Микробная ремедиация нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований в подзоне южной тайги
На правах рукописи
Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пермь - 2013
Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Еремченко Ольга Зиновьевна Научный консультант:
доктор фармацевтических наук, профессор Одегова Татьяна Федоровна
Официальные оппоненты:
Артамонова Валентина Сергеевна – доктор биологических наук, доцент, ФГБУН «Институт почвоведения и агрохимии СО РАН», ведущий научный сотрудник Егорова Дарья Олеговна – кандидат биологических наук, ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН», старший научный сотрудник
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный политехнический университет»
Защита диссертации состоится «05» декабря 2013 г. в 15 часов 15 минут на заседании диссертационного совета Д 212.189.02 на базе ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Букирева, д. 15, в зале заседаний Учёного Совета Адрес сайта: http://www.psu.ru E-mail: [email protected] Тел.: 8(342)239-62- Факс: 8(342)237-16-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» Автореферат разослан «01» ноября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Шибанова Наталья Леонидовна ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы Нефтяная промышленность признана загрязнителем окружающей природной среды, наносящим ущерб биосфере. Отдельные территории вследствие разливов нефти приближаются по состоянию к районам экологического бедствия. Создается угроза устойчивой, часто необратимой, трансформации всех компонентов природной среды, что приводит к нарушению нормального функционирования природных экосистем и ухудшению условий жизни растений, животных, человека.
Нефтезагрязнение сопровождается нарушением физических, химических и биологических свойств почв (Пиковский, 1988;
Звягинцев, 1989;
Солнцева, 1998;
Артамонова, 2002;
Назарько, 2008;
Оборин и др., 2008;
Лысак, 2010 и др.). Естественное самоочищение почв от загрязнения нефтью и нефтепродуктами может длиться десятилетиями. Традиционные методы восстановления нефтезагрязненных почв (сжигание, закапывание) являются не только малоэффективными, но и экологически вредными. При сжигании нефтепродуктов страдает растительность и животное население;
в результате пиролиза нефти и ее компонентов образуются токсичные полициклические ароматические углеводороды. Засыпка нефтяных пятен резко снижает скорость деструкции нефти, создает неблагоприятную анаэробную обстановку и т.д. Поэтому особую актуальность приобретает поиск безопасных для окружающей среды и человека средств и методов биологической ремедиации загрязненных нефтью почв.
Изменение свойств почвы при нефтезагрязнении и скорость деструкции определяются не только дозой поллютанта, но и в значительной степени исходной микробиологической активностью почвы. В условиях подзоны южной тайги исследованы процессы деструкции нефти, изменение микробиологической и биохимической активности дерново-подзолистых почв при нефтезагрязнении (Оборин и др., 2008). Не смотря на множество работ по восстановлению почв, обилию созданных биопрепаратов, вне внимания исследователей осталась проблема ремедиации дерново карбонатных почв, подверженных нефтезагрязнению в районах нефтедобычи предуральского региона.
В антропогенно нарушенных ландшафтах, в том числе, на территориях добычи, хранения нефти и нефтепродуктов, почвы часто механически уничтожены, на их месте сформированы техногенные поверхностные образования (ТПО). ТПО отличаются пониженной биологической активностью и специфическим сообществом микроорганизмов, особенно на фоне загрязнения поллютантами. При рекультивации нефтезагрязнных ТПО первоочередной задачей становится повышение численности и активности углеводородокисляющих микроорганизмов, которые ликвидируют токсический эффект нефти и создадут благоприятные условия для развития растительности.
Цель исследований В условиях подзоны южной тайги оценить изменение свойств нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований на начальном этапе биологической ремедиации.
Объекты исследований Объектами исследований являлись нефтезагрязненные агродерново карбонатные почвы и техногенные поверхностные образования в подзоне южной тайги.
Предмет исследований Агрохимические и микробиологические свойства нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почв и техногенных поверхностных образований при внесении биопрепаратов, на фоне рыхления и применения удобрений.
Основные задачи исследований Установить изменение остаточного количества нефти в почвах 1.
и ТПО при внесении ремедиантов.
Изучить трансформацию агрохимических свойств 2.
агродерново-карбонатных почв и ТПО на начальном этане ремедиации.
Оценить микробиологические свойства и биохимическую 3.
активность поверхностных слоев почв и почвогрунтов на фоне применения биопрепаратов.
Провести оценку эффективности применения селекционных 4.
штаммов микромицетов Phoma eupyrena и Cephaliophora в ремедиации нефтезагрязненной агродерново tropica карбонатной почвы.
Научная новизна В условиях подзоны южной тайги получены новые данные о повышении численности аборигенных углеводородокисляющих бактерий в нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почвах путем применения биопрепаратов. Установлены изменения в сообществе углеводородокисляющих микроорганизмов в результате внесения селекционных штаммов микромицетов Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica на.
Впервые на фоне применения биопрепаратов показано повышение микробиологической и биохимической активности нефтезагрязненных техногенных поверхностных образований.
Практическое значение В нефтезагрязненных агродерново-карбонатных почвах и ТПО на начальном этапе ремедиации существенно снизилась нагрузка нефти, были созданы условия для получения всходов и развития культурных злаков.
Ремедиация на основе применения биопрепаратов может быть рекомендована для очистки почвогрунтов на территориях добычи нефти и складирования нефтепродуктов (нефтебазы, шламовые амбары и др.), для восстановления нефтезагрязненных почв.
Защищаемые положения 1. Агродерново-карбонатные почвы имеют богатый пул углеводородокисляющих бактерий и микромицетов, что определило их потенциальную способность к самоочищению при нефтезагрязнении.
2. Для ремедиации нефтезагрязненных техногенных поверхностных образований с низкой биологической активностью следует применять биопрепараты, содержащие ассоциацию углеводородокисляющих микроорганизмов.
Апробация работы и публикации Материалы исследований были доложены на II Международной конференции «Биоконверсия органических отходов» (г. Иванофранковск, 1998 г.), на III Международной конференции «Биоконверсия органических отходов» (г. Киев, 2000 г.), на II Международной научно-практической конференции «Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2004 г.), на II Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2007 г.), на пятой научно-практической конференции «Экологические работы на месторождениях нефти Тимано Печерской провинции. Состояние и перспективы» (Сыктывкар, 2008 г.).
По теме исследований опубликовано 12 работ, в т.ч. 5 статей, в изданиях, рекомендованных ВАК.
Получен патент на изобретение №2421291 от 20.06.2011г. «Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами» (приложение 1). Имеется акт внедрения за работы по ремедиации нефтезагрязненных ТПО Керженецкой нефтебазы (приложение 2).
Личное участие автора Автором проведен аналитический обзор литературы, планирование и организация полевых экспериментов, интерпретация и обобщение результатов опытов. Микробиологические исследования выполнены автором, агрохимические исследования - при личном участии на кафедре химии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.
Структура и объем диссертации Материал диссертации изложен на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирован таблицами (18) и рисунками (7). Работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы, содержащего источников, из которых 166 на русском и 20 на иностранных языках;
имеет 15 приложений.
Благодарности Автор выражает глубокую признательность за консультативную помощь О.С. Якименко - кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику кафедры химии почв Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, а также А.К. Злотникову - кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина. Автор благодарит за научные консультации ректора Пермской фармацевтической государственной академии, заведующую кафедрой микробиологии, профессора, доктора фармацевтических наук Т.Ф. Одеговой. Особая благодарность - научному руководителю доктору биологических наук, профессору О.З. Ерёмченко за помощь в работе, постоянное внимание и поддержку.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы В главе приведены сведения о деградации нефтезагрязненных почв и основные приемы их восстановления. Рассматривается характеристика нефти и ее влияние на агрохимическое состояние почв, микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв. Приведены примеры влияния нефтяного загрязнения на почвенную биоту. Описаны критерии оценки загрязненности почв и приемы восстановления. Отмечено преимущество биологических методов очистки почв на основе мобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов.
Глава 2. Объекты и методы исследования Методика полевых опытов Мелкоделяночные полевые опыты проведены на территории опытного участка в Ильинском районе Пермского края. Объектом исследований были агродерново-карбонатные глинистые почвы, которые сформировались на пермских карбонатных породах. Эти почвы занимают 288 тыс. га, 1,8 % территории Пермского края;
распахано 203 тыс. га дерново-карбонатных почв. Редкие почвы на пермских породах рекомендованы для включения в Красную книгу почв Пермского края (Еремченко и др., 2010).
В полевых исследованиях 2003-2004 гг. испытано сравнительное действие биопрепаратов биогумус (из расчета 3 т/га), вермикомпост (из расчета 3 т/га), штамм дрожжевой культуры (из расчета 500 л/га), «Альбит» (из расчета 200 л/га), «Байкал ЭМ1» (из расчета 100 л/га), а также навоза (из расчета 40 т/га), диамонийфосфата (из расчета 60 кг/га) и извести (из расчета 4 т/га) на свойства агродерново-карбонатной почвы, загрязненной нефтью в дозе 20 л на 1 м2. Загрязнение почвы и внесение ремедиантов произведено в мае 2003 г. Летом 2004 г. на участке посеяна смесь злаков: овсяница красная (Festuca rubra subsp Rubra), овсяница обыкновенная (Festuca pratensis Huds), мятлик луговой (Poa pratnsis L.), костер безостый (Bromus inermis Leysser), райграс пастбищный (Lolium perenne L.). Количество остаточной нефти в пахотном слое 0-20 см определили летом 2003, весной и осенью 2004 г. В начале осени 2004 г. определили агрохимические свойства почвы, накопление бенз(а)пирена и массу трав.
В опытах 2007 г. исследовано совместное действие препарата «Альбит» и штаммов микромицетов Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica на свойства агродерново-карбонатной почвы при разных дозах загрязнения нефтью (5, 10 и 20 л/м2). Нефть внесли в почву во второй половине мая 2007 г. Через неделю после загрязнения был внесен препарат «Альбит» в виде суспензии из расчета 50, 100 и 200 л/га (соответственно увеличению уровня загрязнения нефтью). В препарате «Альбит» концентрация Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica составляла не менее 1010 клеток/мл.
Рыхление слоя 0-20 см проводили один раз в неделю в течение двух месяцев, одновременно поливали дозой 20 л/м2. Агрохимические свойства и остаточное количество нефти в почве определили через 70 дней после начала ремедиации. Отбор почвенных проб для учета численности микроорганизмов произведен через 7 дней после загрязнения и через 35, 70 дней после внесения ремедиантов.
Исследования по микробной ремедиации ТПО были проведены в течение лета 2004 г. на территории Керженецкой нефтебазы в Нижегородской области. На нефтебазе ТПО представлены слоистыми грунтами неоднородного гранулометрического состава с участками перемешенного почвенного материала, неравномерно пропитанные свежей и остаточной нефтью. В июне 2007 г. на загрязненный нефтью участок внесли биопрепараты «Альбит» + «Байкал ЭМ1» из расчета 200 л/га в соотношении 1:1 на фоне применения диамонийфосфата (из расчета 40 кг/га) и рыхления на глубину 0-20 см. Посев трав провели в середине лета, спустя один месяц после обработки нефтезагрязненных ТПО биопрепаратами. Многолетние травы посеяны с нормой 20 кг/га: овсяница красная (Festuca rubra subsp Rubra), овсяница обыкновенная (Festuca pratensis Huds), мятлик луговой (Poa pratnsis L.), костер безостый (Bromus inermis Leysser), райграс пастбищный (Lolium perenne L.). Всходы трав появились через 15 дней после посева.
Через 25 дней растения образовали покров на загрязненном участке, подвергнутом ремедиации.
Пробы почвогрунта отобраны через месяц после начала ремедиации из шести точек загрязненного участка на глубину 0-20 см – для агрохимических и биохимических свойств и десяти точек по слоям 0-10 и 10-20 см – для микробиологических свойств;
для сравнения взяты образцы с незагрязненной (фоновой) территории.
Характеристика биопрепаратов Действующим веществом биопрепаратов являются живые организмы либо продукты их жизнедеятельности. Биогумус – продукт переработки органических отходов калифорнийским червем (сертификат 0070045338).
Вермикомпост – биогумус с содержанием 25 – 30 % червей (сертификат №0070045338). Навоз - органическое удобрение, полученное в результате твердых и жидких выделений крупного рогатого скота на подстилочный материал.
«Альбит» комплексный препарат, обладающий свойствами регулятора роста, фунгицида, удобрения (патент №2147181). «Байкал ЭМ1» – универсальный концентрат в виде жидкости, содержащий более 80 штаммов почвенных микроорганизмов;
номер государственной регистрации № 05 – 9800 (9801 – 9803) - 0369 (0386) – 1. Штамм дрожжевой культуры суспензия микробных клеток в концентрации не менее 1010 кл/мл. Штамм Phoma eupyrena – сапротроф, выделяемый из почв, подстилки, навоза, гниющих растительных остатков (Кириленко, 1977). Штамм Cephaliophora tropica - сапротроф, выделенный из ризосферы молодого клена (Crook, 1955).
Методы лабораторных исследований Использованы следующие методы почвенных исследований: pH водной суспензии - потенциометрическим методом;
рН солевой суспензии – потенциометрическим методом;
содержание углерода органических соединений - ГОСТ 23740-79;
содержание нитратного азота - ГОСТ Р53219 2008;
содержание подвижных соединений калия - по методу Кирсанова в модификации ЦИНАО (ГОСТ 26207);
содержание подвижных соединений фосфора - по методу Мачигина в модификации ЦИНАО (ГОСТ-26205);
массовая доля нефтепродуктов - методом капиллярной газо-жидкостной хроматографии (ГОСТ 13379-82);
содержание углеводородов нефти методом жидкостной хроматографии (ГОСТ 13379-82);
содержание бенз(а)пирена - методом жидкостной хроматографии (ГОСТ Р-53955-2010);
денитрифицирующую активность почвы - по методу М.В. Фёдорова (ГОСТ 12.4.011-89);
азотофиксирующую активность почвы - ГОСТ 27593-88;
определение активности каталазы по перманганатометрическому методу Джонсона и Темпле;
определение активности дегидрогеназы и инвертазы проводили по методу А.Ш. Галстяна.
Для определения численности и таксономического состава комплекса углеводородокисляющих микроорганизмов применяли метод посева на агаризированную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду и среду Чапека с гексадеканом (Лысак и др., 2003). Посевы проводили стандартным способом из тысячного разведения в 5 кратной повторности после предварительной обработки на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1 (22 кГц;
0,44 А;
2 мин) (Звягинцев, 1991). Для ингибирования развития грибов в среду добавляли мг нистатина на 0,5 л среды.
Посевы инкубировали при комнатной температуре 3-7 суток, затем проводили подсчет и микроскопирование выросших колоний.
Идентификацию микроорганизмов до рода проводили на основании изучения культуральных и микроморфологических признаков (Хоулт и др., 1997).
Общую численность микроорганизмов определяли прямым микроскопическим методом с использованием красителя акридина оранжевого в камере Гаряева (Звягинцев, 1991).
Глава 3. Результаты и их обсуждение Изменение свойств агродерново-карбонатной почвы на фоне применения биопрепаратов, удобрений и извести (2003-2004 гг.) По мере развития процесса ремедиации уменьшалась нагрузка нефти в слое 0-20 см агродерново-карбонатной почвы (табл. 1). Применение биопрепаратов и удобрений ускорило в несколько раз деградацию нефти, благодаря их действию к концу наблюдений деградировано 40-50 % нефти, внесенной на поверхность агродерново-карбонатной почвы в количестве л/м2. Наименьшее остаточное количество нефти содержалось в почве на фоне препарата «Альбит». Этот биопрепарат не содержит живые клетки микроорганизмов, по-видимому, его действие на нефтезагрязненную почву обусловлено активизацией аборигенной ассоциации микроорганизмов.
Внесение биопрепаратов, удобрений и извести не существенно повлияло на актуальную кислотность почвы, которая находилась в пределах нейтрально-слабощелочных значений реакции среды. Наибольшее количество органического углерода отмечено на фоне извести и навоза;
в первом случае - это результат замедленного разложения нефти, а во втором последствие внесения органического удобрения. Меньшим содержанием органического углерода (9-12 %) характеризовались варианты с биопрепаратами «Альбит», «Байкал ЭМ1», биогумус и вермикомпост, что отразило повышенную скорость деградации нефти.
Таблица Содержание нефти в агродерново-карбонатной почве (0-20 см) по вариантам опыта, мг / кг Вариант Срок наблюдений №№ 18.06.03 15.05.04 22.09. Фон 1. 0 0 Нефть 20 л / м 2. 200 191 Нефть 20 л / м2 + биогумус 3. 119 116 Нефть 20 л / м2 + 4. 119 114 вермикомпост Нефть 20 л / м2 + дрожжевые 5. 105 104 культуры Нефть 20 л / м2 + навоз 6. 141 138 Нефть 20 л / м2 + «Альбит» 7. 118 112 Нефть 20 л / м2 + «Байкал 8. 136 130 М1» Нефть 20 л / м2 + 9. 159 141 диаммонийфосфат Нефть 20 л / м2 + известь 10. 169 146 В результате загрязнения нефтью в почве увеличилось содержание нитратов более чем в 2 раза относительно фонового уровня (табл. 2). По видимому, накоплению нитратов способствуют физико-химические и биохимические процессы разрушения соединений нефти. Повышенное количество нитратов отмечено также на вариантах с применением навоза и диаммонийфосфата, содержащих соединения азота в органической и/или минеральной формах.
В результате применения биогумуса, вермикомпоста, препаратов «Альбит» и «Байкал ЭМ1», дрожжевых культур и извести в почве содержится меньше нитратного азота, чем на загрязненном контрольном варианте. Вероятно, в процессе ремедиации формируется замкнутый круговорот соединений азота при участии растений и микроорганизмов без накопления нитратов в почве. На вариантах с биопрепаратами повышено количество подвижных фосфатов и калия в пахотном слое почвы, что в основном связано с присутствием питательных элементов в составе биопрепаратов.
Таблица Агрохимические показатели нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почвы, слой 0-20 см (22.09.2004 г.) Сорг, Р2О5, К2О, N-NO3, № Площадка рНвод мг/100 г мг/100 г мг/100 г % Фон 1 7,25 2,1 39,4 6,5 3, Нефть 20 л / м 2 7,40 - 90,2 6,6 3, Нефть 20 л / м2 + 3 7,32 12,0 26,67 7,65 4, биогумус Нефть 20 л / м2 + 4. 7,30 11,8 26, 7 7,6 4, вермикомпост Нефть 20 л / м2 + 5. 7,03 14,1 34,0 16,2 13, дрожжевые культуры Нефть 20 л / м2 + навоз 6. 7,08 16,5 195,7 13,8 10, Нефть 20 л / м2 + 7. 7,44 10,1 69, 5 15,1 12, «Альбит» Нефть 20 л / м2 + «Байкал 8. 7,26 9,6 17,7 10,2 7, ЭМ1» Нефть 20 л / м2 + 9. 7,70 13,2 103,8 11,4 8, диаммонийфосфат Нефть 20 л / м2 + известь 10 7,60 17,2 64,6 12,2 9, В результате загрязнения в почве обнаружено присутствие бенз(а)пирена, на контроле его количество приближалось к ПДК. Заметно ниже количество бенз(а)пирена в загрязненной агродерново-карбонатной почве на вариантах с дрожжевыми культурами и навозом, биогумусом и вермикомпостом (табл. 3). И в три раза меньше его содержание в почве на фоне применения препаратов «Альбит» и «Байкал ЭМ1».
Зеленая масса сеяных злаков отражает общую картину биодеградации нефти по вариантам опыта (табл. 3). Повышенная масса трав отмечена на вариантах с биогумусом и вермикомпостом, и, особенно, с препаратами «Альбит» и «Байкал ЭМ1»;
на фоне последних она увеличилась в 2 раза относительно варианта с контрольным загрязнением почвы.
Таблица Масса надземной части злаков и количество бенз(а)пирена в слое 0-20 см агродерново-карбонатной почвы по вариантам опыта (22.09.2004) г.
Бенз(а)пирен, мг/кг Зеленая масса, кг/м Вариант почвы 19,0 · 10- Нефть 20 л / м2 0, - 5,1 · Нефть 20 л / м2 + биогумус 1, Нефть 20 л / м2 + 6,2 · 10-3 1, вермикомпост Нефть 20 л / м2 + дрожжевые 8,9 · 10-3 1, культуры 9,9 · 10- Нефть 20 л / м2 + навоз 1, 4,8 · 10- Нефть 20 л / м2 + «Альбит» 1, Нефть 20 л / м2 + «Байкал 4,9 · 10-3 1, ЭМ1» Нефть 20 л / м2 + 17,8 · 10-3 1, диаммонийфосфат 15,9 · 10- Нефть 20 л / м2 + известь 1, Для выявления наиболее эффективных ремедиантов нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почвы был использован метод математической оптимизации. Из каждой выборки показателей состояния почвы (х 1, х2, х3, х4,… хn ) по вариантам опыта выбран экстремум – минимальное (хmin) или максимальное (xmax) значение показателя. Для показателей рН, содержания органического углерода, нефти и бенз(а)пирена в качестве экстремума были выбраны минимальные значения;
а для количества подвижных фосфатов и калия, продуктивности трав – максимальные значения. Относительно экстремума рассчитали нормированные значения каждого показателя: xk = хmin / хn, или xk = хn / хmax. Сложив нормированные значения показателей, получили суммарный критерий оптимизации по каждому варианту ремедиации. При данном подходе был учтен комплекс экологически важных свойств, отражающих состояние нефтезагрязненной почвы в процессе микробной ремедиации. Исходя из суммарных критериев оказались лучшими варианты ремедиации с применением биопрепаратов «Альбит», «Байкал ЭМ1» и дрожжевых культур;
суммарный коэффициент оптимизации составлял на их фоне 7,3-7,9, по сравнению с 5,3-6,5 на остальных вариантах опыта с применением биогумуса, вермикомпоста, навоза, диаммонийфосфата и извести.
Изменение свойств агродерново-карбонатной почвы на фоне применения препарата «Альбит» и штаммов Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica (2007 г.) Благодаря применению препарата «Альбит» за период около двух месяцев количество углеводородов в нефтезагрязненной почве снизилось на варианте 5 л/м2 нефти на 50 %, на варианте 10 л/м2 – на 40 %, на варианте л/м2 – на 55 % относительно контрольного загрязненного варианта. На фоне действия биопрепарата величина рН оставалась в пределах показателей нейтрально-слабощелочной среды, в почве уменьшилось количество нитратов и возросло содержание подвижных форм фосфатов и калия.
Внесение препарата «Альбит» со штаммами Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica незначительно повлияло на процесс деструкции нефти по сравнению с вариантом использования одного препарата.
В незагрязненной агродерново-карбонатной почве опытного участка установлена таксономическая структура и численность колониеобразующих единиц сообщества углеводородокисляющих микроорганизмов.
(КОЕ) Ассоциация бактерий включала следующие роды: Rhodococcus (108 КОЕ/г почвы) = Agrobactrium (108) Bacillus (107) Pseudomonas (106) = Clavibacter (106) (105);
сообщество мицеальных микромицетов Xanthomonas представлено родами: Penicillium (108) = Phytoptora (108) Fusarium (106) = Rhizoctonia (106).
Через неделю после разлива нефти в микробоценозе агродерново карбонатной почвы не обнаружены КОЕ бактерий родов Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus и Agrobactrium. Численность родов Clavibacter и Xanthomonas составила всего 102 КОЕ/г почвы. В тоже время в нефтезагрязненной почве присутствовали микромицеты в количестве сотни и тысячи КОЕ/г почвы, отсутствовал лишь Penicillium.
Через 35 дней с начала ремедиации в верхнем слое загрязненной почвы также присутствовали бактерии Clavibacter и Xanthomonas, при меньшей дозе загрязнения (5 л/м2) появились Agrobactrium (104 КОЕ/г) и Pseudomonas ( КОЕ/г). Обнаружены КОЕ микромицетов при всех дозах загрязнения почвы нефтью (табл. 4).
Применение препарата «Альбит» существенно изменило структуру и численность бактериального сообщества. Через 35 дней ремедиации на его фоне в почве отмечены все характерные для незагрязненной почвы роды бактерий;
с увеличением дозы загрязнения численность КОЕ, как правило, снижалась на 1-2 порядка. Усиление токсичности нефти не сказалось на Не установлено определенного влияния препарата на Xanthomonas.
численность КОЕ микромицетов на всех уровнях загрязнения. Среди грибов самую высокую численность показал Penicillium (105 КОЕ/г при дозах 5 и л/м2, 103 КОЕ/г при дозе 20 л/м2), который отсутствовал на варианте без биопрепарата.
Таблица Численность микроорганизмов в агродерново-карбонатной почве через 35 дней после начала ремедиации, КОЕ/г почвы, опыты 2007 г.
Agroba-cterium Pseudomonas Xanthomonas Rhodococcus Rhizoctonia Clavibacter Penicillium Phytoptora Вариант опыта Fusarium Bacillus Нефть 5 л / м2 102 102 103 104 102 103 104 0 Нефть 5 л / м2, «Альбит» 104 10 102 105 105 102 102 105 Нефть 5 л / м2, «Альбит», Phoma eupyrena 106 105 105 104 103 105 102 102 106 Нефть 5 л / м2, «Альбит», Phoma eupyrena, Cephaliophora tropica 106 103 104 105 105 106 102 10 Нефть 10 л / м2 102 103 103 104 102 0 0 0 Нефть 10 л / м2, «Альбит» 103 102 102 103 104 104 103 102 105 Нефть 10 л / м2, «Альбит», Phoma eupyrena 105 104 103 102 103 103 102 102 104 Нефть 10 л / м2, «Альбит», Phoma eupyrena, Cephaliophora tropica 104 102 102 104 104 104 102 104 Нефть 20 л / м2 102 103 103 102 0 0 0 0 Нефть 20 л / м2, «Альбит» 102 102 103 103 102 103 102 102 103 Нефть 20 л / м2, «Альбит», Phoma eupyrena 104 103 102 102 103 103 103 103 Нефть 20 л / м2, «Альбит», Phoma eupyrena, Cephaliophora tropica 103 102 103 103 102 103 103 102 103 Внесение в почву препарата «Альбит» совместно селекционными штаммами микромицетов незначительно повлияло на численность микроорганизмов. Через 35 дней ремедиации по дозам загрязнения нефтью и 10 л/м2 в почве проявилась тенденция к увеличению численности некоторых родов бактерий в 10 и 100 раз, в тоже время в 10 раз уменьшалась количество КОЕ грибов. На варианте 5 л/м2 нефти численность КОЕ Phoma eupyrena выше, чем у остальных групп микроорганизмов, но при больших дозах нефти его преимущество не выражено.
Через 70 дней в нефтезагрязненной почве присутствовали все группы микроорганизмов, но их численность не превышала 102 – 104 КОЕ/г почвы (табл. 5). Под воздействием препарата «Альбит» отмечены существенные изменения в ассоциации микроорганизмов. Численность бактерий на варианте с дозой нефти 5 л/м2 возросла до 105-107 КОЕ/г почвы, была понижена на вариантах с дозой нефти 10 и 20 л/м2, соответственно 104-106 и 103-105 КОЕ/г почвы. При меньших дозах загрязнения (5 и 10 л/м2) в почве не обнаружены КОЕ микромицетов Phytoptora, Fusarium, Rhizoctonia.
Таблица Численность микроорганизмов в агродерново-карбонатной нефтезагрязненной почве через 70 дней с начала ремедиации, КОЕ/г почвы Phoma eupyrena Cephaliophora Agrobacterium Pseudomonas Xanthomonas Rhodococcus Rhizoctonia Clavibacter Penicillium Phytoptora Вариант Fusarium Bacillus tropica 103 104 102 102 104 104 102 104 103 104 - Нефть 5 л / м Нефть 5 л / м2 + «Альбит» 107 106 107 107 105 106 0 0 0 - 105 107 106 105 106 106 102 0 0 0 Нефть 5 л / м2 + «Альбит» + Phoma eupyrena Нефть 5 л / м2 + «Альбит» + Phoma eupyrena, Cephaliophora 108 107 106 106 102 108 106 102 107 0 tropica Нефть 10 л / м2 102 102 103 102 104 104 103 104 102 103 - Нефть 10 л / м2 + «Альбит» 105 106 105 105 104 105 103 0 0 - 104 106 105 104 102 105 102 102 105 102 107 Нефть 10 л / м2 + «Альбит» + Phoma eupyrena 107 106 106 106 104 106 102 107 0 0 Нефть 10 л / м2 + «Альбит» + Phoma eupyrena, Cephaliophora tropica Нефть 20 л / м2 102 102 102 103 102 104 105 102 - - Нефть 20 л / м2 + «Альбит» 104 105 105 104 103 103 103 105 103 102 - 106 Нефть 20 л / м2 + «Альбит» + Phoma eupyrena 104 104 103 104 103 104 103 0 Нефть 20 л / м2 + «Альбит» + Phoma eupyrena, Cephaliophora - 104 105 105 105 104 104 0 0 tropica Примечание. Знак «-» - отсутствие данных.
На фоне внесения в почву препарата «Альбит» совместно селекционными штаммами микромицетов слабо представлены или отсутствовали бактерии Clavibacter и грибы Phytoptora, Fusarium, Rhizoctonia. Численность КОЕ (106 – 1010) селекционного штамма Phoma eupyrena существенно возросла по сравнению с предшествующим сроком наблюдений;
у Cephaliophora tropica она составила 105 – 106 КОЕ/г почвы.
Установлена положительная корреляционная зависимость между содержанием углеводородов и нитратов в почве (табл. 5), отрицательная связь у количества углеводородов и численности бактерий, количества углеводородов и численности КОЕ Penicillium;
однако, с углеводородами положительно связана численность КОЕ микромицетов Rhizoctonia и Fusarium. Следовательно, с увеличением нагрузки нефти в агродерново карбонатной почве происходило угнетение бактерий и грибов Penicillium, однако численность КОЕ Rhizoctonia и Fusarium нарастала.
Содержание подвижных форм фосфора и калия прямо пропорционально связано с численностью большинства родов микроорганизмов, кроме численности КОЕ двух родов микромицетов (Rhizoctonia, Fusarium). По видимому, активность углеводородокисляющих микроорганизмов Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus, Xanthomonas, Penicillium обусловлена обеспеченностью подвижными формами фосфора и калия. Активное размножение этих микроорганизмов подавляло численность микромицетов.
Связь между показателем нефтезагрязнения (содержание углеводородов) и агрохимическими, микробиологическими параметрами была учтена при расчете нормированных показателей. В качестве экстремума взяты минимальные значения для рН, содержания углеводородов и нитратов.
Микромицеты Rhizoctonia, Phytoptora, Fusarium включают фитопатогенные виды, увеличение их численности в почве может вызвать заболевание у культурных растений. Поэтому для численности КОЕ этих родов микромицетов использовали в качестве экстремума минимальное, но отличное от нуля, значение. Максимальные значения - экстремумы отобраны для содержания подвижных фосфатов и калия, а также для численности КОЕ Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus, Xanthomonas, Clavibacter, Agrobacterium.
Таблица Коэффициенты корреляции между микробиологическими и агрохимическими свойствами (через 70 дней ремедиации) рН УВ Показатели NO3 P2O5 K2O Pseudomonas -0,40 -0,73* -0,76* 0,84* 0,75* Rhodococcus -0,43 -0,79* -0,84* 0,79* 0,84* Bacillus -0,39 -0,8* -0,79* 0,77* 0,78* Xanthomonas -0,24 -0,68* -0,80* 0,88* 0,82* Clavibacter 0,39 0,14 0,39 -0,40 -0, Agrobacterium -0,31 -0,54 0,52 0, -0,83* Rhizoctonia 0,01 0,79* 0,77* -0,81* -0,77* Phytoptora -0,16 0,40 0,55 -0,72* -0,66* Penicillium -0,58 -0,70* -0,67* 0,68* 0,68* Fusarium 0,20 0,60* 0,64* -0,67* -0,67* Примечание. Символ * - достоверная корреляционная зависимость между микробиологическими и агрохимическими свойствами при 95 % уровне вероятности На вариантах с применением биопрепарата суммарные коэффициенты оптимизации в 1,7 раза превышали коэффициенты оптимизации контрольных загрязненных вариантов. При использовании препарата «Альбит» со штаммами микромицетов Phoma eupyrena, Cephaliophor atropica суммарный коэффициент оптимизации не превысил значение коэффициента на вариантах с одним препаратом «Альбит».
Таким образом, опыты по ремедиации агродерново-карбонатной почвы с применением препарата «Альбит», показали, что препарат активизировал аборигенную углеводородокисляющую микробиоту, особенно бактериальную, и ускорил процесс деструкции нефти. За период около двух месяцев количество углеводородов снизилось на варианте 5 л/м2 нефти в раза, на варианте 10 л/м2 – на 40 %, на варианте 20 л/м2 – на 55 % относительно контроля. На фоне действия препарата в почве отмечено повышенное количество подвижных форм фосфатов и калия, уменьшение содержания нитрат-ионов, внесенных с нефтью.
Селекционные штаммы микромицетов Phoma eupyrena, Cephaliophora tropica, внесенные совместно с препаратом «Альбит», понизили численность КОЕ аборигенных микромицетов, в том числе, включающих фитопатогенные виды.
Результаты исследований по ремедиации ТПО Перед началом ремедиации верхние слои (0-20 см) ТПО имели нейтральную реакцию среды (рис. 1). Содержание углеводородов колебалось от 2 до 15 %, органического углерода - от 3 до 16 %, что обусловлено неравномерным загрязнением нефтью. В значительной степени варьировало количество нитратов. Количество подвижных фосфатов и калия в ТПО было низким и в меньшей степени изменялось по точкам отбора проб ТПО.
Спустя месяц с начала процесса ремедиации отмечено незначительное подкисление ТПО, но реакция среды остается в пределах нейтральных значений. Заметно снизилось содержание органического углерода и особенно углеводородов (в среднем в 5 раз ниже). Благодаря удобрениям и биопрепаратам возросло содержание подвижных питательных элементов (рис. 1).
8 До ремедиации После ремедиации рН Сорг,% У.В, % N-NО3 Р2О5, К2О, мг/100г мг/100 гмг/100г Рис. 1. Изменение агрохимических свойств слоя 0-20 см ТПО в процессе ремедиации (различия статистически достоверные) ТПО территории нефтебазы характеризовались низкой фоновой биохимической активностью. В соответствии с критериями обогащенности почв ферментами Д.Г. Звягинцева (1978) верхний слой ТПО был очень бедным по активности инвертазы и дегидрогеназы.
Спустя один месяц после начала ремедиации в слое 0-20 см нефтезагрязненных ТПО повышена активность каталазы по сравнению с фоновым уровнем (рис. 2). По степени обогащенности инвертазой ТПО были бедными, что лучше фонового уровня. По активности дегидрогеназы они относятся к среднеобогащенным и богатым. Ферментативная активность отражает развитие микробной ремедиации, направленной на деструкцию нефти. Скорость азотфиксации в ТПО понижена относительно фонового показателя (рис. 3), что характерно для нефтезагрязненных почв. Скорость денитрификации, в среднем не отличалась от фонового уровня, по-видимому, в нефтезагрязненном почвогрунте не развиты анаэробные процессы восстановления азота.
2, 1, Активность каталазы 0, 1 2 3 4 № образца Рис. 2. Активность каталазы, см3 0,1 КМnО4/г, мин:
1 – проба из фонового ТПО;
2, 3, 4, 5 – пробы из нефтезагрязненного ТПО в процессе ремедиации 0, 0, Скорость азотфиксации 0, 0, 1 2 3 4 Рис. 3. Скорость азотфиксации, нмоль С2Н4/г, 24 ч.:
1 – проба из фонового ТПО;
2, 3, 4, 5 – пробы из нефтезагрязненного ТПО в процессе ремедиации До ремедиации поверхностные слои нефтезагрязненных ТПО имели низкую микробиологическую активность, были неоднородными по ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов. В пробах чаще других бактерий встречались Clotridium, Rhodococсus и Pseudomonas численностью от 10 до 104 КОЕ/г почвогрунта, реже обнаружены Bacillus и Erwinia (табл. 7). В половине проб были КОЕ микромицетов Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Synchyltsium (от 10 до 103 на 1 г почвогрунта). В отдельных пробах присутствовали КОЕ Aspersillus, Mucor, Phytophtora.
После проведения мероприятий по ремедиации ТПО изменилась численность углеводородокисляющего микробного сообщества. Во всех пробах были бактерии Rhodococсus, Clotridium, Bacillus, Pseudomonаs, их численность сильно колебалась (10 – 1010 КОЕ/г почвогрунта), численность КОЕ всех грибов также возросла, в том числе, редко встречаемых до ремедиации Aspersillus, Mucor, Phytophtora (табл. 7).
По-видимому, в благоприятных условиях ремедиации активно размножалась как аборигенная микробиота, так и микроорганизмы, внесенные с препаратом «Байкал ЭМ1». Благодаря углеводородокисляющим бактериям и грибам количество нефти в ТПО за месяц снизилось в среднем в 5 раз.
К анализу численности микробного сообщества ТПО до начала и спустя один месяц после начала ремедиации применили ранее описанный метод оптимизации. Для углеводородокисляющих микроорганизмов Bacillus, Rhodococсus, Clotridium, Pseudomonаs, Aspersillus, Pythium, Synchyltsium при расчете нормированных показателей в качестве экстремума использовали максимальные значения. Для родов, включающих фитопатогенные виды (Fusarium, Rhizoctonia, Erwinia, Mucor, Phytophtora), были применены минимальные (но отличные от нуля) экстремумы. Критерии оптимизации поверхностных слоев нефтезагрязненных ТПО до ремедиации колебались в пределах 0-5,5. После проведения мероприятий по ремедиации ТПО границы колебаний критериев оптимизации составили 3-12, при этом критерий ниже единиц имели 5 проб из 20 (25 %). По отдельным точкам отбора критерий оптимизации для микробного сообщества ТПО увеличился в десятки раз.
Таблица Численность микроорганизмов в ТПО нефтебазы до начала и в процессе ремедиации Pseudomonаs Rhodococсus Synchyltsium Phytophtora Rhizoctonia Aspersillus Clotridium Fusarium Pythium Bacillus Erwinia Mucor Показатель До ремедиации Количество проб 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Среднее 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Минимальное 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 значение 104 104 103 103 103 102 102 102 102 102 103 Максимальное значение В процессе ремедиации Количество проб 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 103 104 104 4 102 102 102 Среднее 10 10 10 10 Минимальное 0 10 10 0 0 0 0 0 0 0 значение 104 107 1010 108 1010 106 104 105 104 104 105 Максимальное значение ВЫВОДЫ 1. В незагрязненной агродерново-карбонатной почве сообщество углеводородокисляющих микроорганизмов представлено многочисленной ассоциацией бактерий Rhodococcus, Agrobactrium, Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter, Xanthomonas и микромицетов Penicillium, Phytoptora, Fusarium и Rhizoctonia. При нефтезагрязнении в агродерново-карбонатной почве сократилась численность бактерий и отмечена тенденция к увеличению количества КОЕ некоторых микромицетов (Rhizoctonia, Fusarium).
2. На начальном этапе ремедиации нефтезагрязненной агродерново карбонатной почвы под действием биопрепаратов ускорились процессы деструкции нефти. Применение препаратов «Альбит» и «Байкал ЭМ1» слабо повлияло на величину рН, способствовало увеличению содержания подвижных фосфатов и калия в слое почвы 0-20 см;
на их фоне нагрузка нефти снизилась на 40-50 %, количество бенз(а)пирена в 3 раза, а масса злаков повысилась в 2 раза относительно контроля.
3. Под воздействием препарата «Альбит» в нефтезагрязненной агродерново-карбонатной почве за 70 дней летнего периода отмечено снижение нагрузки нефти на 50 % при дозе 5 л/м2, на 40 % при дозе 10 л/м2 и на 55% при дозе 20 л/м2. При этом отмечен рост численности бактерий Rhodococсus, Clotridium, Pseudomonаs, Bacillus, Xanthoonas, Agrobacterim и проявилась тенденция к снижению КОЕ микромицетов Phytoptora, Fusarium, Rhizoctonia.
4. Внесение препарата «Альбит» со штаммами Phoma eupyrena и Cephaliophora tropica незначительно повлияло на деструкцию нефти по сравнению с вариантом отдельного использования препарата. В процессе ремедиации проявилась тенденция к снижению численности КОЕ родов микромицетов Phytoptora, Fusarium, Rhizoctonia.
5. В нефтезагрязненных ТПО при совместном применении биопрепаратов «Альбит», «Байкал ЭМ1» на фоне рыхления и удобрений (диаммонийфосфат) за период около одного месяца в 5 раз уменьшилась нагрузка нефти, повысилось содержание подвижных форм азота, фосфора и калия;
уровень активности инвертазы, дегидрогеназы и каталазы превысил фоновую величину, однако оставался подавленным процесс азотфиксации.
6. ТПО территории нефтебазы в слое 0-20 см характеризовались низкой численностью микроорганизмов и неоднородностью их ассоциаций.
В микробной ремедиации нефтезагрязненных ТПО принимали участие бактерии и микромицеты, у которых численность КОЕ увеличилась на несколько порядков. Через месяц с начала ремедиации состояние поверхностных слоев ТПО позволило получить всходы и сформировать покров из сеяных злаков.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ Публикации в рецензируемых изданиях:
1. Злотников А.К., Садовникова Л.К., Баландина А.В., Злотников К.М., Казаков А.В. Биопрепарат Альбит в технологии очистки почв от нефтяного загрязнения // Нефтегазовое дело. 2006. №2. С. 2-10.
2. Злотников А.К., Садовникова Л.К., Баландина А.В., Злотников К.М., Казаков А.В. Использование биопрепарата Альбит для рекультивации нефтезагрязненных почв // Вестник РАСХН. 2007. №1. С. 65–67.
3. Баландина А.В., Одегова Т.Ф., Казаков А.В., Кузнецов Д.Б.
Применение штаммовых культур грибов–сапрофитов в методике рекультивации почв, загрязненных нефтью // Фундаментальные исследования. 2013. №6. С. 668-672.
4. Одегова Т.Ф., Баландина А.В., Бурлакова К.М., Злотников К.М., Злотников А.К., Казаков А.В. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Патент №2421291. 2011. С. 21.
5. Баландина А.В., Еремченко О.З., Одегова Т.Ф., Кузнецов Д.Б.
Микробная ремедиация техногенных поверхностных образований Керженецкой нефтебазы // Фундаментальные исследования. 2013. № (часть 2). С. 328-333.
6. Баландина А.В., Еремченко О.З., Одегова Т.Ф., Кузнецов Д.Б.
Результаты исследований по ремедиации дерново-карбонатных почв // Фундаментальные исследования. 2013. №10. С. 95-99.
Иные научные публикации:
Садовникова Л.К., Баландина А.В. Восстановление 7.
нефтезагрязненных земель с использованием биотехнологических методов // Дождевые черви и плодородие почв: материалы 2-й международной научно практической конференции. Владимир, 2004. С. 232-233.
8. Злотников А.К., Садовникова Л.К., Баландина А.В., Злотников К.М., Казаков А.В. Биопрепарат Альбит в технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв // Современные проблемы загрязнения почв:
материалы 2-й международной научной конференции. М., 2007. С. 283-285.
9. Баландина А.В., Садовникова Л.К. Ремедиация нефтезагрязненных почв с помощью биопрепаратов // Современные проблемы загрязнения почв:
материалы 2-й международной научной конференции. М., 2007. С. 260-262.
10. Баландина А.В., Бурлакова Е.М., Казаков А.В. Использование биопрепаратов на нефтезагрязненных почвах // Медицина и здоровье:
материалы российской научно-практической конференции ПГФА в рамках 14-ой международной выставки. Пермь, 2008. С. 176-177.
11. Баландина А.В., Рудакова И.П., Злотников К.М., Одегова Т.Ф., Бабиян Л.К., Сыропятов Б.Я., Дранишникова О.Н. Изучение высокоактивного комплексного препарата Альбит // Медицина и здоровье:
материалы российской научно-практической конференции ПГФА в рамках 14-ой международной выставки. Пермь, 2008. С. 178-179.
12. Баландина А.В., Кузнецов Д.Б. Остаточные нефтепродукты в дерново-карбонатных почвах после рекультивации и самоочищения // Успехи современного естествознания. №7. 2013. С.95-100.