Регуляция адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям
На правах рукописи
Погорелова Анна Юрьевна РЕГУЛЯЦИЯ АДАПТАЦИИ СИМБИОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ Специальность 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Ванькова Анна Андреевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Воробьева Лена Ивановна кандидат биологических наук Мышкина Вера Леонидовна ГНУ Всероссийский научно-исследовательский
Ведущая организация:
институт агрохимии имени Д.Н. Прянишникова, г. Москва
Защита диссертации состоится «29» сентября 2010 г. в 14 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева, корпус № 9, аудитория имени Н.Н. Худякова.
Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева, факс 8(495)9762492.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева
Автореферат разослан «_27_» августа_2010 г.
и размещен на сайте университета www.timacad.ru
Ученый секретарь диссертационного совета О.В. Селицкая Актуальность проблемы.
Использование бактериальных препаратов на основе симбиотрофных бактерий, способных к фиксации атмосферного азота, является наиболее экономичным и экологически чистым способом повышения плодородия почвы [Черников, Чекерес, 2000;
Новикова, 2004;
Тихонович, Круглов, 2006].
Инокуляция растений симбиотрофными азотфиксирующими бактериями (клубеньковыми рр. Azorhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium или ассоциативными рр. Azospirillum, Agrobacterium, Arthrobacter, Klebsiella) приводит к повышению продуктивности растений при снижении нормы расхода минеральных азотных удобрений [Мишустин, Шильникова, 1973;
Lin, 1983;
Хотянович, 1991;
Воробьева, 2000;
Завалин с соавт., 2003;
Кожемяков с соавт., 2004;
Емцев, Мишустин, 2005;
Тихонович с соавт. 2005]. Симбиозы также обладают огромными преимуществами для развития растительно-микробных ассоциаций в изменяющихся условиях окружающей среды, чему способствуют высокий природный адаптационный потенциал партнеров и их эволюционно закрепленное взаимовыгодное сосуществование [Douglas, 1994;
Seckbach, Dordrecht, 2002;
Muratova et al., 2003;
Проворов, 2001, 2009;
Тихонович, Проворов, 2003, 2007]. Однако при циклической смене хозяина симбиотрофные бактерии попадают в почву и должны существовать в ней в иных, отличных от симбиотических, условиях, что требует реализации ранее не проявляемых свойств. Вместе с тем проблеме выживания симбиотрофных микроорганизмов в природных экосистемах, особенно в неблагоприятных условиях, уделяется мало внимания.
Создание современных бактериальных препаратов сопряжено с селекцией как высокопродуктивных, так и стрессоустойчивых штаммов, быстро адаптирующихся при попадании в почву, возобновляющих активный метаболизм и сохраняющих способность к колонизации растения [Завалин, 2000;
Проворов, Тихонович, 2003]. Поэтому изучение механизмов адаптации симбиотрофных бактерий не только актуально, но является и своевременной агробиотехнологической задачей. Особенно важным представляется исследование таких типов стратегии адаптации, как образование покоящихся форм (ПФ), которые позволяют популяции переживать неблагоприятные для роста условия [Бухарин с соавт., 2005;
Мулюкин с соавт., 2002;
Эль-Регистан с соавт., 2006], реализуя внутрипопуляционную фенотипическую вариабельность, от которой зависит эффективность развития бактерий в их жизненном цикле и результативность симбиозов [Dragutin et al., 2003;
Woude et al., 2004]. Особое значение имеет изучение роли в этих процессах низкомолекулярных микробных и растительных ауторегуляторов.
Цель работы: изучить закономерности формирования и развития адаптивных реакций симбиотрофных бактерий.
Задачи исследования:
1. Установить условия образования покоящихся клеток симбиотрофных бактерий Sinorhizobium meliloti, шт. P221, и Azospirillum brasilense, шт. Sp7 и Sp245, как формы адаптационного ответа на неблагоприятные для роста условия. Исследовать морфологическое и физиологическое разнообразие покоящихся форм этих бактерий, образующихся при имитации природных стрессовых условий. 2. Выявить различия в стратегии выживания симбиотрофных бактерий с разным типом взаимодействия с растительным партнером на примере двух штаммов A. brasilense: неэндофитного (ассоциативного) Sp7 и эндофитного Sp245. 3. Изучить внутривидовую вариабельность S. meliloti и A. brasilense, реализующуюся при прорастании покоящихся форм. Охарактеризовать культуральные, морфологические, физиолого-биохимические и биотехнологические признаки выделенных диссоциантов, а также тип их подвижности. 4. Оценить роль низкомолекулярных ауторегуляторов растительного и микробного происхождения в контроле адаптивных реакций ризобиальных бактерий.
Научная новизна.
1. Впервые получены доказательства способности симбиотрофных ризобиальных бактерий S. meliloti, шт. P221, и A. brasilense, шт. Sp245, образовывать в цикле развития их культур клетки, обладающие признаками покоящихся форм. Выявлены условия, моделирующие стрессовые природные ситуации и способствующие массовому образованию покоящихся форм. 2.
Обнаружено разнообразие покоящихся форм S. meliloti и A. brasilense, различающихся ультраструктурной организацией, пролиферативным потенциалом и терморезистентностью, что демонстрирует гибкость стратегии выживания этих бактерий. 3. Установлена зависимость формирования ПФ A.
brasilense определенного морфотипа от характера взаимодействия с растительным партнером (неэндофитного или эндофитного). 4. Изучена фенотипическая диссоциация S. meliloti и A. brasilense, составляющая адаптивный потенциал популяции. Выделены и охарактеризованы варианты бактерий по культуральным, морфологическим, физиолого-биохимическим и биотехнологическим признакам, а также типу подвижности. 5. Обнаружены различия в плазмидном профиле диссоциантов S. meliloti. 6. Впервые показана возможность регуляции адаптивных реакций симбиотрофных бактерий ауторегуляторами растительного происхождения – агглютинином зародышей пшеницы (АЗП) и микробного происхождения – алкилоксибензолами (АОБ).
Практическая значимость работы. 1. Полученные результаты могут быть использованы для разработки эффективных бактериальных препаратов на основе цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) азотфиксирующих бактерий, длительно сохраняющих жизнеспособность. 2. Предложены способы: а) быстрого получения диссоциантов симбиотрофных бактерий путем рассева ПФ на плотные или полужидкие среды;
б) селекции диссоциантов с заданными свойствами, путем применения избирательных ростовых условий. 3. Создана коллекция диссоциантов S. meliloti и A. brasilense, различающихся ростовыми, физиолого-биохимическими признаками, а также типом подвижности, которые могут быть использованы при получении бактериальных препаратов для сельского хозяйства. 4. Разработаны способы контроля адаптационных возможностей симбиотрофных бактерий, основанные на применении низкомолекулярных ауторегуляторов микробного и растительного происхождения. Способы предусматривают: а) стимуляцию роста;
б) сохранение жизнеспособности клеток при длительном хранении;
в) направленное изменение типа коллективной подвижности бактерий для повышения результативности колонизации растений.
Апробация работы. Результаты работы были обсуждены на: VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск 2008);
II Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (Пушкин, 2008);
Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной выдающимся педагогам Петровской академии (Москва, 2008);
IV межрегиональной конференции молодых ученых (Саратов, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Исследования осуществлялись совместно с ИНМИ имени С.Н.
Виноградского РАН, ГосНИИГенетики, Центром «Биоинженерия» РАН, ИБФМ имени Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Автор выражает искреннюю признательность научному консультанту, доктору биологических наук Г.И. Эль-Регистан, кандидату биологических наук Н.Г. Лойко, сотрудникам лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах и включают 29 рисунков и 20 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы, содержащего 200 работ отечественных и зарубежных авторов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили симбиотрофные азотфиксирующие бактерии Sinorhizobium meliloti шт. P221 (B-9442) и Azospirillum brasilense штаммы Sp7 (ATCC 29145) и Sp245 (из коллекции ИБФРМ РАН, Саратов).
Методы исследований.
Бактерии S. meliloti выращивали на маннитной среде [Muratova et al., 2003] или безазотистой среде Эшби [Зенова с соавт.., 2002];
A. brasilense – на среде MSM [Dbereiner J. et al., 1976] в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на качалке (150 об/мин) при температуре 28°С.
Оптическую плотность (ОП) клеточных суспензий измеряли нефелометрически на спектрофотометре «Specord» ( = 540 нм, l = 10 мм).
Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли высевом бактериальных суспензий соответствующих разведений на агаризованные среды.
Термоустойчивость клеток оценивали после прогрева клеточных суспензий в ультратермостате «UV-10» при температурах 50 – 60°С в течение 5 – 10 минут с последующим определением числа КОЕ. Эндогенное дыхание клеток определяли полярографически [Шольц, Островский, 1975]. Микроскопические наблюдения проводили на микроскопе «Amplival» (Германия) с фазово-контрастным устройством. Для ультрамикроскопических исследований осажденные клетки фиксировали по методу Spurr [Spurr et al., 1980]. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB III (Швеция) и просматривали в микроскопе JEM-100B (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 10000 – 35000. Цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК) получали, подвергая бактерии стрессорным воздействиям (термообработке) [Мулюкин с соавт., 1996;
Лойко с соавт., 2000]. Диссоцианты бактерий получали при рассеве ЦПК на агаризованные среды с пересевом каждого фенотипа по 5 клонов последовательно в 5 – 6 пассажах. Индекс диссоциации популяции определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний.
Подвижность бактерий оценивали после их посева уколом в полужидкую среду (0.4 – 0.5 % агар-агара или фитогеля) [Шелудько с соавт., 2001].
В качестве микробных ауторегуляторов использовали химические аналоги аутоиндукторов анабиоза – алкилоксибензолы (АОБ): амфифильный С7-АОБ и гидрофобный С12-АОБ. В качестве растительного ауторегулятора использовали лектин растительного происхождения – агглютинин зародышей пшеницы (АЗП).
Для исследования влияния ауторегуляторов на адаптационные механизмы бактерий их растворы вносили в плотные или полужидкие среды, или в клеточные суспензии до заданной концентрации.
Степень деградации фенантрена диссоциантами S. meliloti оценивали следующим образом. Клетки бактерий высевали на агаризованную маннитную среду. Спустя трое суток выросшие колонии опрыскивали 3%-ным раствором фенантрена в серном эфире. Через 2 недели фиксировали зоны деструкции фенантрена с областью просветления вокруг колоний. Определение нитрогеназной активности в чистой культуре проводили ацетиленовым методом на газовом хроматографе CHROM-4-1 с пламенно-ионизационным детектором [Звягинцев, 1991].
Выделение ДНК осуществляли согласно методике, основанной на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли [Birnboim, Doly, 1979] и Wizard-технологии фирмы Promega (США). Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система [Lane, 1991]. Секвенирование продуктов амплификации проводили по методу Сэнгера [Sanger et al., 1977]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer Y., De Wachter, 1994]. Плазмидный скрининг осуществляли согласно методике Голубева [Голубев, 2002].
Статистическую обработку проводили стандартными методами в программе Microsoft Excel XP. Значение искомого параметра выражали как среднюю величину из трех независимых экспериментов с учетом значений стандартного отклонения. Различия между группами данных считали достоверными при уровне значимости менее 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Образование покоящихся клеток как форма адаптации симбиотрофных бактерий к условиям, неблагоприятным для роста и развития. Биоразнообразие форм покоя Важным эволюционно выработанным и наследственно закрепленным механизмом адаптации бактерий к стрессовым условиям (исчерпанию питательных веществ, источников энергии, пространственных возможностей, действию повреждающих факторов) является образование покоящихся форм (ПФ), в виде которых популяция переживает неблагоприятные для роста и развития условия [Бухарин с соавт., 2005;
Dressaire et al., 2008]. Недостаток информации об образовании ПФ симбиотрофными бактериями, совмещающими в жизненном цикле стадию свободноживущих гетеротрофных клеток и стадию симбиотического взаимодействия с растением-хозяином, не позволяет эффективно использовать эти бактерии в биотехнологических процессах.
В качестве объекта для исследования процессов образования ПФ у симбиотрофных бактерий были взяты клубеньковые бактерии Sinorhizobium meliloti, штамм Р221, способные к разложению ароматических углеводородов.
Покоящиеся формы у них ранее не были известны. При анализе лабораторных культур S. meliloti, выросших в стандартной (маннитной) среде и длительно хранящихся – 6 – 12 месяцев, в них было обнаружено небольшое количество интактных, уменьшенных в размерах, рефрактерных клеток, которые по морфологическим признакам можно отнести к ПФ. Для увеличения количества образующихся ПФ были применены разработанные ранее способы, имитирующие природные стрессовые условия [Мулюкин с соавт., 1996].
1.1 Образование ПФ при модификации условий S. meliloti культивирования Первый прием, способствующий массовому образованию ПФ у неспорообразующих бактерий, был основан на модификациях стандартной среды роста – снижении количества азота и/или фосфора, уровня аэрации, что приводит к повышенному биосинтезу аутоиндукторов анабиоза, относящихся к алкилоксибензолам, концентрация которых в среде определяет путь дальнейшего развития клеток [Эль-Регистан с соавт., 1979, 1980, 2006;
Светличный с соавт., 1986;
Лойко с соавт., 2003]. Были использованы вариантов модификации стандартной среды: 1) снижение содержания азота (lim N) в 10 раз;
2) снижение содержания фосфора (lim P) в 5 раз;
3) снижение содержания азота в 10 раз и фосфора в 5 раз (lim N,P) 4) снижение уровня аэрации (lim O);
5) снижение содержания азота в 10 раз, снижение фосфора в раз, а также снижение уровня аэрации (lim N,P,O). Культуры клеток, выращенные в этих условиях, хранили при температурах 20°С и 4°С в течение 4 и более месяцев. Микроскопические наблюдения показали, что в лимитированных средах значительно увеличилось количество образовавшихся покоящихся рефрактерных клеток (до 90 %) и время сохранения (2 - 4 месяца) их жизнеспособности. Численность КОЕ через 4 месяца инкубации в опытных вариантах снижалась на 24 – 76 % от максимальной в стационарной культуре (48 ч), тогда как в контрольных вариантах в стандартной среде – на 2 порядка.
Хранение образовавшихся ПФ при низкой температуре (4°С) обеспечивало лучшее сохранение жизнеспособности бактерий, чем хранение при 20°С (рис.
1).
76 80 61 60 42 % 40 20 2,6 0, стандартная lim N lim P lim N, P lim O lim N, P, O среда Рисунок 1. Численность жизнеспособных клеток S. meliloti шт. Р221 (% от КОЕ в стационарной фазе, 48 ч), полученных в разных вариантах сред при хранении их суспензий 4 месяца: – при 20°С;
– при 4°С-- Следует отметить, что хотя в лимитированных условиях роста число КОЕ в выросших культурах было существенно ниже, чем в контроле, однако доля образовавшихся ПФ была значительно больше. По процентному содержанию клеток, сохранивших способность к колониеобразованию на плотной среде после длительного (4 месяца) хранения от максимального числа КОЕ в 48 ч культуре, лучшими оказались варианты: 1) lim N;
2) lim N, P, O при 20°С и 3) lim N;
4) lim N, P;
5) lim N, P, O при 4°С, тогда как по абсолютному количеству образовавшихся ПФ (КОЕ/мл) лидировали культуры в средах с lim P (20°С) и lim N (4°С), lim P (4°С), lim N, P (4°С). Проведение процедур реактивации, включающих отмывку клеток от аутоиндукторов анабиоза, а также инкубацию в 10-4 М растворе фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), повышало число жизнеспособных ПФ (КОЕ) в 1.5 – 2 раза (табл. 1).
Таблица 1. Жизнеспособность ПФ, полученных в лимитированных средах через 7 месяцев хранения при 20°С после проведения процедур реактивации Варианты Варианты сред реактивации КОЕ/мл (% от КОЕ до реактивации) lim N lim P lim N,P lim N,P,O Контроль ( 6.6±0.2) (8.2±0.4) (5.1±0.3) (0.6±0.3) 8 8 108 (100) (до реактивации) 10 (100) 10 (100) 10 (100) Отмывка в физ. р-ре (8.7±0.3) (6.8±0.3) (0.8±0.3) (1.0±0.06) 9 8 108 (119) рН 7.0, 2 ч 10 (152) 10 (106) 10 (133) Отмывка в физ. р-ре (1.3±0.1) (1.0±0.1) (1.2±0.1) (0.93±0.6) рН 7.0+ИУК 109 (197) 109 (122) 109 (235) 108 (142) 10-4М, 2ч Рефрактерные, длительно сохраняющие жизнеспособность клетки обладали свойствами, позволяющими отнести их к покоящимся формам бактерий. Электронно-микроскопически были выявлены существенные различия в ультраструктурной организации переживающих форм и вегетативных клеток. Также были обнаружены различия в морфотипах ПФ, образовавшихся в разных условиях роста (рис. 2). У ПФ, полученных в среде с lim N,P,O (20°С), наблюдались: многослойная оболочка, увеличение периплазматического пространства (электронно-прозрачного или заполненного плотными гранулами на апикальных участках), мелкогранулярная комковатая текстура цитоплазмы и конденсированный нуклеоид. ПФ другого типа, сформированные в средах с lim N и lim O, имели утолщенную клеточную стенку и многочисленные включения полиоксиалканатов (рис. 2 б, в).
а) б) в) Рисунок 2. Ультратонкие срезы покоящихся клеток S. meliloti шт.
Р221, полученных через 4 мес.
хранения в лимитированных средах:
а) lim N,P,O (20°С) б) lim O (20°С);
в) lim N (4°С). Длина масштабной линейки – 1 мкм Полученные в длительно хранящихся (2 – 7 месяцев) культурах переживающие клетки не проявляли метаболической активности эндогенное дыхание не выявлялось.
Важным признаком покоящегося состояния клеток является их повышенная устойчивость к стрессовым воздействиям. ПФ после 4 месяцев хранения обладали повышенной термоустойчивостью. После прогрева при 55°С в течение 10 минут численность жизнеспособных клеток в лимитированных средах в среднем на два порядка выше, чем в стандартной среде (табл. 2). Наиболее терморезистентными оказались ПФ, полученные в среде с lim N.
Таблица 2. Термоустойчивость ПФ S. meliloti шт. Р221 (4 месяца хранения) Условия получения ПФ Число жизнеспособных ПФ, КОЕ/мл Темпе- После термообработки До термообработки Среда ратура (контроль) 55°С, 10 мин. 60°С, 5 мин.
°С (6.1±0.2)103 (5.0±0.3) (0.3±0.1) Стандартная (0.14±0.01)109 (5.6±0.1)103 (4.4±0.2) (1.0±0.1)109 (1.9±0.1)106 (9.0±0.1) lim N (2.5±0.2)109 (5.5±0.3)106 (9.2±0.3) (2.16±0.2)109 (6.3±0.4)105 (8.0±0.5) lim P (4.8±0.3)109 (2.2±0.2)104 (8.0±0.5) (1.2±0.2)109 (5.1±0.4)105 (9.8±0.1) lim N,P (2.9±0.1)109 (9.5±0.6)105 (4.5±0.3) (0.14±0.02)109 (4.4±0.2)104 (2.5±0.1) lim О (0.21±0.03)109 (6.0±0.3)104 (3.1±0.2) (0.48±0.2)109 (1.5±0.1)105 (2.1±0.1) lim N,P,О (0.57±0.1)109 (2.4±0.3)105 (3.0±0.2) Таким образом, лимитирование среды роста по азоту, фосфору или уровню аэрации приводит к образованию в цикле развития культуры S. meliloti покоящихся форм бактерий цистоподобного типа (ЦПК), длительно сохраняющих способность к колониеобразованию, обладающих особенностями ультраструктурной организации, термоустойчивостью и метаболически не активных.
1.2 Образование ПФ S. meliloti в сгущенных клеточных суспензиях Одним из стрессов, «запланированных» в циклах развития микробных культур, является исчерпание жизненного пространства в результате достижения критической клеточной плотности [Parsek, Greenberg, 2000;
Бухарин с соавт., 2005]. Такую ситуацию в работе моделировали сгущением клеточных суспензий S. meliloti в среде роста в 20 раз. При этом часть клеток подвергалась автолизу, другая приобретала рефрактерность. Число жизнеспособных клеток (КОЕ) после 2-месячного хранения сгущенных суспензий оказалось на порядок меньше, чем без сгущения (табл. 3).
Термообработка суспензий ПФ приводила к резкому снижению численности.
После прогрева при 55°С в течение 10 минут сгущенных суспензий число жизнеспособных клеток составило 5.2103 КОЕ/мл, в среде без сгущения – 7.1104 КОЕ/мл. Отметим, что по литературным данным [Layne, Johnson, 1964] цисты бактерий рода Azotobacter практически не отличались от вегетативных клеток по устойчивости к дозе теплового воздействия, но выдерживали высушивание.
Таблица 3. Влияние сгущения клеточной суспензии на жизнеспособность клеток S. meliloti шт. P Численность, КОЕ/мл (% от первоначального Время наблюдения КОЕ) Без сгущения Сгущенная в 20 раз (2.0±0.1)1010 (100) 1 час (5.0±0.3)10 (100) (3.1±0.3)109 (62) (8.6±0.2)108 (4) 2 недели (1.8±0.1)109 (36) (3.8±0.2)108 (2) 1месяц (1.0±0.1)109 (20) (2.7±0.1)108 (1) 2 месяца Электронно-микроскопически было установлено, что переживающая сгущенная популяция (3 месяца хранения) представлена двумя типами клеток.
Первый тип был аналогичен ПФ, полученным в среде с lim N, P, O (рис. 3 а).
Клетки второго типа отличались расширенным периплазматическим пространством, практически не имели включений полиоксиалканатов, обладали конденсированным нуклеоидом (рис. 3 б).
б) а) Рисунок 3. Электронно-микроскопические снимки срезов ПФ клеток S.
meliloti шт. Р221, полученных в сгущенной в 20 раз клеточной суспензии через 3 месяца хранения: а) 1-й тип клеток, б) 2-й тип леток Таким образом, показано, что сгущение клеточных суспензий S. meliloti не приводит к повышению жизнеспособности бактерий.
1.3 Образование ПФ S. meliloti при внесении аутоиндукторов анабиоза Третий прием получения анабиотических клеток S. meliloti имитировал экологическую ситуацию, связанную с высыханием почвы и происходящим при этом повышением в среде концентрации ауторегуляторов, в том числе, аутоиндукторов анабиоза, по химической структуре относящихся к алкилоксибензолам (АОБ) [Эль-Регистан с соавт., 1979;
Дуда с соавт., 1982;
Сузина с соавт., 2004]. Образование ПФ индуцировали внесением химического аналога микробных АОБ – С12-АОБ в 36-часовую культуру до конечных концентраций 1 10-3, 510-4, 1 10-4, 510-5 М. Воздействие ауторегулятора оказалось дозозависимым (табл. 4): при воздействии самой высокой из исследуемых концентраций С12-АОБ 1 10-3 М, бактерии теряли способность к образованию колоний уже через 30 минут экспозиции при сохранении интактности клеток. Такие клетки можно рассматривать как ранее описанные мумифицированные формы [Мулюкин с соавт., 2003]. В варианте с концентрацией 510-4 М клетки теряли способность к колониеобразованию через 1 месяц инкубации, возможно вследствие перехода во временно некультивируемое состояние, описанное ранее для ПФ Micrococcus luteus [Kaprelyants, Mucamolova et al., 1996].
Таблица 4. Жизнеспособность клеток S. meliloti шт. Р221 после воздействия С12-АОБ Время экспозиции Концентра ция Численность жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (% от С12-АОБ, контроля) М 30 мин. 5 сут. 1 мес.
Контроль (6.9±0.2) 10 (100) (4.2±0.1) 10 (100) (2.3±0.2) 109 (100) 9 1 10-3 0 0 10-4 106 (0.02) (13±0.4) 105(0.03) 5 (1.0±0.1) 10-4 109 (86) 108 (9) (2.8±0.3) 107 (12) 1 (5.9±0.2) (3.7±0.1) 5 10-5 (6.7±0.3) 109 (97) (5.8±0.2) 109 (139) (4.2±0.5) 109 (183) В варианте с наименьшей концентрацией – 510-5 М при длительной инкубации (5 суток – 1 месяц) число клеток, способных образовывать колонии на агаризованной среде было на 39% и 83%, соответственно, выше, чем в контроле, а их терморезистентность (55°С 10 минут) на порядок больше (табл. 5). Действие температуры (60°С 5 минут) оказалось губительным как для контрольной, так и для опытных клеточных суспензий. Применение описанных выше процедур реактивации, включающих отмывку ПФ в физрастворе для вариантов 110-4, 510-5 М способствовало увеличению числа КОЕ в 1.5 – 2 раза.
Таблица 5. Термостабильность ПФ S. meliloti шт. Р221, полученных при воздействии С12-АОБ, хранившихся в течение месяца Концентрация Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл С12-АОБ, М До термообработки 55°С, 10 мин. 60°С, 5 мин.
(2.3±0.2) 109 (4.5±0.48) Контроль 1 10-3 0 0 510-4 0 0 1 10-4 (2.8±0.3) 107 (2.2±0.1)104 (4.2±0.5) 510-5 (4.0±0.32)105 Клетки в длительно хранящихся опытных образцах не обладали выявляемым уровнем эндогенного дыхания, что свидетельствовало об ингибировании их метаболической активности, и имели отличительные особенности ультраструктурной организации, характерной для ЦПК.
Следует отметить, что у полученных покоящихся клеток не менялся тип коллективной подвижности, что является важным фактором при взаимодействии ризобиальных симбиотрофов с растениями [Catlow et al., 1990;
Bashan, Holguin, 1994;
Dekkers et al., 2000;
Шелудько, Кацы, 2001;
Czaban et al., 2006]. Вегетативные клетки S. meliloti после инокулирования их уколом в полужидкий агар (0.4%) скоординировано распространялись с образованием регулярных кольцевых структур – роились (Swa+ фенотип, от англ. swarming – роение). На фоне роения наблюдалось также распространение клеток с образованием микроколоний (Gri+ фенотип, от англ. granular inclusions). ПФ также имели смешанный тип подвижности Swa+Gri+, при этом скорость движения у вариантов с внесением С12-АОБ в концентрации 510-5М, 510-4 М была на уровне, 110-4М – значительно выше контрольной, 110-3 – движение отсутствовало (табл. 6).
Таблица 6. Подвижность клеток S. meliloti шт. Р221, полученных при воздействии С12-АОБ Диаметр зон распространения клеток, мм Концентрация Возраст ПФ С12-АОБ, М 30 мин. 5 сут. 1 мес.
Контроль 16.5±0.2 15.0±0.5 11.0±0. 110-3 0 0 510-4 15.0±0.14 15.0±0.32 110-4 25.0±1.9 19.75±1.5 15.0±0. 510-5 15.0±0.4 14.0±0.3 11.0±0. Итак, при повышении концентрации аутоиндукторов анабиоза бактерии S.
meliloti формировали ЦПК, обладающие всеми необходимыми характеристиками ПФ бактерий.
Таким образом, впервые для симбиотрофных ризобиальных бактерий S.
meliloti показано, что они способны в циклах их развития или в условиях повышения уровня аутоиндукторов анабиоза формировать клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм: длительным сохранением жизнеспособности в условиях, способствующих автолизу;
пониженным уровнем метаболической активности (эндогенного дыхания);
устойчивостью к стрессовым воздействиям (термоусточивостью);
особенностями ультратонкой организации, свидетельствующими о существенных внутриклеточных структурных перестройках. Количество, свойства и полиморфизм образующихся покоящихся форм S. meliloti зависели от условий роста культур (модификация среды), условий их постстационарной инкубации, концентрации АОБ. Биоразнообразие ЦПК ризобий, по-видимому, обеспечивает осуществление разных экологических функций. Полученные результаты могут быть использованы при создании бактериальных препаратов нового поколения на основе ЦПК бактерий, длительно сохраняющих жизнеспособность и устойчивость к повреждающим воздействиям.
2. Различия в стратегии выживания (образования ПФ) симбиотрофных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense с разным типом взаимодействия с растительным партнером В жизненном цикле азоспирилл выделяют две фазы, что обусловлено сменой условий окружающей среды и связано с жизнедеятельностью растения хозяина. Фаза активной жизнедеятельности совпадает с периодом вегетации колонизируемого ими растения, а фаза покоя (в зимнее время) совпадает с фазой покоя растения-хозяина [Мулюкин с соавт., 2009]. Поэтому большое значение в их адаптации к неблагоприятным условиям должен играть характер взаимодействия с растительным партнером (экзо- или эндосимбиоз). В работе исследовали стратегию выживания, связанную с переходом клеток в покоящееся состояние, у двух штаммов A. brasilense: неэндофитного шт. Sp7, колонизирующего поверхность корня, и эндофитного шт. Sp245, клетки которого локализуются внутри корня [Assmus et al., 1995;
Schloter et al., 1998].
Оба штамма обладали полиморфизмом покоя и образовывали в циклах развития несколько типов покоящихся клеток, которые по совокупности признаков, описанных в предыдущей главе, можно квалифицировать как ЦПК (рис. 4). Образование ЦПК наблюдалось в разных условиях. ЦПК обоих штаммов отличались ультраструктурной организацией и термоустойчивостью (рис. 4, табл. 7).
б) а) в) г) Рисунок 4. Электронно-микроскопические снимки срезов ЦПК A.
brasilense, полученых в среде с lim N через 4 месяца хранения: а, б) шт. Sp7;
в, г) шт. Sp245. Обозначения: К – капсула;
НМ – наружная мембрана;
ЦПМ – цитоплазматическая мембрана;
Ц – цитоплазма;
Н – нуклеоид;
В – включения;
Гр – гранулы на поверхности клеток;
КС – клеточная стенка;
Э – экзина;
И – интина. Длина масштабной линейки – 300 нм Таблица 7. Термоустойчивость ЦПК A. brasilense шт. Sp7 и шт. Sp Штамм Число жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) До термообработки После термообработки (10 мин.) (контроль) 50°С 55°С 60°С (1.4±0.3)10 (2.0±0.2)10 (2.0±0.1) 6 Sp7 (2.1±0.3) (3.1±0.3)107 (2.1±0.4)105 10 Sp В постстационарных культурах шт. Sp7 (среда с пятикратно сниженным содержанием N) обнаруживались ЦПК двух типов. Для первого (рис. 4 а) было характерно хорошо выявляемое периплазматическое пространство, дополнительные слои в электронно-плотных покровах, выраженный капсулярный слой, наличие внеклеточных электронно-плотных меланиноподобных гранул, ассоциированных с капсульным слоем. ЦПК второго типа (рис. 4 б) капсульного слоя не имели, но были заключены в обширный, синтезированный de novo матрикс, вероятно, обеспечивающий дополнительную защиту ПФ бактерий неэндофитов от повреждающих воздействий, что согласуется с их повышенной термоустойчивостью (табл. 7).
ЦПК штамма Sp245 формировались при развитии культур в средах с пятикратно сниженным содержанием P. У ЦПК штамма Sp245 наружные покровы были менее дифференцированы, цитоплазма содержала меньше включений, отсутствовал выраженный капсульный слой (рис. 4 в). Кроме того, клетки штамма Sp245 в условиях голодания (при перенесении клеток, выращенных в lim N, в физраствор) формировали дифференцированные ПФ, сходные с цистами азотобактера и цистами, описанными выше для S. meliloti.
Такие покоящиеся клетки обладали хорошо выраженными слоями, аналогичными интине и экзине (рис. 4 г). У штамма Sp7 в этих условиях образования цист не наблюдалось, но в литературе они были описаны при высушивании колоний и клеточных агрегатов [Sadasivan, Neyra, 1987].
Таким образом, оба штамма азоспирилл при лимитировании питательных сред образовывали ЦПК разных морфотипов и покоящиеся формы типа цист азотобактера, что отражает различия в их взаимодействиях с растением хозяином. Покоящиеся клетки у штамма Sp245 были получены впервые.
Образование нескольких типов ПФ у обоих штаммов как более просто организованных – типа ЦПК, так и дифференцированных и близких по строению с цистами, различающихся не только особенностями ультраструктурной организации, но и термоустойчивостью, свидетельствует в пользу внутривидового разнообразия форм покоя, что способствует выживанию популяции и сохранению вида.
3. Внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность симбиотрофных бактерий как форма их адаптации к стрессу Вклад в адаптацию микроорганизмов вносит внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность – расщепление однородной популяции бактерий на варианты, различающиеся генотипическими, физиолого биохимическими и морфологическими свойствами [Милько с соавт., 2007].
Фенотипическая вариабельность относится к специфическому типу мутаций и осуществляется за счет транспозиции мобильных генетических элементов, экспрессии генов по типу «включение-выключение», фаговой или плазмидной конверсии и др. [Hallet et al., 1997;
Головлев, 1998;
Прозоров, 2001;
Woude et al., 2004]. Диссоциативные (фазовые) переходы реализуются при прорастании покоящихся клеток как селективное развитие варианта, наиболее адаптивного к новым условиям роста [Дорошенко с соавт., 2001], а для ризобиальных бактерий – наиболее способного к колонизации растения, что обеспечивает результативность симбиоза.
3.1 Популяционная вариабельность Azospirillum brasilense:
сопряженность с состоянием покоя, свойства диссоциантов Способность к фенотипической диссоциации штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 оценивали по образованию и развитию колоний, различающихся по культуральным признакам, при рассеве суспензий ЦПК, полученных в лимитированных средах.
В нашей работе были выделены и описаны 6 диссоциантов азоспирилл шт.
Sp7 (табл. 8): S (smooth) – гладкий, R (rough) имеет шероховатый тип колоний [Милько, Егоров, 1991], Pg (pigment) – пигментированные колонии с гладкой поверхностью, Sm (small) – мелкие (d 0.3-0.7мм) гладкие колонии, Sg (segment) – гладкие колонии с сегментообразным ростом, PgCr (pigment-crystal) – пигментированные колонии, образующие внеклеточные кристаллы в толще агара [Погорелова с соавт., 2009];
и 3 диссоцианта шт. Sp245 (табл. 9): M (mucoid) – слизистый [Милько, Егоров, 1991], S, Sm. По-видимому, наличие более широкого диссоциативного спектра у неэндофитных азоспирилл, по сравнению с эндофитными, обусловливает большие возможности адаптивных реакций в условиях их сапротрофного роста в ответ на действие неблагоприятных факторов.
Внутрипопуляционные диссоцианты различались морфологическими признаками, устойчивостью к стрессовым воздействиям (повышенной температуре), диссоциативной стабильностью, а также типом подвижности клеток, определяющим успешность колонизации растений.
Применение термообработки ЦПК перед их рассевом позволило расширить диссоциативный спектр популяций за счет проявления Sm фенотипа, клетки которого не обладали наблюдаемой подвижностью в полужидком агаре. Этот вариант не обладал стабильностью в стандартных условиях роста и быстро ревертировал к доминантным S- и Pg-типам, что обеспечивало восстановление способности клеток к передвижению.
Таблица 8. Описание фенотипических признаков диссоциантов A. brasilense шт. Sp7 (неэндофитный штамм) Фото Условия Ин Ти Культуральные Тип диссоцианта получения дек п признаки подвиж длина диссоциантов в с ди диссоциантов ности линейки среде с lim N дис сс 5 мм соц оц иац иа ии, нт % а Swa+Gri+ S Округлые палевые Хранение в колонии с гладкой стандартной поверхностью и (безлимитной) ровными краями среде 3 сут.
при +20°С Swa+Gri Pg Округлые бурые Хранение в колонии с гладкой физрастворе поверхностью и мес. при –20°С ровными краями Swa+Gri+ R Округлые колонии Хранение в палевого цвета и физрастворе шероховатой сут. при +20°С поверхностью Swa- Gri Sm Мелкие кремовые Хранение в колонии (d 0.3-0.7мм) физрастворе и с гладкой стандартной поверхностью и среде 4 мес.
ровными краями, при –20°С;
часто сливаются на после плотной среде прогревания при 60°С Swa+Gri Sg Кремовые колонии Хранение в продолговатой формы физрастворе с сегментообразным мес. при +20°С ростом Swa+Gri+ PgCr Пигментированные Хранение в колонии,внеклеточные физрастворе кристаллы в толще мес. при –20°С агара Таблица 9. Описание фенотипических признаков диссоциантов A.
brasilense шт. Sp245 (эндофитный штамм) Т Культуральные Фото Условия получения И Тип и признаки диссоцианта диссоциантов в нд подвиж п диссоциантов длина среде с lim N ек ности д линейки 3 с и мм ди сс сс о оц ц иа и ци а и, н % та S Округлые Хранение в палевые стандартной колонии с (безлимитной), гладкой сут. при +20°С Swa+Gri поверхностью Перенесение в и ровными физраствор, краями инкубация 6 мес.
при +20°С Тот же вариант после термообработки при 55°С Sm Мелкие Перенесение в полупрозрач- физраствор, ные колонии (d инкубация 6 мес.
Swa- Gri 0.3-0.7 мм) с при +20°С гладкой Тот же вариант поверхностью после и ровными термообработки при краями 55°С Swa+ Gri+ M Белые колонии Перенесение в со слизистой физраствор, поверхностью, инкубация 6 мес.
неровными при +20°С краями Тот же вариант после термообработки при 55°С Таким образом, неэндофитный (Sp7) и эндофитный (Sp245) штаммы A.
brasilense различались не только эффективностью образования и разнообразием морфотипов покоящихся клеток, но и культуральными признаками. Различия свойств диссоциантов определяют диапазон толерантности бактериальной популяции к параметрам условий роста [Милько, Егоров, 1991]. Подбор условий, способствующих селективному выщеплению определенного диссоцианта, который может не проявляться в стандартных условиях посева, имеет практическое значение для поиска вариантов с желаемыми признаками.
3.2 Популяционная варибельность S. meliloti, биотехнологические свойства диссоциантов При высеве на плотную маннитную питательную среду ЦПК S. meliloti, описанных выше, были отобраны 2 варианта, различающиеся морфологией колоний (табл. 10).
Таблица 10. Характеристика диссоциантов S. meliloti шт. Р Тип Фото Культуральные Накопление N диссоци диссоцианта признаки биомассы, фиксирующая анта длина диссоциантов ОП (через 30 активность, линейки часов) мкмольN/мл, 3 мм сут.
Гладкие, вогнутые в S центре, кремовые 1.55±0.05 5.9±0. колонии, имеющие ровные края Мелкие плоские Sm прозрачные шероховатые 0.58±0.04 3.0±0. колонии с ровными краями Диссоциант Sm, имеющий мелкие колонии, по ростовым характеристикам и уровню накопления биомассы отставал от варианта S (табл. 10), однако был устойчив к стрессовым воздействиям (длительному хранению, воздействию высоких температур) (табл. 11). Можно предположить, что его экологической функцией является выживание бактерий S. meliloti в почве в условиях дефицита питания и повреждающих воздействий, тогда как доминантный фенотип, способный к колонизации растений, обеспечивает симбиотическую фазу жизненного цикла ризобий.
Таблица 11. Термоустойчивость клеток диссоциантов S. meliloti шт. Р Диссо- Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл До термообработки цианты После термообработки (контроль) 55°С, 10 мин. 60°С, 5 мин.
9 (2.5±0.2)10 (8.0±1.0)10 S 9 (4.2±0.1) (1.9±0.3)10 (6.8±0.6) Sm Оба диссоцианта росли на безазотистой среде Эшби, что говорит об их способности к азотфиксации. Однако вариант Sm не обладал способностью к утилизации полициклического ароматического углеводорода фенантрена.
Одним из генетических механизмов диссоциативных вариаций является изменение плазмидного профиля ризобий. В нашей работе это было продемонстрировано отсутствием плазмидной ДНК у варианта Sm (рис. 5).
1 2 3 М т.п.н.
Рисунок 5. Электрофореграмма плазмидных ДНК диссоциантов S.
meliloti шт. Р221: 1 – S;
2 – Sm;
3 – контроль – E. coli;
М – ДНК Маркер (GeneRuler™ 1000 п.н.) Таким образом, бактерии S. meliloti и A. brasilense обладают способностью изменять диссоциативный спектр их популяций, проявляющийся развитием различных фенотипов, что можно использовать в селективном отборе наиболее приспособленных и устойчивых в данных условиях вариантов. Показанная возможность регуляции диссоциативной активности и выделения определенных фенотипов симбиотрофных бактерий актуальны для разработки эффективных бактериальных препаратов.
4. Роль внеклеточных ауторегуляторов в контроле процессов адаптации симбиотрофных бактерий В формировании и функционировании ассоциаций бактерий и растений важную роль играют внеклеточные регуляторные метаболиты партнеров симбиоза. Известно, что растительные лектины, имеющие функции адгезинов, участвуют в прикреплении бактериальных клеток к корням растения [Антонюк, 2005], но их роль в контроле адаптивных реакций бактерий изучена мало.
Среди микробных низкомолекулярных ауторегуляторов, осуществляющих межклеточную коммуникацию для координированного ответа популяции на изменения окружающих условий, функциями адаптогенов обладают алкилоксибензолы [Николаев с соавт., 2006]. Их влияние на адаптацию симбиотрофных бактерий и результативность симбиозов неизвестны. Отметим, что АОБ широко распространены в природе и синтезируются не только микроорганизмами, но и растениями [Kozubek, Tyman, 1999;
Kulawinek, Kozubek, 2008]. В связи с вышесказанным, в заключительной части работы изучалось участие микробных и растительных низкомолекулярных регуляторов в адаптационных стратегиях симбиотрофных бактерий.
Присутствие в стандартной питательной среде растительного лектина – агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) (1 – 10 мкг/мл) не влияло на рост A.
brasilense Sp245 (ОП культуры, КОЕ), однако дозозависимо повышало количество жизнеспособных ПФ, дающих колонии на агаризованной среде после их рассева. Количество жизнеспособных (КОЕ) покоящихся клеток в культурах с внесением 5 и 10 мкг/мл АЗП через 5 месяцев инкубации оказалось в 11 и 3 раза больше, чем в контроле (рис. 6).
Важно отметить, что при инокулировании ПФ опытных вариантов в полужидкую среду были зафиксированы изменения в типе подвижности выросших клеток: увеличиваась доля Gri+ фенотипа, отвечающего за заселение растущих корней после «заякоривания» бактерий (1 и 5 мкг/мл), тогда как в контрольных суспензиях (без АЗП), а также в варианте с концентрацией АЗП 10 мкг/мл доминировал Swa+ фенотип. Кроме того, в опытной культуре с мкг/мл АЗП после 2 недель хранения, наблюдали появление у Swa+ фенотипа «протуберанцев» – зон более быстро движущихся при роении клеток, а также развитие фенотипа с отсутствием движения (Swa- Gri-).
* 9,5 0.17;
0.18;
0.17;
0. 0.19;
0.37;
0.28;
0.18* 8, lg КОЕ/мл 0.16;
0.19;
0.095;
0.17* 0.38;
0.07;
0.19;
0.13* 7, 6, 1 сут. 2 нед. 2 мес. 5 мес.
Время хранения контроль (без АЗП) 10 мкг/мл 5 мкг/мл 1 мкг/мл * Предельные ошибки средних значений lg КОЕ/мл Рисунок 6. Динамика численности жизнеспособных клеток A. brasilense шт. Sp245 при различной концентрации АЗП Рост азоспирилл в средах с внесенным амфифильным алкилоксибензолом, С7-АОБ, в зависимости от его концентрации характеризовался: (1) сокращением на 25 – 40 % времени лаг-фазы (10-7, 10-6, 10-5 М);
(2) увеличением в ~ 2 раза максимальной удельной скорости роста (10-7 и 10-6 М);
(3) увеличением накопления биомассы (10-6 и 10-5 М) на 120 – 140 %. Кроме того, содержание в среде С7-АОБ в концентрации 10-7 М ускоряло развитие культуры за счет сокращения времени трофофазы. Количество жизнеспособных (КОЕ) покоящихся клеток бактерий в опытных суспензиях после 5-месячной инкубации оказалось выше, чем в контроле.
С7-АОБ также оказывал влияние на диссоциативный спектр популяции азоспирилл: в экспоненциальной фазе роста увеличивалась доля клеток с Swa++типом подвижности (суперроение).
В серии экспериментов по выявлению влияния алкилоксибензолов на результативность адаптивных реакций бактерий гидрофобного гомолога С12 АОБ учитывали его ингибиторный эффект на рост бактерий [Лойко с соавт., 2002]. В этой серии опытов, клетки азоспирилл линейной фазы роста (ОП 0.9;
ч) рассевали на плотные и полужидкие среды, содержащие С12-АОБ, либо инокулировали в среду MSM (рН 5.7 и 7.0) с разными концентрациями С12-АОБ.
Развитие азоспирилл в опытных вариантах существенно отличалось от контрольных (без АОБ) по показателям численности жизнеспособных клеток и их диссоциативным переходам (табл. 12).
Таблица 12. Влияние концентрации С12-АОБ на жизнеспособность и гетерогенность популяции A. brasilense Sp 245 (инкубация в жидкой среде при pH 7.0) Концентра Число Доля Диаметр колец Индекс диссоциации, % ция С12- жизнес- доминан роения, мм Тип подвижности АОБ, М пособных тного + + + диссоци Swa Swa Gri Мико на 3 на клеток, анта, % белый пиг- идный день день КОЕ/мл, 108 мент.
Контроль 4±1.3 55 5 95 0 0 6.5±1.0 9.0±1. - 110 1.8±0.3 52 0 100 0 0 4.0±0.5 6.5±0. - 510 1.9±0.1 41 20 80 1 0 6.0±1.2 8.0±0. - 110 2.8±0.3 33 12 88 0 1 6.5±0.7 10.0±1. - 510 2.6±0.2 46 6 94 0 1 7.0±0.9 8.5±0. Инкубация азоспирилл в присутствии С12-АОБ в MSM среде с рН 5.7 в наибольшей степени способствовала проявлению фенотипической гетерогенности популяции (табл. 13). Эти результаты можно объяснить воздействием на бактерии как закисления среды, так и самого С12-АОБ, играющего в развитии стрессовых реакций роль сигнала тревоги – алармона [Голод с соавт., 2009]. Высокая концентрация С12-АОБ (510-4 М) вызывала переход доминантного фенотипа (Swa+ с белой пигментацией) в минорный микоидный фенотип («М», рост в виде «мицелия»). В популяции, подвергшейся воздействию в пять раз меньшей концентрации (10-4 М) С12-АОБ, 89 % клеток имели микоидный фенотип и 11% – распространялись суперроением (Swa++).
Таблица 13. Влияние концентрации С12-АОБ на диссоциативный спектр A.
brasilense Sp 245 (инкубация в жидкой среде при рН 5.7) Концентрация Диссоциативный спектр, % С12-АОБ, М Тип подвижности + + Микоид Swa++ Gri+ «Протубе Swa Swa белый пигмент. ный ранцы» 1 Контроль 25 67 0 - 1 510 0 0 100 - 1 110 4 0 89 510-5 0 1 16 84 - 0 1 110 8 92 - 510 5 65 1 30 Таким образом, было показано, что низкомолекулярные внеклеточные регуляторные метаболиты растений (АЗП, АОБ) и бактерий (АОБ) способны контролировать развитие адаптивных реакций симбиотрофных бактерий, влияя на их ростовые параметры, жизнеспособность, популяционную гетерогенность, клеточную подвижность. Варьируя приемы обработки клеток фиторегуляторами, их концентрацию и время воздействия на клетки возможно координировать эффекты в нужном направлении для решения конкретных биотехнологических задач.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что одними из основных форм адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям роста являются образование анабиотических покоящихся форм и проявление внутрипопуляционной вариабельности, составляющие часть единой адаптационной системы, обеспечивающей выживание популяции и результативность симбиоза с растением.
2. Продемонстрирована способность симбиотрофных бактерий S. meliloti шт. P221 и A. brasilense шт. Sp245 и шт. Sp7 образовывать в цикле развития их культур при стрессовых воздействиях, имитирующих природные ситуации или при повышении уровня аутоиндукторов анабиоза, цистоподобные клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм бактерий.
3. Выявлено разнообразие морфотипов покоящихся форм S. meliloti и A.
brasilense, зависящее от условий роста и характера взаимодействия с растительным партнером. ПФ разных морфотипов различаются ультраструктурной организацией, пролиферативным потенциалом, термоустойчивостью и степенью реализации фенотипических диссоциативных переходов.
4. Изучена внутрипопуляционная вариабельность бактерий S. meliloti и A.
brasilense. Выделены колониально-морфологические диссоцианты этих бактерий, показаны их различия по морфологическим, физиолого биохимическим и биотехнологическим (для S. meliloti) признакам, а также по типу коллективной подвижности клеток.
5. Установлены различия между неэндофитным Sp7 и эндофитным Sp штаммами A. brasilense в способности к фенотипической диссоциации и подвижности клеток в полужидких средах, что, по-видимому, отражает особенности их адаптации к меняющимся условиям окружающей среды и характер взаимоотношений этих бактерий с растениями.
6. Выявлена способность низкомолекулярных внеклеточных ауторегуляторов – растительного лектина (АЗП) и микробных алкилоксибензолов (АОБ) влиять на эффективность адаптивных реакций симбиотрофных бактерий: параметры их роста в питательных средах, сохранение жизнеспособности при длительном хранении, интенсивность диссоциативных переходов и стабильность развития определенных фенотипов, а также тип коллективной подвижности клеток.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Погорелова А.Ю., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Разнообразие морфотипов покоящихся клеток и условия их образования у Azospirillum brasilense // Микробиология. 2009. Т. 78. № 1. С. 42 52.
2. Погорелова А.Ю., Мулюкин А.Л., Антонюк Л.П., Гальченко В.Ф., Эль Регистан Г.И. Фенотипическая вариабельность у Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и Sp245: сопряженность с состоянием покоя и свойства диссоциантов // Микробиология. 2009. Т. 78. № 4. С. 618-628.
3. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова А.А. Образование цистоподобных покоящихся форм Sinorhizobium meliloti P221 под влиянием алкилоксибензола – химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза // Известия ТСХА.
2009. Выпуск 1. С. 149-154.
4. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова А.А. Регуляция развития и диссоциативных переходов симбиотрофных бактерий // Известия ТСХА. 2009.
Выпуск 2. С. 176-182.
5. Погорелова А.Ю., Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Получение покоящихся форм Azospirillum brasilense для разработки бактериальных препаратов на их основе // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». 2 – 6 июня 2008. Минск. Т. 2. С. 91 92.
6. Погорелова А.А., Затонских О.В., Лойко Н.Г., Ванькова А.А., Эль Регистан Г.И. Механизмы адаптации симбиотических бактерий Sinorhizobium meliloti: образование покоящихся форм, популяционная вариабельность // Материалы второй Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность». 3 – 5 июня 2008. Санкт-Петербург. С.120-122.
7. Погорелова А.Ю., Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Ванькова А.А., Эль-Регистан Г.И. Покоящиеся формы Azospirillum brasilense как основа бактериальных препаратов // Сборник статей Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной выдающимся педагогам Петровской академии. 5 – 6 июня 2008. Москва. С. 345-349.
8. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Косилова И. С., Ванькова А.А., Антонюк Л.П., Эль-Регистан Г.И. Регуляция развития ризобактерий Azospirillum brasilense Sp245 в присутствии внеклеточных метаболитов // Материалы IV межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». 14 – 16 октября 2008.
Саратов. С.51.