Сравнительная характеристика амперометрических холинэстеразных сенсоров на основе углеродистых материалов для детектирования остаточных количеств пестицидов

На правах рукописи

ГОГОЛЬ Эллина Владимировна СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ 03.00.16 - Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

К А З А Н Ь - 2000

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Евтюгин Г.А.

доктор агрохимии, профессор Марти Ж.-Л.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Фридланд С.В.

доктор химических наук, профессор Евгеньев М.И.

Ведущая организация: Институт проблем прикладной экологии и при родопользования, г.Уфа

Защита состоится " " 2000 г. в часов на заседании Диссерта ционного совета К 053.29.24 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский государственный уни верситет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГУ.

Автореферат разослан " " 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета К 053.29.24, доктор химических наук Евтюгин Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Растущий поток загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду, предъявляет все более жесткие требования к эколого-аналитическому контролю их остаточных количеств. Это связано как с постоянным расширением числа токсикантов, так и с углублением представлений о токсическом действии загрязняющих веществ. Как следствие, ужесточаются гигиенические нормативы присутствия экотоксикантов в воде, почве и продуктах питания. Все это приво дит к постоянно растущему разрыву между пробоотбором и фактическим полу чением информации о состоянии окружающей среды. Повышается риск поступ ления токсических веществ в питьевые воды и продукты питания, осложняется оперативное управление экологической ситуацией в целом.

Решение указанных проблем состоит в развитии методов биохимической диагностики, ориентированных на оценку токсического эффекта наиболее опас ных загрязнителей. Перспективным направлением развития таких методов явля ется создание надежных и простых в эксплуатации ферментных сенсоров. Они сочетают преимущества ферментов (высокая чувствительность к экотоксинам) и аппаратных средств контроля (количественная оценка загрязнения и возмож ность автоматизации).

Холинэстеразы наиболее часто используются в ферментативных методах контроля окружающей среды. Это связано с уникально широким кругом ингиби торов фермента, в числе которых пестициды, поверхностно-активные вещества, соли тяжелых металлов. Однако практическое использование холинэстераз в экологическом мониторинге требует решения проблем стабилизации фермента при хранении, интерпретации отклика и упрощения процедуры измерения. По пытки решить проблемы путем создания одноразовых сенсоров на основе техно логий микропечати не продвинулись дальше пилотных образцов, поскольку вос производимость отклика биосенсоров в производимой серии и быстрая инакти вация холинэстераз в процессе хранения не позволяют получить надежного и воспроизводимого сигнала и присутствии токсикантов в объектах окружающей среды.

Внедрение средств биохимической диагностики в практику экологическо го мониторинга требует в первую очередь решить вопросы надежности аппара турного оснащения, сопряжения биологического компонента и средства измере ния. В этой связи настоящая работа, посвященная развитию теоретических и практических основ конструирования холинэстеразных биосенсоров и их при менения для определения пестицидов в объектах окружающей среды, является актуальной.

Цель настоящей работы - создание и сравнительная характеристика но вых биосенсоров на основе углеродистых и современных модифицирующих ма териалов для определения остаточных количеств фосфорорганических и карба минатных пестицидов в объектах окружающей среды.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- исследовать различные углеродистые материалы и способы изготовле ния сенсоров на их основе с целью снижения рабочего потенциала и повышения воспроизводимости сигнала;

- изучить формирование амперометрического отклика биосенсора, ста бильность иммобилизованной холинэстеразы и аналитические характеристики определения фосфорорганических и карбаминатных пестицидов;

- установить механизм влияния модифицирующего слоя нафиона на опе рационные и аналитические характеристики биосенсоров, определить рабочие условия нанесения модифицирующего покрытия;

- провести сравнительные испытания амперометрических сенсоров для определения фосфорорганических пестицидов в стационарном и проточно инжекционном режиме;

- изучить влияние органических растворителей и обратимых эффекторов на отклик биосенсоров и его чувствительность к фосфорорганическим пестици дам - оценить эффективность применения биосенсоров в экспресс-оценке ос таточных количеств пестицидов в растительной продукции, в том числе в рамках межлабораторного эксперимента с участием Центра фитофармации Перпиньян ского университета (Перпиньян, Франция).

Научная новизна работы заключается в том, что:

- впервые установлена возможность селективного определения сигнала (тока окисления тиохолина) биосенсоров на основе углеродистых материалов и сни жения рабочего потенциала окисления в присутствии модифицирующего слоя нафиона без использования медиаторов электронного переноса;

- впервые показано, что нанесение модифицирующего слоя ионообменного по лимера между основным материалом электрода и иммобилизованным фермен том не только стабилизирует отклик биосенсора, но и повышает чувствитель ность и селективность определения фосфорорганических пестицидов;

- установлено активирующее влияние ацетонитрила на нативную и иммобилизо ванную холинэстеразу и на этой основе достигнуто снижение пределов обнару жения фосфорорганических пестицидов в водно-органических экстрактах из зерна;

- определены пути повышения чувствительности и селективности определения пестицидов за счет регулирования удельной активности и толщины ферментсо держащего слоя для биосенсоров на основе печатных углеродных электродов и за счет нестационарного режима массопереноса реагентов в ферментсодержа щем слое и сорбционного предконцентрирования на материале мембраны в про точно-инжекционном режиме.

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые в производстве и удобные в использовании ампе рометрические биосенсоры на основе планарных углеродных электродов, изго товляемых методом микропечати, позволяющие детектировать присутствие фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в воде и растительных экс трактах на уровне нормативов ПДК;

- предложены упрощенные методики ферментативного определения оста точных количеств пестицидов из растительных экстрактов без удаления органи ческого растворителя;

- разработаны и апробированы конструкции проточных ячеек для проточ но-инжекционного определения пестицидов.

Положения, выносимые на защиту:

- исследование и сравнение операционных и аналитических характеристик биосенсоров на основе печатных и объемных электродов из углеродистых мате риалов, выявление экспериментальных факторов (состав ферментсодержащего слоя, материал электрода, режим массопереноса в мембрану), определяющих чувствительность и селективность определения ингибиторов;

- механизм влияния полимерного слоя нафиона, стабилизирующего от клик биосенсора и повышающего чувствительность и селективность определе ния остаточных количеств пестицидов;

- влияние органического растворителя на активность нативной и иммоби лизованной холинэстеразы и возможность прямого определения остаточных ко личеств пестицидов в экстрактах без удаления растворителя - сравнительная оценка результатов контроля реальных объектов окру жающей среды с помощью разработанных биосенсоров и стандартных методов хроматографического анализа, метрологическая характеристика биосенсоров в межлабораторном эксперименте.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на итого вой научной конференции Казанского государственного университета (1999 г.), 2 Всероссийском симпозиуме по проточному анализу (Москва, 1999), Междуна родном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), 3 международном симпозиуме INCO Copernicus "Применение биосенсоров для определения за грязнителей в полевых условиях" (Коимбра, 1998), 7 Международном симпо зиуме по электроаналитической химии ESEAC-98 (Коимбра, 1998), 4 Франко испанском семинаре по биосенсорам (Монпелье, Франция, 1999), 5 Франко испанском семинаре (Вик, Испания, 2000).

Основные результаты изложены в 2 статьях и 5 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 173 страницах машинописного текста, включает 49 рисунков и 16 таблиц. Со стоит из Введения, 4 глав, Выводов, Списка использованных библиографиче ских источников, включающего 229 ссылок на отечественные и зарубежные ра боты, и Приложения.

Диссертация выполнена на кафедре прикладной экологии Казанского го сударственного университета и в Лаборатории фитофармации Перпиньянского университета (Франция) в рамках договора о научном сотрудничестве между Казанским и Перпиньянским университетами и Российско-французской про граммы "Биотехнологии - агропроизводству" Миннауки РФ при поддержке РФФИ (грант № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения инги биторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсо ров"), программы "Университеты России. Фундаментальные исследования" (грант № 015.01.07.01.12" Оценка загрязнения окружающей среды с помощью тест-методов биохимической диагностики").

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использова ны в учебном процессе в Казанском государственного университете при чтении общего курса "Экологических мониторинг".

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В исследованиях использовали промышленно выпускаемые препараты бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади (ХЭ), КФ 3.1.1.8, производства AО "Биомед", г. Пермь, с удельной активностью 4,2±0,5 Е/мг и "Sigma", США, с удельной активностью 600 Е/мг.

Субстратом ферментативной реакции служил S-бутирилтиохолин иодид (БТХИ). Измерения проводили в 0,002 М. фосфатном буферном растворе, со держащих для постоянства ионной силы 0,1 М сульфата натрия.

Иммобилизацию ХЭ проводили путем кросс-сшивки парами и раствором глутарового альдегида на поверхности модифицированного нафионом печатного электрода и нитратцеллюлозной ("Sartorius") или нейлоновой ("Amersham") мембран.

Откликом служило максимальное изменение тока окисления тиохолина, регистрируемого после добавления субстрата (1).

ХЭ (CH3)3N+CH2CH2SCOC3H7 + H2O (CH3)3N+CH2CH2SH + C3H7COOH (1) Вольтамперометрические измерения проводили с помощью вольтамперо графа ИВА-3 (НПВП "Ива", Екатеринбург) и потенциостата Metrohm (641 VA Detector, Швейцария).

В качестве модельных ингибиторов были изучены диазинон {О-(2 изопропил-4-метилпиримидил-6)-О,О-диэтилтиофосфат};

кумафос {О,О-диэтил О-(3-хлор-4-метил-7-кумаринил)тиофосфат};

трихлорфон {О,О-диметил-(2,2,2 трихлоро)-1-гидроксиэтилфосфонат};

хлорпирифос-метил {О,О-диметил-О-[2 (диэтиламино)-6-метил-4-пиримидинил]-тиофосфат}, метиокарб: (4-метилтио 3,5-диметилфенил) N-метилкарбамат и фторид натрия.

Электроды на основе углеродистых материалов изготовляли из эпоксид но-углеродной композиции и путем микропечати на серебряной подложке из суспензии кристаллического графита в гидроксиэтилцелллюлозе с помощью принтера DEK 248 (DEK, Англия). Измерения в проточно-инжекционном режи ме проводили с помощью блока БР-1 проточного анализатора (АО "Химавтома тика", Москва), оснащенного ячейкой типа "отражательная стенка" собственной конструкции.

Характеристика отклика амперометрических сенсоров. Углеродистые материалы весьма перспективны для создания биосенсоров, поскольку облегча ют иммобилизацию фермента. Первоначально были изучены угольно-пастовые электроды на основе различных композиций с органическими и неорганически ми пластификаторами и медиаторами электронного переноса (Nile Blue и Mel dola Blue). Последний позволил снизить потенциал окисления тиохолина с 0, В до 0,60 В отн. Ag/AgCl, однако значительный фоновый ток и плохое разреше ние пиков на вольтамперограммах приводили к низкой точности измерения сиг нала. Вследствие низкой сорбционной емкости материала удельная активность ХЭ была достаточно низкой и быстро снижалась во времени вследствие вымы вания фермента. Использование эпоксидно-углеродной композиции существен но улучшило воспроизводимость сигнала, снизив потенциал окисления до +0. В. Кроме того, на данных электродах удалось добиться разделения токов окис ления тиохолина и иодид-иона, использующегося в качестве противоиона суб страта ХЭ. Прямая иммобилизация ХЭ в пасте и на поверхности приводят к низ кому невоспроизводимому отклику, поэтому использовались накладные мем браны на основе нейлоновых и нитратцеллюлозных носителей. Измерения про водили в проточно-инжекционном режиме. Форма сигнала и его основные ха рактеристики приведены на рис.1 и в табл.1, градуировочные кривые определе ния субстрата – на рис.2.

Рисунок 1. Отклик биосен сора на основе эпоксидно углеродного электрода и ХЭ, иммобилизованной на накладной нейлоновой мембране Таблица Характеристики отклика амперометрических биосенсоров в проточно инжекционном режиме (субстрат БТХИ 610-5 М).

Нейлон Нитрат целлюлозы Материал мембраны ХЭ в растворе Hybond Sartorius Удельная активность, Е/см2 4,2 (Е/мл) 1,8 1, Ток пика, мкА 31 5,5 12, Полуширина пика, с 24 61 Время пика, с 12 40 Общее время измерения, с 120 180 ХЭ сохраняет активность в течение не менее чем 3 месяцев после иммо билизации на нейлоне и нитрате целлюлозы, в растворе отклик сохраняется в те чение не менее чем 3 недель, резкое снижение отклика, иногда наблюдаемое, связано, по-видимому, с образованием микротрещин и подтеканием буферного раствора к поверхности электрода.

i, мкА 0,00 0,05 0,10 0,15 0, CS, мМ Рисунок 2. Определение БТХИ с помощью амперометрического биосенсора на основе эпоксидно-углеродного электрода и ХЭ, иммобилизованной на нитрат целлюлозной (1) и нейлоновой (2) мембране.

Наилучшие результаты были получены с печатными электродами, в кото рых кристаллический графит размещали в виде суспензии в гидроксиэтилцел люлозе на пластиковом носителе. Благодаря использованию техники удалось добиться высокой воспроизводимости характеристик поверхности сенсора и воспроизводимости основных операционных характеристик биосенсоров в се рии. Предварительное тестирование электродов показало, что время их жизни ограничено деградацией электропроводящего слоя. Для увеличения адгезии уг леродсодержащего слоя и снижения рабочего потенциала впервые было предло жено наносить промежуточный слой ионообменного полимера нафиона. В ре зультате такой модификации потенциал окисления тиохолина снижается с 0,8 В (немодифицированные электроды) до 0,25-0,41 В, по-видимому, за счет влияния катионообменных свойств полимера.

В подтверждение этого на модифицированных электродах практически не происходит окисления иодид-ионов. Тиохолин полностью ионизирован в ще лочной срeде буферного раствора (рН 7,8), однако его образование в ферментной пленке сопровождается высвобождением эквивалентного количества масляной кислоты в соответствии с ур.(1). Поэтому большая часть тиохолина во внутрен ней части ферментной пленки, расположенной на нафионовом покрытии, пред ставляет собой неионизированную катионную форму (2).

(CH3)3N+CH2CH2SH (CH3)3N+CH2CH2S- + H+ (2) ферментная пленка: рН 7 буферный раствор: рН 7, В результате рабочий потенциал окисления тиохолина на планарных элек тродах с нафионовым покрытием оказался лишь незначительно больше, чем для аналогичных сенсоров с включением медиаторов электронного переноса. В то же время, разработанный способ иммобилизации позволил сохранить естествен ное микроокружение фермента и упростить процедуру изготовления биосенсора.

Влияние нафиона на отклик биосенсора представлено на рис. 3,4.

i, мкА 0, 0, 0, 0 2 4 6 Объем раствора нафиона, мкл Рисунок 3. Зависимость сигнала биосенсора на основе печатного электрода от аликвоты 0,05 % нафиона, наносимого на электрод. Субстрат БТХИ 110-4 M, Е +400 мВ. Фосфатный буферный раствор 210-3 M + 110-1 M Na2SO4, pH 7,8, 37oC.

ХЭ иммобилизовали на поверхности печатного электрода в парах глута рового альдегида при пониженном давлении. Процедура иммобилизации позво ляет получать сверхтонкие пленки фермента, практически не оказывающие диффузионного торможения переноса реагентов в мембрану.

1, Концентрация нафиона i, мкА 1,00 0.05% 0, 0, 0.5% 0,25 5.0% 0, 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5, -log(Cs, M) Рисунок 4. Зависимость отклика биосенсора на основе печатного электрода от концентрации нафиона. Аликвота 2 мкл на 1 электрод. Условия измерения сиг нала см. рис.2.

Иммобилизация не меняет кинетических параметров ферментативной ре акции. Константа Михаэлиса, рассчитанная по зависимости отклика от концен трации субстрата в двойных обратных координатах i-1 – Cs-1, составила 210-4 М для раствора ХЭ и 1,710-4 М для иммобилизованного фермента.

Определены оптимальные характеристики нанесения нафиона (2 мкл 0,005 % суспензии на электрод) и иммобилизации ХЭ (время обработки парами глутарового альдегида 3-4 мин., 1-5 Е фермента на электрод).

Полученный сигнал линейно зависит от концентрации БТХИ в диапазоне концентраций 110-5-510-4 М. Природа буферного раствора оказывает незначи тельное влияние на определение субстрата. По мере разбавления раствора сиг нал возрастает до максимального значения при концентрации 210-3-510-3 М.

рН-Оптимум отклика биосенсора практически совпадает с полученным для на тивного фермента в тех же условиях измерения (рис. 5).

0. Рисунок 5. Зависимость i, мкА сигнала печатного био 0. сенсора от рН рабочего буферного раствора.

0. БТХИ 110-4 М, борат ный, трис- и фосфатный 0. буферные растворы.

5 6 7 pH Таким образом, предварительное изучение различных типов биосенсоров позволило предложить использование эпоксидно-графитовых и печатных моди фицированных нафионом биосенсоров для испытаний с модельными растворами токсикантов и экстрактами реальных объектов окружающей среды. Некоторые характеристики исследованных типов электродов и биосенсоров на их основе представлены в табл.2.

Таблица Характеристики электродов на основе углеродистых материалов и воз можность их использования в составе холинэстеразных биосенсоров Электроды Угольно- Эпоксидно- Печатные пастовые углеродные планарные Характеристики Рабочий потенциал окисления + 800 + 500-600 +250- тиохолина (отн.Ag/AgCl), мВ Погрешность измерения сиг- 8-12 5-7 3- нала (6 последовательных из мерений, (CS 110-3 M), отн.% Соотношение фонового тока и 1-50 1-2 0,1-0, сигнала (CS 110-3 M) Возможность иммобилизации фермента:

- в материале электрода + - на поверхности без носителя + + - на инертном носителе + + Влияние органического растворителя. При ферментативном определе нии остаточных количеств пестицидов в растительном материале основная про блема состоит в выборе органического экстрагента. В ходе настоящей работы был проведен скрининг органических растворителей по оказываемому ими ан тихолинэстеразному действию. Как показало исследование, присутствие 20-25 % этанола и ацетона вызывает некоторое снижение активности ХЭ, причем иммо билизация на нейлоне и нитрате целлюлозы стабилизирует отклик как на суб страт, так и на ингибирующее влияние пестицидов (табл. 3).

Таблица Антихолинэстеразное действие органических растворителей Растворители, смешивающиеся с водой Растворители, не смешивающиеся с водой Антихолинэстераз- Антихолинэстераз Растворитель Растворитель ное действие ное действие Этанол 10% - Хлороформ + 20% + Ацетон 10% - Тетрахлоруглерод + 20% + Ацетонитрил (а) Гексан 10% Примечание. а) Активирующее действие Для ацетонитрила впервые установлено не ингибирующее, а активирую щее влияние на ХЭ как в нативном, так и в иммобилизованном состоянии. Это позволяет предложить данный растворитель для экстракции остаточных коли честв пестицидов с последующим их ферментативным определением. Также бы ло установлено, что экстракция ацетонитрилом чистых образцов зерна пшеницы, риса, ржи, ячменя не приводит к выделению природных ингибиторов ХЭ: после разбавления экстракт не оказывал ингибирующего влияния на активность на тивного и иммобилизованного фермента. Количественные характеристики влия ния ацетонитрила на отклик биосенсора на основе печатного электрода пред ставлены на рис.6.

Определение пестицидов из модельных водных растворов. Для расчета степени необратимого ингибирования использовали относительное снижение отклика биосенсора: I = (s1-s2)100%, где s1 и s2 – отклики биосенсора до и после ингибирования, соответственно.

25, i, мкА 20, 15, 10, 5, 0 5 10 15 20 C(CH3CN),% Рисунок 6. Зависимость тока окисления тиохолина в присутствии 1 Е/мл ХЭ от концентрации ацетонитрила, об.%. Субстрат БТХИ 110-3М. Фосфатный буфер ный раствор, рН 7,8.

В табл.4 приведены результаты определения пестицидов с помощью пе чатных электродов, модифицированных нафионом, обобщены в табл.6.

Свежеприготовленный раствор трихлорфона выдерживался перед опреде лением в течение не менее, чем 4 часов. По данным хроматографического анали за, в растворе образуются как минимум 4 разных продукта гидролитической трансформации трихлорфона. Максимум накопления одного их них, дихлорме тилвинилфосфата (ДДВФ) соответствует максимальному ингибирующему эф фекту раствора (3).

-HCl (CH3O)P-CHCCl3 (CH3O)P-OCH=CCl (3) O OH O ДДВФ Трихлорфон Тионовые фосфорорганические пестициды предварительно электрохими чески окисляли до кислородных аналогов для повышения чувствительности оп ределения. Для повышения их растворимости эксперименты проводили в 10 % растворе ацетонитрила.

Таблица Градуировочные зависимости определения пестицидов с помощью печатного тонкопленочного электрода I(%) = a + blog(CI, M) Пестицид Трихлорфон Кумафос Хлорпирифос B 219 ± 26 (200 ± 30) 2,9±0,1 35± A 1410 ± 170 (1200±300) -2,3±0,9 177± Коэффициент 0,9785 0,9974 0, корреляции (r) 3,510-7 (910-7) 3,510-8 (510-7) 210- Предел обнару жения, М 410-7 – 810-7 410-8-210-7 4,710-5 -210- Диапазон опреде ляемых концен траций, М Примечание. В скобках приведены значения, полученные для немодифициро ванного электрода (в отсутствие слоя нафиона) Эффективность активации пестицида зависит от продолжительности элек тролиза (рис.7). Максимум эффективности достигается после 5 мин. электролиза для кумафоса и 7 мин. – для хлорпирифоса. В отсутствие ацетонитрила продол жительность электрохимического окисления превышала 10 мин для всех изу ченных пестицидов.

25, I,% Рисунок 7. Зависимость 20, ингибирующего действия 15,0 2.710-8 М кумафоса от продолжительности его 10, электрохимического окис 5, ления 0 5 10 15 20 t, мин Модификация нафионом приводит к снижению предела обнаружения трихлорфона в 3 раза. Для кумафоса этот эффект еще выше, по-видимому вслед ствие его сорбционного концентрирования на модифицирующем слое полимера, поскольку кумафос менее полярен, чем трихлорфон. Токсичность хлорпирифоса для теплокровных животных меньше, чем кумафоса (LD50 для крыс 170 и мг/кг соответственно). В том же направлении меняются пределы их обнаруже ния.

Чувствительность определения фосфорорганических пестицидов зависит также от толщины образующейся на поверхности сенсора белковой пленки.

Сравнение тонкопленочных биосенсоров с высокоактивным ферментом ( Е/мг) и толстопленочных с малоактивным (4,2 Е/мг) препаратом ХЭ при одина ковой удельной активности фермента на рабочей поверхности сенсора имеют различный режим функционирования. Толстопленочные биосенсоры показыва ют предел обнаружения кумафоса более чем на порядок выше, а степень инги бирования – в 2-5 раз ниже, чем тонкопленочные. К тому же наблюдается вос становление ферментативной активности при отмывке.

Как показали исследования с тонкопленочными биосенсорами с различ ной удельной активностью ХЭ, с ростом активности фермента чувствительность отклика в отношении пестицидов снижается. Так, при нагрузке высокоактивной ХЭ 5.3 Е / электрод метиокарб определяется в диапазоне концентраций 4,410-5 – 2,210-4 М, тогда как при активности 0,1 Е / электрода - 110-6-210-6 М. Для окисленной формы кумафоса соответствующие диапазоны концентраций соста вили 210-7-5,510-6 М и 410-8-210-7 М соответственно. Очевидно, что при большей активности иммобилизованного фермента требуется относительно больше ингибитора для достижения того же ингибирующего эффекта. Таким об разом, в зависимости от конкретной эколого-аналитической задачи можно под бирать соотношение величины сигнала и чувствительности к пестицидам как компромисс между требованиями точности определения отклика и чувствитель ности определения токсиканта.

В экспериментах с эпоксидно-графитовыми электродами чувствитель ность определения пестицидов в проточно-инжекционном режиме оказалась да же выше, чем для нативного фермента. Можно предположить, что это связано с сорбционным концентрированием гидрофобного пестицида на полимерном но сителе (табл.5). Этому способствовала специально сконструированная проточная ячейка с высоким отношением площади ферментсодержащей мембраны к объе му контактирующего с ней раствора (2355 см-1).

Таблица Градуировочные зависимости определения диазинона с помощью биосенсора на основе эпоксидно-углеродных электродов с накладными мембранами I(%) = a + blog(CI, M) Носитель Нейлон Нитрат целлюлозы Нативная ХЭ B 58±2 63±3 42± A 470±10 528±26 342± Коэффициент 0,9981 0,9914 0, корреляции (r) 410-9 1,510-9 510- Предел обнару жения, М 610-9 – 310-7 410-9-110-7 710-9 -510- Диапазон опреде ляемых концен траций, М Примечание. Скорость потока 0.4 мл/мин. Фосфатный буферный раствор 210- М + 0,1 М Na2SO4. Инкубирование 10 минут. Субстрат БТХИ 610-5 М.

Механизм формирования отклика печатных биосенсоров в стационарном и эпоксидно-углеродных электродов с накладными мембранами - в проточно инжекционном режиме подтверждается закономерностями изменения ингиби рующего действия фторидов. Переход от немодифицированного электрода к мо дифицированному нафионом сопровождается увеличением пределов обнаруже ния фторида с 110-5 до 1,710-4 М, вероятно, вследствие электростатического торможения переноса аниона в мембрану. Аналогичный эффект имеет использо вание гидрофобных носителей. В ряду “водный раствор фермента – нейлон – нитрат целлюлозы” предел обнаружения фторидов закономерно увеличивается (210-5 - 810-5 510-4 М), а наклон калибровочной прямой io/it – CF, M, – уменьшается (623±9 - 549±42 - 425±15).

Определение пестицидов в растительном материале. Для изучения возможности детектирования остаточных количеств пестицидов в растительном материале в качестве модельных токсикантов были выбраны кумафос и метио карб. Сопоставление результатов, полученных на модельных водных растворах пестицидов и их экстрактах из предварительно зараженных образцов зерна по зволяет предположить, что степень экстракции ацетонитрилом достигает 90 %.

Аналитические характеристики определения кумафоса представлены в табл.6.

Таблица Аналитические характеристики определения кумафоса в растительном материале с помощью холинэстеразных амперометрических биосенсоров.

I% = a + b СI, СI, мг/л Зерно r а B Рис 3,75+1,80 1,40+0,15 0, Ячмень 4,85+3,50 1,40+0,30 0, Модельный раствор 2,30+1,10 0,75+0,050 0, Для метиокарба реально определяемые количества составляют около 15% от внесенного количества, что связано, по-видимому, с высокой скоростью раз ложения этого карбаминатного пестицида при экстракции. Использование аце тонитрила позволило значительно снизить влияние матрицы, наблюдавшееся, в частности, при использовании накладных холинэстеразных мембран или при экстракции пестицидов ацетоном.

Помимо искусственно зараженных образцов зернопродуктов, нами были исследованы пробы перца и груши, полученные от местных поставщиков в су пермаркеты региона Лангедок-Русийон (Франция). Параллельно определению ингибиторов ХЭ в пробах с использованием тонкопленочных биосенсоров про водился их анализ методом ВЭЖХ. В экстрактах груши были обнаружены хлор пирифос-этил, малатион и пиримифос-метил, в экстрактах перца эти же фосфо рорганические пестициды и дитиокарбаминаты. Экстракты из загрязненных об разцов демонстрировали необратимое ингибирующее действие при разбавлении в 7000 раз (перец) и 5000 раз (груша). Чистые образцы снижения отклика био сенсора не вызывали. Степень ингибирования закономерно снижалась при изме нении степени разбавления экстрактов, что свидетельствует об отсутствии обра тимой составляющей ингибирования. Электрохимическое окисление экстракта позволяет выявить вклад тионовых пестицидов в общее загрязнение образцов веществами антихолинэстеразного действия.

Оценка метрологических показателей биосенсоров в межлаборатор ном эксперименте. Для проверки воспроизводимости результатов, полученных при использовании печатных биосенсоров, был проведен межлабораторный экс перимент на базе кафедры прикладной экологии (Казанский университет) и Цен тра фитофармации (Университет г. Перпиньян, Франция).

Совпадение морфологии субстратных зависимостей отклика и выхода на предельное значение силы тока (насыщение мембраны субстратом) независимо от места проведения измерений и аппаратурного обеспечения эксперимента (рис.8) свидетельствует, что методика изготовления и хранения биосенсоров на дежно обеспечивает воспроизводимость их основных операционных характери стики.

отклик, % от макс.

0,01 0,05 0,40 3, Cs, мМ Рисунок 4. Оценка субстратной специфичности в межлабораторном эксперимен те: 1 - результаты измерений в Казанском университете;

2 – результаты измере ний в Центре фитофармации г. Перпиньян.

Оценку воспроизводимости (4) ингибирования модельным раствором ку мафоса проводили методом сравнения углов наклона градуировочных зависимо стей кумафоса по Стьюденту.

b1 b 1 t,P=95% ( = N1+N2-4) (4) b 2 b где b1 – наклон прямой, полученной по результатам российского эксперимента, b2 – наклон прямой, полученной по результатам французского эксперимента и - число степеней свободы. Результаты расчетов представлены в табл.7.

Таблица Воспроизводимость измерения ингибирующего действия кумафоса по результа там межлабораторного эксперимента. I(%) = a + blog(CI, M) Калибровочная кривая по Калибровочная кривая по результатам российского результатам французско эксперимента го эксперимента -2,26 ± 0, a 5,67±1, 2,90 ± 0, b 2,18±0, Коэффициент корреляции 0,9987 0, (R) 0,423 0, Sb (b) 0,814 2, Воспроизводимость Значение воспроизводимости свидетельствует, что результаты ингибиро вания с вероятностью 95% совпадают.

Аналогичным образом, ингибирующее действие разбавленного ацетонит рильного экстракта из риса, зараженного кумафосом, по результатам независи мых измерений, проведенных в Казани и Перпиньяне с печатными биосенсора ми, описываются единой градуировочной зависимостью:

R2 = 0, I,% = 8, 78CI – 3,71;

(5) R2 rk=(t,P=95%/(+ t2,P=95%)) = 0, Таким образом, межлабораторный эксперимент свидетельствует о надеж ности измеренных показателей ингибирования и выводов о загрязнении образ цов растительной продукции, сделанных на их основе. Холинэстеразные биосен соры могут, таким образом, служить средством первичного контроля раститель ной продукции, предназначенного для быстрого определения наиболее загряз ненных образцов с тем, чтобы в последующем химическом анализе выявить природу содержащегося в них пестицида.

ВЫВОДЫ 1. Разработаны новые амперометрические холинэстеразные сенсоры на основе углеродистых композиций и модифицирующих материалов, обладающих улучшенными операционными и аналитическими характеристиками опреде ления остаточных количеств фосфорорганических (хлорпирифос, трихлор фон, кумафос) и карбаминатных (метиокарб) пестицидов.

2. Электростатическое торможение переноса ионных компонентов реакции, создаваемое модифицирующим слоем нафиона, увеличивает время их жизни до 6 месяцев, снижает мешающее влияние ионов – эффекторов фермента и увеличивает долгосрочную стабильность отклика. Чувствительность опреде ления фосфорорганических и карбаминатных пестицидов в 1,5-2 раза выше, а предел обнаружения – в 2-5 раз ниже, чем для биосенсоров на основе немо дифицированных электродов.

3. Иммобилизация холинэстеразы в парах глутарового альдегида позволяет по лучить сверхтонкие ферментсодержащие пленки, не создающие диффузион ного торможения переноса компонентов реакции к поверхности сенсора. В результате расширяется диапазон определяемых концентраций и увеличива ется чувствительность определения ингибиторов по сравнению с толстослой ными мембранами, получаемыми путем кросс-сшивки раствором глутарового альдегида. Увеличение удельной активности фермента снижает чувствитель ность определения необратимых ингибиторов.

4. В проточно-инжекционных условиях чувствительность определения пести цидов с помощью иммобилизованной холинэстеразы повышается за счет сорбционного предконцентрирования ингибиторов. Действие обратимых эффекторов снижается в результате нестационарных условий их переноса в ферментсодержащую мембрану.

5. Установлены рабочие условия определения остаточных количеств пестици дов в растительном материале. Показано, что ацетон и этанол в концентрации до 25 % снижают, а ацетонитрил в концентрации до 20 % увеличивает актив ность нативной и иммобилизованной холинэстеразы. Оценка ингибирующего действия ацетонитрильных экстрактов из зерна пшеницы, ячменя, риса по зволяет определять фосфорорганические пестициды на уровне установлен ных максимально допустимых уровней.

Основное содержание диссертации отражено в публикациях:

1. Evtugyn G.A., Gogol E.V., Ivanov A.N., Latipova V.Z. Flow-injection analysis of cholinesterase inhibitors: optimization of detection system./ Intern.Congress on Analytical Chemistry. Moscow June 15-21, 1997. Abstracts. 1997. V.1. F- 2. Evtugyn G.A., Ivanov A.N., Gogol E.V., Marty J.-L., Budnikov H.C. Carbon paste amperometric biosensor for the flow-through determination of choli nesterase inhibitors ESEAC’98. 7th European Conference of Electro-analysis.

Book of Abstr. Coimbra 1998. P. 3. Evtugyn G.A. Ivanov A.N. Gogol E.V. Budnikov H.C.The comparative deter mination of cholinesterase inhibitors in flow-through and batch conditions./ 3rd INCO-Copernicus Workshop "Biosensors for direct monitoring of environ mental pollutants in the field" Coimbra, May 1998.

4. Evtugyn G.A., Ivanov A.N., Gogol E.V., Marty J.L., Budnikov H.C. Am perometric flow-through biosensor for the determination of cholinesterase in hibitors.// Anal.Chim.Acta. 1999. V.385. №1-3. P.13-21.

5. Gogol E.V., Marty J.-L., Evtugyn G.A., Budnikov H.C. The influence of the sensor and immobilization procedure on the sensitivity of the determination of cholinesterase inhibitors.// Abstr.of IV rencontre transfrontalire capteurs et biocapteurs. Montpelier. France. 1999.

6. Евтюгин Г.А., Иванов А.Н., Гоголь Э.В., Будников Г.К. Определение ин гибиторов холинэстераз с помощью проточных электрохимических био сенсоров Сб.тезисов докл. 2 Всерос. Симпозиума "Проточный химический анализ" 1-3 декабря 1999. М.: ИОНХ РАН.- С.75- 7. Gogol E.V., Evtugyn G.A., Marty J.-L., Budnikov H.C., Winter V.G. Am perometric biosensors based on Nafion coated screen-printed electrodes for the determination of cholinesterase inhibitors.// Talanta. 2000. V.53. №2. P.379 389.