Мутационная изменчивость стх-м -лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов escherichia coli
На правах рукописи
СТЕПАНОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА МУТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ СТХ-М -ЛАКТАМАЗ И ФОРМИРОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К ЦЕФТАЗИДИМУ У КЛИНИЧЕСКИХ И ЛАБОРАТОРНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань – 2011
Работа выполнена в лаборатории антибиотикорезистентности НИИ Антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ.
Научный консультант: Кандидат биологических наук Эйдельштейн Михаил Владимирович
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Чернов Владислав Моисеевич Доктор медицинских наук, профессор Сидоренко Сергей Владимирович
Ведущая организация: Самарский государственный медицинский Университет
Защита диссертации состоится «28» апреля 2011 г. В 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул.
Кремлевская, 18, главное здание, ауд. 211.
Факс: (843) 238-76-01;
e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.
Лобачевского Казанского федерального университета
Автореферат разослан «» марта 2011г.
Ученый секретарь З.И. Абрамова диссертационного совета, доктор биологических наук Актуальность проблемы. Продукция -лактамаз является основной причиной резистентности к -лактамным антибиотикам у грамотрицательных бактерий. Плазмидно-кодируемые -лактамазы молекулярного класса А, обладающие активностью в отношении цефалоспоринов III-IV поколения и известные, как -лактамазы расширенного спектра (БЛРС), представляют собой одну из наиболее значимых групп -лактамаз. Эти ферменты являются основными детерминантами устойчивости к цефалоспоринам и монобактамам у бактерий семейства Enterobacteriaceae. В настоящее время, в России и ряде других стран Европы, Азии и Южной Америки, CTX-M -лактамазы являются доминирующей группой БЛРС (Canton, 2006).
Частота встречаемости СТХ-М -лактамаз особенно высока среди госпитальных возбудителей, что связано с повышенным потреблением современных -лактамных антибиотиков в стационарах. В отдельных лечебных учреждениях России, частота распространенности этих ферментов достигает 80-100%. В 2006-07 гг. суммарная доля CTX-M БЛРС среди нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae в различных стационарах России достигла 69,9% (Sukhorukova and et al., 2010). Стремительное распространение генов CTX-M -лактамаз связывают в основном с активностью мобильных генетических элементов (ISEcp1), которые обеспечивают их перенос на различные плазмиды энтеробактерий.
В отличие от БЛРС TEM- и SHV-типа, большинство СТХ-М проявляют значительно более высокую активность в отношении цефотаксима и цефтриаксона по сравнению с цефтазидимом. В связи с этим преимущественная устойчивость штаммов к цефотаксиму по сравнению с цефтазидимом часто рассматривается как основной диагностический признак продукции CTX-M ферментов. Кроме того, штаммы, продуцирующие CTX-M -лактамазы, часто ошибочно оцениваются как чувствительные к цефтазидиму in vitro, что приводит к необоснованному назначению цефтазидима и клинической неэффективности терапии инфекций, вызванных продуцентами CTX-M БЛРС.
Вместе с тем, в последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что продуценты СТХ-М -лактамаз могут проявлять высокую устойчивость к цефтазидиму. Изменение резистентности к цефтазидиму может быть связано, как с гиперпродукцией или мутациями самих CTX-M ферментов, так и с наличием дополнительных факторов резистентности, например, пониженной проницаемости наружной клеточной мембраны. Более того, для отдельных CTX-M ферментов была показана преимущественная активность в отношении цефтазидима, связаная с мутационной изменчивостью генов, кодирующих СТХ-М -лактамазы. В связи с этим, изучение закономерностей эволюции СТХ-М -лактамаз и роли отдельных аминокислотных позиций в изменении спектра активности этих ферментов имеет большое научное и клиническое значение.
Целью работы явилось установление механизмов формирования резистентности бактерий к цефтазидиму, связанных с мутационной изменчивостью CTX-M -лактамаз.
Основные задачи исследования:
1. Охарактеризовать новые мутантные варианты CTX-M -лактамаз расширенного спектра, определяющие высокий уровень устойчивости к цефтазидиму у клинических штаммов Escherichia coli.
2. Определить роль АК в области -петли CTX-M-3 в изменении спектра ферментативной активности и формировании резистентности к цефотаксиму и цефтазидиму у штаммов-продуцентов.
3. Выявить с использованием методов молекулярно-генетического типирования источники происхождения цефтазидим-гидролизующих CTX-M -лактамаз у клинических изолятов.
4. Определить локализацию генов цефтазидим-гидролизующих CTX-M лактамаз, их связь с мобильными генетическими элементами и возможные механизмы распространения среди нозокомиальных штаммов энтеробактерий.
5. Исследовать мутационную изменчивость CTX-M -лактамаз в экспериментах по in vitro селекции резистентности к цефтазидиму у гипермутабельных штаммов E. coli.
6. Установить взаимосвязь между копийностью генов различных CTX-M -лактамаз и уровнями устойчивости штаммов-продуцентов к различным -лактамам.
Научная новизна. Основной научный приоритет работы заключается в исследовании мутационной изменчивости СТХ-М -лактамаз и роли отдельных аминокислотных позиций в изменении спектра активности данных ферментов.
В ходе настоящей работы выявлена, охарактеризована и зарегистрирована в международной классификации новая -лактамаза расширенного спектра, СТХ М-42;
установлена ключевая роль аминокислотных позиций 167 и 136 в области омега-петли в формировании субстратной специфичности СТХ-М ферментов в отношении цефотаксима и цефтазидима;
доказана эволюция СТХ М-3 и появление СТХ-М-42 у клинических штаммов E. coli, обладающих повышенной частотой мутирования in vivo;
показана возможность селекции мутаций устойчивости к цефтазидиму в генах СТХ-М -лактамаз у гипермутабельных штаммов клинических и лабораторных штаммов E. coli in vitro;
установлены механизмы распространения новой цефтазидим гидролизующей СТХ-М -лактамазы;
впервые установлено наличие точной взаимосвязи между количеством копий гена СТХ-М -лактамаз и уровнями резистентности штаммов продуцентов к различным оксиимино--лактамам.
Практическая значимость результатов. Нуклеотидная последовательность гена blaCTX-M-42 и прилежащего участка ISEcp депонирована в GenBank под номером DQ061159 и может быть использована для сравнительного анализа генов. Результаты проведенных нами исследований по in vitro селекции цефтазидим-резистентности у гипермутабельных штаммов E. coli и по изучению взаимосвязи между количеством копий гена СТХ-М -лактамаз и уровнями резистентности штаммов продуцентов к различным оксиимино--лактамам свидетельствуют о наличии у штаммов, продуцирующих -лактамазы расширенного спектра CTX M-типа, широких возможостей формирования резистености к различным оксиимино--лактамам, связанных как с изменением субстратной специфичности, так и уровня продукции данных ферментов. Полученные данные свидетельствуют о том, что для выявления продукции БЛРС у клинических штаммов энтеробактерий в практике диагностических микробиологических лабораторий недостаточно оценки уровней МПК цефалоспоринов III-IV поколений, и, следовательно, о необходимости использования с этой целью специальных тестов (фенотипических или молекулярных).
Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ (№ гос. регистрации ВНТИЦ 01200608913).
Положения, выносимые на защиту:
1. Появление -лактамазы CTX-M-42, вызывающей преимущественную устойчивость к цефтазидиму, связано с мутационной изменчивостью CTX-M-3 у клинических штаммов E. coli.
2. Аминокислотные замены в позиции 167 (ProSer/Thr), выявленные у клинических штаммов и в экспериментах по in vitro мутагенезу, играют основную роль в формировании “цефтазидимазной” активности CTX-M ферментов.
уровень устойчивости штаммов-продуцентов CTX-M 3. Высокий лактамаз к цефтазидиму может быть связан как с наличием специфических аминокислотных замен в структуре CTX-M, так и изменением копийности blaCTX-M генов.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на 14–ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Прага, 2004 г.), 45–ой Междисциплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Вашингтон, 2005 г.), 34–ой конференции молодых ученых (Смоленск, 2006 г.), 16–ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Ница, 2006 г.), 17–ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Мюнхен, 2007 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.
Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 8 рисунков. Библиография содержи 211 наименований, в т.ч. 208 – зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинические штаммы микроорганизмов. В исследование были включены СТХ-М-продуцирующие изоляты E. coli (n=21), выделенные у пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии Областной детской клинической больницы города Иркутска в 2002-2003 гг.
Определение чувствительности клинических изолятов к антибиотикам проводили в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04, 2004) и рекомендациями Комитета по клиническим и лабораторным стандартам / Института по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS/CLSI, 2004 г.).
Фенотипическое обнаружение БЛРС. Для определения продукции БЛРС использовали фенотипические тесты, основанные на эффекте подавления активности БЛРС в отношении оксиимино--лактамов в присутствии клавулановой кислоты: метод «двойных дисков», а также определение соотношения МПК цефалоспоринов и их комбинаций с клавулановой кислотой (МУК 4.2.1890-04, 2004).
Выделение бактериальной ДНК для последующей амплификации проводили с помощью набора реактивов InstaGene Matrix (Bio-Rad, США) согласно рекомендациям производителя.
ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование генов -лактамаз. Для первичной детекции генов, кодирующих -лактамазы СТХ-М типа, использовали ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим флуоресцентным красителем SYBR Green I и праймерами, комплементарными внутренним участкам blaCTX-M генов: CTX-M-Fext, CTX-M-R1c и CTX-M(1-2) Rnest (Таб. 1). Принадлежность СТХ-М -лактамаз к одному из 4 известных генетических кластеров (СТХ-М-1, СТХ-М-2, СТХ-М-8/-25, СТХ-М-9) определяли на основании анализа температуры плавления (Tm) ПЦР продуктов.
Для амплификации полной нуклеотидной последовательности генов группы blaCTX-M-1, включая промоторную область и открытую рамку считывания, использовали праймеры ISEcp1, CTX-M-R-stop (Таб. 1).
Гены blaCTX-M, полученные в результате прямой амплификации с праймерами ISEcp1 и CTX-M-R-stop от клинических изолятов E. coli Irk2320 и Irk1224, клонировали в вектор рСС1 (Epicentre,США), в котором отсутствуют гены других -лактамаз. Клонирование ПЦР продуктов по осуществляли с использованием коммерческих наборов CopyControl PCR Cloning Kit (Epicentre,США) в соответствии с инструкциями производителя. Компетентные клетки E. coli EPI 300 (Epicentre,США) получали с помощью метода, описанного в работе (H. Inoue and et al.,1990).
Определение полной нуклеотидной последовательности генов blaCTX-M и их промоторной области проводили модифицированным методом Сенгера с использованием прибора ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). В качестве матрицы для проведения реакций секвенирования использовали ПЦР-продукты, полученные с помощью проймеров ISEcp1 и CTX-M-R-stop непосредственно от клинических изолятов E. coli Irk2320 и Irk1224 и рекомбинантные плазмиды, выделенные от трансформантов с помощью коммерческих наборов Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, США) согласно рекомендациям производителя. Реакции секвенирования проводили с использованием внутренних праймеров к генам blaCTX-M и праймеров М13F(-20), М13R(-27) (Таб. 1), а также наборов Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), содержащих флуоресцентно-меченые ддНТФ терминаторы.
Таблица 1.
Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе.
Название Последовательность, 5’-3’ Мишень Назначение СТХ-М-Fext TTTGCGATGTGCAGCACCAGTAA Внутренние Выявление и участки дифференциация blaCTX-M blaCTX-M генов СТХ-М-R1с CCGCTGCCGGTCTTATC различных генетических групп CTX-M(1-2)-RNest TGATCTCAACGCGCTGATTTA CTX-M-R-stop TGTCTGGTATAATAAGAATATCATC 5’ конец ПЦР blaCTX-M амплификация blaCTX-M и ISEcp1 TGTCTGGTATAATAAGAATATCATC 5’ конец промотора ISEcp СТХ-М-R1 CACCGCTGCCGGTTTTATC Внутреннй Определение участок ориентации и blaCTX-M нуклеотидной вектор рСС1 последователь М13F(-20): GTAAAACGACGGCCAGTG ности blaCTX-M в М13R(-27): GGAAACAGCTATGACCATG вектор рСС1 векторе ERIC1 GTGAATCCCCAGGAGCTTACAT - ПЦР-типирование изолятов E. coli с AP7 GTGGATGCGA - произвольными праймерами OPA4 AATCGGGCTG M13 GAGGGTGGCGGTTCT Синтез олигонуклеотидов осуществлен ЗАО «Синтол» (Россия).
Перенос детерминант резистентности с помощью конъюгации.
Перенос CTX-M-кодирующих природных плазмид от донорных штаммов E.
coli Irk1224, Irk2320 и Irk2322 в реципиентный штамм E. coli AB1456 (F-, RifR)проводили с помощью конъюгации в жидкой среде (бульон Мюллера Хинтон), используя начальное соотношение суточных культур донора и раципиента 1:2. Эффективность конъюгации рассчитывали как отношение количества колоний трансконъюгантов на чашках с рифампицином и цефотаксимом к количеству колоний реципиента на чашках с рифампицином.
Параллельно проводили высев на селективные среды донорных культур для оценки частоты спонтанных мутаций устойчивости к рифампицину и в качестве отрицательного контроля конъюгации.
Изоэлектрическое фокусирование -лактамаз. Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) -лактамаз проводили в готовых полиакриламидных гелях, содержащих амфолиты Phast Gel, pH 3-9 (Amersham Biosciences;
Piscataway, США), при помощи прибора Phastsystem (Amersham Biosciences;
Piscataway, США) согласно рекомендациям производителя.
Типирование клинических штаммов с помощью ПЦР с произвольными праймерами (AP-PCR) проводили с использованием четырех праймеров ERIC1, AP7, OPA4 и M13 (Таб. 1). Кластерный анализ ПЦР профилей был выполнен при помощи компьютерной программы GelCompar версия 4.1 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгия) с использованием коэффициента корреляции Пирсона и UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) алгоритма.
Типирование клинических штаммов с помощью пульс электрофореза (PFGE) макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК проводили с использованием наборов для выделения геномной GenePath Group 6 Reagent Kit и прибора CHEF Mapper XA System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, США) согласно стандартному протоколу описанному в работе (Gautom, 1997). Геномную ДНК подвергали рестрикции при помощи эндонуклеазы XbaI (Promega, США).
Анализ природных плазмид, несущих гены blaCTX-M. Выделение бактериальных плазмид у штаммов E. coli Irk1224, Irk2320, Irk2322 и их трансконъюгантов проводили с использованием коммерческой системы QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Германия) согласно рекомендациям производителя. Плазмиды, выделенные от трансконъюгантов, подвергали сравнительному рестрикционному анализу. Сто тридцать нанограмм плазмидной ДНК расщепляли эндонуклеазой PvuII (16 ед.;
Amersham Biosciences, США). Нативные плазмиды и их рестрикционные фрагменты разделяли с помощью электровфореза в 1% агарозном геле. ПЦР-типирование репликонов у трансконъюгантов, полученных от клинических изолятов E. coli Irk1224, Irk2320 и Irk2322, осуществляли согласно протоколу описанному в работе (Carattoli and et al., 2005) Определение частоты формирования спонтанных мутантов, устойчивых к рифампицину. Уровень спонтанных мутаций рассчитывали как соотношение количества колоний, выросших на чашках с рифампицином, к количеству колоний, выросших на чашках без антибиотика. Штаммы рассматривали как гипермутабельные (сильные мутаторы) при частоте мутантов 5х10-7 и как слабые мутаторы при соответствующей частоте от 5х10 - до 5х10-7 (Galan and et all., 2004).
In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов, продуцирующих CTX-M -лактамазы. В экспериментах по in vitro селкции устойчивости к цефтазидиму использовали клинический изолят Е. coli Irk и лабораторный штамм-мутатор E. coli GM2995, экспрессирующие -лактамазу CTX-M-3. Ген blaCTX-M-3 с естественным промотором был перенесен от штамма Irk1224 в GM2995 в составе вектора рСС1. Штаммы Е. coli Irk1224 и GM (рСС1-1224) субкультивировали в бульоне Мюллера-Хинтон в течение 14- часов при 37°C и затем высевали на селективный агар Мюллера-Хинтон, содержащий цефтазидим в концентрациях в два раза превышающих значения МПК данных штаммов (64 мг/л для Irk1224 и 2 мг/л для GM2995 (рСС1-1224)).
Тридцать две мутантные колонии каждого штамма, выросшие на селективной среде, были отобраны случайным образом для дальнейшего определения чувствительности к -лактамным антибиотикам (ампициллину, цефтазидиму и цефотаксиму) и для определения нуклеотидной последовательности blaCTX-M генов. Во избежание накопления мутаций и для определения влияния мутаций, как связанных, так и несвязанных с -лактамазной активностью на резистентность мутантных штаммов к -лактамным антибиотикам, blaCTX-M гены повторно амплифицировали от всех отобранных клонов и клонировали в составе рСС1 вектора в лабораторный штамм E. coli EPI300. Параллельно проводили секвенирование blaCTX-M генов и их промоторных регионов и определяли МПК ампициллина, цефтазидима и цефотаксима для штаммов мутаторов и штаммов E. coli EPI300, несущих blaCTX-M гены отобранных клонов.
Определение копийности плазмид, несущих гены blaCTX-M. Количество копий плазмид, несущих гены blaCTX-M, определяли при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени с SYBR Green I и праймерами CTX-M-Fext и CTX-M-R1c (Таб. 1). Определение проводили в двух повторах для каждлго анализируемого образца. Для количественной ПЦР использовали ДНК, выделенную их бактериальной культуры, выращенной в течение 18 часов в LB бульоне, Параллельно определяли количество бактериальных клеток путем приготовления последовательных 10-кратных разведений каждой культуры и высева их на чашки с добавлением хлорамфенникола (12,5 мг/л). Количество копий плазмиды, рассчитанное по данным количественной ПЦР в реальном времени, соотносили с числом бактериальньных клеток для определения числа копий плазмиды на клетку.
Оценку копийности рекомбинантых плазмид на основе вектора pCC проводили после культивирования штаммов E. coli EPI 300 в хлорамфеникол содержащем LB бульоне с добавлением и без добавления 0,02% L-арабинозы, которая является индуктором «множественной копийности» pCC1 в клетках EPI 300 за счет активации инициации репликации вектора в oriV (Wild and et al, 2002).
В качестве калибровочных стандартов для количественной ПЦР использовали 10-и кратные разведения культуры E. coli EPI 300 (pCC1-1224), выращенной в LB бульоне с добавлением хлорамфенникола, но без добавления арабинозы. Данные условия культивирования обеспечивают однокопийное состояние вектора pCC1 в клетке за счет инициации репликации в oriF (190).
Таким образом, число копий вектора в калибровочных стандартах было рассчитано по количеству бактериальных клеток.
Параллельно с оценкой числа копий плазмид pCC1, несущих гены различных CTX-M -лактамаз, проводили определение чувствительности рекомбинантных штаммов E. coli EPI 300 к ампициллину, цефтазидиму, цефотаксиму, цефепиму и азтреонаму. МПК антибиотиков определяли методом микроразведений в бульоне. Процедура тестирования соответствовала рекомендациями CLSI (47), за исключением замены бульона Мюллера-Хинтон, содержащего сахара, препятствующие активации репликации pCC1 в oriV, на бульон LB с добавлением и без добавления 0,02% L-арабинозы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация клинических изолятов, продуцирующих цефтазидим-гидролизующие -лактамазы СТХ-М-типа. Анализ клинических штаммов энтеробактерий, продуцирующих БЛРС CTX-M-типа, выделенных в рамках многоцентрового микробиологического исследования в 2002-2004 гг. позволил выявить два изолята E. coli, обладающих необычным фенотипом резистентности к оксииминоцефалоспоринам, а именно, более высокой устойчивостью к цефтазидиму (МПК128 мг/л), по сравнению с цефотаксимом (МПК 8 мг/л) (Таб. 2). Оба клинических изолята были выделены в отделении реанимации и интенсивной терапии с разницей 10 дней.
ПЦР в реальном времени с праймерами к внутренним участкам blaCTX-M выявила наличие у обоих изолятов генов, кодирующих -лактамазы CTX-M- группы.
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) экстрактов периплазматических белков позволило обнаружить у штаммов E. coli Irk2320 и Irk2322 экспрессию -лактамаз с изоэлектрическими точками (pI) 5,4 и 8,4, которые предположительно соответствовали ферментам TEM- и СТХ-М-типа. Фермент с изоэлектической точкой 5,4 был идентифицирован, как пенициллиназа TEM- в соответствии с результатами амплификации и определения нуклеотидной последовательности гена blaTEM. Продукция, TEM-1, таким образом, не влияла на профиль устойчивости исследуемых штаммов к оксииминоцефалоспоринам.
В экспериментах по конъюгации была установлена возможность переноса детерминант устойчивости к цефтазидиму от донорных штаммов E. coli Irk и Irk2322 к реципиенту E. coli АB1456 (F-, RifR) с высокой частотой (7 х 10-3).
Трансконъюганты (АВ1456-2320), полученные от штамма Irk2320, проявляли фенотип резистентности к -лактамным антибиотикам аналогичный фенотипу резистентности исходного клинического штамма, подтверждая тем самым наличие у выявленной CTX-M -лактамазы необычного спектра гидролитической активности (Таб. 2).
Таблица 2.
Чувствительность к -лактамным антибиотикам клинических штаммов E. coli Irk2320, Irk2322 и трансконъюгантов E. coli АB1456- МПК, мг/л* Штамм АМР АМС СТХ СТX-C СAZ СAZ-C CTR FEP E. coli Irk2320 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 E. coli Irk2322 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 E. coli AВ1456- 256 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 *AMP-ампициллин, AMC-амоксициллин-клавулановая кислота, СТХ-цефотаксим, СТХ-С цефотаксим-клавулановая кислота, CAZ-цефтазидим, CAZ-С-цефтазидим-клавулановая кислота, CTR-цефтриаксон, FEP-цефепим.
С помощью ПЦР и ИЭФ, у трансконъюгантов было выявлено наличие единственной -лактамазы СТХ-М типа с изоэлектрической точкой 8,4, на основании чего был сделан вывод о том, что необычный профиль резистентности исследуемых клинических изолятов связан с продукцией CTX M фермента с повышенной гидролитической активностью в отношении цефтазидима.
Прямое секвенирование генов blaCTX-M E. coli Irk2320 и Irk2322, амплифицированных с помощью ПЦР, показало наличие у обоих изолятов идентичной мутации, соответствующей аминокислотной замене Pro167Thr (нумерация аминокислотных остатков по R. Ambler (Ambler, 1993)), по сравнению с известной последовательностью -лактамазы СТХ-М-3 (GenBank Acc. No. AF550415) (Рис. 1). ПЦР картирование с праймерами ISEcp1 и СТХ-М R1 выявило характерную для blaCTX-M-3 и родственных генов ассоциацию с инсерционным элементом ISEcp1, расположенным на расстоянии 126 пн выше открытой рамки считывания (ORF) blaCTX-M.
Ранее замена Pro167Thr была описана у СТХ-М-23 -лактамазы, предшественником которой является СТХ-М-1 фермент (Sturenburg and et al., 2004).
Выявленной в ходе данного исследования СТХ-М -лактамазе, отличающейся от широко распространенного варианта СТХ-М-3 наличием остатка Pro167 и повышенной активностью в отношении цефтазидима, присвоено международное номенклатурное название СТХ-М- (http://www.lahey.org/studies/). Нуклеотидная последовательность гена blaCTX-M-42 и прилежащего участка ISEcp1 депонирована в GenBank под номером DQ061159.
CTX-M- (167-Pro) GenBank #AF E. coli (167-Thr) Рис. 1. Хроматограмма, показывающая нуклеотидную замену в позиции (нумерация по Амберу) в blaCTX-M гене Выявление источников происхождения цефтазидим-гидролизующих СТХ-М -лактамаз. Учитывая широкое распространение СТХ-М-3 -лактамаз у нозокомиальных штаммов энтеробактерий в России (Edelstein and et al., 2003) нами была предпринята попытка обнаружения возможного штамма предшественника изолятов E. coli Irk2320 и Irk2322, продуцирующего исходный вариант -лактамазы CTX-M-3, с низким уровнем устойчивости к цефтазидиму. С этой целью была исследована генетическая родственность между E. coli Irk2320, Irk2322 и 19 CTX-M-продуцирующими изолятами E. coli, проявляющими классический фенотип преимущественной резистености к цефотаксиму, выделенными в течение восьми месяцев ранее в том же отделении, что и штаммы, экспрессирующие CTX-M-42.
Выбранные клинические изоляты были типированы методом ПЦР амплификации произвольных последовательностей (AP-PCR) с 4 различными праймерами: ERIC1, AP7, OPA4 и M13. Кластерный анализ суммарных AP-PCR профилей позволил определить единственный изолят, Irk1224, как наиболее родственный Irk2320 и Irk2322 (Рис. 2). Профиль амплификационных фрагментов E. coli Irk1224, полученный при использовании праймера ERIC1, отличался от аналогичных профилей E. coli Irk2320 и Irk2322 только двумя ПЦР-фрагментами. В то же время, AP-PCR профили, полученные с тремя другими праймерами (АР7, ОРА4 и М13) были полностью идентичны у всех трех изолятов. Прочие исследованные штаммы отличались от Irk2320 и Irk по результатам AP-PCR типрования со всеми праймерами. На рисунке 3A суммарные AP-PCR профили изолятов E. coli Irk2320, Irk2322, Irk1224 и Irk (неродственный штамм) представлены для сравнения.
20 40 60 80 100 % ERIC1 AP7 OPA4 M Рис. 2. Кластерный анализ (UPGMA) ПЦР профилей клинических штаммов E. Coli Для дополнительного подтверждения генетической родственности клинических изолятов E. coli Irk1224, Irk2320 и Irk2322 был использован метод пульс-электрофореза (PFGE) XbaI макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК. Результаты PFGE анализа представлены на рисунке 3B.
Макрорестрикционные профили ДНК E. coli Irk2320 и Irk2322 были полностью идентичны. PFGE профиль Irk1224 отличался от них четырьмя фрагментами.
Тем не менее, PFGE профили всех трех изолятов характеризовались наличием 16 общих фрагментов ДНК и, следовательно, проявляли выраженное сходство, свидетельствующее о родственности изолятов.
M1 1 2 3 4 M 1 2 3 4 Праймеры ERIC 565 533, 450 436, AP7 365 339, 242, nm 145, OPA 48, nm M A B Рис. 3. AP-PCR (A) и PFGE (B) профили CTX-M-продуцирующих изолятов E. coli.
1 – Irk1737 (контрольный неродственный изолят);
2 - Irk1224;
3 - Irk2320;
4 - Irk2322;
M1 и М2 - маркеры молекулярной массы (М1 - S. cerevisiae, M2 - Lambda PFGE Standard).
Таким образом, результаты молекулярно-генетического типирования позволили установить клональность изолятов E. coli Irk2320, Irk2322 и охарактеризовать штамм Irk1224, как их наиболее вероятный предшественник.
Электрофоретический анализ плазмид, выделенных от E. coli Irk1224, Irk2320, Irk2322 и их трансконъюгантов, проявляющих устойчивость к оксиимино цефалоспоринам, обнаружил присутствие у них общей CTX-M кодирующей плазмиды с молекулярной массой ~250 тпн. У штамма E. coli Irk1224 была вывлена дополнительная плазмида с молекулярной массой ~150 тпн., которая отсутствовала у его трансконъюгантов (E. coli AB1456 Irk1224), устойчивых к оксиимино цефалоспоринам. CTX-M-кодирующие плазмиды, выделенные от трансконъюгантов E. coli AB1456-Irk1224, AB1456 Irk2320 и AB1456-Irk2322 были подвергнуты рестрикционному анализу с использованием эндонуклеазы PvuII, который выявил их идентичность (Рис. 4).
M1 1 2 nm Рис. 4. PvuII-рестрикционные профили плазмид, несущих гены blaCTX-M.
1 – E. coli AB1456-Irk1224;
2 - E. coli AB1456-Irk2320;
3 - E. coli AB1456-Irk2322;
M1- маркер молекулярной массы (смесь рестрикционных фрагментов BstEII и pUC18 HaeIII) ПЦР-типирование репликонов позволило отнести СТХ-М-кодирующие плазмиды всех трех исследованных изолятов E. coli к группе IncL/M.
ПЦР с праймерами ISEcp1 и CTX-M-R-stop выявила одинаковый характер ассоциации генов blaCTX-M с ISEcp1 в составе IncL/M плазмид у E. coli Irk1224, Irk2320 и Irk2322. ПЦР-фрагмент с ожидаемой молекулярной массой (1225 пн), был получен от всех трех изолятов. Ассоциация blaCTX-M гена с ISEcp последовательностью говорит о возможной мобильности данного гена. ISEcp или ISEcp1-подобные инсерционные элементы неоднократно были обнаружены на расстоянии 42-266 пн и выше открытых рамкок считывания (ОРС), кодирующих CTX-M ферменты, принадлежащих к СТХ-М-1, СТХ-М-2 и СТХ М-9 кластерам (Bonnet, 2004).
Однако, в соответствии с фенотипами резистентности изолятов, прямое секвенирование данного ПЦР фрагмента показало наличие гена blaCTX-M-3 у штамма Irk1224, в отличие от Irk2320 и Irk2322, несущих мутантный вариант blaCTX-M-42 с описанной выше однонуклеотидной заменой в кодоне 167. Отличий в нуклеотидных последовательностях промоторной области blaCTX-M-3 и blaCTX-M 42 обнаружено не было.
Выявление фенотипа гипермутабельности у клинических штаммов E. coli, продуцирующих CTX-M-3 и CTX-M-42 показало, что изоляты E. coli Irk1224, Irk2320 и Irk2322 проявляют повышенную частоту формирования спонтанных мутантов, устойчивых к рифампицину, (1 х 10 -5) по сравнению со штаммами, обладающими нормальной частотой мутирования (5 х 10 -8) (Galan, 2004).
Исследованные изоляты были охарактеризованы, таким образом, как сильные мутаторы. Полученные от штаммов E. coli Irk1224 и Irk амплификационные фрагменты, содержащие гены blaCTX-M-3 и blaCTX-M-42 с естественным промотором, были клонированы в вектор рСС1. В результации трансформации лабораторного штамма E. coli EPI 300 соответствующими рекомбинантными плазмидами (pСС1-1224 и pCC1-2320) были получены полностью изогенные штаммы, экспрессирующие -лактамазы CTX-M-3 и CTX-M-42, отличающиеся единственной аминокислотной заменой – Pro167Thr. Результаты сравнения фенотипов резистентности клинических и лабораторных штаммов, продуцирующих ферменты CTX-M-3 и CTX-M-42, представлены в таблице. 3.
Таблица 3.
Чувствительность клинических и лабораторных штаммов E. coli, продуцирующих CTX-M-3 и CTX-M-42 к -лактамным антибиотикам и их комбинациям с ингибиторами.
МПК, мг/л -лактамаза Штамм AMP AMС CTX CTX-C CAZ CAZ-C CTR FEP 256 256 E. coli Irk1224 CTX-M-3 32/16 2/4 32 4/4 E. coli Irk2320 CTX-M-42 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 E. coli 2322 CTX-M-42 16/8 8 0,125/4 128 2/4 8 E. coli EPI CTX-M-3 8/4 4 0,06/4 0.5 0,25/4 4 0, pCC1- E. coli EPI CTX-M-42 8/4 0.5 0,06/4 32 1/4 1 0, pCC1- E. coli EPI нет 2 2/1 0.06 0,06/4 0,25 0,25/4 0,06 0, pCC AMP-ампициллин, AMC-амоксициллин-клавулановая кислота, СТХ- цефотаксим, СТХ-С цефотаксим-клавулановая кислота, CAZ-цефтазидим, CAZ-С-цефтазидим-клавулановая кислота, CTR-цефтриаксон, FEP-цефепим.
Штамм E. coli EPI 300, несущий вектор pCC1 без вставки, использован в качестве контроля.
Лабораторные штаммы E. coli EPI300, несущие гены blaCTX-M-3 и blaCTX-M-42, проявляли фенотипы устойчивости, сходные с таковоми клинических изолятов E. coli Irk1224 и Irk2320 (Таб. 3). Экспрессия CTX-M-42 (по сравнению с CTX M-3) у E. coli EPI300 приводила к повышению МПК цефтазидима в 64 раза и одновременному снижению МПК цефотаксима в 8 раз, цефтриаксона – в 4 раза и цефепима – в 2 раза, что однозначно доказывает роль замены Pro167Thr в переключении спектра активности CTX-М ферментов.
In vitro селекция мутаций устойчивости к цефтазидиму у штаммов продуцентов CTX-M-3. Предствленные выше данные позволили предположить наличие вероятной взаимосвязи между терапией цефтазидимом и in vivo селекцией мутации Pro167Thr в CTX-M-3 у клинического гипермутабельного штамма E. coli. Для проверки данной гипотезы нами была предпринята попытка воспроизвести эволюцию CTX-M-3 в эксперименте по in vitro селекции мутаций устойчивости к цефтазидиму у гипермутабельных штаммов E. coli.
В качестве исходных штаммов были использованы клинический изолят E. coli Irk1224 и лабораторный штамм-мутатор E. coli GM2995 (mutD5), трансформированный плазмидой pCC1-1224, несущей ген blaCTX-M-3. При культивировании данных штаммов на среде с добавлением цефтазидима в концентрации, превышающей МПК каждого штамма в два раза, цефтазидим резистентные мутанты были получены с частотой 2 х 10 -8 и 2 х 10-6, соответственно, от Irk1224 и GM2995 (рСС1-1224).
В результате эксперимента случайным образом было отобрано тридцать две мутантные колонии каждого штамма, выросшие на селективной среде.
Во избежание накопления дополнительных мутаций в процессе субкультивирования штаммов-мутаторов, гены СТХ-М -лактамаз были повторно амплифицированы у выбранных цефтазидим-резистентных мутантов и клонированы в составe вектора рСС1 в лабораторный штамм E. coli EPI300. У всех трансформантов была определена нуклеотидная последовательность blaСТХ-М генов и их промоторов, а также определены значения МПК ампициллина, цефтазидима и цефотаксима (Таб. 5).
Таблица 4.
Чувствительность исходных штаммов-мутаторов и полученных от них цефтазидим-резистентных мутантов.
МПК, мг/л -лактамаза Исходные штаммы и N мутанты (мутация) AMP CAZ CTX 256 Irk1224 CTX-M-3 (дикий тип) 256 256 Мутанты Irk1224 1-го типа CTX-M-3 (дикий тип) 256 Мутанты Irk1224 2-го типа CTX-M-3 (Ser167) 1 256 Мутанты Irk1224 3-го типа CTX-M-3 (Lys136) 1 GM2995 (pCC1-1224) CTX-M-3 (дикий тип) 1 256 Мутанты GM2995 1-го типа CTX-M-3 (дикий тип) 24 Мутанты GM2995 2-го типа CTX-M-3 (Ser167) 8 128 32 Количество отобранных мутантов каждого типа.
AMP – ампициллин, CAZ – цефтазидим, CTX – цефотаксим.
Таблица 5.
Чувствительность рекомбинантных клонов E. coli EPI300, несущих гены blaCTX-M исходных штаммов-мутаторов и полученных от них цефтазидим резистентных мутантов.
МПК, мг/л -лактамаза Источник гена blaCTX-M N (мутация) AMP CAZ CTX Irk1224 CTX-M-3 (дикий тип) 1 Мутанты Irk1224 1-го типа CTX-M-3 (дикий тип) 30 1 Мутанты Irk1224 2-го типа CTX-M-3 (Ser167) 1 128 16 Мутанты Irk1224 3-го типа CTX-M-3 (Lys136) 1 32 8 GM2995 (pCC1-1224) CTX-M-3 (WT) 1 Мутанты GM2995 1-го типа CTX-M-3 (WT) 24 1 Мутанты GM2995 2-го типа CTX-M-3 (Ser167) 8 128 16 Количество отобранных мутантов каждого типа.
AMP – ампициллин, CAZ – цефтазидим, CTX – цефотаксим.
Анализ полученных мутантов позволил разделить их на несколько типов (Таб. 4, 5). Большинство мутантов, резистентных к цефтазидиму (мутанты 1-го типа), имели одинаково высокие значения МПК цефотаксима и цефтазидима (256 мг/л). Экспрессия blaCTX-M генов этих мутантов в лабораторном штамме E. coli EPI300 приводила к формированию фенотипа устойчивости, идентичного таковому для исходного гена blaCTX-M-3. Секвенирование подтвердило отсутствие мутаций в структурной части и промоторе blaCTX-M генов, полученных от мутантов 1-го типа. Следовательно, повышенная устойчивость к цефтазидиму у матантов данного типа была связана с изменениями хромосомных генов Irk1224 и GM2995 (pCC1-1224), наиболее вероятно, определяющими снижение проницаемости наружной мембраны или увеличение продукции видоспецифической цефалоспориназы (AmpC).
Известно, что такие мутации широко распространены у клинических штаммов энтеробактерий, продуцирующих БЛРС (Livermore D.M., 1987;
Livermore D.M., 2005;
Martinez-Martinez and et all, 1999;
Martinez-Martinez and et all, 2000).
Аналогичные мутации были выявлены также исследовательской группой D.
Livermore и N. Woodford в экспериментах по in vitro селекции расширенного спектра активности у ТЕМ и CTX-M ферментов с использованием MutS штаммов E. coli (Ellington and et all, 2006;
Karisik and et all, 2006).
Мутанты другой группы (мутанты 2-го типа) характеризовались наличием более высоких значений МПК цефтазидима по сравнению с цефотаксимом (Таб. 4). У всех представителей этой группы в последовательности гена blaCTX-M была выявлена идентичная мутация, соответсвующая аминокислотной замене Pro167 Ser. Как было сказано выше, данная мутация встречается у CTX-M-52, которая принадлежит к группе CTX M-1-родственных -лактамаз, а также у отдельных ферментов, относящихся к кластерам СТХ-М-2 и СТХ-М-9, например, СТХ-М-35 и СТХ-М-19 (Poirel and et all, 2001) Интересно отметить, что эксперименты K. Welsh и соавт. по in vitro мутагенезу СТХ-М-2 (Welsh and et all, 2005) и E. Karisik и соавт. по селекции устойчивости к цефтазидиму в СТХ-М-3 (Karisik and et all, 2006), проведенные одновременно с нашим исследованием, также привели к идентификации единственной значимой аминокислотной замены Pro167 Ser. В то же время, у «природных» СТХ-М цефтазидимаз, были обнаружены и другие аминокислотные замены в позиции 167, например, Thr у СТХ-М-23 и СТХ-М 42 (описанной в данной работе) и Gln у СТХ-М-54. Причина невыявления мутаций Pro167 и Gln167 у CTX-M-производных, полученных in vitro, остается неясной. Возможно, что транзиция СА, приводящая к замене Pro 167Ser является более вероятной мутациeй (по сравнению с другими заменами нуклеотидов в кодоне 167) у лабораторных штаммов-мутаторов, включая MutD5 штамм, использованный в нашей работе и MutS штаммы, задействованные в других исследованиях (Karisik and et all, 2006;
Philippon, Arlet, and Jacoby, 2002.). В промоторе blaCTX-M генов, полученных от мутантов 2 го типа, мутаций обнаружено не было. Лабораторные штаммы E. coli EPI300, продуцирующие мутантный вариант -лактамазы CTX-M-3 (Ser167), также проявляли фенотип преимущественной резистентности к цефтазидиму и пониженной (относительно CTX-M-3) устойчивости к ампициллину и цефотаксиму, что однозначно подверждает ключевую роль мутаций в позиции 167 в изменении спектра активности CTX-M ферментов.
У единственного мутанта (мутант 3-го типа), полученного от штамма E.
coli Irk1224, в последовательности blaCTX-M была обнаружена ранее неизвестная мутация T417G, соответствующая аминокислотной замене Asn136Lys в области A4 спирали. Других изменений в промоторной области и структурной части гена blaCTX-M у данного мутанта выявлено не было.
Продукция мутантной -лактамазы CTX-M-3 (Lys136), по сравнению с исходным ферментом, приводила к повышению МПК цефтазидима и одновременному снижению уровня резистентности к цефотаксиму и, особенно, к ампициллину (Таб. 5). Остаток Asn136, находящийся в A4 спирали, непосредственно взаимодействует с остатком Thr165 петли и является консервативным у всех CTX-M -лактамаз (Chen and et all., 2005). Замена Asn136Lys, по всей вероятности, нарушает данное взаимодействие, что, в свою очередь, приводит к увеличению подвижности петли и расширению активного центра. Известно, что увеличение активного центра повышает эффективность связывания и расщепления цефтазидима CTX-M ферментами. С другой стороны, подобное изменение структуры должно приводить к снижению общей стабильности и активности фермента, что подтверждается результатами оценки чувствительности к ампициллину изогенных штаммов E. oli EPI300, продуцирующих исходный фермент (CTX-M-3) и его мутантный вариант Lys136. Возможно также, что низкая активность CTX-M- (Asn136Lys) в отношении ампициллина объясняет тот факт, что до настоящего времени данная мутация не была обнаружена у клинических штаммов.
Следует также отметить, что в экспериментах по in vitro селекции устойчивости к цефтазидиму нами не были обнаружены мутанты CTX-M-3 с заменой Asp240Gly, которая характерна для наиболее широко распространенной у клинических штаммов -лактамазы CTX-M-15 и некоторых других «природных» CTX-M -лактамаз. Возможно это связано с тем, что замена Asp240Gly обеспечивает менее выраженное повышение активности в отношении цефтазидима по сравнению с мутациями в позиции 167.
Влияние копийности плазмид, несущих гены СТХ-М -лактамаз, на уровени резистентности к -лактамным антибиотикам. Система CopyControl (Epicentre Biotechnologies), состоящая из вектора pCC1, имеющего две области инициации репликации: ori F-фактора (oriF) и oriV, и лабораторного штамма E coli EPI300, несущего рекомбинантный ген активатора oriV (trfA) под контролем строгого арабинозного промотора, позволяет изменять копийность вектора в зависимости от условий культивирования (Welsh and et all., 2005). В стандартных условиях инициация репликации pCC1 происходит в oriF, что позволяет поддерживать вектор в однокопийном состоянии. При культивировании E coli EPI300 на среде с добавлением L-арабинозы происходит переключение инициации репликации в oriV, приводящее к резкому увеличению копийности вектора.
Использование системы CopyControl в данной работе позволило исследовать влияние копийности генов blaCTX-M-3 и blaCTX-M-42, экспрессируемых в изогенных штаммах E coli EPI300, на уровни их устойчивости к -лактамным антибиотикам.
По данным количественной ПЦР в режиме реального времени, индукция арабинозой приводила к увеличению копийности плазмид pCC1, несущих гены blaCTX-M, и контрольного вектора pCC1 (без вставки blaCTX-M) примерно в 10 раз (от 1 до 10±1.1 копий на клетку).
В отсутсвии арабинозы экспрессия одной копии гена blaCTX-M-3 в клетках E coli EPI300 обеспечивала резистентность высокого уровня к ампициллину (МПК 512 мг/л) и цефотаксиму (МПК 16 мг/л) и несколько пониженную чувствительность к цефтазидиму (МПК 1 мг/л) по сравнению с контрольным штаммом, не продуцирующим -лактамазу (МПК 0,5 мг/л). Аналогичным образом, экспрессия гена blaCTX-M-42, находящегося в однокопийном состоянии, создавала высокий уровень устойчивости к ампициллину (МПК 256 мг/л) и цефтазидиму (МПК 32 мг.л), но низкие уровни резистентности к цефотаксиму (МПК 1 мг/л) и цефепиму (МПК 0,5 мг/л) (Таб. 6).
Таблица 6.
Чувствительность рекомбинантных штаммов E. coli EPI300 к -лактамам при различной копийности плазмид рСС1, несущих гены blaCTX-M.
Кол-во. копий МПК, мл/л Плазмида -лактамаза плазмиды на AMP CTX CAZ FEP AZT клетку pCC1-1224 CTX-M-3 1 512 16 1 1 10 256 4 4 pCC1-2320 CTX-M-42 1 256 1 32 0.5 10 4 128 1 pCC1 - 1 2 0,25 0,5 0,125 0, (без вставки) 10 2 0,25 0,5 0,125 0, АМР – ампициллин, СТХ – цефотаксим, CAZ – цефтазидим, FEP – цефепим, AZT – азтреонам.
Дясятикратное увеличение копийности плазмид, кодирующих CTX-M-3 и CTX-M-42, (в результате индукции арабинозой) сопровождалось параллельным повышением МПК всех оксиимино--лактамов в 2-16 раз. Наиболее значительное повышение МПК было отмечено для антибиотиков, которые являются предпочтительными субстратами соответствующих -лактамаз.
Например, увеличение копийности гена, кодирующего CTX-М-3, приводило к повышению МПК цефотаксима в 16 раз. Вместе с тем, МПК цефалоспоринов, которые являются «слабыми субстратами» для CTX-М-3 (цефтазидим) и для CTX-M-42 (цефотаксим), также возрастали существенно (в 4 раза), достигая пограничного или клинически-значимого уровня резистентности (в соответсвии с категориями оценки чувствительности CLSI и EUCAST).
Наличие арабинозы и увеличение числа копий вектора pCC1 без вставки blaCTX-M не влияло на устойчивость контрольного штамма E. coli EPI300 к -лактамам (Таб. 6).
Таким образом, представленные выше данные демонстрируют наличие четкой корреляции между числом копий генов СТХ-М БЛРС в бактериальных клетках и уровнями их устойчивости к оксиимино--лактамам.
ВЫВОДЫ 1. Выявлен, охарактеризован и представлен в международной классификации новый мутантный вариант CTX-M -лактамазы расширенного спектра, CTX-M-42, определяющий высокий уровень устойчивости к цефтазидиму у клинических штаммов E. coli.
Аминокислотные замены в позициях 167 (ProSer/Thr) и 136 (AspLys) 2.
играют ключевую роль в изменении спектра ферментативной активности CTX-M-3 и формировании резистентности к цефтазидиму у штаммов продуцентов.
Приобретение мутации Pro167Thr в СТХ-М-3 и появление СТХ-М- 3.
in vivo подтверждается обнаружением клонально и эпидемиологически родственных штаммов, продуцирующих СТХ-М-3 и СТХ-М-42 ферменты и обладающих фенотипом гипермутабельности. Возникновение данной мутации в гипермутабельных штаммах E. coli связано с селекцией при использовании цефтазидима.
Установлено, что ген CTX-M-42 ассоциирован с инсерционным 4.
элементом ISEcp1, находится в составе IncL/M плазмиды и может передаваться с высокой эффективностью при конъюгации.
Данные in vitro селекции цефтазидим-резистентности у клинических и 5.
лабораторных гипермутабельных штаммов E. coli подтверждают роль амнокислотных замен в позиции 167 в формировании резистентности к цефтазидиму.
В модельных экспериментах с изогенными лабораторными штаммами 6.
установлена положительная корреляция между числом копий генов CTX M -лактамаз и уровнями устойчивости штаммов к оксиимино- лактамам.
Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Шевченко, О.В. Металло--лактамазы: значение и методы выявления у грамотрицательных неферментирующих бактерий / О.В.Шевченко, Эйдельштейн М.В., М.Н. Степанова / Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2007. - Т. 9. - №3. - С. 211-218.
2. Stepanova, M.N. Convergent in vivo and in vitro selection of ceftazidime resistance mutations at position 167 of CTX-M-3 -lactamase in hypermutable Escherichia coli strains. / M.N. Stepanova, M. Pimkin, A.A. Nikulin, V.K.
Kozyreva, E.D. Agapova, M.V. Edelstein / Antimicrob Agents Chemother. 2008. – V. 52. - №4. – P. 1297-1301.
Другие публикации по теме диссертации:
1. Степанова, М.Н. Мутационная изменчивость CTX-M -лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli. / М.Н. Степанова / 34-ая конференция молодых ученых и 54-ая научная студенческая конференция. - Смоленск, 2007. - С. 50-51.
Pimkin, M. High frequency of association between CTX-M--lactamase-coding 2.
genes and the ISEcp1 insertion element. / M. Pimkin, I. Palagin, M. Stepanova, M. Edelstein / 14th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. – Prague, 2004. –P. 1471.
Stepanova, M. Rapid Country-Wide Dissemination of Nosocomial CTX-M-14 3.
Beta-Lactamase-Producing Strains in Russia. / M. Stepanova, E. Ryabkova, M.
Edelstein, L. Stratchounski /45th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Washington, 2005.
Stepanova, M. In Vivo Evolution and Emergence of a New CTX-M Beta 4.
Lactamase with "Ceftazidimase" Activity in a Hypermutable Clinical Strain. / M.
Stepanova, O. Shevchenko, M. Edelstein / 45th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Washington, 2005.
Narezkina, A. Continuous Spread of ESBL-Producing Salmonellae in Russian 5.
Hospitals. / A. Narezkina, M. Stepanova, M. Edelstein / 45th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Washington, 2005.
Stepanova, M. Modelling the effect of copy number of plasmids carrying ESBL 6.
genes on resistance levels to -lactam antibiotics. / M. Stepanova, M. Edelstein / 16th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. - Nice, 2006.
Stepanova, M. Convergent selection of ceftazidime resistance mutations at position 7.
167 of CTX-M-3 -lactamase in hypermutable Escherichia coli strains. / M.
Stepanova, M. Edelstein / 16th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. - Nice, 2006.
Stepanova, M. Epidemiological surveillance and characterization of TEM-, SHV 8.
and CTX-M-type ESBLs in Russian nosocomial strains of Enterobacteriaceae using real-time PCR and melting-curve analysis techniques. / M. Stepanova, A.
Nikulin, M. Sukhorukova, M. Edelstein / 17 th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases / 25th International Congress of Chemotherapy. - Munich,2007.
Список использованных сокращений А.к аминокислота БЛРС -лактамаза расширенного спектра ИЭФ изоэлектрическое фокусирование МПК минимальная подавляющая концентрация ОРИТ отделения реанимации и интенсивной терапии ОРС открытая рамка считывания ПЦР полимеразная цепная реакция AP-PCR Arbitrary primed PCR (ПЦР с произвольными праймерами) АТCС American Type Culture collection CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CTX-M cefotaxime modifying enzyme EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing PFGE pulse field gel electrophoresis Аминокислоты Asn аспарагин Lys лизин Pro пролин Ser серин Thr треонин Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: Казань, 420008, ул. Кремлевская, 18, Казанский университет, отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне.
Благодарности.
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н. М.В. Эйдельштейну за постановку проблемы, внимательное отношение к работе и плодотворное обсуждение полученных результатов, к.б.н. М.В. Сухоруковой за постоянное внимание, помощь в работе и консультации.
Отдельная благодарность выражается Е.Д. Агаповой (Иркутская Обласная детская клиническая больница) за предоставление для работы клинических штаммов.
Автор искренне благодарен директору и сотрудникам НИИ антимикробной химиотерапии за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.
Автор также сердечно благодарит семью, родных и близких за всестороннюю поддержку и любовь.