Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи (fagopyrum esculentum moench.).
На правах рукописи
Цыбина Татьяна Александровна Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.).
Специальность – биохимия (03.00.04)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА – 2002
Работа выполнена в отделе функциональной биохимии биополимеров Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им.
М.В.Ломоносова.
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор М.А.Белозерский доктор биологических наук Я.Е.Дунаевский
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Т.А.Валуева доктор химических наук, Г.Н.Руденская
Ведущая организация: ГНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов.
Защита состоится “02” апреля 2002 г. в 12 часов в конференц-зале на заседании диссертационного совета К 002.247.01 в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (117071, Москва, Ленинский пр., 33, корп.2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы по адресу: 117071, Москва, Ленинский пр., 33, корп.1.
Автореферат разослан “01” марта 2002 г.
Ученый секретарь диссертационного совета:
кандидат биологических наук А.Ф.Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Белковые ингибиторы сериновых протеиназ широко распространены в растениях и к настоящему времени получены из многих источников. Особенно богаты ингибиторами семена.
Классификация ингибиторов, несколько различающаяся в работах разных авторов, основывается на гомологии аминокислотных последовательностей, строения реактивных центров, расположения дисульфидных связей и механизмов ингибирования (Laskowski and Kato,1980;
Мосолов и Валуева, 1993).
Большинство известных и исследованных в настоящее время ингибиторов протеиназ из растений взаимодействуют с сериновыми протеазами (трипсином, химотрипсином, субтилизином). В последнее время широко изучаются ингибиторы цистеиновых протеиназ – цистатины. Кроме того, накоплено много данных об ингибиторах протеиназ, принадлежность которых к какому-либо из описанных семейств не установлена.
Биологическое значение растительных белковых ингибиторов протеиназ еще не вполне понято, однако предполагается, что они могут выполнять 3 основных функции, действуя: 1) как запасные белки, 2) как регуляторы активности эндогенных протеиназ, 3) как агенты защиты от насекомых и патогенной микрофлоры (Ryan, 1981).
Поиск и изучение новых низкомолекулярных белковых ингибиторов из различных доступных источников важны в теоретическом аспекте, поскольку позволяют выявить ингибиторы с новым типом специфичности, участвующие в процессах жизнедеятельности растений, а также способствуют развитию эволюционных представлений. Важной задачей для фундаментальных и практических областей знаний является изучение действия ингибиторов на протеиназы фитопатогенов, что может быть полезным в создании методами генной инженерии устойчивых к инфекции трансгенных растений.
Ранее уже было показано, что в семенах гречихи присутствуют ингибиторы трипсина (Ikeda and Kusano,1983;
Kiyohara and Iwasaki, 1985), различающиеся по молекулярным массам, ИЭТ и аминокислотному составу, причем анионные ингибиторы способны подавлять in vivo прорастание спор и рост мицелия грибов Alternaria alternata и Fusarium oxysporum (Dunaevsky et al., 1997) и ингибиовать in vitro секретируемые этими грибами в процессе роста протеазы.
Цель настоящего исследования заключалась в разработке методов очистки новых ингибиторов из семян гречихи, изучению их физико химических свойств и возможного участия в защите растений от фитопатогенов. В соответствии с поставленной целью были определены следующие экспериментальные задачи:
1. Выделение и очистка катионных ингибиторов трипсина из покоящихся семян гречихи.
2. Изучение основных физико-химических свойств очищенных ингибиторов.
3. Изучение действия ингибиторов на разнообразные протеолитические ферменты, включая внеклеточные протеазы мицелиальных грибов, а также на рост гиф этих грибов in vivo с целью выяснения их возможной физиологической роли.
4. Установление на основе совокупности изученных характеристик места катионных ингибиторов из гречихи в общей системе белковых ингибиторов протеиназ.
Научная новизна и практическая ценность. Из покоящихся семян гречихи выделены в электрофоретически-гомогенном состоянии новые белковые ингибиторы сериновых протеиназ (BWI-1с-4с), не действующие на эндогенные ферменты. Кроме трипсина и химотрипсина животного происхождения ингибиторы подавляют активность внеклеточных трипсин подобных протеиназ грибов Botrytis cinerea и Ulokladium botrytis, а BWI-3с и BWI-4с еще и активность бактериальных субтилизинов, а также внеклеточных грибных субтилаз из Penicillium terlicowskii и B.cinerea. На основании физико-химических свойств, а также установленной N-концевой аминокислотной последовательности катионные ингибиторы BWI-3с и BWI-4с могут быть классифицированы как члены семейства картофельного ингибитора протеиназ I. Катионные ингибиторы BWI-1с и BWI-2с по установленной N-концевой аминокислотной последовательности не могут быть отнесены ни к одному из описанных к настоящему времени семейств ингибиторов, однако имеют высокую гомологию с аллергенным ингибитором трипсина из семян гречихи, изученным японскими авторами (Park et al., 1997), а также с участками последовательности запасного белка вицилина из хлопка и некоторыми встречающимися в семенах пептидами, функции которых не известны. Это может быть в дальнейшем использовано для изучения эволюционных изменений в качественном составе белков семян в процессе приспособления к условиям окружающей среды или в результате совмещения разных функций в одном белке-предшественнике.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены на Втором съезде биохимического общества РАН, (Россия, 1997), IV симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Россия, 1997), 7 и международных симпозиумах по белкам семян (Германия, 1997;
2000), международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (США, 1997), 11 и 12 конгрессах Европейского общества физиологов растений (Болгария, 1998;
Венгрия, 2000), VII международном симпозиуме "Advances in Buckwheat Research" (Канада, 1998), 13 симпозиуме "Attack and Defence in Plant Disease" (Великобритания, 1999), IV международной конференции "Физиология растений – наука III тысячелетия" (Россия, 1999), международном симпозиуме по фитопатологии и биотехнологии (Китай, 2000), международной конференции "Biocatalysis-2000: fundamentals and applications" (Россия, 2000), международном симпозиуме "Proteolysis and Biological control" (США, 2001), 27 съезде FEBS (Португалия, 2001).
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, их обсуждения и выводов. Список цитированной литературы включает 228 источников.
Работа изложена на 117 страницах, содержит 19 рисунков и 18 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования.
В работе использовали покоящиеся семена гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.) сорта Шатиловская 5.
Для выделения и очистки ингибиторов использовали высаливание растворимых белков гречихи сульфатом аммония, аффинную хроматографию на трипсин-сефарозе, ионообменную хроматографию на Mono-Q и Mono-S в режиме FPLC.
Активность ингибиторов оценивали по степени подавления активности соответствующих ферментов (трипсина, -химотрипсина и субтилизина-72 из B. subtilis), для чего раствор, содержащий смесь ингибитора и фермента, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Остаточную активность фермента определяли по методу Эрлангера и др. (Erlanger et al., 1961), используя в качестве субстрата 0, мМ раствор Bz-Arg-pNA в 0,1 М K,Na-фосфатном буфере, рН 7,0 (для трипсина), 5мМ раствор Glp-Ala-Ala-Leu-pNA (для субтилизин-подобных ферментов) и 6мМ раствор Glp-Phe-pNA (для -химотрипсина) в диметил формамиде, которые перед употреблением разводили 0,05М K, Na фосфатным буфером, рН 8,0 (1:10). Останавливали реакцию добавлением к инкубационной смеси уксусной кислоты до конечной концентрации 5%.
За единицу активности ингибитора принимали такое его количество, которое снижало оптическую плотность при 410 нм (А410) на 0,1 в условиях определения ферментативной активности при 50%-ном ингибировании. В случае определения активности ингибиторов по отношению к частично очищенным препаратам грибных протеаз, активность ферментов соотносили с активностью чистых препаратов трипсина и субтилизина, используя для расчетов концентрации чистых ферментов.
Концентрацию белка в растворах ингибиторов определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) и спектрофотометрически при 280 нм.
Электрофорез ингибиторов в неденатурирующих условиях проводили по методу Дэвиса (Davis, 1964) в 10%-ном полиакриламидном геле 1 ч при напряжении 600 В и силе тока 5 мА на трубочку. Гели окрашивали 0,04%-ным раствором Кумасси G-250 в 4%-ной хлорной кислоте, избыток удаляли 7%-ным раствором уксусной кислоты.
Модификацию остатков лизина и аргинина для определения аминокислот, входящих в реактивный центр молекул ингибиторов, осуществляли уксусным ангидридом (Freedman et al., 1968) и диацетилом (2,3-бутандионом) (Smith, 1977) соответственно.
рН-стабильность ингибиторов определяли в диапазоне рН 2,0-12,0 с использованием 0,05 М универсального буфера. Раствор, содержащий ингибитор, инкубировали при разных значениях рН при 4°С в течение 4 ч.
Далее рН смеси доводили до 7,0 добавлением 0,25 М фосфатного буфера, рН 7,0.
Термостабильность ингибиторов определяли, инкубируя раствор ингибитора при 100°С в течение 15 и 30 мин при разных значениях рН.
Активность ингибиторов по отношению к трипсину определяли, как описано выше.
Изоэлектрические точки ингибиторов определяли методом хроматофокусирования на колонке с PBI-96. Колонку уравновешивали 0, М трис-HCl, рН 9,3, наносили образец препарата ингибитора в стартовом буфере (0,5 мл/мин) и затем элюировали белок полибуфером-96, рН 6,0, разведенным согласно инструкции фирмы-производителя. ИЭТ соответствовали рН, при которых наблюдались пики активности ингибиторов.
Константы ингибирования (Ki) протеиназ определяли по методу, основанному на измерении остаточной активности несвязанного фермента, взятого с постоянной концентрацией, при действии на него разных концентраций ингибитора (Bieth and Frechin, 1974).
Аминокислотный состав ингибиторов определяли стандартным методом на аминокислотном анализаторе “Hitachi 835” (Япония). Для определения серосодержащих аминокислот белок окисляли смесью 30% ной Н2О2 и 88%-ной муравьиной кислоты (1:9) и затем гидролизовали 5,7 н HCl (110°, 22 ч) (цистеин определяли в виде цистеиновой кислоты).
Триптофан определяли после гидролиза белка 4 М метансульфоновой кислотой, содержащей 0,2% триптамина.
Восстановление и алкилирование белков осуществляли при помощи 4 винилпиридина (Thomsen and Bayne, 1988). Алкилированный белок обессоливали с помощью обращенно-фазовой ВЖХ и высушивали на концентраторе Speedvac (“Savant”, США).
Аминокислотную последовательность белков определяли с помощью белково-пептидного секвенатора модели 816 (“Knauer”, Германия), оснащенного анализатором фенилтиогидантоиновых производных аминокислот модель 120А (“Applied Biosystems”, США). Препараты белков и пептидов растворяли в 10-15 мкл 50%-ного ацетонитрила, содержащего 0,1%-ную ТХУ, и наносили порциями по 5 мкл на мембрану Immobilone P (“Millipore”, США) для последующего секвенирования.
Молекулярные массы ингибиторов определяли на время-пролетном MALDI масс-спектрометре Reflex II (“Brucker-Franzen Analytik GmbH”, Германия) согласно инструкции фирмы-производителя.
Результаты и их обсуждение.
В настоящей работе изучались катионные ингибиторы трипсина (BWI), выделенные из покоящихся семян гречихи. Разработанный метод выделения ингибиторов заключался в следующем. Семена размалывали на электрической мельнице. Белки экстрагировали 0,1 М K, Na-фосфатным буфером, рН 6,8 (1:4, в/о) и высаливали 80% (NH4)2SO4. Полученную фракцию белков после диализа подвергали аффинной хроматографии на колонке с трипсин-сефарозой 4В, синтезированой нами на основе CNBr активированной сефарозы 4В (Дин и др., 1988).
Полученную фракцию ингибиторов разделяли при помощи ионнообменной хроматографии на Mono-Q, рН 6,8 (в режиме FPLC) на фракцию анионных ингибиторов, исследованную ранее (Dunaevsky et al., 1996), и фракцию катионных ингибиторов, которую разделяли далее на колонке Mono-S (в режиме FPLC) при рН 6,8 и рН 4,0. Сорбировавшиеся при рН 6,8 белки элюировали линейным градиентом NaCl (0-0,2 М, 25 мин, 1 мл/мин). В элюате были обнаружены 2 белковые фракции (1с и 2с), обладающие трипсин-ингибирующей активностью (рис. 1). Пик между этими фракциями представлен смесью этих же ингибиторов.
0,5 0, A А NaCl, M NaCl 0,4 0, 0,3 0, BWI-2c 0,2 0, BWI-1c 0,1 0, 0 0 5 10 15 20 Объем, мл Рис. 1. Хроматограмма разделения катионных ингибиторов на Mono-S, pH 6,8 в режиме FPLC.
Сорбировавшиеся при рН 4,0 белки элюировали линейным градиентом NaCl (0-0,1 М, 10 мин, затем 0,1-0,5 М, 30 мин, 1 мл/мин). В элюате были обнаружены 2 белковые фракции (3с и 4с), обладающие значительной трипсин-ингибирующей активностью (рис. 2).
0,3 0, A280 NaCl 0,25 0, А 0,2 0, NaCl, M BWI-4c 0,15 0, BWI-3c 0,1 0, 0,05 0, 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Объем, мл Рис.2. Хроматограмма разделения катионных ингибиторов на Mono-S, pH 4,0 в режиме FPLC.
Выход каждой из фракций и степень ее очистки приведены в таб. 1.
Кажущееся снижение удельной активности и степени очистки на стадии хроматографии на колонке Mono-Q связано с разделением суммарной фракции ингибиторов на преобладающую количественно фракцию анионных ингибиторов, сорбирующихся на колонке при указанных условиях, и фракцию катионных ингибиторов, не сорбирующихся на колонке.
В результате проведенной очистки трипсин-ингибирующие фракции 1с-4с были получены в электрофоретически гомогенном состоянии (рис. 3) и охарактеризованы.
1 2 3 Рис. 3. Электрофореграммы ингибиторов протеаз BWI из семян гречихи (1 – BWI-1с, 2 – BWI-2с, 3 – BWI-3с и 4 – BWI-4с).
Таблица 1. Очистка катионных ингибиторов трипсина из семян гречихи.
Стадия очистки Белок, Общая Удельная Степень Выход, мг активность, активность, очистки % ед. ед./мг Экстракция и 1465 137718 94 1 осаждение Аффинная 11,2 33879 3025 32,2 24, хроматография на трипсин-сефарозе Мono-Q, pH 7,0, 5,8 19331 3333 35.5 14, не сорбирующаяся фракция Мono-S, pH 7, BWI-1с 0,95 6897 7260 77,2 5, BWI-2с 0,31 948,5 3060 32,6 0, Мono-S, pH 4, BWI-3с 0.13 204 1570 16,7 0, BWI-4с 0,095 230 2421 25,8 0, По данным масс-спектрометрии молекулярные массы ингибиторов составляют 5203 Да для BWI-1c, 5347 Да для BWI-2c, 7760 Да для BWI-3c, 6031 Да для BWI-4c, что несколько ниже молекулярных масс анионных ингибиторов (7,5-7,7кДа). Изоэлектрические точки всех исследованных катионных ингибиторов лежат в пределах рН 8,0–8,5.
Относительное ингибирование,% BWI-1c BWI-2c BWI-4c BWI-3c рН 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Рис.4. рН-стабильность катионных ингибиторов трипсина из семян гречихи.
Все изученные ингибиторы характеризуются высокой стабильностью в диапазоне рН от 2,0 до 12,0 (рис. 4), что соответствует данным, полученным для других низкомолекулярных ингибиторов. Небольшое снижение активности ингибиторов (не более 20%) наблюдается в щелочной области рН, а для ингибиторов BWI-3с и BWI-4с и при рН ниже 4,0.
Изучение температурной стабильности ингибиторов при разных значениях рН показало, что исследованные ингибиторы характеризуются высокой устойчивостью к 30 мин инкубации при 100°C в кислых условиях рН (рис.5). Высокая термостабильность, особенно в кислой среде, характерна для ингибиторов протеаз семейств картофельных ингибиторов I и II. Однако среди них существуют и ингибиторы, более устойчивые к нагреванию в щелочной среде, например, ингибитор субтилизина из бобов адзуки (Yoshikawa et al., 1995). Следует отметить относительную стабильность ингибитора BWI-1c при нейтральных и щелочных условиях по сравнению с остальными изученными ингибиторами из семян гречихи.
100, А 80, 60, активность,% 40, 20, 0, рН=3,1 рН=7,0 рН=9,0 рН=12, BWI-1c BWI-2c BWI-3c BWI-4c Остаточная 100, Б 80, 60, 40, 20, 0, рН=3,1 рН=7,0 рН=9,0 рН=12, Рис.5. Стабильность ингибиторов при кипячении в течение 15 мин (А) и 30 мин (Б).
Изучение аминокислотного состава катионных ингибиторов трипсина из семян гречихи (таб. 2) показало, что все рассматриваемые ингибиторы содержат большое количество остатков глутамина и глутаминовой кислоты. В молекулах ингибиторов нет свободных SH-групп, все остатки цистеина связаны дисульфидными мостиками. Для ингибиторов BWI-3c и BWI-4c характерно высокое содержание остатков глицина, валина и аргинина, показанное и для других ингибиторов, выделенных из семян гречихи. В отличие от ингибиторов, изученных другими авторами, состав ингибиторов BWI-1c и BWI-2c характеризуется меньшим количеством остатков пролина и аргинина, а в составе ингибиторов BWI-3c и BWI- присутствует большее количество остатков треонина и аланина.
Таблица 2. Аминокислотные составы ингибиторов трипсина из гречихи.
Число остатков Аминокислоты BWI BWI ИТ (Kiyohara, Iwasaki, 1985) ИТ (Ikeda, (Dunaevsky Kusano, et al., 1996) 1983) 1с 2с 4с 3с 1а 2а 4а I II a IIIa II b II c III III I II III 3 3 75 7 8 8 8 5 5 5 9 12 12 8 7 Asx 2 2 54 1 1 1 1 1 1 2 222 3 2 Thr 6 3 24 3 3 4 2 2 2 2 576 6 5 Ser 9 13 11 11 12 13 13 12 8 8 8 15 19 19 9 12 Glx 2 1 62 4 3 4 4 3 4 3 666 4 1 Pro 6 3 79 5 6 6 5 4 4 4 799 9 7 Gly 3 1 65 4 3 4 4 3 3 3 000 4 5 Ala 4 4 22 2 2 2 2 2 2 2 888 12 10 Cys 3 1 85 11 10 11 9 7 7 8 222 1 3 Val 1 1 02 1 1 0 1 1 1 0 222 1 2 Met 1 1 42 2 2 2 3 2 2 3 222 2 2 Ile 2 2 32 4 4 3 4 2 3 2 566 5 4 Leu 0 0 10 0 0 0 0 0 0 1 222 1 2 Tyr 1 1 10 1 1 1 1 1 1 2 222 2 1 Phe 3 4 22 3 3 3 4 3 2 3 355 6 6 Lys 1 1 11 0 1 0 0 0 0 0 222 1 2 His 4 4 75 7 7 6 7 5 6 5 12 12 12 7 8 Arg 0 0 2 но 1 1 1 2 2 2 1-2 1 1 1 0 0 Trp 51 45 75 61 68 69 69 67 51 53 54-55 85 99 98 81 79 5,2 5,3 7,76 6,0 7,6 7,8 7,6 7,6 6,0 6,0 6,2 10,0 11,5 11,4 8,0 8,0 8, кДа Таблица 3. Модификация остатков аргинина и лизина в молекулах ингибиторов BWI.
Остаточная активность ингибиторов, % Модифицирующий агент BWI-1с BWI-2с BWI-3с BWI-4с Уксусный ангидрид 0 78,2 0 Диацетил (2,3-бутандион) 0 0 100 Для изучения природы аминокислотных остатков, входящих в реактивные центры ингибиторов, было проведено исследование действия модифицирующих аминокислоты агентов на трипсин-ингибирующую активность ингибиторов. Из представленных в таблице 3 данных следует, что в реактивные центры ингибиторов BWI-3c и BWI-4c входит остаток лизина, а в реактивный центр BWI-2c – остаток аргинина. Что касается ингибитора BWI-1c, то потеря его активности при модификации как остатков лизина, так и остатков аргинина может быть связана с изменением конформации молекул ингибитора при связывании модифицирующих агентов или с таким расположением одного из модифицируемых остатков, что он, не входя в реактивный центр ингибитора, тем не менее препятствует взаимодействию ингибитора с ферментом-мишенью.
В таблице 4 приведены данные по влиянию изученных ингибиторов на активность различных протеолитических ферментов. Ингибиторы BWI 1с и BWI-2с инактивируют только трипсин и трипсиноподобные протеазы, причем 50%-ингибирование трипсина (а в случае использования BWI-2с - и трипсиноподобной протеазы из U.botritis) наблюдается при эквимолярном соотношении фермента с ингибитором. Ингибиторы BWI-3с и BWI-4с более эффективно связывают трипсин, а также подавляют активность химотрипсина и субтилизиноподобных ферментов бактерий, в том числе термитазу и савиназу – ферменты, нашедшие практическое применение в производстве моющих средств. Эффективность связывания тиол-зависимой субтилазы из B.intermedia и субтилаз из грибов мала, ингибирование наблюдается при значительном молярном избытке ингибиторов.
Таблица 4. Действие катионных ингибиторов из семян гречихи на активность разных протеолитических ферментов.
Отношение ингибитор/фермент (моль/моль) Протеаза при 50%-ном ингибировании BWI-1с BWI-2с BWI-3с BWI-4с Трипсин быка 1,14 1,11 0,38 0, Химотрипсин не инг. 2,6 1,35 0, Пепсин не инг. не инг. не инг. не инг.
Субтилизин-72 Bacillus не инг. не инг. 0,72 0, subtilis Тиол-зависимая субтилаза не инг. не инг. 4,2 5, Bacillus intermedia.
Трипсиноподобная 1,6 1,8 не опр. не опр.
протеаза Botrytis cinerea Трипсиноподобная 0,34 1,15 не инг. не опр.
протеаза Ulokladium botrytis Субтилаза Penicillum не инг. не инг. 2,56 2, terlicowskii Субтилаза Botrytis cinerea не инг. не инг. 8,4 3, Субтилаза Thrichoderma не инг. не инг. не инг. не инг.
harzianum Дополнительно к полученным данным по ингибированию секретируемых мицелиальными грибами ферментов, было изучено влияние катионных ингибиторов на прорастание и рост гиф грибов.
В опытах in vivo показано, что при наличии ингибиторов в среде культивирования замедляется рост гиф всех протестированных грибов, как фитопатогенов, так и сапротрофов (таб.5). При небольших концентрациях ингибитора наблюдаемый эффект примерно одинаков для всех грибов, а при повышении концентрации ингибиторов их воздействие на рост гиф фитопатогенных грибов было более эффективным, вызывая полную остановку роста гиф в случае Ulokladium artrum.
Таблица 5. Действие катионных ингибиторов из семян гречихи на рост гиф мицелиальных грибов.
Концентрация BWI, мг/мл Грибы 0,35 0,70 1,5 3, Ингибирование роста гиф, % 9,1 45,5 54,4 Ulokladium artrum 24 29 54 Ulokladium botrytis 14 36 38 Thrichoderma harzianum 0 17,4 30,4 Aspergillus penicillosa На основании полученных результатов можно предположить, что физиологическая роль изученных ингибиторов может быть связана с их участием в защите растения от грибной инфекции.
Для того, чтобы оценить количество реактивных центров у изучаемых ингибиторов, было исследовано их взаимодействие с трипсином и химотрипсином методом гель-фильтрации на Superdex-75 в режиме FPLC.
Полученные результаты на примере взаимодействия ингибитора BWI-2с с трипсином (тр) и химотрипсином (хтр) представлены на рис.6.
При гель-фильтрации чистых ферментов белок выходил с колонки одним пиком. При гель-фильтрации смеси BWI-2с с трипсином наблюдались два пика: один - близкий по молекулярной массе комплексу (инг+2тр), второй соответствующий по молекулярной массе комплексу (инг+тр).
При гель-фильтрации смеси BWI-2с с химотрипсином также наблюдались два пика: один - близкий по молекулярной массе комплексу (инг+2хтр), второй - соответствующий по молекулярной массе выходу чистого хтр.
Из приведенных данных можно предположить, что ингибитор BWI 2с имеет два центра связывания ферментов, один из которых имеет большее сродство к химотрипсину.
А 20 кДа 0,8 тр 0, 0, 0, 1 11 21 31 А 25 кДа тр + инг 0, 0, 55 кДа 0, 0, 1 11 21 31 А 1 55 кДа хтр + инг 0, 0, 22 кДа 0, 0, 1 11 21 31 A 22 кДа хтр 0, 0, 0, 0, 1 11 21 31 Объем, мл Рис. 6. Хроматограммы гель-фильтрации трипсина (тр), химотрипсина (хтр) и их комплексов с ингибитором BWI-2c (инг) в режиме FPLC.
Кроме того, была исследована зависимость степени ингибирования протеиназ белками 3с и 4с от присутствия в инкубационной смеси одновременно двух ферментов. В случае ингибитора 3с наблюдалось независимое ингибирование одновременно трипсина и химотрипсина, а также трипсина и субтилизина, и конкурентное ингибирование химотрипсина и субтилизина, что свидетельствует о наличии у ингибитора 3с двух центров связывания ферментов. В случае использования ингибитора 4с одновременное взаимодействие с ферментами носило более сложный характер с различными проявлениями конкуренции за центр связывания, однако из полученных данных можно предположить, что ингибитор 4с также имеет не менее двух центров связывания ферментов, которые, возможно, перекрываются.
Далее были определены константы ингибирования трипсина, химотрипсина и субтилизина-72 изученными в настоящей работе ингибиторами. В таблице 6 для сравнения приведены константы ингибирования ферментов изученными ранее низкомолекулярными белковыми ингибиторами сериновых протеиназ, принадлежащими к разным семействам ингибиторов.
Из представленных данных следует, что все изученные в настоящей работе белки-ингибиторы являются не менее эффективными ингибиторами трипсина, чем приведенные для сравнения в таблице 6, а наблюдаемое ингибирование химотрипсина выше, чем исследованное ранее у других ингибиторов. Особенно примечателен тот факт, что ингибитор BWI-3c высокоэффективно подавляет и активность субтилизина-72 из B.subtilis – такое эффективное ингибирование трех различных ферментов встречается очень редко.
Таблица 6. Сравнение констант ингибирования сериновых протеиназ ингибиторами протеаз из семян гречихи и других растительных источников*.
Ki, M Ингибитор Р трипсин химотрипсин субтилизин (3,8±1,1)х10 –10 (2,0±0,7)х10– BWI-1с не опр. не инг.
(4,7±1,2)х10 –10 (4,8±1,4)х10– BWI-2с Arg не инг.
(4,1±1,0)х10 –10 (8,4±2,5)х10–9 (6,5±1,9)х10– BWI-3с Lys (1,1±0,09)x10–9 (6,7±0,3)x10– BWI-1a Arg не опр.
1,3х10–5 1,6х10– SI не инг.
1,2x10– LA-1 Arg не инг. не инг.
4,8x10–10 4,7x10– PSI-1.1 Thr не опр.
1,6x10–10 5,0 x10– MTI-2 не опр.
5,0x10– DgTI Lys не инг. не инг.
3,7х10–10 (BPN’) 3,4 x10 –10 4,1 x 10 –10 5,5х10– ATSI Lys (Carlsberg) *ATSI – ингибитор семейства картофельного ингибитора I из семян амаранта Amaranthus caudatus L. (Hejgaard et al., 1994).
SI - ингибитор субтилизина семейства картофельного ингибитора I из бобов адзуки (Yoshikawa et al., 1995).
BWI-1a – анионный ингибитор трипсина из гречихи (Гладышева и др., 1995).
DgTI – ингибитор трипсина семейства Баумана-Бирк из семян Dioclea glabra (Bueno et al., 1999.) PSI-1.1 – ингибитор семейства картофельного ингибитора II из семян кайенского перца (Antcheva et al., 1996).
LA-1 - ингибитор трипсина семейства тыквенных ингибиторов из люффы Luffa acutangula Linn (Haldar et al., 1996).
MTI-2 - ингибитор сериновых протеиназ из семян горчицы Sinapis alba L. (Menegatti et al., 1992).
Отдельно следует отметить ингибирование химотрипсина. В условиях измерения остаточной активности этого фермента по п-нитроанилидным субстратам (Glp-L-Phe-pNA и Glp-Ala-Ala-Leu-pNA) ингибирование было сильным в случае прединкубации с ингибитором BWI-4c, слабым – с ингибиторами BWI-2c и BWI-3c и полностью отсутствовало при воздействии BWI-1c. При определении кинетических характеристик в качестве субстрата химотрипсина использовался этиловый эфир N-бензоил L-тирозина (BTEE);
в этих условиях наблюдалось ингибирование химотрипсина и ингибитором BWI-1c, причем это ингибирование было наиболее сильным из исследованных.
Для всех ингибиторов были определены N-концевые аминокислотные последовательности (рис. 7, 8).
1 10 20 BWI-4c - GRGCQGLQEEPELVGTRGPA BWI-3c - TRGCSGKSEWPELVGTRG BWI-1а - LRQCSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRA AmTI - ARECPGKQEWPELVGEYGYKAAAIIERENPNVRD TI-I - LMCEGKQMWPELIGVPTKLAKEIIGKENPSIIN PI-IA - EFECDGKLQWPELIGVPTKLAKGIIEKQNSLISN Рис. 7. N-Концевые аминокислотные последовательности некоторых ингибиторов, выделенных из семян гречихи, и ингибиторов семейства картофельного ингибитора I: BWI-3с, BWI-4с – изученные в настоящей работе, BWI-1а – анионный ингибитор из покоящихся семян гречихи (Belozersky et al., 1995), AmTI - ингибитор из семян амаранта Amaranthus hypochondriacus (Valdes-Rodriguez et al., 1993), TI-I - ингибитор I из листьев томатов (Graham et al., 1985), PI-IA - протомер ингибитора I из клубней картофеля сорта Russet Burbank (Richardson and Cossins, 1975).
Сравнительный анализ N-концевых аминокислотных последовательностей ингибиторов BWI-3c и BWI-4c (рис. 7) показывает, что имеется большая степень гомологии между ними и ингибиторами семейства картофельного ингибитора I. Степень гомологии с ингибитором трипсина из семян амаранта составляет 56% для ингибитора BWI-3c и 45% для ингибитора BWI-4c. Кроме того, BWI-3c и BWI-4c гомологичны изученным ранее анионным ингибиторам из гречихи (Belozersky et al., 1995): степень гомологии с ингибитором BWI-1a составляет 78% для ингибитора BWI-3c и 60% для ингибитора BWI-4c. Все ингибиторы указанного семейства обнаруживают консервативность в положениях Lys7, Pro11-Glu12-Leu13, Gly15. Также относительно стабильны положения остатков Cys4, Gly6 и Val14. Остатки Lys7 и Trp10, имеющиеся практически у всех сравниваемых ингибиторов, в молекуле BWI-4c заменены на остатки Leu7 и Glu10 соответственно. Таким образом, на основании установленных N-концевых а.к. последовательностей, а также физико-химических свойств катионные ингибиторы BWI-3с и BWI-4с могут быть идентифицированы как члены семейства картофельного ингибитора протеаз I.
1 10 20 30 6.5k-AGRP- PRGSPRTEYEACRVRCQVAEHGVERQRRCQQVCEKRLREREGRR MiAMP2a - SEFDRQEYEECKRQCMQLETSGQMR-RCVSQCDKRFEEDIDWS BWI-2b - SDKPQQLLEQCRYLCRIRRWSTDMVHRCQQKCQDDF-QRQQRG BWI-1c - SEKPQQELEECQNYCRMKXXSTEMF BWI-2c - SEKPQQELEECXXXXXXXXWSTEMVHRCEKKCEEK-EERQQR VCLB - -EDPQRRYEECQQECRQQEERQRPQ--CQQRCLKRFEQEQQQS 80 Рис. 8. N-Концевые аминокислотные последовательности ингибиторов, выделенных из гречихи: BWI-1c, BWI-2c – изученные в настоящей работе, BWI-2b (Park et al., 1997), а также вицилина VCLB из хлопка Gossypium hirsutum (Chlan et al., 1986), 6.5k-AGRP из тыквы Luffa cylindrica (Kimura et al., 1997), антимикробного пептида MiAMP2a из Macadamia integrifolia (Marcus, 1999).
N-Концевые последовательности ингибиторов BWI-1c и BWI-2c высокогомологичны между собой и с ингибитором BWI-2b, изученным японскими учеными (Park et al., 1997) (рис. 8). По данным сравнительного анализа этих последовательностей эти ингибиторы не могут быть отнесены к какому-либо из изученных в настоящее время семейств ингибиторов.
Однако имеется сходство этих ингибиторов (30-40 % гомологии) с участками N-концевой области первого экзона запасного белка вицилина из семян хлопка Gossypium hirsutum (Chlan et al., 1986), а также с антимикробными пептидами из Macadamia integrifolia (Marcus, 1999) и аргинин/глутамат-богатым полипептидом (6.5 k-AGRP) из семян люффы Luffa cylindrica (Kimura et al., 1997;
Ishihara et al., 1997), функции которого не исследованы. Характерен мотив Cys-(Xaa)3-Cys-(Xaa)10-12-Cys-(Xaa)3-Cys, присутствующий в исследованных ингибиторах и имеющийся в вицилинах.
Таким образом, катионные ингибиторы BWI-1с и BWI-2с по установленной аминокислотной последовательности не могут быть отнесены ни к одному из описанных к настоящему времени семейств, однако имеют гомологию с аллергенным ингибитором трипсина из семян гречихи (Park et al., 1997), а также с участками последовательности запасного белка вицилина из хлопка и некоторыми встречающимися в семенах пептидами, функции которых исследованы недостаточно. Эти данные могут быть в дальнейшем использованы для изучения эволюционных изменений в качественном составе белков семян в связи с необходимостью противостоять неблагоприятным условиям окружающей среды или в результате совмещения разных функций в одном белке-предшественнике.
ВЫВОДЫ:
1. Из покоящихся семян гречихи впервые выделены и охарактеризованы четыре новых ингибитора сериновых протеиназ: BWI-1с, BWI-2с, BWI 3с и BWI-4с.
2. Молекулярные массы изученных ингибиторов лежат в пределах 5,2-7, кДа, а ИЭТ – в области рН 8,0–8,5. Все исследованные ингибиторы характеризуются высокой рН-стабильностью в широком диапазоне рН 2,0-12,0 и термостабильностью, особенно в кислой среде.
3. В положении Р1 реактивных центров ингибиторов BWI-3c и BWI-4c находится остаток лизина, а в реактивном центре BWI-2c – остаток аргинина.
4. Ингибиторы протеаз BWI-1c и BWI-2c способны инактивировать только трипсин, химотрипсин и трипсин-подобные протеиназы мицелиальных грибов, в то время как ингибиторы протеаз BWI-3c и BWI-4c также эффективно подавляют активность субтилизинов бактерий и субтилаз грибов.
5. Катионные ингибиторы протеаз из семян гречихи в опытах in vivo подавляли прорастание спор и рост гиф фитопатогенных грибов.
6. На основании данных по N-концевым аминокислотным последовательностям в совокупности с физико-химическими свойствами ингибиторы протеаз BWI-3c и BWI-4c из семян гречихи могут быть отнесены к семейству картофельного ингибитора протеиназ I. В то же время ингибиторы протеаз BWI-1c и BWI-2c по совокупности полученных данных не могут быть отнесены ни к одному из известных семейств ингибиторов протеолитических ферментов.
Список основных работ по теме диссертации.
1. Т.А.Цыбина, М.А.Белозерский, Я.Е.Дунаевский. (1997) Катионные ингибиторы протеиназ из семян гречихи. Тезисы IV симпозиума "Химия протеолитических ферментов", Москва, с.88.
2. M.A.Belozersky, T.A.Tsybina, T.N.Gruban, Y.E.Dunaevsky. (1997) On the possible functions of protease inhibitors in buckwheat seeds. The FASEB Journal 11, N9, 2181.
3. Y.E.Dunaevsky, E.B.Pavlukova, G.A.Beliakova, T.N.Gruban, T.A.Tsybina, M.A.Belozersky. (1998) Protease inhibitors in buckwheat seeds: comparison of anionic and cationic inhibitors. J.Plant Physiol., 152, 696-702.
4. Y.E.Dunaevsky, T.N.Gruban, T.A.Tsybina, M.A.Belozersky. (1998) Proteinases and their inhibitors as factors of plant-fungi interactions. Bul. J.
Plant Physiol. (special issue), S13-21, 221.
5. M.A.Belozersky, T.A.Tsybina, G.A.Beliakova, T.N.Gruban, Y.E.Dunaevsky.
(1998) Protease inhibitors in buckwheat seeds: properties, amino acid sequences, classification and possible biological role. Advances in Buckwheat Research, eds. Campbell C., Przybylski R., Winnipeg, Canada, p. 57-60.
6. Y.E.Dunaevsky, T.N.Gruban, T.A.Tsybina, E.A.Golubeva, G.A.Beliakova, M.A.Belozersky. (2000) Defense system in buckwheat seeds against attack of provokers of fusariosis and alternariosis. Plant Physiol. Biochem. 38 (suppl.), 221.
7. Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Белозерский М.А. (2000) Ингибиторы протеаз из семян высших растений как фактор устойчивости к патогенной микрофлоре. Агрохимия 10, 56-61.
8. M.A.Belozersky, T.A.Tsybina, Y.E.Dunaevsky (2001).Cationic protease inhibitors from buckwheat seeds: properties and structure analysis. Abstacts of the 27th FEBS meeting. Eur. J. Biochem. 268 (suppl.1), 192.
9. Y.E.Dunaevsky, T.N.Gruban, G.A.Beliakova, T.A.Tsybina, M.A.Belozersky (2001). On the role of protease inhibitors from buckwheat seeds in protection against pathogens. Abstacts of the 27th FEBS meeting. Eur. J. Biochem. (suppl.1), 262.
10. Цыбина Т.А., Дунаевский Я.Е., Мусолямов А.Х., Егоров Ц.А., Белозерский М.А. (2001). Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи. Биохимия 66, 1157-1164.
11. T.A.Tsybina, T.N.Gruban, G.A.Beliakova, Y.E.Dunaevsky, M.A.Belozersky (2001). Cationic protease inhibitors from buckwheat seeds. Abstacts of the 2001 Cold Spring Harbor Meeting on Proteolysis and biological control.
P.125.