расчеты МД с длиной траектории ~15 нс. Уточнение параметров сме шанных модельных мембран было проведено на основании сравнения характера упаковки липидов в смеси и в однокомпонентных бислоях.
III.2. Определение структуры МАП в модельных мицеллах, сравнение с экспериментом. Влияние гидрофобной организации водно-липидного интерфейса на конформацию пептида в связанном состоянии.
Сопоставление результатов моделирования и эксперимента необходимо для оценки корректности вычислительного подхода, который в дальнейшем был использован для изучения поведения ряда МАП в сложных модельных мембран ных системах. Определение структуры антимикробного пептида (АМП) Ltc2a (см. также раздел III.5) в мицелле ДСН было проведено методом H1-ЯМР спек троскопии в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (Dubovskii et al, 2006). Параллельно были выполнены расчеты МД пептида в мицелле ДСН60 ( нс), которые позволяют получить дополнительную информацию о структурной организации пептида и характере его взаимодействий с мицеллой. Для сравни тельного анализа были использованы траектория МД (равновесный участок) и ЯМР-конформаций пептида (PDB код 2G9P).
ХОЛ – холестерол Ltc2a: GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH Рис.2. А. Структура пептида Ltc2a в мицелле ДСН – данные МД (вверху) и ЯМР. Спиральные участки представлены цилиндрами. Пептид: белый цвет – гидрофобные остатки, серый– полярные, черный – остатки Arg и Lys. Б. Положение пептида на поверхности модельной мицеллы: темные области – по лярные головки детергента, светлые – ацильные цепи. В. Энергии ван-дер-ваальсовых (вверху) и элек тростатических взаимодействий остатков пептида с молекулами ДСН.
На рис. 2А показан общий вид пространственной структуры пептида, по лученной по результатам 1Н-ЯМР и МД. В обоих случаях сохраняется характер ный тип укладки – два спиральных участка, расположенных под углом друг к другу. При этом в каждом случае гидрофобные остатки спиралей ориентированы навстречу друг другу. Отметим, что метод 1Н-ЯМР спектроскопии, использован ный для получения структуры Ltc2a, не позволяет изучать детальную картину взаимодействии с мицеллой, в то время как данная информация может быть по лучена на основании анализа МД пептида. Из рис. 2Б видно, что, взаимодействуя с пептидом, мицелла сохраняет свою сферическую форму. Для мицелл ДСН ха рактерна высокая доля гидрофобной поверхности (~60%, см. также раздел III.1.2), что определяет моду связывания Ltc2a. Пептид ориентируется таким об разом, чтобы наибольшее число гидрофобных остатков находилось в выгодных контактах с гидрофобными участками поверхности мицеллы (области экспони рованных ацильных хвостов), а заряженные – с полярными головками молекул детергента. Наблюдаемое взаимное соответствие пространственных распределе ний гидрофобных / гидофильных свойств для пептида и мицеллы приводит к существенному выигрышу в энергии ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий (рис. 2Б). Это стабилизирует данную конформацию Ltc2a на ин терфейсе. Интересно, что N-концевая спираль пептида, благодаря своим выра женным амфифильным свойствам (см. раздел III.5.1), обладает более низкой энергией взаимодействия с амфипатической поверхностью мицеллы ДСН, чем остальная часть пептида.
Подведем итог. Структура Ltc2a, полученная на основании расчетов МД в мицелле, хорошо согласуется с экспериментальными данными 1Н-ЯМР. Это го ворит об адекватности созданных моделей и эффективности используемых вы числительных протоколов. Пептид в области интерфейса стремится принять конформацию, для которой наблюдается наилучшее взаимное соответствие соб ственных гидрофобных / гидофильных свойств с гидрофобной организацией по верхности мицеллы.
III.3. Влияние динамического состояния мембраны на характер встраивания МАП (на примере фузионного пептида E5).
Оболочечные вирусы «заякориваются» на поверхности клетки с помощью консервативных фрагментов (~20 а.к.), называемых фузионными пептидами (ФП) и представляющих подсемейство МАП. ФП встраиваются в мембрану кле ток хозяина, приводя к образованию контакта между липидными бислоями ви руса и клетки. Изучение молекулярных механизмов слияния имеет не только фундаментальное значение, но также важно для разработки биомедицинских препаратов, направленных на предотвращение проникновения вируса в клетки.
Данный раздел посвящен сравнительному моделированию пептида E5, синтети ческого аналога ФП из гемагглютинина вируса гриппа А, в мембранах, состоя щих из ДМФХ и ДПФХ. Отличие в длине ацильных цепей (две CH2 группы) данных липидов определяет различные физико-химические параметры бислоев (толщина мембраны, коэффициенты латеральной диффузии липидов и пр.). Ис пользование таких систем позволило оценить влияние динамического состояния мембраны («рыхлая» – ДМФХ, «плотная» – ДПФХ) на характер встраивания пептида E5. Суммарные сведения о проведенных расчетах МД даны в табл.3.
Конформация пептида в связанном состоянии Анализ данных МД показывает, что присутствие водно-липидного интер фейса стабилизирует -спиральную конформацию в N-концевой области пепти да (остатки 2-10), что хорошо согласуется с данными, полученными на основа нии анализа набора ЯМР структур в мицеллах ДФХ (Dubovskii et al., 2000). В со ответствии с данными ЯМР и МД, C-концевая область пептида обладает боль шей конформационной подвижностью. Конформация участка 12-20 зависит от типа мембраны – более структурированная в бислое ДМФХ (остатки 12-17 ~50% времени пребывают в -спиральной конформации) и отсутствие какой-либо вы раженной вторичной структуры в ДПФХ.
Таблица. 3. Расчеты МД для E5.
Размер ячейки (3) Система* T,°C** Время МД (нс) + E5/вода7043/Na 5 32 60.060.060. ДМФХ128/вода7219/E5/Na+5 52 (24) 61.861.895. ДПФХ128/вода5188/E5/Na+5 52 (41.5) 61.361.883. *E5 –GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG;
для расчетов были взяты равновесные структуры бислоев (см. раз дел III.1.2);
**Температура в МД расчетах, в скобках даны значения температуры фазового перехода гель-жидкий кристалл.
Характер встраивания E При взаимодействии пептида с обоими бислоями наблюдается заглубление N-концевой спирали, тогда как C-концевой фрагмент остается связанным на по верхности мембраны (рис. 3А). В течение МД угол между осью N-концевой спи рали и плоскостью мембраны ДМФХ изменяется от ~0° (стартовая ориентация) до ~40° (10-14 нс) и впоследствии приобретает значение ~20° (после 17 нс). Та ким образом, в процессе связывания пептид «выбирает» оптимальную геомет рию встраивания, которая стабилизируется на интерфейсе. В бислое ДПФХ N концевая спираль оказывается менее заглубленной и лежит практически парал лельно плоскости мембраны. При этом характер связывания определятся гидро фобной организацией пептида и поверхности мембраны в области контакта (см.
также разделы III.1.2, III.2). Для расчета пространственных гидрофобных / гид рофильных свойств был использован метод МГП. Поверхность пептида была картирована в соответствии со значениями МГП, созданными атомами E (МГПпептид) и соседними атомами липидов (МГПбислой). Для E5 в бислое ДПФХ поверхностное распределение МГПпептид характеризуется наличием двух выра женных гидрофобных паттернов: в N-концевой спирали и на C-концевом участ ке. В бислое ДМФХ оба гидрофобных участка образуют на поверхности пептида непрерывный паттерн. Кроме того, в мембране ДМФХ наблюдается более высо кая корреляция между пространственными распределениями гидрофобных и гидрофильных свойств для МГПпептид и МГПбислой, чем в ДПФХ (рис. 3Б). В ре зультате пептид эффективно взаимодействует с «рыхлой» мембраной и глубоко встраивается в бислой, что приводит к вытеснению некоторых липидных моле кул в водную фазу (рис. 3А). Эти липиды находятся в выгодных контактах с кар боксильными группами остатков глутаминовой кислоты 11, 15, 19, 20. В процес се встраивания пептида бислой ДПФХ сохраняет свою целостность. При этом боковые цепи остатков Glu лежат на поверхности мембраны, что делает их менее доступными для липидов.
Рис.3. А. Геометрия связывания пептида E5 в бислоях ДМФХ (вверху) и ДПФХ. Пептид показан в ви де ленты с выделенными остатками глутаминовой кислоты. Водно-липидный интерфейс схематически представлен плоскостью. Показаны соседние молекулы липидов, их положительно заряженные холи новые группы даны в виде связей и сфер. Б. Гидрофобная организация поверхности пептида и мембран в системах E5/ДМФХ (слева) и E5/ДПФХ. Поверхность пептида раскрашена в соответствии со значе ниями МГП в каждой точке, полученными либо для атомов пептида (вверху), либо для соседних липи дов (внизу). Гидрофобные и гидрофильные области показаны темным и светлым цветами, соответст венно.
Мембранный ответ, вызванный ФП.
Мембранный ответ, вызванный встраиванием E5, как и в случае ряда дру гих МАП (см. разделы III.4, III.5), имеет локальный характер, т.е. существенных изменений интегральных параметров мембраны (AL, Dp-p и пр.) не установлено.
В то же время в системе E5/ДМФХ наблюдается «размывание» профиля плотно сти (смещение в водную фазу) фосфорных групп липидов контактного монослоя, по сравнению с «чистой» мембраной (рис. 4А). В бислое ДПФХ наблюдается обратная тенденция – смещение профиля плотности для фосфорных групп про исходит к центру бислоя, поскольку в данном случае пептид «продавливает» часть липидов внутрь мембраны. В зависимости от состава бислоя, важные от личия наблюдаются в распределении плотности воды вдоль нормали к мембране (w(z)). Разностная кривая w(z) = w(z)E5/ДПФХ - w(z)ДПФХ (рис. 4Б) при z0 име ет два отрицательных (z=16, 22) и один положительный пик (z=11). Проник новение координированных пептидом молекул воды в процессе его встраивания в мембраны приводит к появлению отрицательного пика при z=22. Пики w(z) в области 11 и 16 связаны с заглублением полярных головок липидов вместе с молекулами воды внутрь гидрофобного ядра. Для мембраны ДМФХ функция w(z) в области контактного интерфейса имеет только один отрицательный пик (z=18), соответствующий молекулам воды, привнесенным вместе с пептидом.
При этом полярные головки липидов ДМФХ не погружаются в область ациль ных цепей при встраивании E5 (рис. 4А), а, напротив, формируют «встречный поток». В результате для воды практически не наблюдается изменений характера распределения вдоль нормали к мембране, что приводит к отсутствию дополни тельных пиков на графике w(z).
Встраивание E5 сопровождается локальным уменьшением толщины мем браны «в тени» пептида (рис. 4Б), составляющим 6 и 4 для бислоев ДМФХ и ДПФХ, соответственно. Сходный эффект был ранее обнаружен в МД исследова нии взаимодействия ФП гемагглютинина вируса гриппа H3 с бислоем ПОФХ (Vaccaro et al., 2005).
Рис.4. А-Б. Изменения организации водно-липидного интерфейса, вызванные встраиванием пептида.
А. Распределения плотности фосфорных групп липидов и атомов пептида (штрих линии) вдоль норма ли к контактным монослоям ДМФХ (черный), ДПФХ (серый). Пунктиром показаны данные для «чис тых» бислоев;
сплошной линией – в системах с пептидом. Б. Изменения в характере распределения плотности воды вдоль нормали к мембране (w(z)). На графике представлены разностные кривые w(z) = w(z)E5/бислой - w(z)бислой для систем E5/ДМФХ (черный) и E5/ДПФХ (серый). В. Двумерные карты локальных изменений толщины мембраны ДМФХ (слева) и ДПФХ. Окраска произведена в со ответствии со шкалой, приведенной на рисунке. Подробнее см. раздел III.1. Подведем итог. Результаты моделирования ФП E5 в бислоях ДМФХ и ДПФХ показывают, что в обоих случаях наблюдается ряд сходных черт в пове дении пептида: стабилизация -спиральной конформации N-концевой области пептида в мембране, локальный характер мембранного ответа. Ряд важных ас пектов взаимодействия пептида с мембраной, зависит от ее состава. 1). Пептид глубже встраивается в более «рыхлый» бислой ДМФХ, чем в относительно бо лее плотный ДПФХ. При этом мембрана ДПФХ сохраняет свою целостность, то гда как в ДМФХ некоторые липидные молекулы в области связывания пептида оказываются вытесненными из плоскости бислоя в водную фазу вследствие об разования выгодных контактов с остатками глутаминовой кислоты. 3). Динами ческое состояние мембраны влияет на геометрию встраивания пептида: угол на клона N-концевой -спиралиr к плоскости бислоя ДМФХ составляет ~ 20° в от личие от параллельной ориентации в мембране ДПФХ. В первом случае резуль таты МД воспроизводят экспериментально установленную моду связывания ФП (Han et al., 2001), вторая мода связывания характерна для их неактивных анало гов (Vaccaro et al., 2005).
III.4. Роль специфических контактов пептид-липиды в дестабилизации заря женных и нейтральных мембран.
Неспецифические пептидные переносчики представляют особый класс МАП, которые способны доставлять в клетки различные ковалентно пришитые гидрофильные молекулы (ДНК, пептиды, лекарства) без нарушения целостности плазматической мембраны, что делает их перспективными объектами современ ной биотехнологии. Механизм интернализации таких пептидов до сих пор не ус тановлен. Пенетратин (pAntp)4, 16-членный фрагмент гомеодоменного белка Ан теннопедии из D. melanogaster является типичным представителем пептидных переносчиков. В данном разделе описаны результаты МД (длительностью ~ нс) pAntp в заряженных и цвиттерионных мембранах (ДОФХ и ДОФС, см. раз дел III.1.1), а также в водном окружении. Особое внимание уделено влиянию различных стартовых ориентаций пептида относительно мембраны на характер его встраивания.
Особенности структурной организации pAntp Распределение заряженных и гидрофобных остатков в структуре pAntp не позволяет ему формировать выраженно амфифильную спираль на границе раз дела гидрофобной / гидрофильной фаз и придает подвижность структуре пепти да при взаимодействии с мембранами. Это определяет невысокую долю спиральной конформации (50%) для структуры pAntp в цвиттерионном мо дельном бислое, вне зависимости от стартовой ориентации. При взаимодействии с заряженным бислоем структура пептида определяется его исходной ориента цией (рис. 5А) и характеризуется либо утратой спиральной конформации и появ лением элементов -структуры – в первом случае, либо формированием неста бильной спирали – во втором. Такая конформационная динамика pAntp в заря pAntp: RQIKIWFQNRRMKWKK женной мембране хорошо согласуется с экспериментальными данными и опре деляется характером его взаимодействия липидами. В первом случае (исходная ориентация – запуск 1) ароматические и заряженные остатки в середине молеку лы были обращены в противоположную сторону от поверхности бислоя (рис.
5А), поэтому в процессе встраивания важную роль во взаимодействии с липида ми играют N-концевой остаток Arg1 и С-концевые Lys. Во втором случае (ис ходная ориентация – запуск 2) заряженные и ароматические остатки центрально го фрагмента pAntp (Тrp6, Arg10, Arg11) вносят основной вклад во взаимодейст вие с мембраной, а также участвуют в образовании долгоживущих комплексов с ФС липидами (см. далее). При этом наблюдается стабилизация спиральной структуры пептида.
Рис.5. А. Стартовые ориентации pAntp, исходная конформация пептида – ЯМР-структура в смеси ТФЭ/вода (Czalik et al, 2002;
PDB код: 1KZ0). Структура пептида показана в виде ленты, заряженные и ароматические остатки выделены темным цветом. Б. Положение пептида относительно плоскости (z=0), образованной атомами фосфора липидных головок в бислоях ДОФС (слева) и ДОФХ. Резуль таты МД для стартовых ориентаций запуск 1 (сплошная линия) и запуск 2 (пунктир).
Стэкинг-взаимодействия ароматических остатков с аргинином.
Результаты МД показывают, что в воде исходная спиральная конформация пептида сохраняется, что в целом согласуется с экспериментальными наблюде ниями (Czalic et al., 2002). Отчасти это объясняется наличием долгоживущих стэ кинг-взаимодействий между остатками Arg и ароматическими кольцами Trp и Phe. Стэкинг-пары Trp6-Arg10 и Phe7-Arg11 c параллельной ориентацией гуани диновой группировки относительно плоскости ароматического кольца сформи рованы остатками i,i+4. При связывании с мембранами стэкинг-взаимодействия позволяют понижать энергию для экспонированных в водную и гидрофобную фазу ароматических и заряженных остатков, соответственно. Это повышает сродство pAntp к водно-липидному интерфейсу, а также позволяет стабилизиро вать различные моды связывания пептида (рис. 5Б) с заряженной мембраной.
Рис.6. Механизм дестабилизации мембраны ДОФС (на примере МД расчетов для стартовой ориента ции pAntp – запуск 2). А. Примеры долгоживущих комплексов ФС с остатками пептида. Для каждого комплекса приведены диаграммы со временем жизни. Б. Мембранный ответ (см. подробнее раздел III.1.2). Слева: Поверхностное распределение динамических фракций липидов. Окраска поверхности проведена в соответствии со шкалой для RMSFmol. Темным цветом показаны «замороженные» облас ти (для которых происходит наиболее существенное уменьшение подвижности полярных головок ли пидов в результате связывания пептида). Справа: Поверхностное распределение для углов полярных головок липидов относительно нормали к бислою. Окраска поверхности проведена в соответствии со шкалой для угла. Положение атомов основной цепи пенетратина показано крестиками. Положение липидов, участвующих в долгоживущих комплексах с остатками пептида (см. панель А), обозначено цифрами. В. Временная зависимость доли гиброфобной (пунктир) и гидрофильной (сплошная линия) поверхности в области контакта пептида с мембраной. Г. Структура «дефекта» в области контакта пептида с мембраной. Основная цепь пептида показана лентой. Атомы фосфора полярных головок представлены сферами, ацильные цепи липидов показаны связями.
Специфические комплексы с липидами и механизм дестабилизации модельной мембраны.
Помимо стэкинг-взаимодействий, еще одной важной особенностью Arg и Trp, входящих в состав молекулы pAntp, является их способность к формирова нию долгоживущих комплексов с липидами ФС (рис. 6А). Интересно, что при одновременной координации полярной головки липида гуанидиновой группой Arg и индольным кольцом Trp время жизни комплексов возрастает. Показанное сродство pAntp к липидам ФС отражается на характере мембранного ответа, вы званного встраиванием пептида в модельные мембраны (рис. 6Б). Изменение ди намики липидных головок («замораживание» в области контакта пептида с мем браной) и нарушение их упаковки (изменение ориентации по отношению к нор мали бислоя) более выражено для бислоя ДОФС, чем для ДОФХ. Кроме того, отсутствие специфических контактов остатков пептида с ФХ-липидами объясня ет одинаковые моды связывания pAntp в цвиттерионной мембране в случае раз личных стартовых ориентаций (рис. 5Б). Изменение динамики липидных голо вок определяется числом долгоживущих контактов остатков пептида с молеку лами липидов. В то же время нарушение характера упаковки ФС-липидов в об ласти интерфейса, в первую очередь, связано с формированием долгоживущих комплексов. Важно, что липиды ФС, участвующие в комплексах с остатками pAntp, одновременно обладают пониженной подвижностью и измененной ори ентацией полярной головки относительно нормали к плоскости мембраны, что приводит к образованию дефекта в упаковке липидов на поверхности мембраны (рис. 6Г).
При взаимодействии pAntp с мембранами важную роль играют гидрофоб ные / гидрофильные соответствия для контактных поверхностей пептида и мем браны (см. также раздел III.3). Данный эффект наиболее выражен в бислое ДОФС. В первом случае (исходная ориентация – запуск 1) пептид попадает в об ласть с повышенной долей гидрофобной ПДР (~35%) по отношению к среднему значению, что обусловливает его глубокое встраивание (рис. 5Б). Во втором слу чае исходная доля гидрофобной ПДР в области контакта соответствует ее сред нему значению для бислоя ДОФС, однако в процессе встраивания пептида внутрь интерфейса доля гидрофобной поверхности возрастает (рис. 6В) вследст вие изменения структурно-динамических параметров липидов, находящихся в контакте с пептидными остатками (см. выше). Таким образом, для pAntp наблю дается способность адаптироваться к гетерогенным свойствам водно-липидного интерфейса в процессе встраивания в мембрану.
Подведем итог. Полученные нами результаты, в совокупности с большим набором экспериментальных данных, позволяют предположить гипотетический механизм прямого переноса pAntp через мембраны, состоящий из нескольких этапов. На первом этапе адсорбировавшиеся на поверхности молекулы пептида нарушают структуру липидного бислоя, что может быть связано с локальным увеличением концентрации заряженных липидов (для мембран эукариотических клеток – в основном ФС) и/или с формированием «гидрофобных дефектов» (рис.
6В-Г). При увеличении концентрации пептидов на поверхности мембраны коли чество дефектов возрастает, поэтому вновь связавшиеся пептиды способны глу боко встраиваться в мембрану. Это приводит к существенному изменению ло кальных электрических свойств мембраны, что при наличии трансмембранного потенциала позволяет отдельным молекулам pAntp преодолевать гидрофобную фазу бислоя. При этом липиды, находящиеся в комплексах с остатками пептида, могут экранировать заряженные группы pAntp от невыгодных взаимодействий с гидрофобным ядром. Основным условием возможности трансмембранного пе реноса по предложенному механизму является концентрационная зависимость, т.е. существование определенного порогового значения, при достижении которо го возможно проникновение пептидов в клетку или липидные везикулы. Кон центрационная зависимость для интернализации pAntp показана в ряде экспери ментальных работ.
III.5. Особенности аминокислотной организации МАП, обусловливающие раз личные механизмы связывания с мембраной (на примере антимикробных пепти дов).
В данном разделе описаны результаты сравнительного моделирования пептидов Ltc2a и Ltc1, которые относятся к семейству латарцинов – линейных АМП, недавно выделенных в ИБХ РАН из яда паука Lachesana tarabaevi (Kozlov et al., 2006). Экспериментально обнаружено, что антимикробная активность вы ше для Ltc2a, однако данный пептид также обладает выраженными гемолитиче скими свойствами (литическое действие на эритроциты млекопитающих). Меха низмы действия этих пептидов отличаются. Для Ltc2a показано, что он разруша ет мембраны по «ковровому механизму» (Dubovskii et al., 2006). Для Ltc1 вопрос о механизме остается открытым. Предположительно, его мембранная активность связана с образованием потенциал-зависимых проводящих структур (белок липидных пор). Таким образом, основной задачей являлось определение молеку лярных предпосылок функционального отличия этих достаточно близких по аминокислотной последовательности пептидов. Кроме того, важной практиче ской составляющей данного этапа стала направленная оптимизация функции Ltc2a (в первую очередь, уменьшение гемолитической активности), проведенная в результате использования методов моделирования, для предсказания необхо димых точечных мутаций.
III.5.1 Основные результаты моделировнание Ltc2a и Ltc1 в мембранах «Эритро циты» и «Грам-» Структура пептидов. Оба пептида в процессе МД встраиваются в интер фейсы модельных мембран, сохраняя при этом -спиральную конформацию на протяжении всей молекулы, за исключением N- и С-концевых областей (в сред нем доля спиральной конформации на равновесном участке для данных АМП составляет ~70%, см. табл. 4). В разделе III.2 описана структура Ltc2a в мицел лах ДСН, которая состоит из двух спиральных участков, соединенных гибким линкером и расположенных практически перпендикулярно друг другу. В мем бранах пептид находится в вытянутой спиральной конформации без выражен ных изломов в центре молекулы. Таким образом, характер кривизны поверхно сти модельных водно-липидных систем влияет на конформацию связанного пеп тида: переход от сферической мицеллы к плоской мембране приводит к серьез ным структурным перестройкам в молекуле Ltc2a.
Табл.4 Траектории МД для Ltc2a и Ltc1* в модельных бислоях.
Траектории МД Время МД, нс Доля спиральной конформации пептида % Ltc2a / «Эритроциты»** 20 Ltc1 / «Эритроциты» 20 Ltc2a / «Грам-» 30 Ltc1 / «Грам-» 30 *А.к. последовательности пептидов (ароматические остатки выделены жирным шрифтом, гидрофоб ные подчеркнуты):
Ltc1 SMWSGMWRRKLKKLRNALKKKLKGEK Ltc2a GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH ** Подробнее см. раздел III.1. Взаимодействие с липидами. В процессе взаимодействия с модельными мембранами оба пептида образуют специфические комплексы с липидами. Для Ltc1 характерно формирование таких комплексов с липидами ПОФЭ и ПОФГ только в мембране «Грам-» (рис. 7A). Ltc2a образует серию комплексов с ПОФХ в мембране «Эритроциты», а также с ПОФЭ и ПОФГ – в «Грам-». На формиро вание комплексов с липидами существенное влияние оказывает распределение остатков в -спирали пептида. Из рис. 7A видно, что Ltc1 формирует амфифиль ную спираль, при этом все комплексы с липидами образованы остатками, нахо дящимися на «гидрофильной стороне». Спираль Ltc2a в целом не обладает ам фифильными свойствами. Комплексы с липидами формируют остатки, входящие как в гидрофобные, так и в гидрофильные паттерны. Таким образом, простран ственная организация пептидов содержит предпосылки для взаимодействия с липидами разных типов, а также определяет их характер связывания с мембра нами.
Рис.7. А. Двумерные карты распределения гидрофобных свойств на поверхности пептидов. Остатки, образующие специфические комплексы с липидами в мембранах «Эритроциты» (ЭР) и «Грам-» (Г-), обозначены черными точками. Карты построены с использованием метода МГП для расчета значений потенциала в каждой точке ПДР в проекции на цилиндрическую поверхность спиралей пептидов (, Z) ( – угол поворота относительно оси спирали, Z – смещение вдоль оси спирали). Контурные линии со единяют точки с одинаковым значением МГП. Б. Положение пептидов относительно плоскости, обра зованной атомами фосфора липидных головок в мембранах «Эритроциты» и «Грам-»: Ltc1 (черный) и Ltc2a (серый). Толстой линией показана граница мембраны, рассчитанная по среднему положению атомов фосфора липидного монослоя, пунктиром обозначены оси спиралей.
Характер связывания. В процессе МД пептиды Ltc1 и Ltc2a по-разному связываются с модельными мембранами – для Ltc2a характерна периферическая ориентация, Ltc1 обладает способностью встраиваться под углом к плоскости мембраны, с сильно заглубленной N-концевой областью (рис. 7Б). Эти отличия обусловлены различием в а.к. составе пептидов и гидрофобными свойствами их спиралей (амфифильная для Ltc1 и без выраженных свойств, за исключением амфифильного N-концевого участка – для Ltc2a, рис. 7А). Способность Ltc встраиваться внутрь интерфейса зависит от типа мембраны. В случае цвитери онной мембраны «Эритроциты» с повышенной концентрацией ФХ липидов за глубление пептида затруднено вследствие недостаточно эффективного взаимо действия с полярными головками. Наличие равномерно распределенных арома тических остатков, обладающих повышенным сродством к мембранному интер фейсу (F3, F10, Y17), по-видимому, влияет на параллельную ориентацию Ltc2a.
В Ltc1 присутствие остатков Trp (W3,W7) в N-концевой области способствуют его встраиванию пептида под углом к плоскости мембраны.
Динамические свойства липидов в области интерфейса. Ltc2a, вследствие эффективного взаимодействия с липидами ПОФХ в мембране «Эритроциты», сильнее влияет на их динамику (образует выраженные фракции липидов с пони женной подвижностью), чем Ltc1. В «Грам-» за счет параллельной ориентации пептида также наблюдается более заметное влияние на поверхностное распреде ление динамических фракций липидов (см. подробнее разделы III.1.2, III.4) по сравнению с сильно заглубленным Ltc1.
Подведем итог. Для Ltc2a характерно существенное воздействие на струк турно-динамические свойства мембран вблизи интерфейса, поэтому можно предположить, что механизм действия данного пептида связан с поверхностной дестабилизацией бислоя. Дестабилизация, видимо, «накапливается» при увели чении концентрации пептида, достигая определенного уровня, при котором на блюдается разрушение бислоя. Такое поведение говорит в пользу коврового ме ханизма. Мембранный ответ на действие пептида Ltc1 выражен слабее. Видимо, для реализации его механизма действия необходима трансмембранная (или сильно заглубленная) ориентация пептида, что позволяет предположить для него способность к формированию белок-липидных пор. Результаты моделирования хорошо согласуются с экспериментальными данными (вытекание красителей из ФЭ/ФГ липосом, P31-ЯМР), полученными в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН.
III.5.2. Разработка аналогов Ltc2a c измененной активностью.
Рис.8. А. Энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий Ltc2a с мембраной «Эритроциты». Б. Направ ленное изменение гидрофобных паттернов на поверхности пептида Ltc2a. Приведены двумерные кар ты распределения гидрофобных свойств на поверхности пептида дикого типа и его мутантов. Области мутаций выделены овалами. Остальные детали – как в подписи к рис. 7А По результатам МД цвиттерионная мембрана «Эритроциты» обладает бо лее гидрофобной поверхностью, по сравнению с заряженной «Грам-». Это по зволяет предположить, что уменьшение площади гидрофобной поверхности Ltc2a приводит к понижению эффективности взаимодействия с цвиттерионными мембранами и, следовательно, – к уменьшению гемолитической активности пеп тида. Сравнение двумерной карты распределения гидрофобности на поверхности пептида и профиля энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий остатков Ltc2a с мембраной «Эритроциты» (рис. 8) позволяет выявить наиболее перспективные остатки для последующих мутаций – Ile7, Phe10. Для них одновременно харак терны низкая энергия взаимодействия с мембраной и локализация внутри об ширных гидрофобных паттернов на карте МГП. Поэтому для уменьшения гемо литической активности Ltc2a были предложены мутации Ile7-Gln, Phe10-Lys (рис. 8Б). Данный этап работы проводили в тесном сотрудничестве с Лаборато рией пептидного синтеза и группой оптической спектроскопии Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. Предложенные мутанты Ltc2a были синтези рованы, и для них проведена серия биологических тестов на гемолитическую и антимикробную активности (табл. 5). Видно, что изменение всего лишь одного а.к. остатка позволяет существенно уменьшить гемолитическую активность пеп тидов, сохраняя при этом антибактериальную активность на уровне пептида ди кого типа.
Табл. 5. Активности пептида Ltc2a и его аналогов.
Минимальная ингибирующая ЭК50*, мкМ концентрация, мкМ Пептид Последовательность Эритроци B. subtilis B- E. coli ты челове C-600 ВКМ ка Ltc2a 3.0 0.7 9. GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH Ltc2a_I7Q 5.5 0.7 -** GLFGKLQKKFGRKAISYAVKKARGKH Ltc2a_F10К 5.0 1.3 GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH * Эффективная концентрация, вызывающая 50%-ный лизис.
** Активность отсутствует (0% лизис) при концентрациях до 45 мкМ.
III.6. Краткое описание разработанной технологии моделирования МАП.
В данном разделе приводится описание технологии, оптимизирующей за дачу моделирования МД периферически связывающихся МАП в явно заданных мембрано-имитирующих системах. Технология была разработана на основании систематизации результатов предыдущих этапов работы. Она включает две со ставные части – технологию создание моделей мембрано-имитирующих сред и технологию моделирования пептидов в присутствии таких систем.
IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В этой главе суммированы проведенные в работе исследования, получен ные новые результаты и выводы.
1. Для учета различных эффектов при моделировании МАП была создана БД однокомпонентных липидных бислоев (~200 липидов) и мицелл (~100 молекул детергента) с разной химической структурой полярной головки и ацильных це пей. Проведена оптимизация процедур МД явно заданных гидратированных за ряженных и нейтральных мембранных систем с применением высокопроизводи тельных многопроцессорных вычислительных платформ. Показано хорошее со гласие теоретических моделей мембранных систем с имеющимися эксперимен тальными данными. Созданы модели смешанных бислоев, близких по составу к реальным биологическим мембранам (эритроцитов человека, грам- бактерий).
Разработаны новые методики картирования свойств поверхностей модельных мембран (распределения гидрофобных/гидрофильных свойств, подвижность по лярных головок липидов, характер упаковки липидов, рельеф поверхности).
2. Проведено тестирование методов моделирования МАП на основании срав нения структур АМП Ltc2a, независимо полученных по данным МД и 1Н-ЯМР спектроскопии в мицеллах ДСН. Результаты: a) Данные МД о структуре Ltc2a в мицелле хорошо согласуются с экспериментальными данными 1Н-ЯМР, что го ворит об адекватности созданных моделей и эффективности используемых вы числительных протоколов. б) Структура пептида состоит из двух спиралей, со единенных линкерным участком и ориентированных практически перпендику лярно друг другу своими гидрофобными остатками.
3. Изучен характер взаимодействия фузионного пептида E5, синтетического гомолога пептида слияния из гемагглютинина вируса гриппа, с бислоями, со стоящими из липидов с разной длиной ацильных цепей (ДМФХ и ДПФХ). Ре зультаты: a). В процессе МД пептид глубже встраивается в интерфейс более «рыхлой» мембраны ДМФХ, по сравнению с мембраной ДПФХ. Мембранный ответ также более выражен в случае бислоя ДМФХ. б). Встраивание Е5 в бислой ДМФХ приводит к вытеснению части липидов из плоскости мембраны в водную фазу за счет эффективного взаимодействия с остатками глутаминовой кислоты пептида.
4. Проведено моделирование взаимодействия неспецифического переносчика пенетратина с заряженным (ДОФС) и цвиттерионным (ДОФХ) бислоями. Ре зультаты: а). Конформационная динамика пенетратина отличается от поведения амфифильных МАП. В водном окружении структура пептида частично стабили зирована стэкинг-взаимодействиями остатков Arg и Trp;
в незаряженном бислое ДОФХ сохраняется исходная -спиральная конформация;
в ДОФС, в зависимо сти от стартовой ориентации, наблюдаются как -спиральная, так и структурная конформации. Полученные результаты хорошо согласуются с экс периментальными данными. б). Дестабилизация локальной структуры бислоя и изменение его динамических свойств связаны с образованием специфических долгоживущих комплексов пептид-липиды. Пенетратин проявляет способность к формированию сложных центров захвата молекул ФС, тогда как для ФХ этот эффект практически отсутствует.
5. Изучено поведение АМП Ltc1 и Ltc2a в модельных бислоях, имитирующих мембраны эритроцитов и грам отрицательных бактерий. Результаты: а). Харак тер взаимодействия с ФХ-липидами отличается в случае двух пептидов, что, возможно, определяет их различные гемолитические свойства. б). Отличия в ха рактере связывания с модельными мембранами и мембранном ответе на дейст вие пептидов позволяют сделать предположение о разных механизмах дестаби лизации клеточных мембран («ковровый» – для Ltc2a;
с образование белок липидных пор – для Ltc1). Полученные результаты в целом согласуются с экспе риментальными данными. в). Для Ltc2a предложен ряд мутаций, направленных на уменьшение гемолитической активности пептида. С помощью эксперимен тальных методов была показана эффективность предсказанных аминокислотных замен.
V. ВЫВОДЫ 1. Разработаны и оптимизированы методики исследования поведения пепти дов в явно заданных модельных мембранах, основанные на расчетах МД. Реали зованные новые подходы в анализе МД-данных с использованием процедур кар тирования различных структурно-динамических свойств поверхности мембран позволяют получать детальную картину мембранного ответа, вызванного встраиванием пептидов. На основании систематизации полученных результатов создана интегрированная технология моделирования МАП.
2. Характер связывания фузионного пептида E5, пептидного переносчика пе нетратина и антимикробного пептида Ltc2a является следствием их адаптации к различному мембранному окружению. Основными факторами служат: а) кон формационная подвижность пептида;
б) заряд, динамическое состояние и кри визна поверхности мембраны;
в) гидрофобная организация водно-липидного ин терфейса.
3. Дестабилизация мембран в процессе связывания ряда биологически актив ных пептидов происходит в результате образования специфических контактов аминокислотных остатков с полярными головками липидных молекул. а). Взаи модействие остатков глутаминовой кислоты фузионного пептида E5 c ФХ при водит к вытеснению липидов из плоскости мембраны. б). Формирование ком плексов ароматических и катионных остатков пентератина с ФС способствует возникновению «гидрофобных дефектов» на поверхности мембраны.
4. Особенности аминокислотной организации АМП Ltc1 и Ltc2a обусловли вают различный характер их связывания с моделями бактериальных и эукарио тических мембран. В частности, распределение ароматических остатков в моле кулах пептидов и гидрофобная организация их спиралей определяют перифери ческую моду связывания для Ltc2a и заглубленную – для Ltc1.
5. На основании молекулярного моделирования предсказаны полярные ами нокислотные замены в гидрофобных областях антимикробного пептида Ltc2a (Ile7Gln, Phe10Lys), направленные на уменьшение его гемолитической активно сти. Данные биологического тестирования для полученных аналогов (Ltc2a_I7Q, Ltc2a_F10K) показали эффективность предложенных мутаций.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Nolde D.E., Arseniev A.S, Efremov R.G. Role of lipid charge in organization of water/lipid bilayer interface: insights via computer simulations. (2005). J. Phys. Chem. B, 109, 15052-15059.
2. Volynsky P.E., Polyansky A.A., Simakov N.A., Arseniev A.S., Efremov R.G. Ef fect of lipid composition on the "membrane response" induced by a fusion peptide.
(2005). Biochemistry, 44, 14626–14637.
3. Dubovskii P.V., Volynsky P.E., Polyansky A.A., Chupin V.V., Efremov R.G., Ar seniev A.S. Spatial structure and activity mechanism of a novel spider antimicrobial peptide. (2006). Biochemistry, 45, 10759-10767.
4. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Arseniev A.S., Efremov R.G. Computer simula tions of anionic unsaturated lipid bilayer – a suitable model to study membrane inter actions with a cell-penetrating peptide In: Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II. (Eds. N.Kolchanov and R. Hofestaedt) Springer Science+Business Media, Inc. 2005, 235-246.
5. Efremov R.G., Volynsky P.E., Polyansky A. A., Nolde D.E., Arseniev A.S. Pro tein-membrane interactions: lessons from in silico studies. In: Structure and Biophys ics - New Technologies for Current Challenges in Biology and Beyond (J.D. Puiglisi), NATO Science Series: Life and Behavioural Sciences, – in press.
6. Efremov R.G., Nolde D.E., Volynsky P.E., Vereshaga Y.A., Simakov N.A., Poly ansky A.A. Molecular modeling of membrane peptides and proteins. Fundamental & Clinical Pharmacology 2004 18, 7. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Efremov R.G. Computer simulations of anionic unsaturated lipid bilayer: a base system to study peptide-membrane interactions. Pro ceedings of the Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regula tion and Structure, Novosibirsk, Russia (2004), 1, 333-334.
8. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Efremov R.G. Unsaturated phosphatidylserine bi layer: a perspective model system to study peptide-membrane interactions via com puter simulations. International symposium “Peptide-Membrane Interactions” Namur, Belgium (2004).
9. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Efremov R.G. Computer simulations of interaction of Trojan peptides with lipid bilayers. 5th EMBL PhD Student International Sympo sium, “Design of Life - Learning from Nature”, Heidelberg, Germany (2004).
10. Efremov R.G., Volynsky P.E., Polyansky A.A., Aliper E.T., Dubovskii P.V., Ar seniev A.S. Binding of membrane-active peptides to lipid bilayers: From modeling of structure and dynamics – to understanding of function. Symposium “Interactions of Peptides and Proteins with Membrane Surfaces”, the 231st ACS National Meeting, At lanta, USA (2006) 11. Polyansky A.A., Aliper E.T., Volynsky P.E., Efremov R.G. Action of membrane active peptides on explicit lipid bilayers. Role of specific peptide-lipid interactions in membrane destabilization. Proceedings of the Fifth International Conference on Bioin formatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia (2006), 1, 302 305.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Czajlik A., Mesko E., Penke B., Perczel A. J. Pept. Sci. 2002, 8, Dubovskii P.V., Li H., Takahashi S., Arseniev A.S., Akasaka K. Protein Sci. 2000, 9, 786.
Efremov R.G., Vergoten G. J. Phys. Chem. 1995, 15, 63.
Forrest L.R., Sansom M.S. Curr Opin Struct Biol. 2000, 10, 174.
Han X., Bushweller J.H., Cafiso D.S., Tamm L.K. Nat Struct Biol. 2001, 8, 715.
Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. J. Biol. Chem. 2006, 281, 20983.
Lindahl E., Hess B., van der Spoel. D. J. Mol. Mod. 2001, 7, 306.
Petrache H.I., Tristram-Nagle S., Gawrisch K., Harries D., Parsegian V.A., Nagle J.F.
Biophys. J. 2004, 86, 1574.
Vaccaro L., Cross K.J., Kleinjung J., Straus S.K., Thomas D.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Fraternali F. Biophys. J. 2005, 88, 25.