Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками

На правах рукописи

ЕФРЕМОВ Артем Константинович ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КИНЕТОХОРОВ ХРОМОСОМ С МИКРОТРУБОЧКАМИ 03.00.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2008 1

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор – Фазоил Иноятович Атауллаханов Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор – Иван Андреевич Воробьев доктор физико-математических наук, доцент Вавилин Василий Александрович Ведущая организация – институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится «22» мая в часов 2008г. 18: на заседании диссертационного совета Д 501.002.11 при Московском государственном уни верситете имени М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В.Ломоносова, физический факультет, аудитория 5-19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. Ломоносова

Автореферат разослан «22» апреля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук, доцент Хомутов Г.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микротрубочки – биополимеры цитоскелета, играющие важную роль в жизни клетки. Они активно участвуют в поддержании формы клетки и транспортной системе. Но самая важная функция микротрубочек – распределение точных копий генетиче ского материала по дочерним клеткам во время деления клетки – митоза. Для решения этой задачи природа в течение эволюции создала специальный белковый комплекс, собираю щийся на центромерном участке каждой хроматиды, – кинетохор. За него во время митоза могут зацепляться микротрубочки, участвующие в транспорте хромосом. Раньше считалось, что за перемещение хромосом в митозе отвечают моторные белки на кинетохоре, а кинето хорные микротрубочки просто играют роль «рельсов» по которым идут эти белки. Однако недавно было показано, что это не так – для транспорта хромосом во время митоза необхо димо и достаточно только динамической нестабильности микротрубочек. Основа этого яв ления состоит в том, что микротрубочка может находиться в двух состояниях – быстрой разборки или медленного роста. Причем переход из одного состояния в другое является случайным процессом у свободных микротрубочек. Сокращающаяся микротрубочка, зацеп ленная за кинетохор, тянет за собой хромосому, в то время как растущая микротрубочка на оборот толкает хромосому. То, что микротрубочки действительно могут создавать силы достаточные для движения хромосом во время митоза, было показано экспериментально.

Однако до сих пор ни одна из существующих моделей взаимодействия кинетохора и микро трубочки не может полностью описать их структурные данные и динамические характери стики, полученные в недавних экспериментах, несмотря на частичные успехи этих моделей.

Целью данной работы было теоретическое и экспериментальное исследование механиз ма движения кинетохорного Dam1 комплекса, ответственного за взаимодействие микротру бочек с кинетохорами хромосом и образующего кольца вокруг микротрубочек.

Задачи исследования:

1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре и кинетики деполимеризации. При этом модель должна включать в себя тепло вые флуктуации, которые не были учтены ни в одной предшествующей модели микротру бочки.

2. Создать и объединить с моделью микротрубочки модель кинетохорных белковых ком плексов, взаимодействующих с микротрубочкой, основываясь на их структурных и динами ческих данных.

3. С помощью получившейся математической модели определить, какими свойствами должны обладать кинетохорные белки, взаимодействующие с микротрубочкой, для наибо лее эффективного развития тянущей силы деполимеризующейся кинетохорной микротру бочкой.

4. Понять, как удается кинетохорным белковым комплексам быть сильно связанными с микротрубочкой и при этом быстро передвигаться.

5. Экспериментально определить по какому из известных теоретических механизмов происходит движение кинетохора во время деления клетки.

Научная новизна. Впервые была разработана наиболее полная модель кинетохора и его взаимодействия с микротрубочкой, включающая в себя все известные на сегодняшний день структурные и динамические экспериментальные данные. В результате введения дополни тельной гипотезы в модель о существовании подвижных белковых мостиков – линкеров у кинетохора, ответственных за связывание со стенкой микротрубочки, впервые было показа но, каким образом удается совместить высокую эффективность движения кинетохора вдоль микротрубочки с сильным связыванием кинетохора и микротрубочки. Этого свойства кине тохора до сих пор не могла объяснить ни одна существующая на сей день математическая модель. Не смотря на такое чисто теоретическое предположение, подобные линкеры были совсем недавно обнаружены на электронных фотографиях [Wang 2007], что свидетельствует в пользу созданной нами модели. Сравнение результатов модели с существующими экспе риментальными данными по динамике кинетохорного белкового комплекса, ответственного за зацепление хромосомы к микротрубочкам, показало, что в природе реализуется силовой механизм движения (power stroke mechanism) кинетохора при разборке микротрубочки, а не механизм диффузии со смещением (biased diffusion mechanism). Этот результат также под тверждается проведенными мной экспериментальными исследованиями. Кроме того теоре тические расчеты показали, что кинетохор движется наподобие моторных белков – его лин керы перешагивают из одного сайта взаимодействия на микротрубочке в другой, используя вместо энергии АТФ энергию упругих напряжений, запасенную в стенке микротрубочки.

Подобный механизм движения до сих пор не был никем описан. Кроме того было экспери ментально показано существование in vitro никем ранее не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обладают ки нетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.

Научно-практическое значение. Исследование механизмов, участвующих в делении клеток, очень важно при изучении развития раковых заболеваний. Знание процессов, проте кающих во время митоза и принципов их действия, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание ме ханизма движения и взаимодействия кинетохора с микротрубочкой, а также выяснение ме ханизма генерации сил, развиваемых кинетохорными микротрубочками во время деления клетки.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана оригинальная математическая модель взаимодействия микротрубочки и кине тохора, хорошо согласующаяся со всеми существующими экспериментальными данными.

2. С помощью полученной математической модели определены необходимые свойства кинетохорных белков, связывающихся с микротрубочкой, для обеспечения наиболее эффек тивного функционирования кинетохора.

3. Показано, каким образом можно совместить в кинетохоре два противоречивых свойст ва – сильное связывание с микротрубочкой и высокую подвижность.

4. Экспериментально определен механизм, по которому происходит движение кинетохо ра во время деления клетки.

5. Экспериментально показано существование ранее никем не описанных структур, обра зуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обла дают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.

Апробация работы состоялась 13-ого марта 2008 г. на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на III съезде биофизиков России (Воронеж, 24- июня 2004);

46-ой и 47-ой конференциях annual ASCB meeting (December 9-13, 2006, San Di ego, CA и December 1-5, 2007, Washington, DC);

конференции молодых ученых "Биология наука XXI века" (29 октября - 2 ноября, 2007, Пущино).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 5-и конфе ренций и 2статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинопис ного текста, состоит из введения, шести глав, библиографического указателя, включающего 106 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.) и в Университете штата Колорадо, США (зав лабораторией проф. Ричард Макинтош).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Модель микротрубочки. За основу была взята модель микротру бочки из статьи [Molodtsov 2005a] с небольшими изменениями, описанными ниже. В этой модели рассматривается микротрубочка, состоящая из 13 протофиламентов с 3-х заходной спиралью, ось микротрубочки направлена вдоль оси z. Считалось, что каждый протофила мент все время находится в плоскости, проходящей через ось микротрубочки и начальное вертикальное положение протофиламента. Это предпо ложение не ограничивает применение модели, т.к. на электронных томограммах видно, что протофиламенты практически полностью лежат в таких плоскостях.

Конформационное изменение формы протофиламента при выгибании из стенки микротрубочки происходит благодаря изгибанию между и субъединицами внут ри димеров тубулина и наклону между соседними ди Рис.1. Схематическое изобра- мерами тубулина [Nicholson 1999, Gigant 2000, Stein жение положения силовых цен metz 2000]. Поэтому в модели протофиламенты состоя тров в модели.

ли из твердых сферических мономеров одинакового диаметра (4 нм), которые могут наклоняться друг относительно друга. Предполагалось, что каждый мономер имеет четыре точки взаимодействия с соседними мономерами. Две из них соответствуют взаимодействию «голова к хвосту», это связи мономеров внутри протофила ментов (темно-серые кружочки на рис. 1). Две другие – по бокам, соответствующие боко вым связям мономеров внутри стенки микротрубочки (светло-серые кружочки на рис. 1).

Как и в статьях [Molodtsov 2005a, 2005b] считалось, что все взаимодействия между мономе рами одинаковы для - и -мономеров.

Координаты первого мономера в каждом протофиламенте были зафиксированы. Про дольные связи «голова к хвосту» мы считали нерастяжимыми и отвечающими только за из гибание протофиламентов, а потенциал этого взаимодействия описывался функцией gk,n = B· (k,n–o)2/2, где k,n = k,n – k-1,n – угол между k-ым и (k-1)-ым мономерами в n-ом прото филаменте, k,n – угол между k-ым мономером в n-ом протофиламенте и осью микротрубоч ки, эти углы являются независимыми переменными в модели;

B – параметр, характеризую щий изгибную упругость связи. Потенциал боковых взаимодействий мономеров мы описы вали функцией (r) = A·(r/ro)2·exp(-r/ro), где А и ro – параметры потенциала, r = r (k,n) – рас стояние между боковыми центрами взаимодействия тубулинов.

Модель ДАМ-кольца. Из экспериментальных данных известно, что ДАМ-кольцо состоит из ~ 16 субъединиц. Но для упрощения модели считалось, что кольцо состоит из 13. Такое упрощение не ограничивает общности модели, поскольку образование дополнительных связей стерически не возможно. Кольцо в расчетах имело внутренний диаметр 33 нм [Wes termann 2005, Miranda 2005]. От каждой из 13 субъединиц кольца к одному из 13 протофи ламентов идет линкер – белковый мостик комплекса Dam1, ответственный за взаимодейст вие с микротрубочкой. Каждый линкер описывался линейным стержнем длиной 4 нм. Счи талось, что каждый линкер может сжиматься в продольном направлении, а также выгибать ся из плоскости кольца, при этом в расслабленном состоянии все линкеры направлены в центр кольца. Исходя из результатов статьи [Westermann 2005] я предположил, что центр связывания линкера с димером тубулина находится на -мономере тубулина. Положение сайта взаимодействия линкера с -мономером тубулина показан белым кружочком на рис.

1. Для простоты расчетов считалось, что подвижный конец каждого линкера все время дви жется по внешней поверхности соответствующего протофиламента. Следовательно, каждый линкер будет описываться одной степенью свободы, не включая координат ДАМ-кольца. В качестве нее был взят угол n между плоскостью кольца и направлением линкера. Эти углы, так же как и углы k,n являются независимыми переменными в нашей модели. Кроме того к независимым переменным относятся три координаты положения центра ДАМ-кольца в про странстве Xc, Yc, Zc и три угла Эйлера для него,,. Таким образом, углы k,n, n,,, и координаты Xc, Yc, Zc составляют весь набор независимых переменных системы, который обозначим.

Энергия продольной деформации n-го линкера равна qn(ln) = kspring·ln2/2, где kspring – ко эффициент продольной жесткости линкера;

ln = ln( ) – абсолютное изменение длины линкера. А энергия изгибания n-го линкера равна pn(n) = kflex·n2/2, где kflex – коэффициент изгибной жесткости линкера;

n = n( ) – угол отклонения линкера от равновесного поло жения.

Кроме этих двух энергий, описывающих свойства упругости линкеров в модель была введена энергия взаимодействия подвижного конца линкера с -мономерами тубулина. Она аппроксимировалась формулой dn(n) = –kDAM·exp(–n2/rDAM2), где kDAM – параметр, описы вающий глубину ямы;

rDAM – параметр, характеризующий ширину потенциальной ямы, n = n( ) – расстояние от подвижного конца n-го линкера до центра взаимодействия на бли жайшем -мономере.

Выбор значений констант модели. Параметр o был выбран исходя из структурных дан ных [Muller-Reichert 1998] – угол между соседними ГДФ-димерами тубулина в протофила менте в расслабленном состоянии равен 0.4 радиана. Для простоты считалось, что этот угол есть сумма равных интердимерного и интрадимерного изгибания между мономерами тубу лина, т.е. равновесный угол o = 0.2 радиана в обоих случаях. Другой параметр – B в форму ле был выбран из соображения, что вся энергия гидролиза ГТФ, связанного с -мономером тубулина, – EH = 7.3 ккал/моль = 12.3 kBT, [Lehninger 1993], запасается в стенке микротру бочки в виде упругих напряжений. Следовательно, B = EH/ o2 300 kBT/рад2. Для соответ ствия температурной зависимости скорости разборки микротрубочки был подобран пара метр A, который оказался равен 28 kBT, а величина барьера боковой связи Ebarrier = 4Ae-2 kBT. Поэтому разность энергии барьера боковой связи мономера и энергии запасенной в продольной связи мономера равна Etheor = Ebarrier – EH/2 = 15 kBT – 6 kBT = 9 kBT, что соот ветствует экспериментальным данным Eexp = (4.8 ± 0.6) ккал/моль (8 ± 1) kBT [Molodtsov 2005b].

Дальнейшие расчеты модели показали, что от изменения величины kspring на порядок по лученные далее динамические зависимости не сильно меняются, поэтому эта величина во всех приведенных ниже расчетах была фиксирована и равна kspring = 0.13 Н/м. Такой коэф фициент упругости для стержня длиной 4 нм площадью поперечного сечения 1 нм2 соответ ствует модулю Юнга E = 5·108 Н/м2, характерному для многих белков.

Расстояние типичного белок-белкового взаимодействия составляет 1-2 [Jiang 2002].

Поэтому параметр ro из формулы был выбраны равными ro = 0.8, т.к. длина связи равна 2ro = 1.6. Это же касается и параметра rDAM, который был взят равным 1.4.

Также в модели необходимо задать коэффициент диффузии свободного ДАМ-кольца в воде. Для этой цели были взяты данные по измерению коэффициента диффузии Dam1 дека меров в воде [Miranda 2005] и был оценен коэффициент диффузии свободного ДАМ-кольца в растворе по порядку величины как D = 10-7 см2/с.

Таким образом, в модели микротрубочки, взаимодействующей с ДАМ-кольцом, есть только два важных параметра – kflex, kDAM, от которых сильно зависят конечные результаты.

Экспериментальная установка. Все эксперименты с проточной камерой были сделаны на световом микроскопе Zeiss Axiophoto2, адаптированным под конструкцию лазерной ловуш ки. Изображения движущихся флуоресцентных Dam1 комплексов были получены с интер валом в 5 секунд в виде z-стеков, включающих в себя 3-4 плоскости с шагом в 0.3 мкм. Это было необходимо, т.к. микротрубочки, на которых сидят ДАМ-пятна, совершают колеба тельные тепловые движения и часто выходят из фокальной плоскости микроскопа, что сильно сказывается на величине интенсивности ДАМ-пятен. Экспозиция камеры в каждой плоскости была равна 400 мс. Изображения движущихся шариков, покрытых Dam1 ком плексом, при деполимеризации микротрубочки, снимались с использованием DIC микро скопии и выдержкой видеокамеры 100 мс для каждого кадра.

Реагенты и белки. Большинство реагентов были куплены у Sigma и Molecular Probes. Не гидролизуемый аналог ГТФ, GMPCPP, был приобретен у Jena Bioscience. Тубулин был по лучен из коровьих мозгов путем по протоколу из [Weingarten, 1975]. Мечение тубулина ро дамином и биотином было выполнено по стандартному протоколу из [Hyman, 1991]. В ка честве центров нуклеации тубулина использовались лизированные шкурки тетрахимены или аксонемы, присланные из университета штата Миннесоты. Стеклянные микрошарики были приобретены у Spherotech Inc и обработаны по протоколу из [Asbury, 2006].

Приготовление проточной камеры к экспериментам. Эксперимент проводился в термо стати-руемой (32°С) проточной камере, основой которой служили предметное и покровное стекла, разделенные слоем двустороннего скотча. Схема эксперимента представлена на рис.

2. До начала эксперимента шкурки тетрахимены (или аксонемы) помещались на покровное стекло, после чего камера заполнялась буфером А (BRB-80, 4 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0. мг/мл казеина), собиралась и запечатывалась силиконом (Kwik-cast, WPI, Inc). После этого не адсорбировавшиеся на покровном стекле шкурки тетрахимены (аксонемы) вымывались из камеры 300 мкл буфера А на скорости 100 мкл/мин. Затем в камеру вмывался ГТФ тубулин концентрации 1.4 мг/мл (с 1 мМ ГТФ) со скоростью 30 мкл/мин. Спустя 15 мин, когда микротрубочки вырастали до размеров ~ 10 мкм, камера промывалась четырьмя объ емами GMPCPP-тубулина (1:3 тубулин был мечен родамином) в концентрации 0.4 мг/мл (с 1 мМ GMPCPP) со скоростью 30 мкл/мин. За время промывки камеры на плюс концах мик ротрубочек нарастало несколько слоев GMPCPP-тубулина и микротрубочки становились устойчивыми и не чувствительными к разбавлению концентрации свободно плавающих димеров тубулина. Благодаря этому камеру можно было хорошо от мыть от остатков свободно плавающего в растворе меченого родамином тубулина.

Рис. 2. Схематическое изображение экспери Кроме того, благодаря наличию крашено мента.

го родамином тубулина на GMPCPP кон чиках микротрубочек, можно было инициировать деполимеризацию микротрубочек, нахо дящихся в поле зрения микроскопа, уничтожая GMPCPP кончики микротрубочек путем их освещения зеленым светом, на котором поглощает родамин. Отмывка камеры производи лась все тем же буфером А на скорости 10 мкл/мин в течение 5 минут. Затем камера промы валась буфером Б, за основу которого брался буфер А с добавлением BSA до концентрации 0.5 мг/мл и 1% 2-меркаптоэтанолом.

В некоторых экспериментах в проточную камеру добавлялся раствор буфера Б с Dam комплексом там, где это отдельно оговаривается в тексте. Меченный краской Dam1 ком плекс был любезно предоставлен Вестерманом, университет Беркли, Калифорния. Непо средственно перед введением в проточную камеру Dam1 разводился в буфере Б до концен траций порядка 3-30 нМ.

Результаты.

Увеличение жесткости линкеров кольца ведет к уменьшению силы связывания кольца с микротрубочкой. Расчеты модели для разных kflex показали, что с ростом изгибной жестко сти линкеров падает количество связей между ДАМ-кольцом и микротрубочкой. При kflex = 2000 kBT/рад, максимальное количество линкеров, взаимодействующих с сайтами связыва ния на микротрубочке, в каждый момент времени 3 и эта цифра не зависит от kDAM. При жесткости kflex = 200 kBT/рад с сайтами взаимодействия на микротрубочке связываются по 7 9 линкеров кольца, а при kflex = 20 kBT/рад все линкеры кольца находятся в связанном со стоянии для глубин ДАМ-потенциала в интервале 10-16 kBT. С уменьшением kDAM наблюда ется уменьшение максимального количества связанных линкеров до 3. Следовательно, мож но заключить, что кольцо с более гибкими линкерами образует больше связей, чем кольцо с жесткими линкерами, т.к. такому кольцу легче наклониться относительно оси микротрубоч ки, чтобы образовать больше связей. Кроме того нашей группой было ранее показано, что жесткое кольцо с внутренним диаметром, приблизительно равным диаметру микротрубоч ки, имеет низкое КПД преобразования упругой энергии, запасенной в стенке микротрубочки в механическую работу [Molodtsov 2005b]. А поскольку кольцо с жесткими линкерами (kflex = 2000 kBT/рад) эквивалентно жесткому кольцу с внутренним диаметром равным диаметру микротрубочки, то можно уже на этой стадии заключить, что конфигурация кольца с жест кими линкерами не является оптимальной.

ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубоч ки. Дальнейшие расчеты показали, что для колец с гибкими линкерами kflex = 20 kBT/рад и глубиной ДАМ-потенциала kDAM ~ 12-14 kBT наблюдается совпадение распределения углов наклона кольца относительно оси микротрубочки с экспериментально померенным [Miranda 2005] с достоверностью 95%, см. рис. 3. На этом рисунке черным цветом изображена диаграмма распределения для теоре тических расчетов в пред положении, что на димере тубулина есть только один Рис. 3. Диаграммы распределения углов наклона кольца от сайт связывания линкера носительно оси микротрубочки. kflex = 20 kBT/рад и kDAM = кольца – на -мономере.

kBT.

Белым цветом изображена диаграмма распределения для экспериментальных данных. Для сравнения была также по считана серая диаграмма распределения в случае, когда на димер тубулина приходится два сайта связывания линкера кольца – один на -мономере, другой – на -мономере. С досто верностью 95% эта теоретическая диаграмма отличается от экспериментальной диаграммы.

Эти данные хорошо согласуются с экспериментальными наблюдениями [Westermann 2005], которые свидетельствуют о том, что субъединицы ДАМ-кольца связываются только с мономерами димеров тубулина.

У кольца есть несколько выгодных наклонных положений относительно оси микротрубочки. Их можно проиллюстрировать с помощью полярной диаграммы, как это сделано на рис. 4. На диа грамме каждая точка изображает проекцию конца единичного вектора коллинеарного оси кольца на плоскость, перпендикулярную оси микротрубоч ки. Радиальные круги на диаграмме, идущие с Рис. 4. Угловая диаграмма устойчи вых положений ДАМ-кольца. kflex = шагом 0.05, показывают абсолютную величину kBT/рад и kDAM = 13 kBT.

проекции, равную sin, где – угол Эйлера кольца. Азимутальные направления показывают расположение плоскостей протофиламен тов, если смотреть от плюс конца к минус концу микротрубочки. Из диаграммы видно, что точки расположены неравномерно, что объясняется спиральностью микротрубочки. И наи более часто кольцо образует угол 0.27±0.07рад с наклоном в сторону 5 протофиламента.

Слабосвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо движется по механизму направ ленной диффузии. Расчеты по зависимости эффективного коэффициента диффузии кольца, связанного с микротрубочкой, от kflex и kDAM показа ли, что наибольшее влияние на этот параметр ока зывает величина kDAM, в то время как зависимость от kflex небольшая. Результаты расчетов изображены на рис. 5, на котором показаны зависимости эффек тивного коэффициента диффузии кольца от глуби ны ямы kDAM для различных изгибных жесткостей линкеров kflex. Из графиков видно, что когда взаи Рис. 5. Зависимость коэффициента модействие кольца с микротрубочкой очень слабое диффузии кольца от энергии связы вания линкеров с тубулином. (kDAM 2 kBT), кольцо диффундирует очень быстро.

При этом эффективный коэффициент диффузии на этом участке мало зависит от глубины ДАМ-потенциала. При увеличении силы связывания (kDAM = 2-5 kBT) наблюдается экспо ненциальная зависимость – увеличение силы связывания на 1 kBT приводит к 10 кратному уменьшению эффективного коэффициента диффузии ДАМ-кольца в модели.

При таких неглубоких ДАМ-потенциалах кольцо во время укорочения микротрубочки двигается по механизму диффузии со смещением, см. рис. 6, на котором изображено изме нение положения центра кольца и деполимеризующегося конца микротрубочки с течением времени. Из графика видно, что кольцо совер шает случайные движения вдоль микротрубоч ки, однако деполимеризующийся конец микро трубочки ограничивает движение кольца, не давая ему слететь с микротрубочки. Это проис ходит благодаря тому, что деполимеризую щийся конец микротрубочки очень сильно рас крывается, и его диаметр превышает диметр Рис. 6. Зависимость положения центра ДАМ-кольца. Поэтому такой конец микротру ДАМ-кольца и конца микротрубочки при бочки играет роль энергетического барьера, ко ее деполимеризации. kflex = 20 kBT/рад и торый кольцо не может преодолеть, т.к. для kDAM = 4 kBT.

этого понадобилась бы энергия 100 kBT для распрямления протофиламентов микротрубочки.

Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо двигается по механизму силового шагания. При увеличении глубины ДАМ-потенциала наблюдаются сильные изменения в динамическом поведении кольца. Так при kDAM = 10-15 kBT кольцо имеет очень маленький эф (10- фективный коэффициент диффузии см2/с), т.е. такое кольцо при характерном вре мени проведения эксперимента порядка часа выглядело бы неподвижным. Но при деполиме ризации микротрубочки изгибающиеся прото филаменты развивают силу давления на линке ры кольца, достаточную для того, чтобы кольцо Рис. 7. Зависимость положения центра начало двигаться со скоростями порядка скоро ДАМ-кольца от времени при деполиме сти разборки микротрубочки. При этом такое ризации микротрубочки для разных кольцо перемещается вдоль оси микротрубочки kDAM. kflex = 20 kBT/рад.

шагами (см. рис. 7), что разительно отличается от диффузии слабосвязанного с микротру бочкой кольца (см. рис. 6). На рис. 7 разными оттенками изображены графики смещения центра кольца вдоль оси микротрубочки в зависимости от времени для разных значений kDAM. Из рис. 7 видно, что центр сильно связанного с микротрубочкой кольца всегда дви жется в направлении деполимеризации микротрубочки и не испытывает случайно диффузии как у слабосвязанного с микротрубочкой кольца. Однако и здесь наблюдается некий эле мент случайности – движение кольца часто прерывается паузами, являющимися результа том стохастического поведения протофиламентов при разборке микротрубочки и вероятно стными переходами кольца между устойчивыми положениями относительно микротрубоч ки. При этом длительность пауз тем больше, чем больше сила связывания линкеров кольца с поверхностью микротрубочки. Из-за чего с увеличением силы связывания наблюдается за медление скорости движения ДАМ-кольца и деполимеризации микротрубочки, см. рис. 8.

Т.к. сильносвязанное с микротрубочкой кольцо пе ремещается вдоль оси микротрубочки шагами под действием силы со стороны деполимеризующегося конца микротрубочки, то такой механизм движения можно назвать «силовым шаганием». При этом лин керы передвигаются 8нм шагами, что довольно таки очевидно, т.к. на протофиламентах микротрубочки сайты связывания линкеров идут как раз с этим ша- Рис. 8. Зависимость скорости гом, равным длине димера тубулина. Центр же самого движения ДАМ-кольца при раз борке микротрубочки от kDAM. kflex кольца передвигается с менее регулярным шагом в = 20 kBT/рад.

отличие от линкеров, т.к. движение кольца является усреднением движения всех 13 линкеров, которые шагают асинхронно.

Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо обладает более лучшими динами ческими характеристиками, чем слабосвязывающееся ДАМ-кольцо. Для сравнения двух ти пов колец – сильносвязывающихся (kDAM = 10-15 kBT) и слабосвязывающихся (kDAM = 1- kBT) было исследовано две зависимости – сила остановки (stalling force) и сила отрыва кольца от глубины ДАМ-потенциала. В первом случае нагрузка, приложенная к кольцу, равномерно распределялась между 13 субъединицами кольца и искалась такая величина на грузки, при которой кольцо останавливалось при деполимеризации микротрубочки. Во вто ром случае бралась неразбирающаяся стабильная микротрубочка с ДАМ-кольцом, к кото рому опять же была приложена равнораспределенная по кольцу нагрузка. Только на этот раз искалась такая величина нагрузки, при которой кольцо начинало двигаться в сторону нагрузки, преодолевая ДАМ-потенциалы на поверхности микротрубочки и, в конечном сче те, отрываясь от конца микротрубочки.

Так, например, оказалось, что сила остановки для слу чая kDAM = 5 kBT равна ~ 60-70 пН, а для случая kDAM = 13 kBT она равна ~ 40-50 пН. И, следовательно, в первом случае КПД системы ~ 80-90%, а во втором ~ 50-60%, т.к. максимально развиваемая микротрубочкой сила по теоретическим оценкам равна 80пН. Но КПД системы – не единственный параметр, определяющий оптималь ность конструкции ДАМ-кольца. На рис. 9 изображено два графика: 1) светлый – зависимость силы остановки Рис. 9. Зависимость сил оста от глубины ДАМ-потенциала;

2) темный – зависимость новки и отрыва ДАМ-кольца от силы отрыва от глубины ДАМ-потенциала. В районе kDAM. kflex = 20 kBT/рад.

точки пересечения этих двух графиков и немного правее находится область оптимального значения параметра kDAM, изображенная на рисунке штри хованным прямоугольником, т.к. ДАМ-кольца, которые под действием деполимеризующей ся микротрубочки развивают силу, большую, чем сила отрыва кольца от микротрубочки, будут постоянно терять связь с микротрубочками. С другой стороны также невыгодно иметь слишком большую силу связывания ДАМ-кольца с микротрубочкой, т.к. это приво дит к маленькому КПД системы или вообще ее полной остановке. Таким образом, можно заключить, что клетке более выгодно иметь ДАМ-кольца с гибкими линкерами, взаимодей ствующими с димерами тубулина микротрубочки с энергией kDAM ~ 13-15 kBT.

На закрепленных к покровному стеклу микротрубочках образуются как нормальные ДАМ-кольца, так и ДАМ-структуры в виде недостроенных ДАМ-колец. Мной были прове дены эксперименты, аналогичные [Westermann 2006] по диффузии флуоресцентных ДАМ пятен вдоль стабилизированных таксолом микротрубочек, закрепленных за покровное мик роскопное стекло. При этом мы использовали микротрубочки, выращенные из биотинили рованного тубулина, а стекло непосредственно перед экспериментом было покрыто стреп тавидином. В результате связывания микротрубочек с покровным микроскопным стеклом, ДАМ-кольца с трудом могли образовываться вокруг них, исходя из стерических соображений. Это предположение подтверждается и электронными фотографиями ДАМ пятен, сделанных Грищук Е.Л., которые образовывались на таких связанных с поверхностью микротрубочках, см. рис.

10B. Из изображения видно, что Dam1 чаще образует струк туры в виде недостроенных ДАМ-колец, – ДАМ-патчей (Dam1-patches).

Все флуоресцентные ДАМ-пятна, связанные с микротру бочками, делились на две категории, см. кимограмму, изо браженную на рис. 12. Первая категория – более яркие пят на, которые совсем не двигались и сидели на одном месте Рис. 10. A. Электронная на микротрубочке в течение всего эксперимента. Вторая – фотография биотинилиро очень подвижные пятна, которые часто сливались друг с ванной микротрубочки, ле другом или наоборот разбивались на пару более слабых жащей на связывающей по верхности в отсутствии диффундирующих пятен. Динамические более слабые Dam1 в растворе. B. Тоже, ДАМ-пятна никогда не проходили сквозь яркие неподвиж что и в А, только на этот раз ные пятна, «отскакивая» от них. Это говорит о том, что та с Dam1 в растворе. Dam1 об кое яркое ДАМ-пятно занимает все протофиламенты мик разовал на поверхности мик ротрубочки структуры, часть ротрубочки, по из которых точно не являют- этому нет ни од ся замкнутыми кольцами ной обходной (показаны белыми стрелка дороги вокруг ми). C. Электронная фото этой структуры.

графия свободноплавающей микротрубочки с ДАМ- Т.к. в электрон кольцом на ней. ный микроскоп не было видно образования каких-либо агрегатов Рис. 11. Зависимость эффективного ко из Dam1, покрывающих все протофиламенты, эффициента диффузии флуоресцентных кроме ДАМ-колец, то, по-видимому, эти яркие ДАМ-пятен вдоль микротрубочек от их относительной яркости.

ДАМ-точки как раз представляли собой эти кольца.

Характерно, что при увеличе нии яркости ДАМ-пятна падал его коэффициент диффузии, см.

диаграмму на рис. 11, что гово рит о присутствии на микротру бочках ДАМ-комплексов с раз Рис. 12. Кимограмма флуоресцентных ДАМ-пятен, ным количеством Dam1 ком сидящих на микротрубочке, которая закреплена на свя плексов и связей, образованных зывающей поверхности. Из рисунка видно, что все пятна с микротрубочкой, и состоящих делятся на две группы – яркие неподвижные и более слабые, диффундирующие вдоль микротрубочки (белые из разного количества Dam1.

стрелки).

Причем чем больше флуорес ценция ДАМ-пятна, тем больше крашеного Dam1 входит в его состав, тем больше образует ся у такого пятна связей с микротрубочкой и тем меньше его коэффициент диффузии, начи ная от значений, обнаруженных в работе [Westermann 2006] и кончая полной остановкой ДАМ-пятна. Если взять верхнюю оценку коэффициента диффузии для самых ярких пятен из диаграммы на рис. 16 и подставить в теоретический график на рис. 6, то оказывается, что соответствующая глубина ДАМ-потенциала будет не менее 6-7 kBT.

В заключении об этом эксперименте стоит сказать, что, по-видимому, в работе [Wester mann 2006] как раз и наблюдали диффузию таких ДАМ-патчей на адсорбированных к стек лу микротрубочках, хотя приписывали ее движениям полных ДАМ-колец, что, по видимому, оказалось неверным. В нашей экспериментальной работе была впервые показана возможность существования высокодинамичных ДАМ-патчей на микротрубочке, которые вполне возможно могут играть немалую роль во время митоза.

Микрошарики, покрытые Dam1 комплексом, ускоряют разборку микротрубочек и обла дают высокой процессивностью движения. Для того чтобы исследовать более подробно возможность ДАМ-патчей трансформировать упругую энергию напряжений в стенке мик ротрубочки в механическую работу, были использованы микрошарики, покрытые меченым алексой 488 Dam1 комплексами. Микротрубочки выращивались из шкурок тетрахимен, ад сорбированных на покровном стекле. Затем в проточную камеру вмывались покрытые ша рики, большинство из которых повисало на микротрубочках. Непосредственно перед вмы ванием в проточную камеру эти шарики тщательно были отмыты от свободных Dam1 ком плексов, не связавшихся с поверхностью шариков и плавающих в растворе. Таким образом, эти шарики при зацеплении за микротрубочку не образо вывали ДАМ-колец. Это под тверждалось наблюдениями в течение всего эксперимента – на микротрубочках не было видимых во флуоресцентном канале ДАМ-пятен. При ини циации разборки микротру Рис. 13. Диаграммы распределения скоростей движения бочек путем облучения их шариков, покрытых Dam1, при деполимеризации микро зеленым светом 44% шариков трубочек для случаев отсутствия (серая) и присутствия (черная) Dam1 в растворе. отваливались от микротрубо чек, но оставшиеся 56% (231 шарик) начинали двигаться за разбирающимися концами мик ротрубочек вплоть до самого сайта нуклеации. В среднем такие шарики проходили порядка 7-10 мкм. При этом средняя скорость движения этих шариков была равна 29.8±3.4 мкм/мин (N=248), см. рис. 13, что было больше, чем средняя скорость разборки свободных микро трубочек 21.8±0.6 мкм/мин (N=57) в той же системе в отсутствии шариков, см. рис. 18. Сле довательно, шарики, покрытые Dam1 комплексом в отсутствии свободноплавающего Dam в растворе, обладают деполимеризующей активностью и двигаются при разборке по меха низму диффузии со смещением аналогично шарикам в [Lombillo, Peskin 1995, Tao 1998].

Уменьшение плотности покрытия Dam1 комплексом поверхности шариков ведет к уменьшению их скорости движения за деполимеризующимися концами микротрубочек.

При проведении экспериментов аналогичным тем, что упоминались в предыдущем пункте, с разными плотностями покрытия поверхности шариков Dam1, была получена зависимость, изображенная на рис. 14. И хотя график состоит всего из трех точек, хорошо заметна тен денция уменьшения скорости движения шариков с уменьшением количества Dam1 на их поверхности. Это служит доказательством того, что в такой постановке эксперимента не на блюдается формирование ДАМ-колец при присоединении шарика к микротрубочке. Т.к.

иначе понижение плотности Dam1 на шариках при водило бы к меньшему числу образующихся ДАМ колец, соединенных с шариком. А это бы приводило в свою очередь к увеличению скорости движения шариков при деполимеризации микротрубочки. Та кое поведение шариков в зависимости от плотности покрытия Dam1 наряду с их свойством ускорять де полимеризацию микротрубочек хорошо объясняет ся моделью диффузии со смещением, предложенной Рис. 14. Зависимость относитель в [Peskin 1995] для аналогичных экспериментов, ной скорости движения шариков при деполимеризации микротрубочек от правда с другим белком.

плотности их покрытия Dam1 ком Проводя такие же эксперименты, только в при плексами.

сутствии Dam1 комплекса в растворе оказалось, что в этом случае средняя скорость движения шариков за разбирающимися концами микротру бочек равна 9.4 ± 2.9 мкм/мин (N=119), что приблизительно в три раза меньше, чем в отсут ствии свободно плавающих Dam1 ком плексов, см. рис. 13. Это объясняется об разованием ДАМ-колец вокруг микротру бочек в месте присоединения шариков.

В пользу этого говорят измерения, про веденные на шариках с помощью лазер ной ловушки. Оказалось, что сила, разви ваемая деполимеризующейся микротру бочкой, на стрептавидиновые шарики, за цепленные за биотинилированные микро Рис. 15. Диаграммы динамических характе трубочки [Grishchuk 2005] по своей ам ристик сигналов, возникающих при перемеще плитуде и продолжительности гораздо нии шариков под действием деполимеризую щихся микротрубочек, измеренных в опыте с меньше, чем в случае шариков, покрытых лазерной ловушкой. Dam1, с присутствием Dam1 в растворе, см. диаграмму на рис. 15. Эти экспериментальные данные объясняются тем, что в первом случае нет ДАМ-кольца между шариком и микротрубочкой, поэтому шарики гораздо легче отваливаются от деполимеризующихся концов микротрубочек, что и дает маленькую про должительность силы. Кроме того, в первом случае на эти шарики давление оказывают все го 2-3 протофиламента, исходя из стерических соображений. Во втором случае, по видимому, образуется ДАМ-кольцо между шариком и микротрубочкой, в результате чего на шарик посредством ДАМ-кольца давят все 13 протофиламентов, что создает силу раз в шесть большую, чем в случае стрептавидиновых шариков, что и наблюдается в эксперимен тах. Таким образом, эти данные говорят о наличии ДАМ-колец вокруг микротрубочек, свя занных с шариками, в присутствии Dam1 в растворе. При этом на самих микротрубочках во флуоресцентном канале видны неподвижные ДАМ-пятна, которые, следовательно, являются кандидатами на ДАМ-кольца.

Более детальная обработка экспериментов с лазерной ловушкой показала наличие прецес сии оси ДАМ-кольца вокруг оси микротрубочки, которая также наблюдается и в теории.

ДАМ-кольца in vitro двигаются по механизму силового давления. В дальнейшем я решил выяснить – как влияет разборка микротрубочки на движение ДАМ-колец. В этих экспери ментах проточная камера с микротрубочками, выращенными из аксонем, приготовлялась, как описано в «методах и материалах». При этом в конце промывки проточной камеры в нее добавлялся буфер Б с Dam1 с такой концентрацией, чтобы на микротрубочках образовались отчетливо видимые ДАМ-пятна, которые, как было показано выше, представляли собой ДАМ-кольца. Исходя из верхней оценки коэффициента диффузии таких пятен, глубина ДАМ-потенциала взаимодействия имеет значение 6-7 kBT. И, следовательно, такое кольцо при деполимеризации микротрубочки должно было бы двигаться по механизму силового давления. Т.к. механизм диффузии со смещением не может объяснить, как малоподвижное ДАМ-кольцо двигается со скоростями 7.2 ± 0.3 мкм/мин (N = 209), померенными в этих экс периментах. Как видно из графика на рис. 8, такая скорость движения ДАМ-кольца соответ ствует глубине ДАМ-потенциала порядка 13-14 kBT, при которой также наблюдается согла сие со структурными данными ДАМ-колец, полученных с помощью электронной микроско пии, см. рис. 3. Но тогда из-за такого сильного связывания наблюдалась бы остановка ДАМ– кольца, движущегося за деполимеризующим концом микротрубочки, при столкновении с любым ниже лежащим на микротрубочке ДАМ-кольцом, но в [Westermann 2006] наблюда лось скоплением ДАМ-пятен на конце деполимеризующегося конца микротрубочки без за медления скорости деполимеризации. Поэтому было решено воспроизвести опыты [Wester mann 2005, 2006] в нашей системе, где инициация деполимеризации микротрубочек проис ходила с помощью промывки проточной камеры от свободноплавающих димеров тубулина.

Непосредственно перед этим на микротрубочках можно было видеть в основном образова ние очень слабых ДАМ-пятен, диффундировавших вдоль микротрубочек, в отличие от чет ких неподвижных ДАМ-пятен, образовавшихся при использова нии стандартного протокола. Это свидетельствует о том, что это были по большой части ДАМ патчи с редко попадающимися ДАМ-кольцами на микротрубоч ках. Поэтому можно заключить, что плавающий в растворе тубу Рис. 16. Графики зависимости положения концевого лин, по-видимому, обладает инги флуоресцентного ДАМ-пятна (черный) относительно биторным действием на образова минус конца микротрубочки и его относительной ин тенсивности (серый) с течением времени при деполи- ние ДАМ-колец на микротрубоч меризации микротрубочки. Слева графика показано ках.

начальное изображение микротрубочки, покрытой При деполимеризации микро ДАМ-пятнами. Видны только наиболее яркие пятна, трубочек можно было действи хотя в микроскоп можно было наблюдать и очень сла бые ДАМ-патчи, диффундирующие вдоль микротру- тельно наблюдать увеличение ин бочки. тенсивности концевого ДАМ пятна (см. рис. 16), что объясняется не сбором ДАМ-колец, как делали это авторы в [Wes termann 2005, 2006], а накоплением более подвижных ДАМ-патчей на конце микротрубочки, возможно при этом упаковывающихся в ДАМ-кольцо. Если же ДАМ-пятно, следующее за деполимеризующимся концом микротрубочки, наталкивалось во время своего движения на другое яркое ДАМ-пятно (ДАМ-кольцо), то происходила остановка деполимеризации мик ротрубочки. В таком положении система обычно находилась несколько секунд, после чего движение концевого ДАМ-пятна восстанавливалось. При этом было заметно понижение ин тенсивности концевого пятна по сравнению с тем, которое оно имело во время паузы. Это свидетельствует о сбрасывании с конца микротрубочки лишних Dam1 комплексов. Чтобы определить, какое из двух ДАМ-пятен на микротрубочке – ближнее или дальнее от разби рающегося конца, продолжает движение после окончания паузы, были сделаны эксперимен ты с обесцвечиванием крашенных Dam1 комплексов путем облучения их лазером с длиной волны 488 нм. Оказалось, что при вхождении в эту зону обесцвечивания, интенсивность концевого ДАМ-пятна резко падала, а затем возрастала после выхода из зоны. Это говорит о том, что при столкновении одного ДАМ-пятна с другим во время деполимеризации микро трубочки разбирается то, которое стоит ближе к концу микротрубочки, а дальнее от конца пятно затем продолжает движение.

Эти экспериментальные данные не описываются моделью Хилла [Hill, 1985].

ДАМ-кольца С-мутанта Dam1 двигаются при разборке микротрубочки с большими, чем в случае нативного Dam1, скоростями. В статьях [Wang, Miranda 2007] было показано, что С концы Dam1p белков подходят на роль линкеров между ДАМ-кольцом и микротрубочкой, поэтому возникает во прос – как же влияет отсутствие этих лин керов на движение ДАМ-колец, которые все еще образуются вокруг микротрубо чек, хотя и при боль Рис. 17. Справа изображена кимограмма движения концевого ших концентрациях.

ДАМ-пятна, состоящего из C-мутантного Dam1, при деполимери зации микротрубочки. Слева изображены графики зависимости по- Для этой цели были ложения концевого ДАМ-пятна относительно минус конца микро поставлены экспери трубочки (черный) и его относительной яркости с течением време менты, в которых из ни, построенные для этой кимограммы (серый).

аксонем, прикреплен ных к покровному стеклу проточной камеры, выращивались микротрубочки, растущие внутрь проточной камеры. Затем туда вмывался С-мутантный Dam1 комплекс, у которого были удалены С-концы Dam1p белков. Большинство ДАМ-пятен, образовавшихся вдоль микротрубочек, обладали довольно таки сильной диффузией и не большой яркостью, что говорит об образовании ДАМ-патчей на микротрубочках мутантным Dam1 комплексом и о его пониженных свойствах образовывать ДАМ-кольца, хотя они иногда присутствовали на микротрубочках. При этом при инициализации деполимеризации микротрубочек можно бы ло наблюдать увеличении яркости концевого ДАМ-пятна с ростом пройденного расстояния, см. рис.

17. А средняя скорость его движе ния была равна 20 ± 1 мкм/мин (N = 177), т.е. очень близка к скорости разборке свободной микротрубоч ки, и приблизительно в три раза больше, чем для ДАМ-колец, со стоящих из нативного Dam1, см.

Рис. 18. Диаграммы распределения скоростей дви диаграмму на рис. 18. Эти экспери жения концевых ДАМ-пятен при деполимеризации ментальные данные говорят о том, микротрубочек для случая нативного Dam1 (белая) и что в природе не реализуется каче С-мутантного Dam1 (черная). Также приведена диа грамма распределения скоростей деполимеризации ственная гипотеза электростатиче микротрубочек в отсутствии какого бы то ни было ского скольжения ДАМ-кольца Dam1 (серая).

[Wang, 2007].

ВЫВОДЫ 1. На основе последних экспериментальных данных построена детальная молекулярно механическая модель взаимодействия микротрубочки и ДАМ-кольца, включающая в себя гипотезу линкеров – белковых мостиков, соединяющих ДАМ-кольцо с микротрубочкой.

2. С помощью полученной математической модели показано, что кольцо с жесткими линкерами обладает малым КПД ~10%, в то время как линкеры с маленькой изгибной жест костью позволяют кольцу эффективно преобразовывать энергию деполимеризации микро трубочки в полезную механическую работу с КПД ~ 50% даже при сильном связывании линкеров с поверхностью микротрубочки ~ 13 kT.

3. Показано, что в модели существует два типа движения кольца при разборке микро трубочки – по механизму диффузии со смещением при слабом связывании линкеров с мик ротрубочкой и по механизму силового давления при сильном связывании. При этом во вто ром случае наблюдается перешагивание линкеров кольца с одного сайта связывания на микротрубочке в другой подобно движению кинезинов.

4. На основе экспериментальных измерений доказано, что ДАМ-кольца двигаются по механизму силового давления во время деполимеризации микротрубочек. Во время этого процесса наблюдается прецессия оси кольца вокруг оси микротрубочки.

5. Экспериментально показано существование ни кем ранее не описанных не кольцевых ДАМ-стурктур, которые в отличие от ДАМ-колец имеют большой коэффициент диффузии вдоль микротрубочки.

6. При деполимеризации микротрубочек не кольцевые ДАМ-патчи следуют за разби рающимся концами микротрубочек подобно ДАМ-кольцам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov A.K., McIntosh J.R., Ataullakhanov F.I. 2005.

Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:4353-8.

2. Efremov A.K., Grishchuk E.L, McIntosh J.R., Ataullakhanov F.I. 2007. In search of an op timal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 104:19017-22.

3. Ефремов А.К., Кочиков И.В., Трубецков М.К., Тихонравов А.В., Атауллаханов Ф.И., Механическая модель микротрубочки // III Съезд Биофизиков России, сборник тезисов докладов, Воронеж, 24-29 июня 2004, стр. 38.

4. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, A.K.Yefremov, I.S. Spiridonov, F.I. Ataullakhanov and J.R. McIntosh. 2006. Mechanisms of poleward chromosome movement. 2006. 46th annual ASCB meeting. December 9-13. San Diego, CA.

5. E.L. Grishchuk, A.K. Efremov, I. S. Spiridonov, V.A. Volkov, S. Westermann, I.M.

Cheeseman, A. Desai, D. Drubin, G. Barnes, F.I. Ataullakhanov, J.R. McIntosh. Biomechanical design of molecular couplers that transduce microtubule depolymerization into chromosome movement. 2007. 47th annual ASCB meeting. December 1-5. Washington, DC. p. 451.

6. J. McIntosh, M. Morphew, D. Mastronarde, A. Yefremov, K. Zhudenkov, E. Grishchuk, F.

Ataullakhanov. Kinetochore-microtubule interactions visualized by EM tomography. 2007. 47th annual ASCB meeting. December 1-5. Washington, DC. p. 603.

7. Жуденков К.В., Ефремов А.К., Грищук Е.Л., МакИнтош Р., Атауллаханов Ф.И. Ис следование структуры кинетохорных элементов, взаимодействующих с микротрубочкой.

11-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", сборник тезисов докладов. Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, стр. 9.