Взаимодействие базидиальных грибов с гуминовыми веществами
На правах рукописи
Кляйн Ольга Ивановна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ С ГУМИНОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ 03.01.04 Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Королева Ольга Владимировна доктор биологических наук Куликова Наталья Александровна
Официальные оппоненты: Верховцева Надежда Владимировна доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», профессор Жердев Анатолий Виталиевич кандидат биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, ведущий научный сотрудник
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук
Защита состоится «28» ноября 2013 г. в «15-00» часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) по защите диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.
Автореферат разослан «25» октября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Базидиомицеты – возбудители белой гнили древесины относятся к немногочисленной группе грибов, которые практически всегда существуют в условиях недостатка легкодоступного источника углерода. Поэтому в процессе эволюции у них сформировалась лигнинмодифицирующая система (ЛМС) – набор экстрацеллюлярных ферментов и низкомолекулярных медиаторов, благодаря которым эти грибы могут использовать в качестве источника углерода и / или азота труднодеградируемые субстраты. В частности, грибы рода Trametes способны разрушать лигнин и целлюлозу, которые являются предшественниками гуминовых веществ (ГВ) – преобладающей и наиболее устойчивой к микробной деградации фракции почвенного органического вещества. Таким образом, грибы белой гнили отвечают за вывод органического углерода из активного круговорота в недоступную для большинства живых организмов форму. С другой стороны, в настоящее время установленной считается роль этих грибов в разложении ГВ, т.е. возвращении выведенного из активного круговорота углерода обратно в цикл. Таким образом, базидиомицеты – возбудители белой гнили являются микроорганизмами, играющими ключевую роль в глобальном цикле углерода, а изучение их роли в этом процессе – актуальная проблема современной биохимии.
Используемые в большинстве случаев модельные системы, создаваемые для изучения взаимодействия грибных организмов с ГВ, основаны на т.н. «богатых» питательных средах, т.е. средах, содержащих глюкозу – легкодоступный источник углерода [Kate et al., 2011]. В то же время в природных условиях эти микроорганизмы функционируют при недостатке легкодоступных источников углерода, что, безусловно, влияет на грибной метаболизм и, как следствие, на их взаимодействие с ГВ. Поэтому такие исследования требуют создания модельных систем, адекватных природным условиям существования базидиальных грибов, где ГВ выступают в качестве единственного источника углерода. Для установления и понимания основных закономерностей процессов, протекающих в системе возбудители белой гнили – ГВ, изучение взаимодействий необходимо проводить не только на клеточном, но и на молекулярном уровнях.
Цели и задачи исследования. Целью работы было сравнительное изучение взаимодействия ГВ с грибами – возбудителями белой гнили Trametes hirsuta и Trametes maxima в условиях богатой питательной среды и при отсутствии легкодоступного источника углерода. Выбранные штаммы базидиомицетов являются продуцентами высокоактивных лакказ и пероксидаз. В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
– изучить влияние ГВ на рост и развитие грибов на уровне организма;
– на основании сравнительного анализа основных физико-химических характеристик ГВ до и после взаимодействия с грибами выявить основные пути деградации ГВ выбранными штаммами грибов;
– провести количественную оценку поступления ГВ в клетки грибов;
– на основании оценки изменений, наблюдаемых в физиологических процессах грибов под действием ГВ, установить основные метаболические пути, на которые влияют ГВ;
– на основании оценки изменений, происходящих в протеоме грибов под действием ГВ, выявить молекулярные основы взаимодействия грибов – возбудителей белой гнили с ГВ.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование взаимодействий, протекающих в системе возбудители белой гнили – ГВ и установлено влияние этих веществ на физиолого-биохимические и морфо функциональные свойства грибных клеток. Впервые установлено поступление ГВ в клетки грибов и проведена количественная оценка этого процесса. Впервые показано, что в присутствии ГВ происходит уменьшение длины митохондрий и изменяется толщина клеточной стенки и полиглюканового чехла гиф базидиомицетов. Впервые установлено, что ГВ способствуют накоплению полифосфатов и увеличению концентрации глюкозы в цитозоле. Показано наличие альтернативного пути дыхания у базидиомицета Trametes maxima. Установлено, что внесение ГВ в питательную среду приводит к общей активизации дыхания и показано, что ГВ увеличивают скорость дыхания как по цитохромному, так и по альтернативному путям. На основании сравнительного анализа протеомных профилей впервые установлено, что в присутствии ГВ происходит увеличение количества внутриклеточных белков и показано повышение уровня биосинтеза белков семейства АТФаз, белков теплового шока и нуклеозидтрифосфатаз. При оценке влияния ГВ на дифференциальную экспрессию генов методом ПЦР в реальном времени впервые установлено, что ГВ влияют на уровень углеводного обмена: показано повышение экспрессии гена eno, кодирующего енолазу, участвующую в процессе гликолиза и снижение экспрессии гена pgd, кодирующего 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, участвующую в пентозофосфатном цикле.
Практическое значение работы. Биотестирование продуктов взаимодействия базидиомицетов с ГВ показало их детоксицифирующую способность по отношению к гербициду атразину и способность повышать уровень витамина С в редисе.
Полученные продукты могут быть использованы для создания функциональных биоудобрений и в природоохранных технологиях.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIV конференции международного Гуминового общества (Москва-Санкт-Петербург, 2008), 5-ой международной конференции «Гуминовые вещества и фитогормоны в сельском хозяйстве» (Днепропетровск, 2009), 3-ей международной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2010), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), 1-ой и 2-ой международных конференциях по гуминовым инновационным технологиям (Москва, 2010 и 2012), конференции «Молекулярная биология и биотехнология леса» (Брянск, 2011), 17-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2011» (Москва, 2011);
международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей в журналах, рекомендованных ВАК, а также 9 статей в сборниках и тезисов докладов.
Объем и структура работы. Работа изложена на 160 страницах печатного текста, содержит 32 рисунка и 27 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 224 источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследования были штаммы базидиальных грибов Trametes hirsuta 075 (Wulf. Ex. Fr) и Trametes maxima 0275 (Mont.) David & Rajchenb. 1985 Quel.
семейства Polyporaceae из коллекции культур Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН. В качестве модели ГВ в твердом состоянии использовали окисленный бурый уголь (Солнцевское месторождение, о. Сахалин), а в качестве растворенных ГВ – ГВ, выделенные из этого угля, и коммерческий препарат ГВ угля Powhumus (Humintech GmbH, ФРГ).
Твердофазное стационарное культивирование проводили путем внесения инокулята гриба на уголь (20 г угля на колбу 750 мл) с последующим смачиванием субстрата по мере высыхания стерильными питательными средами.
Жидкофазное стационарное культивирование проводили на питательных средах двух видов: богатой и бедной. Состав богатой питательной среды (г/л): глюкоза 10,0;
NaNO3 3,0 КН2РО4 0,6;
ZnSO47H2O 0,001;
К2НРО4 0,4;
FeSO47H2O 0,0005;
MnSO 0,05;
MgSO47H2O 0,5;
CaCl2 0,25;
CuSO4 0,25. рН 6,0. Бедная среда имела тот же состав, но не содержала глюкозу. В колбу вносили 20 г ГВ и 200 мл питательной среды. Культивирование проводили в течение 30 сут.
Жидкофазное глубинное культивирование проводили на аналогичных средах, но при постоянном перемешивании 180 об./мин. Внесение ГВ (концентрация в среде 50 мг/л) осуществляли на 7 сут., время взаимодействия с ГВ 24 ч.
Определение активности ферментов ЛМС грибов. Активность Mn-пероксидазы (MnП) определяли фотометрически при 238 нм по скорости образования комплекса Mn(III) с винной кислотой из Mn(II) в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 5,0.
Определение активности лигнинперосидазы (ЛП) осуществляли по скорости окисления вератрового спирта до вератрового альдегида, измеряя снижение поглощения при 310 нм в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 3,0. Активность лакказы (ЛК) детектировали при длине волны 410 нм, используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,5.
Выделение ГВ из угля осуществляли экстракцией 0,1 М NaOH в весовом соотношении 1:2 с последующим диализом (12 кДа) против дистиллированной воды и центрифугированием (3000 g, 20 мин). Полученный препарат и оставшийся осадок высушивали в сушильном шкафу при температуре 50С.
Элементный состав ГВ определяли на CHN-анализаторе Carlo Erba Strumentazione-1106 (Италия). Зольность препаратов определяли путем ручного сожжения в кварцевой трубке (850С, 40 мин.). Содержание кислорода рассчитывали по разнице между массой навески и суммарным содержанием золы и СНN.
Молекулярные массы ГВ определяли с помощью эксклюзионной хроматографии согласно существующей методике [Perminova et al., 2003]. На основании получаемых гель-хроматографических профилей рассчитывали средневесовые молекулярные массы (ММ) ГВ с использованием программы GelTreat [Kudryavtsev et al., 2000].
Структурно-групповой состав углеродных фрагментов в ГВ определяли методом 13С ЯМР спектроскопии согласно [Ковалевский et al., 2000]. Регистрацию спектров проводили на спектрометре Varian VXR-400. Содержание углерода различных структурных фрагментов определяли интегрированием соответствующих спектральных областей (м.д.): 0-49 – атомы С незамещенных алифатических фрагментов (СAlk), 49-104 атомы углерода O- и N-замещенных алифатических фрагментов (СAlk-О), 104-144 – атомы С незамещенных ароматических фрагментов (СAr), 144-165 – атомы углерода O- и N-замещенных ароматических фрагментов (СAr-О), 165-185 – атомы С карбоксильных и эфирных групп (СCOO), 185-220 – атомы С кетонных и хинонных групп (СC=O).
Изучение морфологии клеток грибов методом световой микроскопии. Для приготовления препаратов использовали метод прижизненного окрашивания нейтральной красной (окрашивание полифосфатов) или родамином 6Ж (окрашивание митохондрий). Препараты просматривали на микроскопе Axioskop 40 FL (Zeiss) при увеличениях объективов 40 и 100.
Изучение морфологии клеток грибов методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Предварительная подготовка грибного мицелия включала последовательную фиксацию 1,5% глутаровым альдегидом и 2% раствором OsО4 с последующим обезвоживанием в градиенте концентраций этилового спирта и пропиткой смолой EPON 812. Ультратонкие срезы микроскопировали на электронном микроскопе Jeol-1011 и Jem-100B.
Изучение морфологии клеток грибов методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Подготовку грибного мицелия для СЭМ осуществляли путем его фиксирования 2,5% глутаровым альдегидом в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,2 с последующей отмывкой буфером и обезвоживанием в градиенте концентраций этилового спирта и ацетоне. Обезвоженные пеллеты высушивали в критической точке на HCP-2 (Hitachi, Япония). Далее пеллеты наклеивали на предметные титановые столики, напыляли смесь платина/палладий (IB-3 Ion Coater) и изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа высокого разрешения с автоэмиссионным катодом JSM-6380LA (JEOL, Япония).
Исследование состава и содержания углеводов в цитозоле грибов. Экстракцию углеводов из мицелия проводили кипящей водой в течение 20 мин четырехкратно.
Далее проводили очистку экстракта и определение в нем углеводов методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ), получая из лиофильно высушенного экстракта триметилсилильные производные сахаров. В качестве внутреннего стандарта использовали -метил-D-маннозид (Merck, США). Хроматографию проводили на газожидкостном хроматографе Кристалл 5000.1 (Хроматек, Россия) на капиллярной колонке ZB-5 30 м0,32 мм0,25 мкм (Phenomenex, США) при градиентном нагревании от 130 до 270°С со скоростью 5-6°С/мин. В качестве стандартов использовали глюкозу, маннит, арабит, инозит, трегалозу (Sigma, США).
Оценка клеточного дыхания грибов. Для измерения интенсивности клеточного дыхания готовили суспензию грибного мицелия путем гомогенизации 1 г мицелия в гомогенизаторе Поттера на льду в течение 1 мин. Полученную суспензию клеток инкубировали в ячейке Кларка при 25°С в 10 мМ HEPES-буфере, рН 7,5, с 1,2 М сорбитом и 0,5% БСА. Потребление кислорода клетками измеряли полярографически в ячейке с электродами, закрытыми фторопластовой пленкой, с постоянной разностью потенциалов 660 мВ. При проведении ингибиторного анализа использовали 2мM KCN (ингибирование цитохромного пути) и 2мM салицилгидроксамовую кислоту (ингибирование альтернативного пути).
Оценка антиоксидантной системы грибов. Для определения продукции активных форм кислорода (АФК) в суспензии клеток использовали флуоресцентный краситель 5-(и-6)-хлорметил 2',7'-дихлордигидрофлуоросцеина диацетата ацетиловый эфир (CM-H2DCFDA). Краситель (40 мкМ) добавляли к суспензии клеток с последующей 30-мин инкубацией в темноте в среде, содержащей 1,2 M сорбит, 10 мМ HEPES, 0,5% БСА, pH 7,4. Далее суспензию клеток промывали дважды средой того же состава и оценивали интенсивность флуоресценции каждые 10 мин в течение 120 мин (ex = 485 нм, em = 528 нм) на микропланшетном фотометре-флюориметре Synergy 2 (BioTeck, США).
Активность супероксиддисмутазы (СОД). Выделение белков проводили из предварительно полученного гомогенизата грибного мицелия на льду в 0,05 М Tris HCl буфере, рН 6,8, с добавлением 2 мМ ЭДТА. Электрофорез белков проводили в градиентном полиакриламидном геле (7,5–25%) в электрофорезной камере PROTEAN II xi 2-D Cell (Bio-Rad, США). Для окрашивания использовали водный раствор тетразолия нитросини. Проявление СОД в геле осуществляли раствором рибофлавина в K-фосфатном буфере 15 мМ, рН 10, с добавлением N,N,N',N' тетраметилэтилендиамина (ТМЭД) и последующим освещением люминесцентной лампой до проявления светлых зон. Идентификацию белков осуществляли методом матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации (МАЛДИ).
Поглощение ГВ базидиомицетами. Для изучения поглощения ГВ базидиомицетами использовали меченный тритием препарат ГВ ([3H]ГВ), полученный методом атомарной бомбардировки. Для количественной оценки поглощения ГВ проводили глубинное жидкофазное культивирование гриба T. maxima в присутствии [3H]ГВ (50 мг/л, 50 мКи/л), время взаимодействия 24 ч. Далее мицелий грибов отделяли от культуральной жидкости путем фильтрования. Затем мицелий промывали питательной средой, фильтраты объединяли и определяли радиоактивность, на основании которой рассчитывали равновесную концентрацию ГВ в культуральной жидкости после взаимодействия с базидиомицетом и количество ГВ, сорбированных грибом. Для определения количества ГВ, поступивших во внутриклеточное пространство гриба, клетки разрушали путем гомогенизации в жидком азоте, осаждали дебрис центрифугированием и определяли радиоактивность супернатанта, на основании которой рассчитывали количество ГВ, поступившее в клетки грибов.
Анализ протеома и секретома гриба. Для выделения внеклеточных белков из концентрированной обессоленной культуральной жидкости проводили их осаждение смесью 13,3% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 0,093% -меркаптоэтанола в ацетоне с дальнейшим растворением в 0,05 М Tris-HCl, рН 6,8 и переосаждением при помощи 2D Protein Kit (Bio-Rad, США). Выделение внутриклеточных белков проводили из гомогенизата мицелия 0,05 М Tris-HCl, рН 6,8 с 2 мМ ЭДТА. Для осаждения белков использовали смесь ацетон/ТХУ/-меркаптоэтанол, осадок растворяли в лизис-буфере и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин при 20°С.
После обработки реакционную смесь инкубировали в течение часа при 20°С и затем центрифугировали 5 мин при 14000 g. Супернатант собирали и использовали для дальнейших исследований. Концентрацию белка в образцах определяли методом Брэдфорд согласно инструкции производителя (Thermo Scientific, США).
Разделение белков протеома и секретома проводили методом двумерного электрофореза на системе PROTEAN II xi 2-D Cell (Bio-Rad, США).
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) осуществляли в градиенте рН 3-10 амфолитов Serva Electrophoresis (ФРГ). Полученные после ИЭФ образцы фракционировали в градиентном полиакриламидном ДДС-геле (7,5-25%) при напряжении 300 В. Для визуального анализа распределения белковых компонентов использовали окраску азотнокислым серебром, а для масс-спектрометрического анализа – раствором Brilliant Blue R Staining Solution (Sigma, США). Построение и анализ белковых карт проводили с помощью системы гель-документирования Infinity1000/26MX (Vilber Lourmat) и ПО ImageMaster 2D Platinum v.7 (GE Healthcare) соответственно.
Выделение суммарной РНК и обратная транскрипция. Выделение суммарной РНК из грибной биомассы проводили с использованием набора реактивов RNeasy Plant Mini Kit (50) (Qiagen, США) согласно методике производителя, адаптированной для растительного материала и мицелиальных грибов. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили с использованием набора реактивов для синтеза кДНК Mint (Евроген, РФ) согласно инструкции производителя в амплификаторе C1000 (Bio Rad, США). Полученную дц-кДНК использовали в качестве матрицы в последующей ПЦР. Качество выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Чистоту препаратов РНК и дц-кДНК определяли по соотношениям 260/280 нм и 260/230 нм.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Праймеры к исследуемым генам подбирали с использованием ПО Beacon Designer. Использовали следующие пары праймеров (прямой и обратный, все последовательности в ориентации 5’-3’):
– CGGCTTCGGTCGTATTGG и TGGAGGAGGGGATGATGTT для gapdh;
– TTGGTGATGAAGGTGGTTTTGCTCC и CCCAATCATCCTGATCGAAGGGGTC для eno;
– TCGTCGGCTCTGGCGTTTCTGGTGG и GTCTCCGTACTCGATACCGTTGTG для 6pgdh, – CAAGATGCGACGGCACAGATGGC и CCAACACCGCAAGCAACCATAC для aco, – ACGTACAACTCCATCTTCAAGTG и TCCTTCTGCATACGATCAGCGATACC для -actin, – ACGCTTTCCGTTCACCAG и TGTCCGGAAGCAAATGTCG для -tubulin.
Для анализа ПЦР в реальном времени амплификацию проводили с использованием готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR (Evrogen, РФ) согласно инструкции производителя. Для определения специфичности ПЦР анализировали кривую плавления двухцепочечной ДНК. Выбор референсного гена из трех генов кандидатов (-актин, -тубулин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), относящихся к генам домашнего хозяйства, осуществляли с использованием ПО BestKeeper© Software. Обработку данных осуществляли на базе значений пороговых циклов амплификации Ct. Результаты выражали в условных единицах относительной C (C ) экспрессии NE = 2 t,ref t, tar, где Ct, ref – пороговый цикл амплификации контрольного гена, Ct, tar – пороговый цикл амплификации исследуемого гена.
Биологическая активность биопрепаратов. Ростостимулирующую и детоксифицирующую способность получаемых биопрепаратов – культуральных жидкостей (КЖ) – проводили с использованием в качестве тест-объекта пшеницы мягкой Triticum aestivum L. и гербицида атразина. Тест-откликами были длина побегов и масса растений. Для оценки влияния КЖ на качество продукции проводили мелкоделяночные эксперименты с редькой посевной (редис) Raphanus sativus L.
Оценку качества редиса проводили по содержанию аскорбиновой кислоты.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Комплексное исследование взаимодействия базидиомицетов с ГВ включало в себя два основных направления: изучение деградации ГВ под действием базидиомицетов и изучение влияния ГВ на базидиомицеты. Все эксперименты проводили как в условиях богатой питательной среды, обычно используемой для культивирования базидиомицетов, так и при отсутствии легкодоступного источника углерода (бедная среда), моделируя природные условия обитания грибов. Для оценки биологической активности продуктов взаимодействия базидиомицетов с ГВ использовали КЖ, получаемые в процессе культивирования грибов.
Деградация ГВ базидиомицетами Исследование деградации ГВ базидиомицетами проводили в двух модельных системах. В первом случае использовали модель деградации, наиболее адекватно отражающую условия существования грибов в природе – твердофазное культивирование базидиомицетов в присутствии ГВ. Во втором случае деградацию ГВ изучали в условиях жидкофазного стационарного культивирования, что позволило отслеживать динамику активности основных ферментов ЛМС (MnП, ЛП, ЛК). Для проведения исследований в качестве источника ГВ использовали окисленный бурый уголь, характеризующийся их высоким (90%) содержанием. О направлении трансформации ГВ судили по изменению их основных физико-химических свойств.
Исследованные штаммы базидиомицетов активно взаимодействовали с углем, что приводило к заметному разрыхлению его поверхности (рис. 1). Это является прямым доказательством способности базидиальных грибов деградировать ГВ угля, используя их в качестве источника питательных веществ.
Контроль (без грибов) Бедная среда Богатая среда Рис. 1 – СЭМ образцов угля после взаимодействия со штаммами T. hirsuta и T. maxima;
увеличение 300. Твердофазное культивирование.
На рис. 1 хорошо видно систему гиф, демонстрирующую рост исследуемых грибов на угле. На бедной среде видны отдельные гифы на поверхности и гифы, проросшие внутрь частиц угля, тогда как на богатой среде, где рост грибных культур был более интенсивный, мицелий образовывал пленку на поверхности угля.
Исследование элементного состава исходных и трансформированных ГВ показало, что наблюдаемые изменения напрямую определяются использованным штаммом, но мало зависят от наличия в среде глюкозы. В случае T. hirsuta изменения содержания углерода практически не наблюдали, в то время как при выращивании T. maxima происходило снижение этого показателя (табл. 1). Принимая во внимание, что содержание азота практически не изменялось, можно предположить, что культивирование T. hirsuta сопровождается частичным восстановлением ГВ, а T. maxima – их окислением.
Данные 13С ЯМР-спектроскопии подтвердили высказанное предположение: во всех случаях трансформация ГВ T. maxima сопровождалась увеличением в них суммы CС=О и CСОО (табл. 1). Наблюдаемые при этом снижение содержания CAlk и рост ароматичности ГВ CAr/CAlk указывает на то, что в условиях твердофазного культивирования окислению подвергались преимущественно алифатические фрагменты. В условиях жидкофазного культивирования для этого штамма было отмечено возрастание CAlk-О и падение ароматичности, что может свидетельствовать о частичном окислении CAr. Установленная тенденция возрастания кислородсодержащих функциональных групп хорошо согласуется с общим направлением гумификации в природных условиях, для которого характерно именно такое изменение распределения углерода по функциональным группам, сопровождающееся увеличением растворимости ГВ и повышением их реакционной способности по отношению к почвенным минералам.
В случае T. hirsuta однозначных тенденций по изменению распределения углерода по структурным фрагментам ГВ отмечено не было. По-видимому, это объясняется менее выраженной, по сравнению с T. maxima, способностью этого штамма трансформировать ГВ. Об этом же свидетельствуют данные о накоплении биомассы исследуемыми штаммами: в присутствии ГВ грибная биомасса возрастала в случае T. hirsuta в 1,1-1,2 раза, а в случае T. maxima в 1,4-2,6 раза.
Табл. 1 – Основные физико-химические свойства исходных и модифицированных базидиомицетами ГВ.
Содержание, Распределение углерода по структурным CAr/ МM, Вариант % масс. фрагментам, % CAlk кДа C HN CC=O CCOO CAr-О CAr CAlk-O CAlk Твердофазное культивирование Контроль 72 6 3 14 5 18 9 37 18 14 1, Бедная среда 75 6 4 27 4 15 9 44 17 11 1, T. hirsuta T. maxima 70 5 3 29 8 18 9 36 15 13 1, T. hirsuta+ 70 5 3 25 5 19 10 46 8 12 2, T. maxima Богатая среда 74 6 4 31 8 18 11 37 15 12 1, T. hirsuta T. maxima 69 5 3 23 6 19 12 42 12 10 2, T. hirsuta+ 70 5 3 26 13 17 10 33 16 12 1, T. maxima Жидкофазное культивирование Контроль 74 5 3 20 5 13 15 43 12 13 2, Бедная среда 73 5 4 20 8 18 11 37 15 12 1, T. hirsuta T. maxima 73 5 4 20 4 17 8 43 18 10 1, T. hirsuta+ 76 6 4 23 6 17 10 36 15 15 1, T. maxima Богатая среда 81 6 3 18 4 15 8 44 14 15 1, T. hirsuta T. maxima 69 5 4 23 5 15 8 39 20 15 1, T. hirsuta+ 71 5 3 25 6 14 10 37 22 12 1, T. maxima Во всех случаях при культивировании в твердофазных условиях и в половине случаев при культивировании в жидкофазных условиях наблюдали возрастание ММ ГВ в процессе трансформации базидиомицетами (табл. 1). Это указывает на полимеризацию ГВ, связанную, по-видимому, с процессами опосредованной ферментативной деградации, обусловленной формированием радикалов в качестве основных и побочных продуктов ферментативных реакций с последующим запуском радикальных процессов.
Наиболее наглядно изменения, происходящие с ГВ в процессе трансформации, можно представить с помощью диаграммы Ван Кревелена, отражающей соотношения окисленности (атомное отношение O/C) и ненасыщенности (атомное отношение H/C) в исследуемых соединениях (рис. 2).
Твердофазное культивирование Жидкофазное культивирование 0.98 H/C 0.98 H/C 0.94 0. 0.90 0. +H 0.86 0. CO восста 0.82 0. окисление новление 0.78 0. -(CH3)n -OH -H O/C O/C 0.74 0. 0 0.1 0.2 0.3 0 0.1 0.2 0. Рис. 2 – Диаграмма ван Кревелена исходных и трансформированных ГВ.
– контроль (без гриба): – T. hirsuta;
– T. maxima;
– T. hirsuta + T. maxima (незакрашенные символы – бедная среда, закрашенные символы – богатая среда).
Как видно из рис. 2, изменение свойств ГВ происходило в двух направлениях. В случае T. hirsuta одновременно снижались оба исследуемых атомных отношения, т.е.
модификация ГВ этим штаммом протекала по пути восстановления и дегидратации.
При трансформации ГВ под действием T. maxima или в варианте совместного культивирования T. hirsuta и T. maxima также наблюдали снижение отношение H/C, но при этом одновременно происходил рост показателя O/C, т.е. можно предполагать протекание окислительных процессов, таких как деметилирование.
Мониторинг ферментативной активности культуральных жидкостей показал, что динамика активности всех трех исследуемых ферментов имела сложный характер и зависела от фазы роста культуры. Поэтому для сравнения использовали средние значения активностей за изучаемый период трансформации ГВ (табл. 2).
Табл. 2 – Активность ЛП, MnП и ЛК T. hirsuta и T. maxima при жидкофазном стационарном культивировании в присутствии ГВ.
ЛП, 103 МЕ/л MnП, 103 МЕ/л Вариант ЛК, МЕ/л Бедная среда 6 18 0, T. hirsuta 3 8 0, T. maxima T. hirsuta + T. maxima 3 7 0, Богатая среда 4 10 0, T. hirsuta 10 8 0, T. maxima T. hirsuta + T. maxima 10 14 0, Данные, представленные в табл. 2, указывают, что в ЛМС T. hirsuta и T. maxima наблюдалась преимущественно лакказная активность, что характерно для выбранных штаммов. Корреляционный анализ показал, что существует обратная линейная зависимость (r2 = –0,89) между активностью присутствующей в КЖ MnП и содержанием карбоксильных групп в трансформированных ГВ. Полученная зависимость хорошо согласуется с данными других исследователей, отмечавших декарбоксилирование ГВ низкомолекулярным диффундирующим медиатором с высоким редокс-потенциалом – хелатированным ионом Mn(III), образующимся под действием грибной MnП. Кроме того, в выбранных условиях наблюдали также положительную линейную взаимосвязь (r2 = 0,91) между активностью ЛК и содержанием CAlk-O в ГВ, что указывает на роль ЛК в окислении ГВ.
Взаимодействие базидиомицетов с ГВ Эксперименты проводили с использованием T. maxima и ГВ угля в условиях жидкофазного глубинного культивирования, концентрация ГВ 50 мг/л.
Влияние ГВ на накопление биомассы T. maxima. Анализ полученных кривых роста показал, что на обеих питательных средах в течение 5 сут. происходит интенсивный прирост биомассы, который на 6-8 сут. сменяется стационарной фазой, (рис. 3), поэтому внесение ГВ осуществляли на 7 сут.
Бедная среда Богатая среда Сухая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л 5 без ГВ 4 + ГВ 3 2 без ГВ 1 + ГВ Время, сут. Время, сут.
0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 Рис. 3 – Влияние ГВ на накопление биомассы T. maxima при жидкофазном культивировании.
Было установлено, что как на бедной, так и на богатой среде внесение ГВ приводило к увеличению биомассы T. maxima, что подтверждает способность грибов – возбудителей белой гнили использовать ГВ в качестве источника углерода. При этом при отсутствии в среде легкодоступного источника углерода внесение ГВ приводило к возрастанию накопления биомассы в 1,1-1,7 раз, а в присутствии глюкозы – в 1,1-1,4 раза. Следовательно, можно ожидать, что на бедной среде влияние ГВ на метаболизм гриба будет более выражено.
Влияние ГВ на морфологию и ультраструктуру клеток T. maxima. Анализ влияния ГВ на плотность упаковки пеллет T. maxima проводили при помощи световой микроскопии (рис. 4) и СЭМ (рис. 5).
Бедная среда Богатая среда Без ГВ В присутствии ГВ Рис. 4 – Световая микроскопия пеллет T. maxima.
На бедной среде было отмечено формирование рыхлой поверхности пеллет (рис. 5), на периферии которых обнаруживались мицелиальные гифы (рис. 4), что объясняется, по-видимому, нехваткой питательных веществ и необходимостью формирования длинного поискового мицелия. Наличие регулярных пряжек (рис. 5) позволяет сделать вывод о хорошей репродуктивности гриба в этих условиях. При добавлении ГВ происходит формирование тяжей (рис. 4), обусловленное изменением поверхностного заряда при сорбции ГВ на мицелии, а также увеличивается количество экстрацеллюлярных белков (рис. 5).
На богатой среде образующиеся глобулы характеризовались высокой плотностью, короткими гифами (рис. 4, 5) и наличием большого количества секреторных белковых конгломератов (рис. 5). Внесение ГВ приводило к образованию на поверхности пеллет округлых выростов неясной этиологии, возможно, склероциев (рис 5).
Бедная среда Богатая среда Без ГВ В присутствии ГВ Рис. 5 – СЭМ пеллет и гиф T. maxima. Стрелкой отмечены образования на поверхности пеллет.
Резюмируя данные по морфологии T. maxima, можно заключить, что наиболее яркие различия наблюдали между образцами, полученными при культивировании на бедной и богатой средах, тогда как выраженного влияния ГВ на морфологию гриба обнаружено не было.
Оценка накопления полифосфатов в клетках T. maxima, проведенная с помощью прижизненного окрашивания нейтральной красной, показала, что на бедной среде их максимальное количество наблюдается в молодой 3-х сут. культуре: окрашенные гранулы присутствовали в 90% клеток. К 5-ым сут. количество клеток, где обнаруживали окрашенные гранулы, снижалось до 5%, а еще в 10% наблюдали диффузную окраску. На 7-е сут., в момент перехода гриба в стационарную фазу роста, гранул полифосфатов при культивировании штамма на бедной среде обнаружено не было. Установленная тенденция указывает на то, что на бедной среде рост исследуемого штамма характеризовался лаг-периодом, что может быть связано с адаптацией грибного метаболизма к среде, не содержащей легкодоступного источника углерода. Эффект от внесения ГВ в среду напрямую зависел от возраста культуры. При внесении ГВ к молодой 3 сут. культуре наблюдали преимущественное диффузное окрашивание вакуолей, а окрашенные гранулы присутствовали только в 15% клеток. Это указывает на смену функционального состояния гриба в присутствии ГВ, в частности, активизацию энергетических процессов. На 5-е и 7-е сут. внесение ГВ приводило к увеличению накопления полифосфатов в клетках гриба: окрашенные гранулы присутствовали в 25% и 5% клеток соответственно.
При культивировании гриба на богатой среде, где процессы роста шли более активно, чем на бедной, накопление полифосфатов в виде гранул было отмечено только на стационарной фазе роста, что указывает на быстрый рост культуры в логарифмической фазе и его замедление в стационарной. Влияние ГВ на накопление полифосфатов в этих условиях было выражено гораздо слабее. Значимые различия наблюдали только на 5-е и 7-е сут. роста, когда внесение ГВ привело к накоплению гранул полифосфатов в 5 и 7% клеток соответственно. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что ГВ оказывают непосредственное влияние на энергетические процессы в клетках базидиомицета. Результаты исследования ультраструктур клеток T. maxima хорошо согласуются с высказанным предположением: в присутствии ГВ наблюдали снижение длины митохондрий (табл. 3) – органелл, отвечающих за синтез АТФ.
Табл. 3 – Влияние ГВ на параметры некоторых ультраструктур клеток T. maxima.
Бедная среда Богатая среда Параметры Без ГВ + ГВ Без ГВ + ГВ Ширина клетки, мкм 2,0±0,4 2,2±0,2 2,0±0,2 2,2±0, Толщина клеточной стенки, нм 59±7 41±6 45±9 57± Толщина полиглюканового чехла, нм 108±29 51±26 52±9 73± Диаметр митохондрий, мкм 0,42±0,05 0,29±0,03 0,38±0,04 0,36±0, Длина митохондрий, мкм 0,7±0,1 0,47±0,07 0,6±0,1 0,45±0, Количество крист 8±1 6±2 6±1 5,0±0, ± – доверительный интервал, = 0, На бедной среде внесение ГВ способствовало также изменению формы митохондрий на более округлую, аналогичную наблюдаемой при культивировании гриба на богатой среде, и увеличению толщины содержащихся в них крист. На богатой среде при внесении ГВ наблюдали образование концентрических слоев, свидетельствующих о частичном разрушении митохондрий (рис. 6).
Бедная среда Богатая среда Без ГВ В присутствии ГВ Рис. 6 – ПЭМ срезов клеток T. maxima.
Данные, представленные в табл. 3, показывают, что при недостатке углерода толщина клеточной стенки и полиглюканового чехла клеток T. maxima значительно превышает аналогичные параметры для культуры, выращенной на богатой среде.
Внесение ГВ приводило к изменению толщины как клеточной стенки, так и полиглюканового чехла: на бедной среде при внесении ГВ наблюдается уменьшение этих показателей, а на богатой – увеличение. Снижение величин этих параметров при внесении ГВ в бедную среду указывает на возможность использования ГВ в качестве источника углерода. С другой стороны, на богатой среде, содержащей оптимальное количество питательных веществ, увеличение толщины клеточной стенки и полиглюканового чехла может объясняться созданием стрессовых условий для роста гриба, вызванных избытком питательных веществ в среде.
Таким образом, отмеченные изменения ультраструктур грибных клеток подтверждают ранее установленную способность T. maxima использовать ГВ в качестве источника углерода. Поэтому далее проводили оценку возможности поступления ГВ в клетки гриба.
Поступление ГВ в клетки T. maxima. Проведенные эксперименты показали, что ГВ интенсивно поглощаются грибным мицелием: через 24 ч инкубирования T. maxima с ГВ радиоактивность КЖ снижалась до (58±2)% и (31±2)% от начальной величины на бедной и богатой средах соответственно. Обнаруженная разница в уровнях снижения начальной радиоактивности связана, по-видимому, с различным количеством грибной биомассы: масса влажного мицелия на богатой среде была приблизительно в 6 раз больше, чем на бедной. При нормировании количества поглощенных грибами ГВ на единицу биомассы было установлено, что при отсутствии в среде глюкозы поглощение ГВ происходит более интенсивно (табл. 4).
Табл. 4 – Поглощение ГВ клетками T. maxima.
Поглощено ГВ, мг/г влажного мицелия Бедная среда Богатая среда Всего 1,1±0,2 0,52±0, Из них поступило внутрь грибных клеток 0,56±0,09 0,17±0, ± – доверительный интервал, = 0, Количество поглощенных грибами ГВ на бедной среде более чем в 2 раза превышало аналогичный показатель для богатой среды. Это хорошо согласуется с полученными ранее данными и свидетельствует о том, что при отсутствии в среде легкодоступного источника углерода взаимодействие грибов с ГВ происходит более интенсивно. На это же указывает рассчитанное количество ГВ, поступивших внутрь грибных клеток, которое снижалось от 0,56±0,09 на бедной среде до 0,17±0,02 мг/г на среде с глюкозой (табл. 4).
Влияние ГВ на дыхание T. maxima. Анализ параметров дыхательной активности выявил стабильно высокий уровень эндогенного клеточного дыхания исследуемого штамма (табл. 5). Значительное увеличение скоростей клеточного дыхания в присутствии ГВ наблюдали во всех вариантах культивирования, однако наиболее выраженный эффект проявлялся в случае выращивания гриба на бедной среде.
Табл. 5 – Влияние ГВ на дыхание T. maxima.
Скорость дыхания, нг ат. О/г сух. веса Вариант Бедная среда Богатая среда Без ГВ + ГВ Без ГВ + ГВ Контроль (без ингибиторов) 291±37 1507±111 398±57 956± KCN, 2 мМ 207±6 708±90 151±20 736± СГК, 2 мМ 84±29 527±15 175±28 277± KCN, 2 мМ + СГК, 2 мМ 9±6 60±45 20±20 10± ± – доверительный интервал, = 0,05, СГК – салицилгидроксамовая кислота При внесении KCN, ингибирующего цитохромный путь дыхания, дыхательная активность исследуемого штамма T. maxima сохранялась на достаточно высоком уровне (табл. 5), что свидетельствует о наличии альтернативного пути дыхания у данного гриба. Ранее возможность дыхания по альтернативному пути была показана для ряда базидиомицетов, таких как Phanerochaete chrysosporium, T. versicolor и др., однако для T. maxima это явление продемонстрировано впервые.
Соотношение скоростей основного и альтернативного путей дыхания, рассчитанное на основании скорости дыхания в присутствии СГК и KCN, составило 0,4 и 1,2 для бедной и богатой среды соответственно. Это свидетельствует о стрессовых условиях роста гриба при недостатке углерода, т.к. именно в таких условиях обычно наблюдают преобладание дыхания по альтернативному пути.
Внесение ГВ способствовало увеличению интенсивности дыхания, что указывает на участие ГВ в регуляции дыхания как по цитохромному, так и альтернативному пути. При этом на бедной среде было отмечено увеличение соотношения основного / альтернативного путей до 0,7, а на богатой – снижение до 0,4. Можно предположить, что внесение ГВ в богатую среду приводит к созданию стрессовых условий для роста гриба вследствие образующегося избытка питательных веществ в среде. Полученные результаты хорошо согласуются с ранее установленными изменениями в морфологии и ультраструктуре клеток T. maxima в этих условиях. Об этом же свидетельствует возрастание количества АФК на богатой среде в присутствии ГВ (табл. 6).
Табл. 6 – Влияние ГВ на продукцию АФК в клетках T. maxima.
Продукция АФК, отн. ед./мг сухого веса Бедная среда Богатая среда Без ГВ 620±13 905± В присутствии ГВ 190±133 2148± ± – доверительный интервал, = 0, Как видно из представленных в табл. 6 данных, влияние ГВ на продукцию АФК напрямую зависело от присутствия легкодоступного источника углерода. На бедной среде в присутствии ГВ наблюдали снижение продукции АФК, а на богатой – увеличение. При этом минимальную активность СОД наблюдали на богатой среде, тогда как на бедной среде этот показатель был в 1,8 раза выше. Внесение ГВ приводило к повышению активности СОД как на бедной, так и на богатой средах.
Отсутствие снижения АФК на богатой среде, несмотря на отмеченный рост СОД под действием ГВ, указывает на сложные процессы регуляции продукции АФК в этих условиях.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о непосредственном участии ГВ в регуляции дыхания T. maxima. Так как интенсивность дыхания тесно связана с присутствием глюкозы, далее изучали влияние ГВ на состав и содержание углеводов в цитозоле T. maxima.
Влияние ГВ на состав и содержание углеводов в цитозоле T. maxima.
Определение углеводов показало, что в цитозоле T. maxima они представлены, главным образом (90% от общего содержания), трегалозой и глюкозой;
в следовых количествах присутствовали также маннит, арабит и глицерин. Было установлено, что при росте гриба на бедной среде происходит снижение содержания трегалозы с 80 до 50%, сопровождающееся ростом концентрации глюкозы с 9 до 43% (рис. 7). Можно предположить, что образование глюкозы происходит за счет расщепления трегалозы.
Внесение ГВ не влияло на содержание трегалозы, но приводило к увеличению концентрации глюкозы в 1,1-1,6 раза. Возможно, причиной усиления дыхания на бедной среде в присутствии ГВ является интенсификация процесса гликолиза.
Бедная среда Богатая среда Содержание, % Содержание, % Трегалоза Без ГВ + ГВ Глюкоза 80 Без ГВ + ГВ 60 20 Время, ч Время, ч 0 0 10 20 0 10 20 Рис. 7 – Влияние ГВ на содержание трегалозы и глюкозы в цитозоле T. maxima.
На богатой среде наблюдали аналогичную тенденцию: в процессе роста культуры происходило снижение содержания трегалозы и возрастание – глюкозы. Однако в связи с оптимальным содержанием питательных веществ в среде начальная концентрация трегалозы была ниже, чем на бедной среде, и составляла 63%, а глюкозы, наоборот, выше, достигая 14%. Внесение ГВ, как и на бедной среде, сопровождалось повышением концентрации глюкозы в цитозоле в 1,4-2,5 раза.
Однако, в отличие от бедной среды, на богатой среде было также отмечено снижение концентрации трегалозы. Таким образом, ГВ могут усиливать дыхание T. maxima за счет интенсификации процесса гликолиза, обусловленной увеличением концентрации глюкозы в цитозоле. Для установления молекулярно-генетических механизмов этого явления было исследовано влияние ГВ на протеом и секретом T. maxima.
Влияние ГВ на протеом и секретом T. maxima. Проведенный сравнительный анализ белковых профилей T. maxima показал, что в присутствии ГВ происходит увеличение количества синтезируемых внутриклеточных белков с 365 до 451 и с до 511 на бедной и богатой средах соответственно. Эти данные свидетельствуют об активизации метаболизма T. maxima в присутствии ГВ.
Было установлено, что максимальные различия между белковыми профилями при внесении ГВ наблюдаются в 5 регионах 2D-электрофореграмм (рис. 8). Для бедной среды такими регионами были области с изоэлектрической точкой pI в диапазоне 3,95-4,55 и ММ от 66 до 77 кДа (регион I на рис. 8) и регион с pI 5,8-6,2 и ММ 26 27 кДа (регион II). На богатой среде дополнительно было выделено еще три региона:
pI 3,99-4,5 кДа и ММ 90-108 кДа (регион III);
pI 3,59-4,08 кДа и ММ 35-40 кДа (регион IV);
pI 3,47-6,23 и ММ 15-18 кДа (регион V).
Бедная среда Богатая среда Без ГВ 3 pH 11 3 pH 250 кДа 250 кДа III I 7 I ММ ММ II IV II 1 5 ?
?
V 10 ?
11 кДа 11 кДа В присутствии ГВ 3 pH 11 3 pH 250 кДа 250 кДа III I I ММ ММ II IV 14 II 12 45 ?
?
10 V ?
11 кДа 11 кДа Рис. 8 – Влияние ГВ на белковый профиль T. maxima.
В связи с недостатком информации о последовательностях внутримолекулярных белков T. maxima, удалось идентифицировать лишь 15 белков (отмечены арабскими номерами на рис. 8), для которых наблюдали преимущественно снижение интенсивности пятен. В частности, было выявлено снижение интенсивности пятен, относящихся к регуляторным белкам с широким спектром функций (14-3-3, марганец супероксиддисмутаза семейства Sod-Fe), регуляторам транскрипции (ДНК-зависимая РНК полимераза, ДНК-связывающий белок), НАДФ-зависимым оксидоредуктазам (короткоцепочечная дегидрогеназа/редуктаза) и компонентам цитоскелета (белок семейства актинов).
В то же время для каждой питательной среды были идентифицированы и белки, характеризующиеся увеличением интенсивности пятен на электрофореграммах. В присутствии ГВ возрастал синтез регуляторных белков с широким спектром действия. На бедной среде было отмечено увеличение синтеза белка FOXB семейства АТФаз, а на богатой – белка теплового шока БТШ70 и HSS1 – белка, регулирующего скорость пролиферации. Кроме того, было показано, что при внесении ГВ в бедную среду обнаруживаются ранее отсутствовавшие белки-гомологи шаперонов семейства DNAJ (БТШ 40) и субъединица фактора репликации ДНК С (RFC2), а на богатой – ferrichrome transport ATP-binding protein FhuC семейства ABC транспортеров.
Анализ секретома, напротив, показал снижение количества выделяемых белков в присутствии ГВ с 85 до 74 на бедной среде и с 226 до 110 на богатой. Было установлено снижение секреции лакказы, -глюканазы, /-гидролазы, фенолгидроксилазы, металлопротеиназы МЕР2 и белка – представителя семейства DHHC. Это свидетельствует о том, что ГВ выступают в качестве субстрата одновременно фенольной, полисахаридной и белковой природы.
Влияние ГВ на экспрессию генов основных метаболических путей синтеза и распада углеводов. Установленные эффекты ГВ, а также проведенный сравнительный анализ белковых профилей позволяют предположить, что ГВ влияют, прежде всего, на энергетический статус клетки. Так как энергию в форме молекул АТФ организмы получают в ходе клеточного дыхания, то были проанализированы уровни экспрессии генов, кодирующих ферменты основных путей метаболизма углеводов – основного субстрата для окисления при дыхании. В частности, была изучена экспрессия генов, кодирующих ферменты, участвующие в гликолизе, пентозофосфатном пути (ПФП), глюконеогенезе и цикле трикарбоновых кислот (ЦТК). При анализе уровней экспрессии генов ключевым фактором является выбор гена «домашнего хозяйства» (референсного гена). Для этого была проведена оценка изменения экспрессии трех генов-кандидатов при действии ГВ на базидиомицет.
Было показано, что лучшим кандидатом в качестве референсного гена является актин: стандартное отклонение Ct для него составило 0,72, что является наименьшим значением среди анализируемых генов, при стандартном отклонении ± 1Ct, а коэффициент корреляции r = 0,963. Для -актина и -тубулина T. maxima были установлены частичные нуклеотидные последовательности с использованием пар вырожденных праймеров (в ориентации 5’-3’): GGGCYAAGGGTYAYTAYAC и GGRATCCAYTCRACRAA для tub и GAYATGGARAAGATYTGG и TTYTCCTTGATGTCRCG для act [Einax and Voigt, 2003;
Wang et al., 2013].
Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с данными GenBank NCBI [URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov] с помощью ПО BLAST показало 96% идентичность с -актином Wolfiporia cocos (gb|DQ157753.1|) и 92% с -тубулином Schizophyllum commune H4-8 (ref|XM_001838247.2|). Корректность проведения ПЦР в реальном времени для исследуемых генов также подтверждали сравнением нуклеотидных последовательностей получаемых продуктов с имеющимися в базе данных GenBank.
Было установлено, что внесение ГВ влияет на экспрессию генов aco (кодирует аконитазу), eno (кодирует енолазу), gapdh (кодирует фосфоенолпируваткарбоксикиназу) и pgd (кодирует 6-фосфоглюконатдегидрогеназу) (рис. 9).
Бедная среда Богатая среда NE NE Без ГВ Без ГВ 1. 0. + ГВ + ГВ 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0.1 0. 0 aco eno gapdh pgd aco eno gapdh pgd Рис. 9 – Влияние ГВ на экспрессию генов aco, eno, gapdh и pgd T. maxima.
Как видно из рис. 9, в присутствии ГВ на обеих средах наблюдали повышение экспрессии eno, что подтверждает ранее полученные результаты об усилении процесса гликолиза и, как следствие, скорости дыхания под действием ГВ. На это же указывает снижение экспрессии pgd, свидетельствующее об уменьшении интенсивности окисления глюкозы в присутствии ГВ по ПФП. Однако корректная интерпретация полученных результатов требует проведения дополнительных исследований.
Биологическая активность продуктов взаимодействия базидиомицетов с ГВ Возможность получения и применения в сельском хозяйстве БП на основе базидиомицетов практически не изучена, хотя известно, что эти микроорганизмы способствуют усилению азотного и фосфорного питания растений, защищают их от патогенов и экотоксикантов. Так как базидиомицеты способны деградировать природные полимеры, при культивировании их в присутствии ГВ угля можно получать БП, содержащие в качестве действующего начала наряду с грибными штаммами также ГВ, обладающие собственной биологической активностью.
Наши исследования показали, что внесение в почву БП на основе КЖ, получаемой при культивировании базидиомицетов в присутствии угля (КЖУ) привело к значимому ( = 0,05) повышению в редисе содержания витамина С – одного из основных показателей пищевой ценности корнеплодов. В контрольном варианте (обработка почвы водопроводной водой) и варианте с обработкой КЖ, величины этого показателя не различались между собой и составили 15,6±1,8 и 14,0±1,5 мг/100 г соответственно, тогда как в варианте КЖУ аналогичная величина достигала 21,7±1,1 мг/100 г.
Эксперименты, проведенные на почве, искусственно загрязненной атразином, позволили выявить также наличие детоксифицирующей способности грибных БП (рис. 10).
Бедная среда Богатая среда 100 % от контроля 100 % от контроля Длина Масса Длина Масса T. hirsuta T. maxima T. hirsuta T. maxima 80 А КЖ КЖУ КЖ КЖУ А КЖ КЖУ КЖ КЖУ Рис. 10 – Детоксифицирующая способность БП на основе культуральных жидкостей базидиомицетов T. hirsuta и T. maxima по отношению к атразину (а).
Как видно из рис. 10, в присутствии БП наблюдали увеличение, как длины побегов, так и биомассы растений. Это указывает на перспективность проведения дальнейших исследований, направленных на изучение БП на основе грибов – возбудителей белой гнили.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что при трансформации ГВ под действием грибов – возбудителей белой гнили одновременно протекают как деструктивные, так и конденсационные процессы. Общее направление модификации – восстановительная дегидратация или окислительное деметилирование – определяется физиолого-биохимическими особенностями штамма.
2. Показано, что ГВ могут быть использованы базидиомицетами как источник углерода: в присутствии ГВ накопление биомассы грибами возрастает в случае T. hirsuta в 1,1-1,2 раза, а в случае T. maxima в 1,4-2,6 раза.
3. Установлено, что внесение ГВ приводит к изменению ряда морфологических характеристик и параметров ультраструктур T. maxima: длины митохондрий, толщины клеточной стенки и полиглюканового чехла гиф.
4. Впервые показано поступление ГВ в клетки базидиомицетов и проведена количественная характеристика этого процесса. При росте гриба на бедной среде на мицелии сорбируется 1,1±0,2, а проникает в грибные клетки 0,56±0,09 мг ГВ/г сырого веса мицелия. На среде с глюкозой аналогичные показатели составляют 0,52±0,05 и 0,17±0,02 мг ГВ/г сырого веса мицелия соответственно.
5. На примере T. maxima впервые выявлено влияние ГВ на основные физиолого биохимические параметры: накопление полифосфатов, увеличение интенсивности дыхания 2,5-5 раз и повышение концентрации глюкозы в цитозоле на 20-50%.
Показано участие ГВ в регуляции дыхания как по цитохромному, так и альтернативному пути.
6. На основании сравнительного анализа протеомных профилей установлено, что внесение ГВ приводит к увеличению количества внутриклеточных белковых компонентов с 365 до 461 и с 448 до 551 на бедной и богатой среде соответственно.
Установлено, что на бедной среде возрастает синтез белка FOXB семейства АТФаз, а на богатой – БТШ70 и HSS1.
7. Впервые установлено, что ГВ влияют на уровень экспрессии генов, кодирующих ферменты углеводного обмена T. maxima: показано повышение экспрессии гена eno, кодирующего енолазу, участвующую в процессе гликолиза, и снижение экспрессии гена pgd, кодирующего 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, участвующую в пентозофосфатном цикле.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:
1. Куликова Н.А., Кляйн О.И., Степанова Е.В., Королева О.В. 2011. Использование базидиальных грибов в технологиях переработки и утилизации техногенных отходов:
фундаментальные и прикладные аспекты (обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 2011, т. 47, №6, с. 619-634.
2. Кляйн О.И., Куликова Н.А., Степанова Е.В., Софьин А.В., Филиппова О.И., Ландесман Е.О. Королева О.В. 2011. Влияние биопрепаратов на основе базидиальных грибов на урожайность и качество редиса. Проблемы агрохимии и экологии. 2011, №3, 36-39.
3. Кляйн О.И., Николаев И.В., Куликова Н.А., Степанова Е.В., Королева О.В. Влияние органических и минеральных удобрений на антиоксидантную емкость почв. Вестник Московского государственного университета леса – Лесной вестник, 2012, №1, 109-111.
4. Королёв А.В., Куликова Н.А., Филиппова О.И., Ландесман Е.О., Кляйн О.И., Королёва О.В. Получение компоста с использованием биопрепарата на основе базидиомицета Trametes hirsuta. Проблемы агрохимии и экологии, 2012, №1, 9-13.
5. Терехова В.А., Королева О.В., Рахлеева А.А., Куликова Н.А., Ландесман E.O., Кляйн О.И. Грибные препараты для деградации лигнинсодержащих отходов: оценка биобезопасности. Теоретическая и прикладная экология, 2012, №3, 19-23.
6. Кляйн О.И., Куликова Н.А., Константинов А.И., Федорова Т.В., Ландесман Е.О., Королева О.В. Трансформация гуминовых веществ высокоокисленного бурого угля базидиальными грибами Trametes hirsuta и Trametes maxima. Прикладная биохимия и микробиология, 2013, т. 49, №3, 292–300.
7. Кляйн О.И., Куликова Н.А., Степанова Е.В., Филиппова О.И., Федорова Т.В., Малошенок Л.Г., Филимонов И.С., Королева О.В. Получение и характеристика биологической активности биопрепаратов, полученных при биосолюбилизации бурого угля базидиальными грибами белой гнили. Биотехнология, 2013, №4, 65–83.
8. Фёдорова Т.В., Шахова Н.В., Кляйн О.И., Глазунова О.А., Малошенок Л.Г., Куликова Н.А., Псурцева Н.В. Королева О.В. Сравнительный анализ лигнолитического потенциала базидиальных грибов, принадлежащих к различным таксономическим и экологическим группам. Прикладная биохимия и микробиология, 2013, т. 49, №6, 1–10.
Статьи в сборниках и тезисы докладов:
1. Klein O., Stepanova E., Kulikova N., Koroleva O. Coal biodegradation by basidiomycetes for production of biofertilizers and soil conditioners. In: From Molecular Understanding to Innovative Applications of Humic Substances;
Proceedings of the 14th International Meeting of the International Humic Substances Society, September 14-19, 2008, Moscow – Saint Petersburg, Russia, Editors: I. V. Perminova, N. A. Kulikova, Vol. II, Humus Sapiens, Moscow, pp. 663-666.
2. Nikolaev I., Klein O., Kulikova N., Stepanova E., Koroleva O. Development and validation of antioxidant capacity assessment protocol for humic and humic-like substances. In: From Molecular Understanding to Innovative Applications of Humic Substances;
Proceedings of the 14th International Meeting of the International Humic Substances Society, September 14-19, 2008, Moscow – Saint Petersburg, Russia, Editors: I. V. Perminova, N. A. Kulikova, Vol. II, Humus Sapiens, Moscow, pp. 441-444.
3. Кляйн О.И., Николаев И.В., Куликова Н.А., Степанова Е.В., Королева О.В. Оценка антиоксидантной емкости гуминовых и гуминоподобных веществ. Тезисы VIII Межд. конф.
Биоантиоксидант. Отделение химии и наук о материалах, РФФИ, Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, Институт химической физики им. Н.Н Семенова РАН, 4- октября 2010 г., Москва.
4. Klein O.I., Kulikova N.A., Stepanova E.V., Koroleva O.V. Biotransformation of coal-derived humic acids by Basidiomycetes.
Abstract
Book of conf. «Humic substances and phytohormones in agriculture. Radostim-2009». Dnepropetrovsk, Feb. 16-18, 2010, p. 44-45.
5. Куликова Н.А., Бадун Г.А., Чернышева М.Г., Цветкова Е.А., Константинов А.И., Коробков В.И., Кляйн О.И., Степанова Е.В., Королева О.В., Перминова И.В. Получение меченных тритием природных биологически активных соединений нестехиометрического строения и переменного состава: перспективы биологических исследований. Тезисы докладов научно-практической конференции «Биологически активные вещества:
фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». 23-28 мая 2011, Новый Свет, АР Крым, Украина, с. 6. Кляйн О.И., Исакова Е.П., Дерябина Ю.И., Куликова Н.А., Степанова Е.В., Королева О.В. Оценка интенсивности клеточного дыхания базидиомицета Trametes maxima.
Материалы международной школы-конференции молодых учёных, посвященной 80-летию Брянской государственной инженерно-технологической академии и профессору В.П.
Тимофееву «Молекулярная биология и биотехнология леса», 12-18 сентября 2011 г., Брянская государственная академия, с. 80-81.
7. Степанова Е.В., Кляйн О.И., Куликова Н.А., Королева О.В. Использование базидиальных грибов в технологиях переработки и утилизации отходов. Материалы международной школы-конференции молодых учёных, посвященной 80-летию Брянской государственной инженерно-технологической академии и профессору В.П. Тимофееву «Молекулярная биология и биотехнология леса», 12-18 сентября 2011 г., Брянская государственная академия, с. 102-103.
8. Klein O., Kulikova N., Badun G., Chernysheva M., Koroleva O. Interaction of Coal Humic Substances with White Rot Fungi: an Approach with Tritium Labeled Preparations. Abstract Book of the Second International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies «Natural and engineered nanoparticles in clean water and soil technologies», October 29 to November 2, 2012, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia, p. 23.
9. Кляйн О.И., Исакова Е.П., Дерябина Ю.И., Куликова Н.А., Королева О.В. Сигнальная роль активных форм кислорода в реализации адаптивного ответа на ограничение питания у базидиомицета Trametes maxima. Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 27-30 мая 2013 г., издательский дом В. Ема, Москва, т. 2, с. 677-681.
Работа выполнена при финансовой поддержке Государственных контрактов №П «Использование базидиальных грибов в технологиях переработки и утилизации техногенных отходов: фундаментальные и прикладные аспекты», №16.512.11.2028 «Разработка методов получения биопрепаратов для переработки жидких и твердых отходов сельскохозяйственных животных», соглашения о предоставлении гранта в форме субсидии № 8111 «Изучение молекулярных и клеточных механизмов взаимодействия гуминовых веществ с грибами класса Basidiomycetes».