Особенности роста и водного обмена растений пшеницы и ячменя с различной солеустойчивостью при натрий-хлоридном засолении
На правах рукописи
ШАРИПОВА ГУЗЯЛЬ ВАКИЛЬЕВНА ОСОБЕННОСТИ РОСТА И ВОДНОГО ОБМЕНА РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ И ЯЧМЕНЯ С РАЗЛИЧНОЙ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТЬЮ ПРИ НАТРИЙ-ХЛОРИДНОМ ЗАСОЛЕНИИ 03.00.16.-Экология 03.00.12 - Физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа –2007
Работа выполнена в лаборатории физиологии растений Института биоло гии Уфимского научного центра Российской Академии наук
Научный консультант: кандидат биологических наук Веселов Дмитрий Станиславович Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Высоцкая Лидия Борисовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Зялалов Абдуллазян Абдулкадырович доктор биологических наук, профессор Усманов Искандер Юсуфович Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет
Защита состоится 13 ноября 2007 г. в 14.00 часов на заседании Регио нального диссертационного совета КМ 002.136.01 при Институте биоло гии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Ок тября, 69, тел./факс 8 (347) 235-62-47, е-mail: [email protected]
Автореферат разослан ………октября 2007 г.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.
Ученый секретарь Диссертационного совета к.б.н., доцент Р.В. Уразгильдин Актуальность. Засоление – один из наиболее важных абиотических факто ров внешней среды, приспособление к которому определяет способность расте ний выживать в этих условиях и давать урожай. Возделываемые виды и сорта растений различаются по чувствительности к засолению (Строгонов, 1962;
Flowers, 2004). На начальных этапах онтогенеза устойчивость растений к засо лению четко определяется по активности ростовой функции. С точки зрения агрономии наиболее важным критерием солеустойчивости является урожай ность растений на засоленных почвах. Однако отбор солеустойчивых форм в полевых условиях осложняет неравномерность распределения засоленных уча стков (Munns, 2005). Поэтому не прекращается поиск способов оценки устой чивости растений к засолению в контролируемых лабораторных условиях. Для того чтобы повысить эффективность отбора, необходимо хорошо понимать, как формируется солеустойчивость. В действии засоления на растения выделяют два фактора: токсический компонент, связанный с накоплением ионов (прежде всего, ионов натрия) в цитоплазме и дефицит воды (осмотический компонент), обусловленный присутствием избытка ионов в почве (Neumann, 1993). Основ ное внимание исследователей привлекает изучение механизмов, обеспечиваю щих ионный гомеостаз при засолении (Yeo, 1998). При этом осмотический компонент воспринимается скорее как фактор, маскирующий проявление ток сического компонента (Munns et al., 2002). Вместе с тем, осмотический и токси ческий компоненты в какой-то мере взаимосвязаны: токсичные ионы поступа ют в растение с транспирационным потоком, а их накопление нарушает водный обмен (например, функционирование устьичного аппарата (Robinson et al., 1997)). Однако в литературе можно найти не так много сведений об особенно стях регуляции водного обмена у растений, различающихся по солеустойчиво сти, и эти сведения разрознены и противоречивы (Костюк и др., 1994;
Леонова и др., 2005). Так, можно встретить утверждения, что устьичная проводимость выше у солеустойчивых растений (Volkov et al., 2004), а также противополож ные сведения о том, что она выше у чувствительных к засолению растений (Rivell et al., 2002). Все сказанное свидетельствует о недостаточном внимании к проблеме регуляции водного обмена растений на фоне засоления, что опреде лило актуальность нашей работы.
Цель работы состояла в выявлении особенностей регуляции роста и водного обмена при натрий-хлоридном засолении у растений, различающихся по соле устойчивости. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести сравнительное изучение водного обмена относительно солеустой чивых растений ячменя Hordeum vulgare (сорт Golf) и более чувствительных к за солению растений твердой пшеницы Triticum durum (сорт Безенчукская 139) и выявить особенности их устьичной и ростовой реакции при кратковременном и длительном действии засоления.
2. Оценить значение аквапорина семейства HvPIP2;
4 в регуляции водного обмена при засолении путем сопоставления уровня экспрессии гена, гидравли ческой и устьичной проводимости у линий растений Hordeum spontaneum, раз личающихся по солеустойчивости.
3. С помощью изучения контрастных по засохоустойчивости растений яч меня выявить значимость регуляции устьичной проводимости и транспирации в ограничении потока ионов и предотвращении их токсичного действия, а также поддержании газообмена, фотосинтеза и роста в условиях засоления.
4. Провести сравнительное изучение уровня накопления абсцизовой кисло ты (АБК) и скорости закрытия устьиц у растений, различающихся по засухоус тойчивости, при кратковременном действии хлорида натрия, с целью подтвер ждения (или опровержения) гипотезы о том, что АБК контролирует интенсив ность транспирационного потока на начальном этапе действия засоления.
5. Провести сравнительный анализ особенностей водного обмена и роста на засолении растений пяти сортов ячменя из коллекции ВИР с целью проверки воспроизводимости закономерностей, обнаруженных при изучении растений контрастных по солеустойчивости и засухоустойчивости.
Научная новизна. Впервые проведено сравнение экспрессии гена аквапо рина Hv PIP2;
4 растений разных линий Hordeum spontaneum (дикий вид ячме ня) и показана связь уровня экспрессии с изменением гидравлической и усть ичной проводимости, а также более выраженное снижение экспрессии гена, гидравлической проводимости и транспирации у солеустойчивой линии. Срав нительное изучение устьичной реакции на засоление у относительно соле устойчивых и чувствительных к засолению видов, сортов и линий растений по казало, что способность растений быстро закрывать устьица при кратковремен ном действии засоления необходима для формирования солеустойчивости рас тений. Уровень накопления АБК в листьях был выше у тех растений ячменя, у которых сильнее снижалась устьичная проводимость, что подтвердило роль этого гормона в регуляции транспирационного потока при засолении. Обнару жена связь между уровнем накопления ионов хлора и способностью растений быстро снижать транспирационный поток при засолении. Показано, что харак тер связи между уровнем транспирации и солеустойчивостью меняется при длительном действии засоления: в этом случае, в отличие от кратковременного действия засоления, более высокий уровень транспирации обнаружен у соле устойчивых сортов ячменя, что коррелирует с их способностью быстрее накап ливать биомассу.
Практическая значимость работы. Обнаружены особенности водного обмена у солеустойчивых форм, которые проявляются в быстром снижении уровня экспрессии генов аквапоринов, снижении гидравлической проводимо сти и транспирации, что ограничивает приток токсичных ионов и их негативное действие на растения. Показано, что при длительном действии засоления при знаком более высокой солеустойчивости растений является относительно вы сокий уровень их устьичной проводимости. Эти показатели могут быть исполь зованы в системе оценки селекционного материала в процессе отбора соле устойчивых форм.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), VI съезде общества физиологов рас тений России (Сыктывкар, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК России.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, вы водов и списка цитируемой литературы, включающего _наименования, в том числе _на иностранных языках. Работа изложена на _страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 6 таблиц.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводили в лабораторных условиях на растениях ячменя (Hordeum vulgare, сортов Golf, Прерия, Михайловский, Ранний, Красноярский 1, Красноярский 80, Porvenir и Riso-1058;
Hordeum spontaneum, линий Т1 и 20-45), и яровой твердой пшеницы (Triticum durum Desf., сорт Безенчукская 139) в вод ной культуре. Семена ячменя и пшеницы проращивали в темноте в течение 2 3 суток на дистиллированной воде с добавлением 10-5 M CaCl2, при температу ре 24С. Семисуточные проростки пересаживали на 10 % среду Хогланда Арнона-I и выращивали при освещенности 18 клк и 14-часовой продолжитель ности светового дня. Для длительных экспериментов растения пересаживали на 100 % питательную среду Хогланда-Арнона-I и выращивали в контейнерах из оргстекла. Для предотвращения оксидативного стресса питательную среду не прерывно аэрировали воздухом с помощью микрокомпрессоров. Контейнеры оборачивали светонепроницаемой бумагой во избежание подавления роста корневой системы. Засоление вызывали добавлением в питательный раствор хлорида натрия до конечной концентрации 100 mM (опыт). Эта концентрация NaCl наиболее часто используется в физиологических экспериментах по изуче нию действия засоления (Fricke, 1997;
Munns, 1993;
Neumann, 1997). Водный дефицит создавали, добавляя непроникающее из питательного раствора в корни растений нейтральное осмотически активное вещество полиэтиленгликоль (ПЭГ) до конечной концентрации 13 %. Оба вещества создавали в питательной среде осмотическое давление равное 0,5 МПа.
Транспирацию определяли весовым методом. Осмотический потенциал определяли с помощью осмометра CAMLAB (Великобритания) по температуре замерзания. Концентрацию хлорид-ионов определяли с помощью метода ка пиллярного электрофореза на ионном анализаторе «Нанофор 01». Относитель ное содержание воды (ОСВ) определяли в дифференцированной части листа растений. Измерение проводили согласно описанной методике (Pardossi et al., 1992). ОСВ рассчитывали по формуле: ОСВ(%)=100(сырой вес–сухой вес)/(тургорный вес–сухой вес). Содержание воды рассчитывали по формуле:
СВ(%)=100(сырой вес–сухой вес)/сырой вес. Экспрессию гена HvPIP2;
1 оце нивали с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Гидравлическую проводимость растений рассчитывали по аналогии с зако ном Ома (Carvajal et al., 1996). Движущей силой потока воды была разность ос мотических потенциалов между питательной средой и ксилемным экссудатом.
Устьичную проводимость растений определяли с помощью автоматического порометра Mk3 (Англия). Измерения длины и ширины листьев проводились с помощью металлической линейки с шагом 0,05 см. Площадь листьев находи ли с помощью их сканирования и анализа полученного изображения. Содержа ние хлорофиллов a и b определяли в аликвоте 96% этилового спирта, полу ченной из навески побегов. Оптическую плотность раствора измеряли при дли нах волн 663 и 644 нм на спектрофотометре СФ-56 (LOMO, Russia). Расчет вели по формулам Реббелена (Методы биохимического анализа, 1978). Для опреде ления содержания гормонов растительный материал гомогенизировали и экс трагировали 80 % этанолом. Экстракцию АБК из аликвоты водного остатка проводили диэтиловым эфиром (Кислин и др., 1985). Содержание гормонов в растительном материале определяли с помощью твердофазного иммунофер ментного анализа по модифицированной методике (Kudoyarova et al., 1998).
Статистическую обработку проводили по стандартным программам MS Excel.
Все эксперименты повторяли не менее трех и более биологических повторений (n).
На рисунках и в таблицах приведены средние значения показателей и ошибки средних.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние засоления на рост и водный обмен растений ячменя (Hordeum vulgarе) и пшеницы (Triticum durum) Среди возделываемых растений нет галофитов и большинство важнейших сельскохозяйственных культур чувствительны к действию засоления (Балнокин и др., 2005). Однако среди них выделяются виды и сорта, обладающие относи тельной устойчивостью к неблагоприятному воздействию токсичных ионов.
Представляется важным использовать более устойчивые к засолению сельско хозяйственные культуры в областях с повышенной засоленностью почв.
Для проведения опытов нами были выбраны растения ячменя и пшеницы, различающиеся по со % от контроля леустойчивости (Munns et al., 2000). Добавление в питательную среду хлорида натрия до конеч ной концентрации 100 мМ при вело к снижению устьичной про 24 48 72 водимости растений пшеницы и Время после добавления NaCl, ч Рис.1. Влияние засоления на устьичную прово- ячменя по сравнению с кон трольными растениями (рис. 1).
димость растений ячменя и пшеницы (n=8) Поскольку растения ячменя и пшеницы различались по уровню устьичной проводимости, результаты пред ставлены как процент от значений контрольных растений, которые не подвер гались действию засоления. На вторые сутки засоление вызывало снижение устьичной проводимости на 30 % у растений пшеницы и на 40% у растений яч меня. На третьи сутки снижение составило 40% у чувствительного к засолению вида (пшеница) и 70% у устойчивого (ячменя).
Таким образом, сначала уменьшение устьичной проводимости было силь нее выражено у более устойчивых растений ячменя. Но уже на четвертые сутки экспозиции картина изменилась. В то время, когда устьичная проводимость подвергнутых засолению растений пшеницы оставалась низкой, у растений яч меня этот показатель вернулся к контрольным значениям.
В результате добавления в питательный раствор хлорида натрия до конеч ной концентрации 100 мМ происходило снижение его водного потенциала, что затрудняло поглощение воды растениями. Вода переставала поступать в корень из-за исчезновения градиента водного потенциала между средой корнеобитания и клетками корня (осмотический компонент действия засоления). Закрытие устьиц является реакцией на снижение доступности воды. В наших экспери ментах после первоначального снижения устьичной проводимости (на 70 % по сле трех суток воздействия по сравнению со значениями контрольных расте ний), к четвертым суткам действия засоления у растений ячменя наблюда лось резкое увеличение этого показателя (до 90 % от контрольных величин). По всей видимости, у растений ячменя существует защитный механизм, позво ляющий поддерживать более высокую устьичную проводимость и, соответст венно, более высокий уровень фотосинтеза, что дает возможность растениям продолжать свой рост в новых, экстремальных условиях. У растений пшеницы уровень устьичной проводимости был почти в два раза ниже, чем в контроле, начиная с 72 часов действия засоления, что неизбежно должно было сказаться на фотосинтетической активности. Отрицательное действие засоления на фото синтетический аппарат проявляется не только в нарушении газообмена, но и в снижении количества пигментов (Cramer et al., 1988;
Herradle et al., 1998). Дей ствительно, на девятые сутки действия засоления концентрация хлорофилла уменьшалась в большей степени у растений пшеницы по сравнению с расте ниями ячменя (табл. 1).
Таблица - Концентрация хлорофилла (мг·г сырой массы) в побеге после 9 суток воздействия хло рида натрия (n=5) Растение Вариант a b a+b Ячмень контроль 4,4±0,2 4,6±0,2 8,7±0, 3,5±0,3 3,4±0,3 6,7±0, NaCl % от контроля 80,6±9,0 75,1±9,6 77,5±10, Пшеница контроль 4,1±0,2 4,0±0,2 7,8±0, 2,7±0,1 2,2±0,5 5,1±0, NaCl % от контроля 66,4±2,7 53,7±12,9 64,7±1, Подавление функционирования фотосинтетического аппарата в условиях засоления неизбежно приводит к ингибированию роста побега. Измерение дли ны листьев показало, что к 9 суткам действия засоления рост третьего и четвер того листа ячменя подавлялся в меньшей степени, чем у растений пшеницы (рис. 2). Снижение содержания хлорофилла, которое было сильнее выражено у а в 120 % от контроля % от контроля 40 20 7 8 0 1 2 б г 120 % от контроля % от контроля 60 0 0 1 2 3 4 7 8 9 Рис. 2. Влияние засоления на рост первого (а), второго (б), третьего (в) и четвертого (г) листьев растений ячменя и пшеницы. На осях абсцисс представлены сутки после начала действия засоления (n=40) растений пшеницы, является индикатором подавления фотосинтеза (табл. 1), и более выраженное ингибирование прироста побегов у растений пшеницы можно объяснить тем, что у них уровень фотосинтетических процессов при засолении был подавлен в большей степени, чем у растений ячменя. К 9 сут кам засоления было зарегистри ровано снижение накопления биомассы побега, которое наибо- лее значимо проявилось у расте- % от контроля ний пшеницы (рис. 3). В случае корней различий по биомассе не наблюдалось. Это можно объяс- нить тем, что дефицит воды, вы- званный засолением, влияет на побег корень рост корней гораздо в меньшей степени, чем на рост побегов Рис. 3. Сухая масса растений ячменя и пше ницы через 9 суток с начала засоления (n=20) (Frensch, 1997). То, что у растений ячменя наблюдалось даже увеличение массы корней по сравнению с контролем, по-видимому, связано с удлинением корней как адаптивной реакцией на дефи цит воды.
Таким образом, характер различий реакций растений пшеницы и ячменя на засоление менялся со временем. При кратковременном действии засоле ния растения ячменя, в отличие от пшеницы, сильнее закрывали устьица, что позволяло им в большей степени восстанавливать свои ростовые функции в первые часы стресса за счет ограничения транспирационных потерь и повыше ния доступности воды для роста растений. При более длительном засолении картина была обратной. В этом случае уровень устьичной проводимости у рас тений ячменя был выше, что обеспечивало нормальный газообмен и позволя ло фотосинтетическому аппарату функционировать с большей интенсивностью (косвенным подтверждением этого предположения являются наши данные по содержанию хлорофилла), в результате чего в меньшей степени угнетался при рост биомассы побега.
2. Изучение водных отношений и роль аквапоринов в реакции расте ний на засоление на примере двух линий ячменя Hordeum spontaneum Т1 и 20-45, контрастных по солеустойчивости Сравнение реакции на засоление у растений пшеницы и ячменя показало важное значение механизмов, обеспечивающих поддержания водного обмена для формирования солеустойчивости. Помимо непосредственного токсичного действия ионов, при засолении также нарушаются водные отношения в расте ниях. Гидравлическая проводимость на пути воды от клетки к клетке зависит от количества и активности аквапоринов (Morillon and Chrispeels, 2001). Аквапо рины – это белки мембраны, формирующие каналы для воды. Действие этих каналов связано с контролем движения воды в растении, что особенно важно при засухе и засолении (Yeo, 1998). Хотя цитоплазматическая мембрана обла дает меньшей проницаемостью для воды, чем тонопласт, ее гидравлическая проводимость более вариабельна, что указывает на важность функционирования аквапоринов цитоплазматической мембраны (PIP аквапорины) (Javot and Maurel, 2002). Семейство аквапоринов PIP2 наиболее ярко представлено в корнях (Javot et al., 2003;
Chaumont, et al., 2000) и экспрессия PIP2;
4 гена в растениях кукурузы была признана неспецифической реакцией на засоление (Zhu et al., 2005).
Растения ячменя являются традиционным объектом изучения аквапоринов в условиях дефицита воды из-за преобладания трансклеточного пути транспор та воды (Steudle and Jeschke, 1983). Для получения более полной картины отве та растений на солевой стресс на следующем этапе нашей работы были изуче ны водные отношения и вклад аквапоринов в реакцию растений на засоление на примере двух, различающихся по солеустойчивости, линий ячменя Т1 (чувст вительная) и 20-45 (устойчивая).
Концентрацию хлорида натрия повышали постепенно, увеличивая её ка ждые сутки на 25 мМ до конечной величины 75 мМ. В первые 2 часа с начала действия засоления скорость транспирации у растений обоих линий ячме ня снижалась в равной степени (рис. 4). Значительное ингибирование этого процесса было зафиксировано через 24 часа после начала засо- ления у 20-45 растений, в то вре- % от контроля мя, как у Т1 растений транспира- ция уменьшалась в меньшей сте пени.
Через 3 часа после увеличе ния концентрации хлорида на- 0 0.5 2 24 трия с 50 мМ до 75 мМ снижение Длительность засоления, ч гидравлической проводимости Рис. 4. Влияние засоления на транспирацию:
- Т1, - 20-45 (n=30) корней у линии Т1 составило примерно 20% от контроля, а у линии 20-45 гидравлическая проводимость снижалась в 2 раза (абсолютные значения приведены в диссертации).
Изменение во времени экс прессии гена аквапорина для Т1 1, 1, Условные единицы и 20-45 растений при засолении 1, представлено на рисунке 5. Сни- 1, жение экспрессии у 20-45 расте- 0, ний стало статистически значи- 0, мым через 2 часа действия хло- 0, рида натрия и осталось на таком 0, уровне до конца эксперимента. 0 0,5 2 24 Уменьшение экспрессии гена ак- Длительность засоления, ч вапорина у Т-1 растений наблю- Рис. 5. Изменение в уровне транскрипции гена далось спустя 24 часа после на- аквапорина PIP 2;
4 (экспрессия представлена по отношению к контролю) при действии на чала действия засоления. Разница трий-хлоридного засоления:
- Т1, - 20-45 (n=5) между двумя линиями растений в степени ингибирования транспирации становится заметной позже, чем разли чия в уровне экспрессии гена аквапорина, поскольку требуется время, чтобы изменения в экспрессии гена привели к яркому физиологическому эффекту.
Почему у толерантных к засолению растений снижается гидравлическая проводимость, в результате чего затрудняется поступление воды в побег, ко торое уже и так проблематично из-за уменьшения доступности воды в засо ленном растворе? Возможно, снижение гидравлической проводимости линии 20- позволяет растениям сохранять оводненность корней в условиях дефицита воды. У солеустойчивой линии 20-45 содержание воды в корнях снижалось лишь на 1 %, в то время как у чувствительной линии Т-1 – на 3 %. Кроме того, из-за уменьшения гидравлической проводимости снижается поступление ток сичных ионов в корни растений через неспециализированные ионные каналы (Davenport and Tester, 2000).
Основной показатель жизнеспособности растений – это прирост их биомас сы. Засоление ингибировало рост всех листьев (кроме первого) у обеих линий растений. Во всех случаях рост листьев тормозился в большей степени у линии Т1 (рис. 6).
А Б % от контроля % от конторля 60 50 3 6 9 6 9 Сутки с начала действия NaCl Сутки с начала действия NaCl Г В % от контроля % от контроля 60 50 13 17 20 17 Сутки с начала действия NaCl Сутки с начала действия NaCl Рис. 6. Изменение длины листьев растений ячменя при действии 75 мМ хлорида на трия:
- Т1, - 20-45 (а – второй лист, б – третий лист, в – четвертый лист, г – пятый лист (n=40) Способность к накоплению биомассы определяется интенсивностью фото синтеза, что в свою очередь зависит от содержания поглощающих свет пиг ментов. Содержание хлорофилла a +b снижалось в большей степени у линии Т по сравнению с 20-45 (рис. 7).
В фазе раннего ответа на со левой стресс для растения важно как можно быстрее «почувство- % от контроля вать» угрозу и запустить в дейст- вие долговременную стратегию, которая позволит ему справиться со стрессом не только в первое время его действия. Растения ли- Т нии 20-45 успешнее справились с 20- преодолением неблагоприятного Рис.7. Содержание хлорофилла a + b в листьях действия засоления. Вероятно, ячменя на двадцатые сутки действия засоления резкое снижение гидравлической (n=5) проводимости у линии 20-45 – это своеобразный сигнал, который поступает из корней в побеги, передавая ин формацию о развитии водного дефицита в корнях и, по всей видимости, запус кает каскад защитных реакций.
Снижение уровня транспирации считается первичным ответом на солевой стресс (Robinson et al, 1997). Физиологический смысл этого явления заключается в том, что побег теряет меньше воды, т.е. компенсирует снижение поступления воды из корней уменьшением ее испарения с поверхности листа через устьичные щели. Таким образом, «сэкономленная» вода может поступать в растущие клет ки и способствовать частичному восстановлению ростовых процессов.
Кроме того, в результате снижения интенсивности работы «верхнего кон цевого двигателя» у поверхности корней меньше концентрируется токсичных ионов. Показано, что растения, не способные в этих условиях закрывать усть ица, ожидает обезвоживание и гибель (Volkov et al., 2003). Изменение устьич ной проводимости позволяет растениям адаптироваться к условиям окружаю щей среды (Jones, 1998). В наших экспериментах транспирация в большей степе ни снижалась у растений, отличающийся большей солеустойчивостью (20-45), чем у чувствительных к засолению растений (Т1). Этот факт подтверждает ги потезу о том, что снижение транспирации в условиях засоления необходимо для минимизирования поглощения токсичных ионов и способствует запуску механизмов солеустойчивости растений. Наблюдаемое нами изменение в экс прессии аквапоринов может быть ответственно за последующее снижение гид равлической проводимости, обеспечивающее сохранение оводненности корней, закрытие устьиц и ингибирование транспирации.
3. Использование сортов Прерия и Михайловский для изучения влия ния засоления на растения ячменя В первых сериях экспериментов мы использовали виды, которые судя по дан ным литературы, должны были отличаться по солеустойчивости (пшеница и яч мень) и линии, заранее отобранные по чувствительности к хлориду натрия (Т1 и 20-45). Представляло интерес проверить солеустойчивость сортов, районирован ных в нашей Республике, которые не были ранее охарактеризованы в этом плане.
Было необходимо выяснить, будут ли у них работать механизмы солеустойчиво сти, характерные для ранее изученных нами растений. В ходе предварительных экспериментов нами были выбраны два сорта ячменя, отличающиеся по засухоус тойчивости (Прерия - засухоустойчивый, Михайловский - влаголюбивый).
Транспирация растений обоих сортов снижалась уже через 15 минут после до бавления соли в питательный раствор (рис. 8 А). Угнетение транспирации за счет закрытия устьиц было ожидаемой реакцией на снижение доступности воды при 110 А Б 100 % от контроля % от контроля 24 ч 48 ч 5 сут 0 15 30 45 60 75 Длительность засоления Время, мин Рис. 8. Влияние кратковременного (А) и длительного (Б) засоления на транспирацию растений ячменя сортов Михайловский и Прерия (n=20) засолении в результате уменьшения осмотического потенциала питательной среды. Наблюдения за растениями в течение 90 минут показали, что транс пирация под влиянием засоления снижалась сильнее у растений сорта Пре рия, чем у растений сорта Михайловский. Эти различия были небольшими и не превышали 10-15%. На следующие сутки солевого стресса скорость транспирации у растений сорта Прерия была по-прежнему ниже контроля (рис. 8 Б), но разница между растениями сорта Прерия и Михайловский увеличилась почти вдвое. Однако затем картина изменилась. В то время как растения сорта Прерия сохраняли скорость транспирации на уровне 50% от контроля, растения сорта Михайловский снизили этот показатель в 2 раза че рез двое суток засоления и почти полностью закрыли устьица на 5 сутки экспе римента. Подтверждением того, что транспирация снижалась в результате за крытия устьиц, служат данные по устьичной проводимости (данные приведены в диссертации).
Ранее было показано, что закрытие устьиц у растений ячменя при действии засоления происходит в результате накопления АБК (Fricke et al., 2004;
Ахия рова и др., 2005). С помощью метода иммунолокализации было обнаружено, что накопление АБК при засолении происходит именно в устьичных клетках (Ахиярова и др., 2006). Представляло интерес выяснить, связаны ли различия в устьичной реакции на засоление с уровнем накопления АБК в растениях раз ных сортов ячменя. Как видно из рисунка 9, уже через 10 мин содержание АБК в побегах растений увеличивалось в 1,5 раза у растений сорта Михайлов ский и в 2 раза у растений сорта Прерия. В корнях растений к этому времени содержание АБК возрастало только у растений сорта Прерия. Через сутки Концентрация АБК, нг/г сырого веса Концентрация АБК, нг/г сырого веса побег А Б побег корень корень 6 2 контроль опыт контроль опыт контроль опыт контроль опыт Михайловский Прерия Михайловский Прерия Рис. 9. Концентрация АБК у растений ячменя через 10 минут (А) и 24 часа (Б) по сле начала экспозиции на хлориде натрия (n=9) содержание АБК в побегах растений ячменя на фоне засоления было в 3 раза выше, чем в контроле, у растений сорта Михайловский и в 7 раз выше, чем в контроле, у растений сорта Прерия. Таким образом, прослеживается связь меж ду снижением устьичной проводимости и накоплением АБК: у растений сорта Прерия, которые накапливали больше АБК, устьичная проводимость снижалась в большей степени. Эти результаты свидетельствуют о том, что различия в устьичной реакции растений на засоление связаны со способностью накапли вать АБК.
Осмотическое давление клеточного сока растений не менялось в первое время после добавления хлорида натрия в питательный раствор (табл. 2). Раз ница между необработанными и подверженными действию засоления расте ниями наметилась спустя сутки после начала действия стрессового фактора. В большей степени осмотическое давление возрастало у сорта Михайловский. Че рез 8 суток эта разница была уже почти в 5 раз выше по сравнению со значения ми контрольных растений.
Таблица Влияние засоления на осмотическое давление (МПа) клеточного сока (n=8) Сорт Михайловский Прерия Воздействие контроль контроль NaCl NaCl 70 мин побег 1,15±0,06 1,36±0,05 1,19±0,03 1,31±0, корень 0,76±0,04 0,97±0,08 0,63±0,11 0,84±0, 3 часа побег 1,20±0,04 1,27±0,04 1,20±0,11 1,16±0, корень 0,69±0,03 0,81±0,06 0,66±0,01 0,79±0, 24 часа побег 1,09±0,03 1,53±0,01 1,03±0,01 1,39±0, корень 0,58±0,04 0,75±0,09 0,57±0,02 0,79±0, 48 часов побег 1,12±0,09 1,67±0,12 1,04±0,1 1,69±0, корень 0,54±0,07 0,76±0,06 0,42±0,01 0,68±0, 8 суток побег 1,39±0,02 1,49±0, 4,94±0,26 3,61±0, корень 0,56±0,03 0,76±0, 0,73±0,08 0,85±0, Накопление осмотически активных веществ поддерживает тургор клеток при возрастании дефицита воды. Поскольку рост клеток растяжением происхо дит за счет тургора, а количество осмотически активных веществ возрастало при засолении в большей степени у сорта Михайловский, можно было ожидать, что растения этого сорта будут расти на засолении быстрее. Кроме того, счита ется, что осмотическое приспособление может способствовать поддержанию высокой скорости транспирации (Serraj and Sinclair, 2002). Таким образом, ка залось бы, способность к накоплению осмотически активных веществ и под держанию тургора, которая ярче проявлялась у растений сорта Михайловский, должна была привести к более высокой устьичной проводимости у растений этого сорта при длительном действии засоления. Однако этого не происходило.
Почему? Известно, что ионы натрия и хлора являются «дешевым осмотиком» (Munns et al., 2006), накопление которых в вакуолях клеток обеспечивает зна чительный вклад в осморегуляцию галофитов (одновременно с накоплением нетоксичных осмотиков в цитоплазме). В отличие от галофитов, ячмень, как и большинство возделываемых растений, является гликофитом. Известно, что у гликофитов накопление ионов натрия в побеге приводит к ингибирова нию их роста (Munns, 2005;
Леонова и др., 2005). Таким образом, выражен ный ростингибирующий эффект засоления у растений сорта Михайловский (см. диссертацию) был следствием более быстрого накопления токсичных ио нов в побеге растений. Данные, полученные в результате анализа содержания ионов хлора в корнях и побегах растений подтверждают это предположение (табл. 3). Что могло быть причиной более быстрого накопления ионов у расте ний сорта Михайловский? Поддержание ионного гомеостаза – сложный про цесс, обусловленный ускоренным формированием поясков Каспари, а также функционированием селективных каналов, которые ограничивают поступление ионов натрия в клетки, их загрузку в ксилему и т.д. (Tester and Davenport, 2003;
Ершов и др., 2005).
Таблица Концентрация (г/л) хлорид ионов в клеточном соке растений после 9 суток засоления (n=6) Сорта Воздействие побеги корни Михайловский контроль 1,4±0,2 0,3± 38,3±4,1 3,9±0, NaCl Прерия контроль 1,7±0,1 0,2±0, 26,3±4,3 4,3±0, NaCl Вместе с тем, запуск механизма поддержания ионного гомеостаза требует времени. За это время ионы натрия могут проникать в клетки по неселективным каналам (Davenport et al., 2007). Скорость пассивной диффузии ионов в клетки корня определяется их поступлением к поверхности корня с транспирационным потоком. Загрузка ионов в ксилему зависит от разведения ксилемного сока и также возрастает с увеличением скорости транспирации (Davenport et al., 2007).
Таким образом, неудивительно, что у растений сорта Михайловский, у которых транспирация снижалась в меньшей степени, чем у растений сорта Прерия в первые сутки после засоления, в побег поступало больше токсичных ионов, что и могло быть причиной более выраженного подавления роста на засолении.
Таким образом, сравнение реакции на засоление у растений, различающих ся по степени засухоустойчивости, позволило показать, что снижение скорости транспирации в начале действия засоления снижает степень его ростингиби рующего действия, что, по-видимому, связано с уменьшением притока токсич ных ионов с транспирационным потоком. Солеустойчивость растений склады вается из многих признаков, и ее невозможно свести к одному механизму. Вме сте с тем, полученные нами результаты указывают на то, что способность рас тений быстро закрывать устьица при наличии соли в питательном растворе способствует формированию солеустойчивости и может быть использована как физиологический признак в процессе селекции. Сравнение растений разных сортов свидетельствует о том, что степень закрытия устьиц при засолении зави сит от уровня и скорости накопления АБК.
4. Сравнение действия натрий-хлоридного засоления на примере раз личных сортов растений ячменя В предыдущем разделе представлены результаты исследования пар видов (пшеница и ячмень), линий (Т1 и 20-45) и сортов (Прерия и Михайловский).
Выявлены определенные закономерности в характере изменения транспирации и роста растений, различающихся по солеустойчивости. Представляло интерес проверить, удастся ли выявить те же закономерности при изучении более ши рокого спектра сортов.
Нами изучалось действие 0,35 кратковременного (1-2 часа) и 0, % от контроля 0, длительного (10 дней) засоле Вес побега, г 0, ния на растения пяти сортов 0, ячменя из коллекции ВИР:
0, 0, Красноярский 1 и 80, Ранний-1, 0 Riso-1058 и Porvenir. Засоление Ранний Красн 1 Красн Riso Porvenir Рис. 10. Сырая масса побегов различных сортов приводило к снижению скоро ячменя после 9 суток действия засоления: аб- сти роста всех изученных сор солютные значения, значения массы, выра тов растений: через 10 дней женные в % от контроля (n=12) масса побега была ниже, чем в контроле на 30 -70 % (рис. 10). Засоление в наибольшей степени (в 3 раза по сравнению с контролем) подавляло рост побега у растений сорта Краснояр ский 80 и в наименьшей степени - у сорта Красноярский 1. В последнем случае масса побега на засолении была на уровне 67 % от контроля. По аб солютной массе побегов на фоне длительного засоления его ростингиби рующее действие было в наименьшей степени выражено у растений сорта Ранний-1, у которого данный параметр на фоне стрессового воздействия был на 40 % выше, чем в среднем у остальных сортов. Как в абсолютном, так и относительном выражении ростингибирующее действие засоления в наибольшей степени проявлялось у растений сорта Porvenir.
В наших экспериментах транспирация у растений всех сортов кроме Красноярский 80 снижалась на 30-50% уже через 15 мин после добавления соли в питательный раствор, что позволяло этим растениям поддерживать баланс между снижением притока воды из корней и транспирационными потерями (рис. 11).
Кроме экономии воды, за- крытие устьиц на засолении имеет дополнительное приспо- % от контроля собительное значение, которое заключается в ограничении про никновения в растения токсич- ных ионов с транспирационным Красн 80 Красн 50 Porvenir Ранний 1 Riso- потоком (см. предыдущие раз- 0 15 30 45 60 75 делы). Отсутствие видимого за- Время, мин вядания растений сорта Красно Рис. 11. Влияние кратковременного действия ярский 80 указывает на то, что у засоления на транспирацию растений разных них приток воды из их корней сортов ячменя (n=20) на засолении мог поддерживаться за счет возрастания гидравлической про водимости. По всей видимости, высокая скорость транспирационного по тока у растений этого сорта способствовала быстрому накоплению токсич ных ионов, что могло быть причиной резкого снижения скорости их роста до 20 % от контрольных значений. Растения остальных сортов не различа лись по транспирационной реакции на кратковременное действие засоле ния. Однако различия между ними проявлялись при его более длительном действии (рис. 12).
В наибольшей степени транспирация снизилась у рас тений сорта Ранний-1 (на 63 % % от контроля по сравнению с контролем), т.е.
у сорта, который по скорости Ризо накопления биомассы на засо- Порвенир Красн. лении проявил себя как наибо- Красн. Ранний лее устойчивый. Снижение 0 1 2 транспирации у растений этого Длительность воздействия, сут сорта происходило благодаря Рис. 12. Влияние длительного действия засоле закрытию устьиц (устьичная ния на транспирацию разных сортов ячменя (n=10) проводимость у них была на уровне 30 % от контроля). Такое резкое снижение скорости транспирации за счет закрытия устьиц, по-видимому, было необходимо как компенсация вы сокой поглотительной способности хорошо развитой корневой системы (данные по массе растений приведены в диссертации). Второе место по сте пени снижения транспирации заняли растения сорта Riso, которые также бы ли вторыми по накоплению биомассы побега на засолении. У растений сор тов Красноярский 80 и Porvenir скорость транспирации снизилась гораздо меньше, и они были наиболее чувствительными к засолению (у растений сортов Porvenir и Красноярский 80 в наибольшей степени снижалось накоп ление биомассы по сравнению с контролем). Интересно то, что хотя масса побега растений сорта Красноярский 80 резко снижалась на засолении, по абсолютной величине она была все же на 30 % выше, чем у растений сорта Porvenir. Вероятно, причина этого эффекта заключается в закономерности, обнаруженной австралийскими исследователями (Munns, 2005). Она заклю чается в том, что за счет массы побега происходит разбавление токсичных ионов. Поэтому, вероятно, приток токсичных ионов с быстрым транспираци онным потоком растений сорта Красноярский 80 разбавлялся за счет боль шой исходной массы побега этих растений. Казалось бы, удается проследить связь между степенью снижения транспирации и солеустойчивостью. Более высокий уровень транспирации на засолении был у растений чувствительных сортов (Porvenir и Красноярский 80), а низкий уровень транспирации – у от носительно солеустойчивых сортов (Ранний-1 и Risо). Однако в эту картину не вписывались растения сорта Красноярский 1. У них на фоне высокой транспирации степень ингибирования роста под влиянием засоления была самой низкой (масса их побегов на засолении была только на 23 % ниже кон троля). Эти результаты объясняются тем, что устойчивость к засолению свя зана не только со скоростью транспирационного потока. Известно, что с уве личением транспирации возрастает проникновение ионов по неселективным ионным каналам (Davenport et al., 2007). Однако это далеко не единственный путь поступления ионов натрия в растения. Кроме них имеется много раз личных селективных каналов, работа которых предотвращает поступление ионов натрия и хлора в побег и их накопление до токсичного уровня в цито плазме (Tester, Davenport, 2003). Эффективная работа таких каналов может обеспечить устойчивость растений к засолению на фоне высокой скорости транспирации, что может позволить растению держать устьица открытыми.
Такая возможность в свою очередь обеспечивает высокую активность накоп ления биомассы растениями за счет нормализации газообмена и фотосинтеза на засолении. Относительная устойчивость растений сорта Красноярский 1 к засолению, которая проявлялась на фоне высокой скорости транспирации, может быть связана с эффективностью работы механизмов, обеспечивающих ионный гомеостаз. Отсутствие видимого завядания растений сортов Красно ярский 1 и Porvenir указывает на высокую гидравлическую проводимость этих растений на фоне засоления. Однако в последующем у растений сорта Porvenir транспирация падала, в то время как у Красноярский 1 она сохраня лась на высоком уровне, что указывает на снижение способности корней рас тений Porvenir проводить воду. Это могло быть проявлением их чувстви тельности к токсичному действию ионов и причиной резкого торможения роста у растений этого сорта.
Таким образом, сравнение реакции растений разных сортов на засоление выявило довольно сложную картину. Полученные нами результаты свиде тельствуют о том, что способность растений быстро закрывать устьица в на чале действия засоления является важным условием формирования соле устойчивости. Однако, в дальнейшем, поддержание ионного гомеостаза оп ределяется иными механизмами, которые обеспечивают возможность поддер жания устьиц в открытом состоянии. Эти результаты свидетельствуют о необхо димости дальнейшего изучения динамики транспирационного ответа с целью поиска критериев оценки солеустойчивости растений, в процессе селекции ус тойчивых к засолению сортов.
Выводы 1. Сравнение реакции на кратковременное воздействие хлорида натрия у от носительно солеустойчивых растений ячменя и менее устойчивых расте ний твердой пшеницы, а также линий и сортов ячменя показало, что бы строе закрытие устьиц и снижение транспирационного потока характерно для более солеустойчивых генотипов.
2. Установлено, что быстрое падение гидравлической проводимости и транс пирации у растений солеустойчивой линии ячменя Hordeum spontaneum 20-45 по сравнению с менее устойчивыми к засолению растениями линии Т-1 связано с более выраженным снижением экспрессии гена PIP2;
4 на фоне засоления.
3. Показано, что при кратковременном действии хлорида натрия уровень на копления АБК был выше в листьях растений ячменя сорта Прерия, у кото рых устьичная проводимость снижалась в большей степени по сравнению с растениями сорта Михайловский. Эти результаты свидетельствуют о ро ли АБК в ограничении транспирационного потока при засолении.
4. Выявлено, что при кратковременном засолении растения ячменя сорта Михайловский отличаются от растений сорта Прерия более высоким уров нем транспирации и большим накоплением токсичных ионов хлора.
5. Обнаружено, что при более длительном действии засоления характер связи между устьичной проводимостью и солеустойчивостью меняется на про тивоположный по сравнению с тем, который был выявлен при кратковре менном действии засоления: более высокая устьичная проводимость про является у более солеустойчивых растений.
Выражаю благодарность всем сотрудникам нашей лаборатории, особую призна тельность Кудояровой Г.Р. за ценные советы и поддержку на всех этапах моей ра боты и сердечную благодарность моему научному руководителю Веселову Д.С. за неоценимую помощь.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Веселов Д.С., Шарипова Г.В., Кудоярова Г.Р. Сравнительное изучение реак 1.
ции растений ячменя (Hordeum vulgare) и пшеницы (Triticum durum) на кратко временное и длительное действие натрий хлоридного засоления // Агрохимия.
- 2007. №7. С. 41-48.
Веселов Д.С., Шарипова Г.В. Источник и последствия быстрой генерации 2.
сигнала АБК при засолении. Тезисы докладов международного симпозиума «Сигнальные системы растений: роль в адаптации и иммунитете». Казань, 27 30 июня 2006. С. 162-163.
Фархутдинов Р.Г., Фаизов Р.Г., Высоцкая Л.Б., Шарипова Г.В., Веселов Д.С., 3.
Кудоярова Г.Р. Устьичная реакция на дефицит воды у растений ячменя, реко мендованных к районированию в контрастных климатических условиях. Тези сы докладов международной конференции «Современная физиология расте ний: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 18-24 июня 2007. С. 406-408.
Шарипова Г.В., Веселов Д.С., Чернов В.Е., Пендинен Г.И., Кудоярова Г.Р.
4.
Ростовая реакция на засоление у растений разных сортов ячменя и ее связь с соотношением массы побег/корень и характером изменения транспирации. Те зисы докладов международной конференции «Современная физиология расте ний: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 18-24 июня 2007. С. 427-429.
Веселов Д.С., Шарипова Г.В. Сравнение чувствительности водного обмена и 5.
роста растений ячменя и пшеницы к натрий-хлоридному засолению. Тезисы докладов международной конференции «Современная физиология растений:
от молекул до экосистем». Сыктывкар, 18-24 июня 2007. С. 66-67.