Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования

На правах рукописи

Николаев Андрей Владимирович ФИБРИН-ПОЛИМЕРНЫЕ СЕТКИ, МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Специальность 03.00.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в отделе строения вещества учреждения Российской Академии Наук Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор Лобанов Алексей Иванович доктор физико-математических наук Буравцев Владимир Николаевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, доцент Мухин Сергей Иванович доктор физико-математических наук, доцент Смолянинов Владимир Владимирович

Ведущая организация: Государственное учреждение Гематологический научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Защита состоится 22 октября 2009 г. в 17:30 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.11 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, Физический факультет, аудитория 5-19.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» _ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.002.11, доктор физико-математических наук Г.Б. Хомутов.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Процессы, протекающие при свертывании крови, и их взаимное влияние еще до конца не описаны. Выделяют первичный и вторичный гемостаз1,2. Первичный представляет собой формирование тромбоцитами рыхлой пробки в месте повреждения сосудистого русла. Вторичным гемостазом (или плазменным звеном) называют сложный многоста дийный процесс в плазме крови, приводящий к формированию фибрин-полимера (далее ф.-п.) и геля на его основе. Образование ф.-п. геля, эффективно изменяющее форму сосудистого русла, и гидродинамические факторы наряду с биохимическими реакциями плазменного звена гемостаза играют существенную роль в процессе свертывания. По сути, плазменное звено системы свертывания крови (ССК) — это сложная система с одновременно протекающими процессами реакции и диффузии в потоке вязкой жидкости в реакторе, форма которого изменяется в зависимости от истории реакции. Из-за сложности этой системы до сих пор не существует полных моделей ее функционирования. Для различных целей успешно строятся огрубленные3, зачастую феноменологические модели ССК и процесса образования ф.-п4. Относитель но недавно появился ряд математических моделей с детальным описанием биохимиче ских процессов плазменного звена ССК, верифицированных по большому числу экспериментальных данных и использующих экспериментально измеренные констан ты5. В то же время, общей модели полимеризации фибрина, учитывающей желирова ние, еще не создано. Это значительно затрудняет создание общих моделей ССК, описывающих взаимное влияние процессов образования ф.-п. и потока крови. Заметим, что построение даже упрощенных моделей плазменного звена ССК оказывается весьма полезным, так как неотъемлемой частью моделирования является математическая формализация описания предлагаемых гипотез. В свою очередь, эксперименты, поставленные для проверки допущений моделей, позволяют развить и дополнять последние.

В данной работе проведена проверка допущений упрощенной модели полимеризации фибрина и приближения нулевых конвективных потоков внутри ф.-п. сгустка.

Балуда В.П. и др. —М: Медицина, 1995.—244С.

Stassen J.M. et al.// Curr. Med. Chem.—2004.—v.17.— p.2245– Anand M. et al.// J Theoret Med.—2003.—v.5.—p.183–218..

Weisel J.W. et al.// Biophys J.—1992.—v.63.—p.111– Panteleev M.A. et al.// Biophys J.—2006.—v.90.— p.1489–1500.

Цель исследования Описать физико-химические механизмы влияния структуры фибрин-полимерного сгустка на фильтрацию внутри него. Выяснить допустимость использования упрощенной модели полимеризации фибрина и приближения нулевых фильтраци онных потоков внутри фибрин-полимера для математического моделирования плазменного звена гемостаза и эволюции фибринового сгустка в сдвиговом потоке.

Задачи исследования 1. Произвести анализ математической модели типа реакция–диффузия–конвекция на основе двухавтоволновой модели плазменного звена гемостаза в потоке жидкости с малыми скоростями (1см/сек) методом подобия и размерности.

2. Создать и реализовать алгоритм решения уравнений данной модели, учитывающий обратное влияние ф.-п. сгустка на поток жидкости в приближении нулевых конвек тивных потоков внутри сгустка.

3. Экспериментально исследовать возможность накопления на фибрин-полимерной сетке альбуминов в количествах, сопоставимых с массой фибрина и возможное влия ние этого процесса на проницаемость фибриновых сгустков.

4. Средствами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) высокого разрешения определить структуру зрелых фибрин-полимерных. сгустков, сформированных из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург, и сравнить их со структурой нормальных сгустков. Фибрин Марбург выбран для сравнения как предельный слу чай фибрин-полимера, у которого предположительно полностью отсутствует одна из фаз полимеризации — латеральная агрегация.

5. Оценить применимость закона Дарси для вычисления проницаемости фибрин полимерных сгустков на основе представления о микровязкости и сравнения с экспе риментальными данными.

Научная новизна Построена математическая модель эволюции ф.-п. сгустка в потоке жидкости с малыми скоростями ( 1см/сек) на основе двухавтоволновой модели плазменного звена гемостаза и упрощенной модели полимеризации в приближении нулевых фильтрационных потоков внутри ф.-п. Произведен анализ модели методом подобия и размерности. Создан программный комплекс, реализовывающий алгоритм расчета данной модели. На основании результатов моделирования и теоретических расчетов по двухавтоволновой модели показано, что запуск автоволны активатора происходит в диапазоне скоростей движения жидкости, соответствующего параметрам течений внутри ф.-п. сгустка, а не в просвете сосуда. Для параболического профиля скоростей жидкости аналитически выделены характерные зоны течения, закономерности развития процессов в которых качественно отличаются. На основе представления о микровязкости теоретически обоснована связь между свойствами ф.-п. (полной длиной фибров) и его коэффициентом проницаемости Дарси. Экспериментально показано, что альбумин не накапливается на сформированной ф.-п. сетке в количествах, сопоставимых с массой самого фибрина, а потому не может играть существенной роли в процессах фильтрации плазмы через ф.-п.

сгусток. Средствами СЭМ высокого разрешения исследован мутантный фибрин Мар бург. Показано, что фибры мутантного ф.-п. Марбург состоят из единичных фибрилл, не агрегировавших латерально. Это позволяет считать его предельным случаем ф.-п. с наименьшей проницаемостью. На основе представления о микровязкости показано, что структура мутантного ф.-п. Марбург не будет мешать процессу диффузии крупных белковых молекул. Предложены критерии для построения модели полимеризации фибрина, которые позволят использовать соответствующую им модель для корректных количественных расчетов процессов плазменного звена гемостаза и эволюции ф.-п.

сгустка в сдвиговых потоках.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Для описания движения жидкости внутри фибрин-полимерного сгустка с малыми скоростями (1см/сек) справедлив эмпирический закон Дарси. Коэффициент про ницаемости Дарси фибрин-полимерного сгустка зависит от суммарной длины фиб ров в единице объема.

2. Альбумин не накапливается на сформированной фибрин-полимерной сетке в количествах, сопоставимых с массой самого фибрина, и на проницаемость сформи рованного фибрин-полимерного сгустка влияния не оказывает.

3. Фибры мутантного фибрин-полимера Марбург состоят из единичных фибрилл не агрегировавших латерально.

4. Согласно двухавтоволновой модели диапазон скоростей сдвига, в котором возмо 8,9 мин–1), соответствует параметрам жен запуск автоволны активатора ( max 3,110–1 2,9 мин–1), а не в просве фильтрационных течений внутри сгустка ( max те сосуда.

5. Для построения количественной модели плазменного звена гемостаза и эволюции фибрин-полимерного сгустка в сдвиговом потоке необходимо использовать описа ние полимеризации фибрина, учитывающее длину фибров в единице объема. Это сделает возможным рассчитывать проницаемость сгустка.

Теоретическая и практическая ценность Современные модели ССК строятся на базе детальных знаний о биохимии взаимодейст вий факторов свертывания. Процесс полимеризации самого конечного продукта реакций ССК — фибрина — в них учитывается в упрощенном виде. Такой подход безусловно оправдан с методической точки зрения и тем, что до относительно недавнего времени модели строились для систем с отсутствующими потоками жидкости. В то же время, основной задачей ССК в организме является локализация повреждений сосудистого русла и подавление потоков крови путем образования непроницаемых преград. Естест венно, что при моделировании ССК в присутствии потока нужно учитывать как влияние потока на реакцию, так и обратное влияние продуктов реакции, в том числе и ф.-п. геля, на поток. С этой точки зрения вопросы о взаимодействии потока и ф.-п. геля имеют большое значение. Согласно современным представлениям процесс полимеризации фибрина состоит из нескольких этапов. Показано, что этот процесс зависит не только от структуры полимеризующегося фибрина, но и от кинетики наработки фибрин-мономера.

Поэтому полная модель такого процесса может быть вопросом достаточно далекого будущего. Построение промежуточной модели полимеризации, хорошо описывающей только ключевые для взаимодействия с потоком параметры ф.-п., может оказаться гораздо проще и дать полезные результаты для моделирования ССК. На наш взгляд работа, направленная на выделение таких ключевых параметров ф.-п., имеет важное значение для создания уточненных моделей ССК.

Апробация и публикации По теме работы было опубликовано 6 печатных работ, включая 4 статьи и 2 тезиса докладов. В т.ч. 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Апробация работы прошла 23 апреля 2009 года на заседании секции №5 ученого совета ИХФ РАН.

Материалы работы были представлены на международной конференции "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах" (Суздаль, 1995), школе по современной нейтронографии НИИЯФ МГУ (зимняя, Дубна. 2004), XLVIII конференции МФТИ, cекция биофизики и физики живых систем (Долгопрудный, 2005), научном семинаре кафедры биофизики биологического факультета МГУ име ни М. В. Ломоносова (2006), научных семинарах лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН (Москва, 2006-2008), научных семинарах в лаборатории биофизики отдела строения вещества в ИХФ РАН (Москва 2006-2008).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 125 страницах, иллюстрирована 34 рисунками и 5 таблицами.

Работа состоит из введения, и трех глав (обзора литературы, математического моделиро вания работы плазменного звена системы свертывания и роста фибринового сгустка в потоке, экспериментов по определению свойств ф.-п. сеток), заключения, выводов, списка литературы, включающего 305 отечественных и зарубежных источников, а также 5 приложений с описанием расчетов.

Личный вклад автора Диссертационная работа является результатом исследований, выполненных автором на протяжении 10 лет. В исследованиях по проницаемости ф.-п. сгустка, электронной микроскопии фибрина Марбург и нормального фибрина автор выполнял большую часть объема работ на всех этапах — сбор и анализ первичной информации, выполнение экспериментов, обработка и интерпретация полученных данных, подготовка публикаций.

В исследовании по математическому моделированию активации плазменного звена гемостаза и росту фибринового сгустка в потоке автор выполнял работы по проектирова нию и реализации блока программного комплекса для решения уравнений реакция– диффузия–конвекция и стыковке этой части с блоком расчета течений жидкости, проведению тестовых расчетов, анализу результатов. Автор провел анализ системы уравнений методами подобия и размерности, опубликованный позднее.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы В первой главе кратко излагаются современные представления о ССК. Особое внимание уделено источникам с описанием плазменного звена гемостаза как каскадного саморегу лирующегося автокаталитического процесса. Проанализированы публикации о строении молекулы фибриногена6,7, полимеризации фибриногена, структуре ф.-п.8, эксперимен тальных методах изучения свойств ф.-п., желировании ф.-п.9 Рассмотрены математиче ские модели плазменного звена гемостаза.

На основе литературных источников показано, что плазма крови обладает уникальным набором свойств, позволяющем говорить о ней как об активной среде нового типа — с активным восстановлением10. Существуют как феноменологические модели плазменно го звена ССК, так и редуцированные11, с различной степенью детализации описания каскада биохимических реакций. При численном исследовании феноменологических моделей ССК выявлено наличие решений, существенно зависящих от интегральной величины начального возмущения12. Также показана чувствительность процессов автоволновой природы в околопороговых состояниях к свойствам среды13.

Биохимия плазменного звена гемостаза детально изучена и описана, в отличие от процесса полимеризации фибрина. Из-за многостадийности этого процесса его матема тическое описание представляет серьезную проблему. На современном этапе не сущест вует цельной модели возникновения ф.-п. сгустка. В то же время свойства ф.-п. сгустка сильно отличаются от свойств жидкой плазмы.

При рассмотрении литературных данных о свойствах ф.-п. сеток автором проводится уточнение известной эмпирической формулы для коэффициента проницаемости Дарси ф.-п. сгустка. Используя понятие микровязкости, автором получено выражение для проницаемости без эмпирических коэффициентов. Также автором показано, что в общем случае связь между оптической плотностью и проницаемостью полидисперсной ф.-п.

сетки может быть получена только при наличии информации о распределении диаметров фибров сетки.

На основании обзора делается вывод о том, что для построения уточненных моделей ССК естественным требованием является учет взаимодействия процессов конвекции, реакции и диффузии с растущим ф.-п. сгустком.

Weisel J.W.//Adv Protein Chem.—2005.—v.70.—p.247–299.

Mosesson M.W.// J Thromb Haemost.—2005.—v.3.—№8.—p.1894–1904.

Ferri F. et al.// Phys Rev E—2001.—v.63.—p.031401-1–031401-17.

Hantgan R.R. et al.// J Biol Chem.—1979.—v.254.—№22.—p.11272–11281.

Атауллаханов Ф.И. и др.// Биофизика.—1994.—Т.39.—С.89–96.

Zarnitsina V.I. et al.// Thrombosis Research.—1996.—v.84.— p.225–236.

Лобанов А.И. и др.// Математическое моделирование.—1997.—Т.9.—C. 83–95.

Попцова М.С. и др.// Биофизика.— 2003.— Т.48.—С.1116–1122.

Глава 2. Математическое моделирование работы плазменного звена гемостаза и роста фибринового сгустка в потоке В данной главе описана разработанная с участием автора математическая модель роста ф.-п. сгустка в потоке. Целью построения данной модели являлось рассмотрение развития процессов плазменного звена гемостаза и образования ф.-п. сгустка в потоке вязкой несжимаемой жидкости рядом с поврежденной сосудистой стенкой. Рассматрива лись условия запуска автоволны активатора в пристеночной области или разрушения надпорогового возмущения сдвиговым потоком.

Уравнения математической модели. Для описания биохимических процессов использо вана двуавтоволновая феноменологическая модель (ДАФМ)14, дополненная членами, описывающими адвективный перенос. Процесс желирования фибрина, как и в ориги нальной ДАФМ, принят мгновенным по достижении пороговой концентрации фибрина мономера = c. Сам фибрин считается неподвижно закрепленным в месте образова ния. Потоки внутри ф.-п. сгустка полагаются нулевыми. Напротив, диффузия реагентов в сгустке считается такой же, как и в остальном объеме.

Рассматривается формирование сгустка в плоском канале с твердыми стенками длиной Lx, шириной Ly и перепадом давления на концах P. Размер канала по третьей оси принимается равным бесконечности, что ведет к двумерной постановке задачи. В начальный момент времени течение описывается стационарными уравнениями Навье– Стокса для несжимаемой жидкости с условием прилипания на стенках канала и на границе сгустка:

( V ) V = P + V, divV = 0, где V — поле скоростей движения жидкости, — кинематическая вязкость, — плотность, P — давление. Профиль скоростей жидкости в канале в начальный момент времени дается формулой Пуайзеля:

1 P y ( Ly y ), Vy = 0, x [ 0, Lx ], y 0, Ly.

Vx ( y ) = 2 Lx При повреждении сосудистой стенки кровь приходит в контакт с клетками, на мембранах которых есть тканевой фактор, чем запускается внешний путь свертывания. Поскольку ДАФМ не учитывает детальную схему каскадов ССК, то в рамках модели можно считать, Атауллаханов Ф.И. и др.// Биофизика.—1994.—Т.39.—вып.1.—С.97–104.

что вплотную с поврежденной поверхностью в канале мгновенно формируется область с размерами x y и концентрацией активатора Am. Изменение поля скоростей V ( x, y ) в результате роста сгустка описывается в квазистационарном приближении, т.к. предполага ется что вязкая релаксация поля скоростей происходит много быстрее, чем развитие биохимических процессов. Таким образом система уравнений модели примет вид:

( V ) V = P + V, divV = 0, = D1 V + 1, + t = D1 V + 1 1 + 2, C t d = k, dt где (r, t ) — концентрация активатора (тромбин), (r, t ) — концентрация ингибитора (предположительно активированного протеина С), D1 и D2 — коэффициенты диффу зии, 1 и 2 — коэффициенты пассивных утечек, и — константы, определяющие скорости наработки тромбина и ингибитора, — скорость инактивации тромбина ингибитором, k — константа скорости наработки фибрина при избыточной концентра ции фибриногена (положена равной единице). Значения параметров модели приведены в таблице 1. Величины большинства из них совпадают со значениями из первой публикации по ДАФМ и соответствуют режиму, в котором надпороговое возмущение приводит к образованию одиночного локализованного ф.-п. сгустка. Геометрические параметры сосудов, приведенные в таблице 4, соответствуют венулам и артериолам15.

, мин–1, мин–1, мин–1нМ–1 0, нМ 0, нМ 2,0 0,0015 5,0 5,0 0, D1, см2/мин D2, см2/мин 1, мин–1 2, мин– C, нМ 610–6 610– 5,0 0,05 0, – с, нМ x, мм y, мм k, мин Am, нМ 45 1,0 10 0,06 0,, см2мин–1 Pmin, гсм–1мин–2 Pmax, гсм–1мин– Lx, мм Ly, мм 1,2 2,4 0,3 5 Таблица 1. Значения параметров, используемых в модели. Большинство параметров, используе мых в МС, имеют те же значения. Pmin и Pmax указывают диапазон постоянного перепада давления на границах канала, используемый в расчетах. Соответствующие начальные скорости плазмы в центре канала V = 1,9510–36,6410–2 см/мин, а число Рейнольдса Re10–410–3.

Каро К. и др.—М.:Мир,1981.—624С.

Использовалась следующая схема перехода к безразмерным переменным:

Ly t, = 0, P = 0 Vh 2 P, = 0, x = Ly x, y = Ly y, V = Vh V, t = Vh * = 0, C = 0 C, * = 1, =, =, =, (0* ) 1 * * Ly LyVh Vh Ly 2 = * 2, = 0, k = * k, Pe =, Da =, Re = D1 Vh где Pe — число Пекле, Da — число Дамкелера, Re — число Рейнольдса.

Числа Pe и Da являются независимыми параметрами. Анализ того, как от их значения будет зависеть поведение системы (1), представляет определенный интерес.

( V ) V = P + Re V, divV = 0, ( ) 1 V + Da, = ( ) +1 t Pe (1) 1 V + Da 1 (1 + 2 ) 2, = t Pe C = Da k.

t Рекционно-диффузионная система обладает своими характерными масштабами скорости V* = * D и длины L* = D *. Очевидно, что для эффективной борьбы с гидродина мическим потоком, необходимо чтобы V* и Vh были сопоставимы. По предложению Г. Т. Гурия был введен безразмерный параметр Gu = Vh V*. Несложно убедиться, что VL VL L L D L L Pe = Gu 1 y.

, Pe = h y = h y * = Gu y, Da = * y = * y Gu = (2) D * Da D L* Vh L* Vh D Из (2) можно сделать вывод, что при фиксированных параметрах кинетики и геометрии системы, основным управляющим фактором будет выступать отноше ние скоростей химической автоволны активатора к максимальной гидродинамиче ской скорости потока ( Gu 1 ). В представленных экспериментах Gu менялось в диапазоне от 0,56 до 19.

Одной из альтернативных форм записи числа Пекле является Pe = LyVh D = rdiff, где rdiff = DL2, а — скорость сдвига. В канале с пуайзелевым профилем скоростей Романовский Ю.М. и др.—М.:Наука,1984.—304С.

наибольшая скорость сдвига = 4Vh Ly будет рядом со стенками, а по направ max лению к центру канала будет уменьшаться вплоть до нуля. Положив d core = ( DLy 2 4Vmax ), в которой ( ycore ) rdiff = 1 можно указать зону шириной процессы диффузии будут превалировать над процессами адвекции. Или в безраз d core 1 L* 3 1 =3 = мерном виде. Назовем такую зону «диффузионным ядром Ly 4Gu Ly 4 Pe потока». Оценки для d core при параметрах из таблицы 1 дают значения до 0,09 мм ( dcore Lx =0,3). Таким образом, наличие сдвигового потока в канале, не влияет на события в его центральной (до 30% ширины) зоне до возникновения существенно го количества ф.-п.

Методы исследования математической модели. Система уравнений модели (1) решалась численно методом расщепления по физическим процессам17. Для решения стационарных уравнений Навье–Стокса в области фиксированной геометрии применя лась аппроксимация на разнесенной сетке: давление считалось в центрах ячеек, а скорости соотносились к серединам соответствующих ребер. Полученная система решалась методом простой итерации.18 Для решения уравнений реакция–диффузия– конвекция применялась неявная разностная схема первого порядка аппроксимации по пространственным переменным. Основными расчетными величинами являлись полные потоки веществ, относившиеся к серединам соответствующих граней. Для аппроксима ции переносных слагаемых использовались разности «против потока». Ввиду того, что кинетическая часть системы является жесткой, первая итерация распределения актива тора и ингибитора находилась из решения в каждой ячейке системы ОДУ однократно диагонально-неявным А-устойчивым методом Рунге-Кутты второго порядка аппрокси мации19.

Наконец, на каждом шаге по времени решалось уравнение, описывающее производство фибрин-полимера. Если из-за роста сгустка менялась форма доступной течению области, то поле скоростей вновь определялось путем решения стационарных уравне ний Навье–Стокса. А за начальное приближение для метода итераций бралось поле скоростей с предыдущего шага.

Кобельков Г.М. // Вычислительные процессы и системы. Вып. 8.— М.:Наука,1991.—С.204–236.

Фаворский А.П. // Современные проблемы математической физики и вычислительной математики.— М.:Наука,1982.—С.312–320.

Хайрер Э. и др.—М.:Мир,1990.—512С.

Результаты и обсуждение. Проведенные расчеты показали наличие трех принципиаль но различных сценариев развития событий — возникновение локализованного сгустка, возникновение множественного сгустка, подавления реакции свертывания сдвиговым потоком путем разрушения зоны надпорогового возмущения. Представленная на рис. параметрическая плоскость (Am, Re) делится на три фрагмента соответствующих упомя нутым сценариям. Фактически, наличие потока сдвигает порог активации свертывания (th V =0 = 0 1 ( 1 ) = 0,128, по таблице 1) даже при малых скоростях.

Рис. 1. Разбиение параметрической плоскости (Re, Am) (Re варьировалось с помощью изменения P) на области, с различными сценариям развития пристеночных сгустков.

Область I — отсутствие свертывания из-за разрушения зоны начального закритического возбуждения сдвиговым потоком. Область II — множественное образование сгустков.

Область III — образование локализованного сгустка. Кривая (a) соответствует границе локализованный–множественный сгусток, кривая (b) — границе свертывание– подавление свертывания сдвиговым потоком.

На рис. 2 приведены два сценария образования ф.-п. сгустков, соответствующих –1 – и P = 12 гсм–1мин–2. При P = 5 гсм–1мин–2 скорость на входе P = 5 гсм мин сосуда составляла Vmax = 1,9510–3 см/мин (Re = 4,910–5, Pe = 10, Da = 31, Gu = 0,56, =2,610–1 мин–1). В этом случае зона запорогового возбуждения активатора max инициирует рост локализованного вокруг повреждения сгустка. Остатки активатора с подпороговой концентрацией уносятся потоком и реакция прекращается. При –1 – (Vmax = 4,6910–3 см/мин, P = 12 гсм мин повышении разницы давлений до Re = 1,1710–4, Pe = 23, Da = 13, Gu = 1,34, =6,310–1 мин-1) наблюдается другой max сценарий. До 24 минуты он очень схож со сценарием при P = 5 гсм–1мин–2. Пример но за то же время вокруг зоны повреждения возникает локализованный сгусток.

Однако, остатки активатора, унесенные потоком, очевидно, попадают в диффузионное ядро течения в запороговой концентрации. В результате происходит вспышка реакции по центру канала на 1 мм ниже по течению от зоны повреждения, что приводит к формированию там перекрывающего просвет сгустка.

При разнице давлений свыше 170 гсм–1мин–2 (Vmax = 6,6410–2 см/мин, Re = 1,710–3, =8,9 мин-1) процесс свертывания подавляется гидродинами Da = 0,92, Gu = 19, max ческим потоком и образования сгустка не наблюдается.

Рис. 2. Слева — P = 5 гсм–1мин–2. Сценарий развития сгустка, локализованного вокруг места повреждения. Справа — P = 12 гсм–1мин–2. Сценарий «убежавшей» закритической зоны активатора, приводящей к окклюзии канала 1 мм ниже по течению.

Рассмотрим вопрос о границе режимов тромбообразование — подавление сверты вания сдвиговым потоком. Поскольку конвективное число Дамкелера ( Da conv = r ) обладает свойством «точечности» и не привязано явно ни какому размеру, то в различных местах канала это число будет строго говоря своим. Т.к. химическая кинетика r не зависит от гидродинамического потока с малыми характерными скоростями, то наименьшее число Дамкелера будет там, где модуль сдвига = 4Vh Ly максимален. В нашем случае в начале процесса число Дамкелера max будет наименьшим в пристеночных областях Da min = r Ly 4Vh. Как уже подчерки валось выше, свертывание в потоке возможно, когда скорость реакции r превали Am 1 в рует (Da 1). Используя ДАФМ можно записать выражение для r = Am + точке пространства, где = Am, = 0. Используя выражение для Da min 1, получим Am 1 0. Из этой оценки, оценку для начального момента времени:

Am + вытекает условие на зависимость порога активации th от модуля локальной скорости сдвига :

0 ( 1 + ) th ( ) =. (3) ( 1 + ) Сопоставление (3) с данными таблицы 1 показывает, что даже при малых Re = 4,910–5 ( Vmax = 1,9510–3 см/мин, = 0,26 мин–1, 1 = 0,05 мин–1) сдвиг будет max играть доминирующую роль при определении порога активации в пристеночной области — th = 0,92 нМ против th = 0,128 нМ. Эта зависимость качест = 0.26 = венно объясняет ветвь b на рис. 1 при малых числах Рейнольдса. Формальная оценка по формуле (3) приводит к тому, что порог th ( ) обращается в бесконеч ность при условии = ( 1 + ). Определенный биологический смысл имеет условие активации реакции в той же макроточке размером L*, в которой был расположен начальный стимул. Такой сценарий возможен когда сумма скоростей распада и конвективного переноса активатора меньше, чем скорость его автокаталитической генерации. Однако возможна ситуация, когда конвекция сдвинет зону запорогового возмущения и вспышка произойдет немного ниже по течению, но образовавшийся ф. п. сгусток накроет исходное повреждение.

Множественные сгустки возникают тогда, когда сдвиговый поток и диффузия способны создать зону запорогового возмущения достаточно далеко, чтобы после дующая вспышка ингибитора не могла достичь ее.

Глава 3. Эксперименты по определению свойств фибрин-полимерных сеток Экспериментальное исследование проницаемости фибрин-полимерного сгустка в присутствии альбумина. Основным результатом работы системы свертывания является формирование твердого тромба в месте повреждения сосуда. Тромб противостоит гидродинамическому потоку и предотвращает потерю крови из сосуда. Он состоит из тромбоцитов, других клеток крови и ф.-п. сетки. В физиологической норме концентрация тромбоцитов составляет 300 тыс. шт./мм3, концентрация фибриногена 1,4 4 мг/мл, а удельная длина волокон ф.-п. сгустка при полимеризации всего фибриногена 8 –2 lfp = 0,44 1,26·10 см (или ~10 см в 1 мл). Для понимания относительной эффективно сти ф.-п. сетки и клеточного агрегата полезно провести оценку коэффициентов прони цаемости Дарси ф.-п. сгустка и модели тромбоцитарного тромба, сформировавшихся из одного объема плазмы. При малых скоростях (u 1 см/c) потока проницаемость 1 ln ( 3.70 Ru ) монодисперсной ф.-п. сетки будет выражаться как kfp =, где R — 4 lfp радиус фибра ф.-п. сетки (порядка 50 70 нм в норме). В качестве модели тромбоци тарного тромба возьмем закрепленные равномерно по объему в узлах кубической решетки сферы диаметром d pl = 3·10–6 м. Используя формулу Стокса, можно полу чить оценку для коэффициента Дарси такого тромба как kpl = 1 ( 3 d plcpl ). При физиологической норме оценки дают kfp 1 дарси, а kpl 110 дарси. Конечно, данные оценки являются грубыми, и не учитывают, например, накопление в тромбе тромбоцитов, приносимых потоком.

Помимо фибриногена плазма крови содержит большие количества других белков, в частности альбумина. Его концентрация в норме составляет примерно 35–55 мг/мл, т.е. она превосходит массовую концентрацию фибриногена (4 мг/мл) в 8–14 раз.

Существует большое количество экспериментальных свидетельств нековалентного взаимодействия фибриногена с альбумином20. Если благодаря нековалентным взаимодействиям ф.-п. сетка связывает альбумин в количествах сопоставимых или превосходящих массу самой сетки, то это должно существенным образом влиять на динамику роста сопротивления сетки потоку и ее механические свойства.

Материалы. В работе использовалась донорская плазма, заготовленная на стандарт ном цитратном антикоагулянте на станции переливания крови ГУ ГНЦ РАМН.

Концентрации белков измерялись биуретовым методом. Концентрация общего белка в плазме составляла 74±3 мг/мл. В работе были использованы также растворы 10% альбумина человека (фирма «Биофарма», Киев, Украина), который перед использова нием разбавляли до 5% буферным раствором, содержащим 0,01 М HEPES и 0,15 М NaCl (pH 7,35), 1% раствор бычьего гемоглобина, L-динитрофенилаланин (Serva, США), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-2-этаносульфоновая кислота (HEPES) фирмы Fisher Biotech (Fair Lawn), CaCl2 (Sigma) и NaCl (осч) («Реахим», Россия).

Формирование фибринового сгустка. Сгустки, свойства которых (проницаемость и способность сорбировать альбумин) изучались, были предобразованы из плазмы путем ее рекальцификации. При этом к 2,5 мл плазмы добавляли 50 мкл 1 М раствора СаСl2 (конечная концентрация добавленного CaCl2 составляла 19,6 мМ). Затем плазму перемешивали в течение 10 секунд и 2 мл аккуратно переносили в стеклянную колонку (d 5,6 мм, длина 22 см, сделана из стеклянной пипетки), в которой London M.// Clinical Biochemistry.— 1997.—v.30.—p.83–89.

происходил процесс свертывания. Для фиксации сгустка в колонке, ее нижний конец был затянут капроновой сеткой, которая была укреплена на трубке липкой лентой, а поверх этого пленкой Parafilm (Sigma). В результате в колонке формировался фибри новый сгусток высотой примерно 8 см. Сгусток выдерживали в колонке 3–4 часа после начала процесса коагуляции. После полного свертывания плазмы пленку парафильм удаляли и систему использовали подобно хроматографической колонке (Рис. 3). Перед началом эксперимента сгусток промывали 6–8 мл буфера. Высоту столба буфера над верхней границей сгустка поддерживали постоянной (L = 10 ± 0,5 см) с помощью перистальтического насоса. Суммарная высота сгустка и раствора над ним составляла hp = 18 см. В пробах элюата определялся белок. После промывки сгустка 5 мл Рис. 3. Схема установки для проведения буфера общий белок в экспериментов по определению проницае мости фибриновых сгустков: 1 — элюате составлял ме- стеклянная трубка (внутренний диаметр 5,6 мм);

2 — сформированный сгусток нее 0,1 мг/мл. Отмы- (объем 2 мл, высота hc = 8 см);

3 — капроновая сетка, поддерживающая тые сгустки использо- сгусток;

4 — резервуар для сбора проб;

5 — резервуар с буфером для промывания вали в экспериментах сгустка;

6 — перистальтический насос, поддерживающий постоянную высоту по измерению их про- столба буфера со сгустком в колонке (hp = 18 ± 0,5 см);

7 – силиконовая ницаемости или сор- магистраль внутренним диаметром 1 мм.

бции на них альбумина из растворов.

Определение массы фибриновых сгустков. В отдельных экспериментах была определена масса сформированных и промытых фибриновых сгустков. Для этого сгустки (в объеме 2 мл вместе с объемом окружающего буфера) были перенесены в 2 мл раствора 0,4 М NaOH и растворялись в течение 12 часов при 37 °С. В полученном растворе была измерена концентрация белка, после чего была рассчи тана общая масса белка в растворенном сгустке.

Измерение проницаемости фибриновых сгустков. Для измерения проницаемости фибриновых сгустков, ф.-п. сгустки, промытые буферным раствором, использова лись как неподвижная фаза хроматографической колонки. По 0,1 мл растворов 5% альбумина или 1% гемоглобина, а также 1% раствора низкомолекулярного L-динитрофенилаланина, использованного как маркер хроматографического фронта, в буфере наносили шприцем с длинной иглой непосредственно на верхнюю границу сгустка (Рис. 4 A). О проницаемости сгустка судили по скорости прохождения через него нанесенного вещества. Фильтрация окрашенного белка, например, гемоглобина, удобна для визуального наблюдения. Если в сгустке присутствуют какие-либо дефекты, то это становится заметно по изменению формы прокрашенной зоны и такие сгустки выбраковывались. Для оценки взаимодействия подвижной и неподвижной фаз использовали зависимость положения фронта нанесенного белка от объема прошедшего элюата. При этом положение полосы нанесенного белка в ф.-п. опреде ляли по центру — «ядру» полосы, т.к. полосы могут деформироваться, в первую очередь, из-за пристеночных эффектов. На рис. 4 приведены последовательные фотографии колонки с нанесенным на нее раствором гемоглобина. Cкорости элюции составляли от 0,011 до 0,1 мл/мин (Vmax 4,410–2 4,110–1 см/мин, макроскопический 3,110–1 2,9 мин–1 ). Падение скорости элюции было обусловлено сдвиг max формированием уплотнения на верхней незакрепленной границе сгустка. Элюат собирался каплями в пробирки Eppendorf.

Изучение связывания альбумина с отмытыми фибрин-полимерными сгустками. К отмытым сгусткам объемом 2 мл (вместе с окружающим буфером) добавляли по 2 мл 5 %-ного раствора альбумина. Таким образом, конечная концентрация альбумина составляла 2,5 % (или 25 мг/мл), а количест Рис. 4. Фотографии колонки с нанесенным на во ф.-п. в 4 мл суммарного объема было сгусток раствором 0,1%-ного гемоглобина (0,1 мл) в различные моменты после начала равно 7,7 мг, учитывая, что измеренная масса элюции. Положения «ядра» полосы отмечены черными треугольниками и соответствуют ф.-п. сгустков составляла 3,85 мг/мл.

прохождению 0;

0,4;

1,4 и 1,55 мл элюата для случаев А, В, С и D, соответственно. Растворы аккуратно перемешивали в течение 15 мин так, чтобы избежать полного коллапса сгустков. После перемешивания сгустки выдерживали при температуре 20–27 °С в течение разного времени (от 6 до 24 часов). В определенный момент времени из каждого образца отбирали по 3 пробы для определе ния концентрации оставшегося в объеме альбумина.

Результаты. Определение массы ф.-п. сгустков показало, что концентрация белка (фибрина) в них составляла 3,85 ± 0,08 мг/мл (n = 3). Это находится в хорошем соответст вии с разностью величин концентраций общего белка в исходной плазме (74 ± 3 мг/мл) и суммарным количеством белка, оказавшегося в элюате в ходе промывки (70 ± 3 мг/мл).

В экспериментах по адсорбции альбумина промытые ф.-п. сгустки экспонировались в растворе белка 6, 18 или 24 часа. Результаты показали, что для каждого из исследован ных времен экспозиции, усредненная из 3 независимых измерений концентрация общего, оставшегося в растворе белка, соответствовала 25 ± 1 мг/мл. С одной стороны, это говорит о том, что равновесие адсорбции устанавливается гораздо быстрее 6 часов, а с другой — что масса связанного альбумина гораздо меньше общей массы фибрина, в отмытом сгустке (7,7 ± 0,16 мг из оценки выше).

Для измерения проницаемости отмытых ф.-п. сгустков, на колонку со сгустком наносили 0,1 мл раствора 5% альбумина или 1% гемоглобина, или низкомолекулярного L-динитрофенилаланина и следили за скоростью прохождения полосы нанесенного вещества при смывании буферным раствором. Несмотря на то, что в некоторой части опытов фибрино вый сгусток не выдерживал длительного промывания, что помешало набрать хорошую статистику, в тех случаях, когда L-динитрофенилаланин и гемогло бин демонстрировали равномерное движение по колонке, были Рис. 5. Концентрации человеческого альбумина в пробах, элюированных с колонки с отмытым предварительно получены очень схожие зависимо фибриновым сгустком, в зависимости от объема прошед сти объема прошедшего элюата от шего элюата. На колонку было нанесено 0,12 ± 0,1 мл раствора альбумина с концентрацией 50 мг/мл.

времени. Для всех образцов константы Дарси ( kfp ), рассчитанные для начального этапа фильтрации, лежали в диапазоне 3 ± 1 дарси, что совпадает с приведенными в литературе данными21 и оценоч ным расчетом.

Поскольку скорость фильтрации через ф.-п. сгусток в ходе опыта изменялась, то для характеристики проницаемости была использована зависимость положения полосы вещества (в см от верхней границы сгустка) от объема прошедшего элюата (в см3). Эти зависимости для гемоглобина и L-динитрофенилаланина были линейны, а тангенсы углов наклона оказались одинаковы (–3,9 ± 0,1 см/мл для бычьего гемоглобина и – 4,1 ± 0,1 см/мл для L-динитрофенилаланина). За скоростью фильтрации альбумина Diamond S.L.// Annual Review of Biomedical Engineering.—1999.—v.1.—p.427–461.

можно следить, измеряя концентрацию прошедшего белка в пробах элюата. На рис. приведен график зависимости концентрации альбумина от объема прошедшего элюата в одном из экспериментов. Центр пятна альбумина в данном случае вышел примерно на объеме 2 мл. Это позволяет положить, что тангенс угла наклона прямой зависимости положения «ядра» полосы от объема элюата для альбумина примерно равен таковым для гемоглобина и L-динитрофенилаланина. Полный интеграл массы альбумина под графиком равен 5,14 мг. Наблюдаемый концентрационный хвост (Рис. 5) можно объяс нить деформациями полосы из-за пристеночных эффектов, схожими с теми, что были видны ранее при фильтрации гемоглобина (Рис. 4).

СЭМ сгустков из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург.

Известно более 300 генетических мутаций фибриногена. Структура мутантных форм ф.-п. может сильно отличается от нормальной, особенно в случае гомозиготных мутаций. Мутация фибриногена Marburg была впервые обнаружена в 1975 году22. Эта мутантная форма примечательна тем, что у нее нарушена латеральная агрегация фиб рилл23. Следовательно, ф.-п. сгустки фибрина Marburg должны обладать наибольшей возможной удельной длиной фибров.

СЭМ широко применяется для исследования структурных особенностей ф.-п. сеток, полученных из нормального фибрина и его мутантных форм. Прочность, реологические и динамические параметры макроскопических сгустков определяются статистическими свойствами ф.-п. сеток. Для определения этих свойств анализ СЭМ-микрографий дает большие возможности.

Основная цель данного исследования состояла в том, чтобы получить микрографии высокого разрешения зрелых ф.-п. сгустков фибрина Marburg и сравнить их структуру со структурой нормальных сгустков.

Приготовление образцов плазмы. К девяти объемам цельной крови добавлялся один объем 3,8% раствора цитрата натрия. Тромбоциты вместе с другими клетками крови были удалены путем центрифугирования в 4 приема: 2 раза по 15 мин на 200 g и два раза по 20 мин на 5000 g 24. Центрифугирование образцов производи лось при температуре 4°C, для каждого последующего центрифугирования отби Fuchs G. et al.// Blut.—1977.—v.34.—p.107–118.

Sobel J.H. et al.// Blood.—1995.—v.86.—p.989–1000.

Leitzel K. et al.// Cancer Res.— 1991.—v.51.—p.4149–4154.

рался супернатант от предыдущего. Приготовленные образцы обедненной тромбо цитами плазмы хранились при –18°C.

Формирование фибриновых сгустков. Пробирки с плазмой размораживались в водяной бане при 10°C. Образцы по 0,25 мл плазмы отбиралось для каждого эксперимента по коагуляции в стандартную 2 мл пластиковую пробирку фирмы Эппендорф. К образцам добавлялось 3 мкл 0,2 M CaCl2 (конечная концентрация добавленного CaCl2 в растворе составляла 2,5 мМ) с последующим интенсивным перемешиванием. Сразу после этого добавлялся тромбин в количестве 2 NIH U/мл.

Использованный тромбин был приобретен в SIGMA (T6884, из человеческой плазмы). Процесс коагуляции производился при 27°C в течение 3 часов для нормальной плазмы и 6 часов для плазмы типа Марбург. В итоге получался зрелый макроскопический сгусток, пригодный для последующей обработки. Реакция прекращалась путем замещения буферного раствора на 2 % раствор глютаральде гида в фосфатном буфере (pH 7,3, Merck) c 1 % сахарозы 25. Опыт показал, что в отсутствие дополнительного Ca++ сгустки фибрина Марбург не обладали необхо димой механической прочностью и разрушались при дальнейших манипуляциях.

Сканирующая электронная микроскопия. Сгустки тщательно промывались в стан дартном PBS буфере, затем дегидратировались путем перенесения в растворы с увеличи вающимися концентрациями этанола (20%, 40%, 60%, 80%, 100%). После этого сгустки просушивались методом критической точки26. Высушенные сгустки приклеивались к держателю образцов с помощью проводящей пасты Leit-C (G3300, Plano GmbH) и подвергались покрытию 3 нм слоем платины и углерода методом испарения электрон ным пучком. Образцы исследовались в микроскопе Hitachi S-5200, детектирование изображений производилось по вторичному электронному сигналу.

Статистическая обработка изображений. Измерения характерных размеров на СЭМ-микрографиях производились с помощью графического редактора GIMP. Стати стические распределения толщины фибров для нормального и мутантного сгустков были получены из серий по 4 микрографии каждого. Диаметры фибрилл нормального фибрина измерялись по латеральному узору микроструктуры на фибрах (Рис. 6). На микрографи ях мутантного ф.-п. сгустка видны нити, напоминающие четки (Рис. 6). Поэтому Reimer L. et al.—Berlin:Springer-Verlag,1977.— 282S.

Anderson T.F.// Trans NY Acad Sci.—1951.—v.13.—p.130–134.

толщины этих нитей рассчитывались, как среднее на основании измерений в соседних точках. Средние значения и их стандартные отклонения (указываются после знака «±») были рассчитаны для каждого распределения. Гистограммы распределений были построены с помощью Microsoft Excel (Рис. 7).

Рис. 6. Слева — СЭМ-микрофотографии высокого разре шения фибринового сгустка мутантного фибрина типа Марбург (А) и нормальных плазменных тромбов (Б), полученные автором. Длина масштабных отрезков составляет 250 нм. Обращает на себя внимание микро структура фибра нормального фибрина (Б), указывающая на фибрильную субструктуру. Сверху — СЭМ микрофотографии фибрина Марбург из литературы. Длина масштабных отрезков — 1 мкм.

Результаты и обсуждение. СЭМ микрографии высокого разрешения нормального ф.-п. сгустка и сгустка фибрина типа Марбург представлены на рис. 6. Различия между ними легко заметны. Они проявляются в толщине фибров, образующих фибриновые сети. Полученные СЭМ микрографии облада ют разрешением достаточным, чтобы разли чать в образцах ф.-п. сгустка упакованные в фибр отдельные фибриллы, проявляющиеся как элементы микроструктуры (Рис. 6 Б).

Распределение толщин фибров, измеренных для образцов ф.-п. сгустка мутантного фибрина представлено на рис. 7 А (средний размер равен 20 ± 2,0 нм). Толщина фибрилл в Рис. 7. Распределение толщин фибров для мутантного плазменного сгустка (А) и фибрах нормального плазменного сгустка нормального (Б). Распределение A (среднее значение толщин фибров 20 ± 2,0 нм, n = 35) равна 21 ± 2,4 нм. Средняя толщина фибров Распределение толщин фибров нормального плазменного тромба показано на Б (средняя нормального ф.-п. сгустка 0,18 ± 0,048 мкм. Из толщина 0,18 ± 0,048 мкм, n = 169, соответ чего следует, что каждый фибр в норме ствует литературным данным).

содержит в среднем 64 фибриллы. Толщины единичных фибрилл, полученные по периоду латеральных микроструктур на фибрах (20 ± 2,0 нм), согласуются с литературными данными (19 нм)27.

Очевидно, что «бесфибровая» структура сгустка фибрина типа Марбург будет влиять на их макроскопические свойства, такие как механическая прочность, модули упругости, проницаемость и т.д. Оценка соотношение проницаемостей нормального ф.-п. сгустка и мутантного дает kfpM kfp lfp lfpM 2 10-2. В то же время, «тонкая» структура ф.-п.

сетки мутантного фибрина Марбург не будет оказывать влияние на коэффициенты броуновской диффузии для большинства факторов свертывания и лизиса согласно проведенным оценкам.

Заключение В заключении автор обобщает полученные результаты. Оценки автора показали, что коэффициент проницаемости Дарси ф.-п. сгустка зависит от суммарной длины фибров в единице объема. Экспериментально полученная проницаемость ф.-п. сгустка, сформиро ванного из плазмы, содержащей 3,8 мг/мл фибриногена, оказалась равна 3±1 дарси, что находится в согласии с литературными данными и оценками автора. Таким образом, закон Дарси адекватно описывает фильтрационные потоки в ф.-п. сгустках. Макроскопи ческая скорость потока через ф.-п. сгусток составляла V 4,110–1 см/мин, а макроскопи 3,110–1 2,9 мин–1. Этот сдвиг примерно соответствует диапазону, ческий сдвиг max при котором в модели, представленной в главе 2, наблюдалась сильная зависимость сценария эволюции запороговогого возмущения от пристеночной скорости сдвига 2,610–1 8,9 мин–1). Следовательно, эволюция любого запорогового возмуще ( max ния, находящегося внутри ф.-п. сгустка может быть адекватно описана только с учетом фильтрационных потоков. Очевидно также, что сценарии образования сгустков будут зависеть от величины параметра c из-за большой чувствительности к сдвигу, а значит и к полю скоростей потока. Экспериментально показано, что свойства ф.-п. сеток, в частности, проницаемость, сильно зависят от особенностей процесса полимеризации.

Следовательно, любая модель, претендующая на хорошее количественное соответствие с экспериментом, должна учитывать особенности полимеризации фибрина, чтобы корректно рассчитывать локальную длину фибров в единице объема.

Weisel J.W.// J Ultrastruct Mol Struct Res.—1986.—v.96.—p.176– Результаты и выводы 1. Экспериментально показано, что альбумин не накапливается на сформирован ной фибрин-полимерной сетке в количествах, сопоставимых с массой самого фибрина.

2. Показано, что для описания движения жидкости c малыми скоростями (1см/сек) внутри фибрин-полимерного сгустка справедлив эмпирический за кон Дарси. Выполненные в рамках представления о микровязкости расчеты автора совпадают с экспериментальными данными, полученными автором. Ко личественное согласие расчетных и экспериментальных данных указывает на зависимость проницаемости фибрин-полимерного сгустка от суммарной длины фибров в единице объема. Анализ литературных данных и результаты автора по исследованию мутантного фибрина Марбург методами электронной микроско пии позволяют заключить, что суммарная длина фибров сгустка может варьи роваться в широких пределах, как и его проницаемость.

3. Проведенные с участием автора расчеты по двухавтоволновой модели показали, что запуск автоволны активатора происходит в диапазоне скоростей сдвига 8,9 мин–1), соответствующего параметрам течений внутри жидкости ( max 3,110–1 2,9 мин–1), а не в просвете сосуда.

фибрин-полимерного сгустка ( max 4. Для построения количественной модели плазменного звена гемостаза и эволю ции фибрин-полимерного сгустка в сдвиговом потоке необходимо использовать описание полимеризации фибрина, учитывающее длину фибров в единице объ ема. Это сделает возможным рассчитывать проницаемость сгустка.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Чуличков А.Л., Николаев А.В., Лобанов А.И., Гурия Г.Т. Пороговая активация свертывания крови и рост тромба в условиях кровотока // Математическое мо делирование.— 2000, Т.12, №3, стр. 75-96.

2. Николаев А.В., Синауридзе Е.И., Буравцев В.Н. Экспериментальное наблюде ние проницаемости фибринового тромба // Вестник Московского университе та.— Сер. Физика и астрономия 2009, №3, стр. 85-89.

3. Николаев А.В., Вальтер П., Эгбринг Р., Гурия Г. Т. Тромбы из плазмы доноров с гиподисфибриногенемией Марбург не обладают фибровой структурой // Тромбоз Гемостаз и Реология.— 2004, Т.1, №17, стр. 30-36.

4. Куриленко И.А., Лобанов А.И., Николаев А.В. Качественное исследование математической модели свертывания крови в сдвиговом потоке // Материалы Международной научной конференции «Моделирование нелинейных процессов и систем», Москва, 2009 г., стр. 515–529.

5. Николаев А.В., Лобанов А.И. Применение метода потоков при численном исследовании структурообразования в реакционно–диффузионной возбудимой 2D-системе с активным восстановлением // Тез. докл. Международной конфе ренции “Критерии самоорганизации в физических, химических и биологиче ских системах”, Москва – Суздаль, 12 – 18 июня 6. Николаев А.В., Ковалев Ю.С., Горделий В.И. Исследование структурных свойств фибрин-полимерных сетей методом малоуглового рассеяния нейтронов // Сборник трудов XLVIII конференции МФТИ, cекция биофизики и физики живых систем, 2005 г., МФТИ, стр. 145–149.

Николаев Андрей Владимирович Фибрин-полимерные сетки, математическое моделирование и экспериментальные исследования Подписано в печать 16.09. Формат 60х84 Усл. печ.л.1, Тираж экз. 80 Заказ Государственное образовательное учреждение высшего профессио нального образования Московский физико-технический институт (государственный университет) 141700, Московская область г. Долгопрудный, Институтский пер.