Влияние ртутьорганических соединений природного происхождения на регенерацию, размножение и пищевое поведение свободноживущих червей (олигохет и планарий)
На правах рукописи
Медведев Игорь Валерьевич ВЛИЯНИЕ РТУТЬОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА РЕГЕНЕРАЦИЮ, РАЗМНОЖЕНИЕ И ПИЩЕВОЕ ПОВЕДЕНИЕ СВОБОДНОЖИВУЩИХ ЧЕРВЕЙ (ОЛИГОХЕТ И ПЛАНАРИЙ) 03.00.18 - Гидробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Борок – 2006
Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина Российской Академии наук Научный руководитель Доктор биологических наук Комов Виктор Трофимович
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Крылов Александр Витальевич Кандидат биологических наук Шейман Инна Моисеевна
Ведущая организация:
Институт биологии Карельского Научного Центра РАН
Защита состоится « 14 » декабря 2006 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета К.002.036.01 при Институте биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН по адресу:
Ярославская обл., Некоузский район, п. Борок, ИБВВ РАН;
тел./факс: (48547)24-0-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН.
Автореферат разослан « 9 » ноября 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Л.Г. Корнева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.
Актуальность проблемы. При добыче и переработке минеральных ресурсов происходит изменение глобальных циклов химических элементов.
Отношение количества элемента, участвующего в глобальном круговороте, к уровню его добычи служит ориентировочной оценкой опасности для окружающей среды и человека (Bowen, 1979). По этому показателю наибольшую опасность представляют тяжелые металлы, среди которых ртуть занимает особое место. Ртуть высоко токсична для теплокровных животных и человека. В результате антропогенной эмиссии в атмосферу попадает количество ртути, соизмеримое с участвующим в природном глобальном цикле (Fitzgerald, 1995;
Mason, Sheu, 2002). Антропогенными источниками ртути являются сельское хозяйство, энергетические предприятия, транспорт, горнодобывающая и перерабатывающая промышленность (Лапердина, 2000).
Наибольшее количество ртути попадает в окружающую среду при сжигании природного ископаемого топлива. В угле содержание ртути максимально по сравнению с нефтью и газом и варьирует от 0.8 до 100 г ртути в тонне (Габайдулин и др., 1999).
Особенностью этого металла является метилирование, происходящее в водоемах с образованием токсичного для организмов соединения – метилртути, которое накапливается в тканях и органах водных животных (Bloom et al., 1991). В мышцах рыб из водоемов России, удаленных от источников загрязнения, содержание ртути может достигать 3.1 мг/кг массы (Haines et al., 1992). Уровни такого порядка приводят у рыб к нарушению многих жизненно важных функций, включая воспроизводство, осморегуляцию, ориентацию, поиск пищи, распознавание хищника и коммуникацию (Zillioux et al., 1993).
Работы, посвященные изучению токсичности метилртути, проводятся в основном на млекопитающих и птицах, имеющих наиболее развитую в животном мире нервную систему. Они находятся на вершине пищевой пирамиды и подвержены действию самых высоких концентраций метилртути (Wolfe et al., 1998). При высоких уровнях накопления ртути у теплокровных животных развиваются функциональные нарушения центральной нервной системы (Rodier, 1995;
Shigematsu et al., 2000).
Механизм токсического воздействия ртутьорганических соединений на холоднокровных животных исследован недостаточно. Основная масса работ посвящена изучению влияния неорганических соединений ртути, менее токсичных по сравнению с ртутьорганическими. Метилированные соединения ртути, накопленные в организме рыб, не исчезают после их гибели и снова становятся частью пищевой цепи в водоеме. Влияние ртутьорганических соединений, поступающих с пищей, на беспозвоночных фактически не изучено.
Цель проведенных исследований - изучение влияния ртутьорганических соединений, при их поступлении в организм с пищей, на регенерацию, пищевое поведение и размножение олигохет Lumbriculus variegatus и планарий Dugesia tigrina (половая и бесполая расы), D. lugubris и Polycelis tenuis.
Были поставлены следующие задачи:
1. Оценить динамику накопления соединений ртути в организме червей.
2. Изучить влияние накопленных в организме олигохет и планарий ртутьорганических соединений на восстановление поврежденных участков тела.
3. Выявить зависимость степени восстановления фоторецепторных органов у планарий от количества накопленных в их организме соединений ртути.
4. Исследовать репродуктивную активность при разных уровнях содержания соединений ртути в организме планарий.
5. Оценить влияние соединений ртути в теле планарий на их пищевое поведение.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние ртутьорганических соединений, обладающих нейротоксическим эффектом, на скорость регенерации, степень восстановления недостающих фрагментов тела и фоторецепторных органов, репродуктивную активность и пищевое поведение у беспозвоночных.
Установлена различная чувствительность изученных показателей к ртутьорганическим соединениям (максимальная – восстановление фоторецепторных органов, минимальная – репродуктивная активность).
Обнаружено, что торможение восстановительных процессов при воздействии накопленных ртутьорганических соединений имеет у организмов видовую специфичность. Пищевое поведение планарий нарушается только при высоких уровнях ртутьорганических соединений.
Практическая значимость. Впервые обосновано применение показателя восстановления фоторецепторных органов у планарий в токсикологических исследованиях, как наиболее чувствительного из изученных физиологических показателей. Разработана имитация пищевой цепи, состоящая из нескольких звеньев, которая позволяет с большой долей вероятности прогнозировать поведение токсических веществ в водных экосистемах. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при чтении курса лекций «Водная токсикология» и «Санитарная гидробиология».
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XII Международной конференции молодых ученых «Биология внутренних вод:
проблемы экологии и биоразнообразия» (Борок, 2002), Международной конференции «Трофические связи в водных сообществах и экосистемах» (Борок, 2003), II Съезде токсикологов России (Москва, 2003), Международной научной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (г. Петрозаводск, 2004 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 124 стр., иллюстрированы 12 рисунками и 12 таблицами. Список литературы включает наименования, из них 127 на иностранном языке.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность сотруднику лаборатории биологии и систематики водных животных ИБВВ РАН Е. М.
Коргиной и Н. В. Шакуровой (Казанский государственный университет) за видовую идентификацию планарий.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РТУТИ;
ЗАКОНОМЕРНОСТИ МИГРАЦИИ И НАКОПЛЕНИЯ;
РЕГЕНЕРАЦИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ СВОБОДНОЖИВУЩИХ ЧЕРВЕЙ.
Представлен обзор литературных данных по эмиссии ртути, особенностях ее трансформации в водных экосистемах и воздействию на биологические показатели животных, характеристике механизма токсического действия метилртути. Приводятся сведения о регенерации планарий и олигохет, размножении и пищевом поведении планарий.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Объект исследования.
Для экспериментов использовали олигохет Lumbriculus variegatus (Mller, 1773) и планарий Dugesia tigrina (Girard, 1850) (половая и бесполая расы), D. lugubris (O. Schmidt, 1861) и Polycelis tenuis (Ijima, 1884).
2.2. Условия и методы культивирования животных.
Олигохет Lumbriculus variegatus содержали в пластиковых емкостях объемом 1 л с кусочками гигроскопичной бумаги в качестве искусственного субстрата в отстоянной водопроводной воде при температуре 23°С (Lesiuk, Drewes, 1999;
Drewes, 1996). Раз в неделю в емкости с червями добавляли по г фарша, приготовленного из мышечной ткани рыб Solea solea (низкое содержание ртути - 0.2 мкг/г сухой массы) и Anoplopoma fimbria (высокое содержание – 0.7 мкг/г сухой массы), выловленных в бухте Монтерея (Калифорния, США).
Для выращивания хирономид (Chironomus riparius Meigen, 1804) использовали кристаллизаторы емкостью 2 л с отстоянной водопроводной водой. В них помещали по 3-5 кладок. Каждую неделю в кристаллизаторы добавляли по 2 г фарша, полученного из мышечной ткани рыб с высокой концентрацией ртути (0.30-0.50 мкг/г сырой массы) и с низкой (0.02-0.07 мкг/г сырой массы). Рыбу отлавливали в Рыбинском водохранилище. Хирономиды питались бактериями, развивающимися на фарше.
Культивирование олигохет Enchytraeus albidus (Henle, 1837) проводили по стандартной методике (Грудцин, Ильина, 1977). Червей кормили фаршем из рыбы, помещенным в почву с червями на глубину 3-4 см.
Планарий содержали в пластиковых пятилитровых емкостях при температуре 19-22°С в затененных условиях. Животных кормили два раза в неделю: Dugesia tigrina и D. lugubris - личинками лабораторной культуры хирономид, Polycelis tenuis – олигохетами Enchytraeus albidus.
Таким образом, в эксперименте формировали пищевую цепь: фарш из мышечной ткани рыб - бактерии – личинки хирономид или олигохеты – плоские черви. Накопление ртути хирономидами и олигохетами до уровней, определенных в фарше, происходило за 2-4 нед.
Регенерация головного и хвостового участков тела у олигохет.
Животным отсекали головной и хвостовой участки тела (рис. 1). Оставшуюся часть тела, состоящую из 30 сегментов, использовали для экспериментов (по 50 в каждой группе с высоким и низким содержанием соединений ртути).
Восстановление головных и хвостовых сегментов регистрировали два раза в неделю в течение 41 сут.
Рис. 1. Схема операции у олигохет Lumbriculus variegatus (темный участок фрагмент тела, который использовали в эксперименте;
светлые участки – отсекаемые). Рис.
по Drewes, 1996.
Варианты надрезов у планарий. Планариям делали надрезы, наиболее часто применяемые для изучения восстановительных процессов в частности, и в токсикологических исследованиях (рис. 2а-д):
а - поперечное рассечение (декапитация) за аурикулярными выростами на переднем конце тела (Сахарова, Лакирев 1986) – для изучения восстановления фоторецепторных органов у Dugesia tigrina (половая раса);
б-г - поперечное рассечение перед глоткой (Pionteck, 1998;
1999) для изучения восстановления фоторецепторных органов у D. tigrina (половая раса), Polycelis tenuis и Dugesia lugubris и формирования бластемы у Polycelis tenuis и Dugesia lugubris;
д - продольный разрез всего тела (Morgan, 1901) для изучения формирования бластемы и фоторецепторных органов в процессе латеральной регенерации у D. tigrina (бесполая раса).
Для выяснения реакции организма на слабое травматическое воздействие, планариям наносили небольшие надрезы (рис. 2б,в).
а б в г д Рис. 2. Схема операций планарий: прямая линия – место разреза.
Перед операциями планарий и олигохет обездвиживали, охлаждая в ванночке со льдом (Шейман, 1995;
Drewes, 1996).
Восстановление поврежденных участков тела и формирование бластемы у планарий. У D. tigrina (половая раса) регистрировали количество червей с полным восстановлением поврежденных участков после 3, 12 и 24 мес выращивания на ртутьсодержащем корме;
у бесполой расы D. tigrina (9 и мес), D. lugubris (9 мес), Polycelis tenuis (6 мес выращивания на корме с низким и высоким содержанием соединений ртути) проводили измерение площади бластемы (скопление однородных неспециализированных клеток на раневой поверхности).
Восстановление фоторецепторных органов у планарий. У половой расы Dugesia tigrina (3, 12 и 24 мес), бесполой расы D. tigrina (3 и 9 мес), D.
lugubris (9 мес) и Polycelis tenuis (3, 6 и 9 мес выращивания на ртутьсодержащем корме) подсчитывали количество восстановленных фоторецепторных органов после рассечения животных.
Репродуктивная активность планарий. У половой расы Dugesia tigrina (3 и 12 мес), D. lugubris (1 и 9 мес) и Polycelis tenuis (3 и 6 мес выращивания на корме с высоким и низким содержанием ртути) подсчитывали количество отложенных коконов и молодых червей, вышедших из них.
Пищевое поведение планарий.
У половой расы Dugesia tigrina (3, 12 и 24 мес), бесполой расы D.
tigrina (3 и 9 мес) D. lugubris (9 мес) и Polycelis tenuis (3, 6 и 9 мес выращивания на ртутьсодержащем корме) проводили оценку влияния соединений ртути на пищевое поведение.
Для оценки реакции приближения животных к жертве использовали показатель предпочтения планариями корма с низким или высоким содержанием ртути, выраженного в количестве червей находившихся в контакте с жертвой, для оценки двигательной реакции глотки червей - число планарий, внедривших свою глотку в тело добычи.
Во всех экспериментах с Dugesia lugubris, D. tigrina (бесполая раса) и D. tigrina (половая раса) на каждый опыт отбирали отдельную серию червей (по 38, 100 и 40 экз. соответственно). В опытах с Polycelis tenuis использовали одних и тех же животных после 3, 6 и 9 мес выращивания на ртутьсодержащем корме (по 60 особей).
В экспериментах использовали планарий, как из естественных водоемов, так и культивируемых в лаборатории, поэтому не всегда удавалось синхронизировать начало их выращивания на ртутьсодержащем корме.
Определение ртути и обработка полученных результатов.
Определение содержания общей ртути в планариях, Enchytraeus albidus, Lumbriculus variegatus и Chironomus riparius ввиду их малой массы проводили для каждого вида в интегральных пробах методом атомной абсорбции холодного пара (Gill, Fitzerald, 1987). Сертифицированный биологический материал Dorm-II (мышцы акулы) со стандартным содержанием ртути получен из Канадского института химии окружающей среды.
Статистическую обработку полученных результатов проводили стандартными методами с использованием программы Statgraphics Plus для Windows (версия 2.1). Результаты выражали в виде средних значений и их ошибок (x ± mx). Достоверность различий определяли в соответствии с t критерием Стьюдента (р=0.05) (Sokal, Rohlf, 1995).
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ РТУТЬОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА РЕГЕНЕРАЦИЮ, РАЗМНОЖЕНИЕ И ПИЩЕВОЕ ПОВЕДЕНИЕ ОЛИГОХЕТ И ПЛАНАРИЙ.
3.1. Накопление ртути у олигохет и планарий.
У Lumbriculus variegatus уровни накопления ртути в организме уже через месяц были сопоставимы с концентрациями металла в рыбном фарше, на котором животных культивировали. У олигохет Enchytraeus albidus, обитающих в почве, накопление уровней ртути аналогичных таковым в корме, проходило в те же сроки что и у Lumbriculus variegatus, обитающих в водоемах (табл. 1, 2). Процесс накопления соединений ртути у олигохет не зависел от среды обитания.
Таблица 1. Концентрации ртути в мышечной ткани рыб, олигохетах и хирономидах.
Объект Концентрация ртути, мкг/г сырой массы низкая высокая Мышечная ткань рыб 0.02-0.07 0.30-0. Enchytraeus albidus 0.02-0.05 0.30-0. Chironomus riparius 0.02-0.07 0.30-0. Таблица 2. Содержание ртути в мышечной ткани рыб и олигохетах Lumbriculus variegatus.
Объект Концентрация ртути, мкг/г сухой массы низкая высокая а 0.71±0.01 б мышечная ткань рыб 0.23±0. 0.32±0.01 а 0.51±0.01 б Lumbriculus variegatus Величины внутри каждой строки, имеющие разные буквенные индексы достоверно различаются при уровне значимости р=0.05.
Уровни накопления ртути планариями в экспериментах варьировали в широких пределах (0.08-15.97 мкг/г сырой массы). Одни виды (Dugesia tigrina, половая раса) планарий накапливали высокие уровни ртути после 3 мес содержания на корме с ее низкими концентрациями, тогда как другие (D.
lugubris) даже спустя 9 мес имели концентрации, соизмеримые с таковыми в корме.
У использованных в экспериментах планарий отмечено накопление соединений ртути, которое происходило с разной динамикой. При высоком содержании ртути в корме, ее накопление интенсивнее проходило у половой расы планарий D. tigrina и Polycelis tenuis, по сравнению с бесполой расой Dugesia tigrina и D. lugubris. У бесполой расы планарий D. tigrina концентрация ртути даже снижалась с течением времени. При низком содержании ртути в корме, ее уровни в организме планарий D. tigrina (половая раса) постепенно уменьшались в течение двух лет, у планарий Polycelis tenuis – после 6 мес выращивания на корме с соединениями ртути было зарегистрировано их увеличение (6 мес) и в дальнейшем после 9 мес снижение (табл. 3). Планарии вероятно имеют эффективный механизм выведения соединений ртути, но это предположение требует дополнительного исследования.
Таблица 3. Динамика накопления ртути в теле планарий в зависимости от времени содержания в культуре.
Время содержания Концентрация ртути, мкг/г сырой массы в культуре, мес низкое содержание в корме высокое содержание в корме Dugesia tigrina (половая раса) 1.23±0.01 а 4.80±0.04 б 1.01±0.003 а 7.71±0.09 б а 10.30±0.06 б 24 0.74±0. Dugesia tigrina (бесполая раса) 0.08±0.003 а 2.95±0.05 б 0.95±0.03 б 9 12 - 0.64±0. Dugesia lugubris 0.48±0.003 а 0.51±0.01 б Polycelis tenuis 0.85±0.02 а 4.59±0.12 б а 15.97±0.24 б 6 3.93±0. 1.09±0.01 а 9.27±0.03б Величины внутри каждой строки, имеющие разные буквенные индексы достоверно различаются при уровне значимости р=0.05.
Максимальную разницу (в 36 раз) концентрации ртути у планарий, выращенных на корме с высоким содержанием ртути, по сравнению с животными, выращенными на корме с ее низким содержанием, наблюдали у бесполой расы Dugesia tigrina. У половой расы D. tigrina она различалась в 3- раз, у Polycelis tenuis – в 4-8 раз в зависимости от экспозиции. Минимальные различия зафиксированы у Dugesia lugubris.
3.2. Регенерация головного и хвостового участков тела у олигохет Lumbriculus variegatus. Восстановление головных сегментов, количество которых у этого вида постоянно (7-8), проходило интенсивнее первые 5 сут у червей с низким содержанием ртути (рис. 3а). Через 11 сут у червей в обеих экспериментальных группах количество головных сегментов достигло первоначальных значений. Различия в числе восстановленных хвостовых сегментов носили достоверный характер на протяжении всего времени наблюдения (рис. 3б).
12 ***** 1 *** 45 10 * 40 ** 6 * 2 2** 10 * * 0 2 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41 2 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 а б Рис. 3. Формирование головных (а) и хвостовых (б) сегментов у Lumbriculus variegatus с низким (1) и высоким (2) содержанием соединений ртути. По оси абсцисс – время регенерации, сут, по оси ординат – количество сегментов. * отличия между вариантами эксперимента статистически достоверны при р=0.05 (t-критерий Стьюдента).
3.3. Восстановление поврежденных участков тела и формирование бластемы у планарий.
Влияние ртути на восстановление целостности организма планарий при слабом травматическом воздействии. Высокое содержание соединений ртути (4.80, 7.71 и 10.30 мкг/г сырой массы) в организме планарий Dugesia tigrina (половая раса) при экспозиции соответственно 3, 12 и 24 мес не влияло на динамику срастания надрезов.
После 12 мес содержания планарий на корме с разной концентрацией соединений ртути, восстановление поврежденных участков тела на передних фрагментах проходило быстрее, чем на хвостовых фрагментах при любом содержании соединений ртути в червях (рис. 4а,б).
60 60 * 50 * * 1 3 5 7 9 3 5 7 9 11 а б Рис. 4. Интенсивность восстановления поврежденных участков тела у половой расы планарий Dugesia tigrina при низком (а) и высоком (б) уровне соединений ртути в теле животных после 12 мес выращивания на ртутьсодержащем корме. По оси абсцисс – время регенерации, сут;
по оси ординат – число животных с полным восстановлением области повреждения, %;
1 – хвостовой участок тела, 2 – передний. * отличия между вариантами эксперимента статистически достоверны при р=0.05 (t-критерий Стьюдента).
Абсолютный рост вновь образующихся тканей у планарий. В первые сутки регенерации бластема планарий была непигментированной. При рассмотрении животных под бинокуляром отмечали четкий контраст между старыми пигментированными и вновь образованными не пигментированными клетками тканей регенеранта.
У D. tigrina (бесполая раса) после 9 мес выращивания на корме с разной концентрацией соединений ртути различия в формировании бластемы между животными с высоким и низким содержанием металла обнаруживались только на 8 сут после препарирования (рис. 5а).
После экспозиции червей в течение 12 мес, различия в размерах бластем появлялись также на 8 сут. У животных с высоким содержанием соединений ртути (0.64 мкг/г сырой массы) площадь вновь образующихся тканей увеличивалась быстрее (рис. 5б). У планарий бесполой расы после мес выращивания на корме с высокой концентрацией ртути зарегистрированы одни из самых низких уровней накопления ртути, по сравнению с планариями других видов.
У D. lugubris с более высоким содержанием соединений ртути в теле скорость формирования бластемы была ниже (рис. 5в). Эффект торможения восстановительных процессов у этой планарии проявлялся даже при относительно невысоком уровне соединений ртути, накопленных за 9 мес.
У Polycelis tenuis, при высоком уровне накопления ртути (15.97 мкг/г сырой массы), площадь бластем увеличивалась значительно медленнее по сравнению с планариями, накопившими более низкие концентрации (3.93 мкг/г сырой массы). Различия регистрировали уже через 10 сут после операции, а после 13 сут они были статистически значимыми (рис. 5г).
У всех видов планарий с высоким и низким содержанием соединений ртути, после продольного и поперечного рассечения длительное время наблюдалась фаза мышечного сокращения, которая продолжалась на 1-2 сут дольше, чем было описано ранее (Шейман и др., 2004). Задержка начала восстановительных процессов у червей с низким содержанием ртути вероятно связана с тем, что после длительного времени (3-24 мес выращивания на ртутьсодержащем корме) планарии накапливали металл в концентрациях, превышающих характерные для популяций в естественной среде обитания.
4000 * * 2* * 2 8 10 12 8 10 12 а б 6000 * 4000 * * 1 * 0 10 13 15 17 10 13 15 в г Рис. 5. Рост бластем у бесполой расы планарий Dugesia tigrinа (а – 9 мес содержания на ртутьсодержащем корме, б – 12 мес), Dugesia lugubris (в – 9 мес), Polycelis tenuis (г – 6 мес). По оси абсцисс – время, сут;
по оси ординат – величина площади бластемы, усл. ед.;
1 – при содержании на корме с низкой концентрацией соединений ртути, 2 – с высокой. * отличия между вариантами эксперимента статистически достоверны при р=0.05 (t-критерий Стьюдента).
3.4. Восстановление фоторецепторных органов у планарий.
При рассечении планарий головной ганглий либо удалялся вместе с передним фрагментом (поперечное рассечение), либо оставалась его часть (продольное). Глазки у планарий начинают восстанавливаться вслед за ганглием, который регенерирует за 5 сут (Шейман, 1984), поскольку каждый фоторецепторный орган турбеллярий соединяется с головным ганглием специальным зрительным нервом (Иванов и др., 1981).
После 3 мес выращивания на корме с высокими и низкими уровнями содержания ртути у Dugesia tigrina (половая раса) глазки появлялись на 5- сут, после 12 мес - на 4-7 сут и 24 мес - на 4-6 сут после препарирования. У планарий с высоким содержанием ртути в организме, формирование глазков после 3, 12 и 24 мес выращивания на ртутьсодержащем корме начиналось на 1 2 сут позже, чем у червей с низким. Минимальные отличия по времени восстановления глазков между группами планарий с высоким и низким содержанием ртути в организме отмечены через 3 мес, а максимальные и статистически достоверные – 12 и 24 мес, когда различия в уровнях накопления ртути были максимальными.
После 3 мес выращивания планарий D. tigrina (бесполая раса) на корме с разным содержанием соединений ртути глазки появлялись на 6-е сут после продольного рассечения червей. Статистически достоверную разницу в количестве фоторецепторных органов наблюдали на 7-е сут после операции. В последующие сроки (9 мес) эффект торможения формирования фоторецепторных органов наблюдали даже при низком уровне накопления ртути в организме планарий этой расы (рис. 6а,б).
* *** б * а * * * 2 20 * * 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 Рис. 6. Регенерация глазков у бесполой расы планарий Dugesia tigrina с низкой (1) и высокой (2) концентрацией ртути после 3 (а) и 9 (б) мес выращивания на ртутьсодержащем корме. По оси абсцисс - время регенерации, сут;
по оси ординат – число червей с глазками, %. * отличия между вариантами эксперимента статистически достоверны при р=0.05 (t-критерий Стьюдента).
Независимо от способа рассечения планарий D. tigrina (продольное или поперечное), начало формирования фоторецепторных органов начиналось в одни и те же сроки.
Различия в количестве глазков у D. lugubris с низким и высоким содержанием ртути в организме были достоверными только на 10 сут после рассечения животных.
Молодые особи Polycelis tenuis, вышедшие из кокона, имели 12- глазков. Спустя 3 нед их число увеличилось до 20, через месяц - до 40-70.
Перед препарированием у особей с низким содержанием ртути среднее число глазков было равно 49, а с высоким - 51.
У планарии P. tenuis с низкой концентрацией ртути в организме после 3 мес выращивания на ртутьсодержащем корме (0.85 мкг/г сырой массы) глаза появлялись на 4-е сут после операции, с высокой (4.59 мкг/г сырой массы) - на 7-е сут. У последних, начиная с 10-х и по 17-е сут, количество фоторецепторных органов было достоверно ниже по сравнению с животными, накопившими низкие уровни металла. Впоследствии эти различия сохранялись, но были статистически недостоверными.
После 6 мес выращивания на ртутьсодержащем корме у P. tenuis восстановление глазков на хвостовых фрагментах червей обеих групп начиналось на 8-9 сут после операции. В последующие 10 сут интенсивность восстановления фоторецепторных органов у планарий с низкими концентрациями ртути была выше, чем у планарий с высокой концентрацией ртути. Далее (19-27 сут) количество глазков и скорость регенерации у животных из обеих групп были одинаковы.
Спустя 9 мес выращивания на ртутьсодержащем корме появление глазков у P. tenuis (единичные случаи) наблюдали на 6-8 сут после операции.
Темпы формирования глазков были низкими в обеих группах планарий. До 14 х сут различия между регенерантами с низким и высоким содержанием соединений ртути (1.09 и 9.27 мкг/г сырой массы соответственно) носили достоверный характер. В дальнейшем появление глазков проходило фактически с одинаковой интенсивностью, различия между группами были незначительны.
Среди изученных видов планарий с низким содержанием ртути наиболее раннее формирование глазков отмечено у P. tenuis, более позднее – у Dugesia lugubris. D. tigrina по этому показателю занимала промежуточное положение. Высокое накопление ртути в организме планарий задерживало восстановление глазков: у Polycelis tenuis – в большей степени, у Dugesia tigrina и D. lugubris – в меньшей.
3.5. Репродуктивная активность планарий.
Не выявлено влияние ртути, поступающей в организм с пищей на репродуктивную активность планарий.
С увеличением сроков содержания планарий на ртутьсодержащем корме от 3-х до 12 мес количество коконов у D. tigrina уменьшалось в обеих группах: с 3.8 до 1.3 экз./(мес·особь) у животных с низким содержанием ртути и с 2.3 до 1.4 экз./(мес·особь) у животных с ее высоким содержанием.
У Polycelis tenuis с низкими концентрациями ртути в организме количество коконов с увеличением времени выращивания на ртутьсодержащем корме (3 и 6 мес) не изменялось (0.1 экз./(мес·особь));
у P. tenuis с высокими концентрациями ртути – оно увеличивалось с 0.06 до 0.2 экз./(мес·особь). У планарий Dugesia lugubris при небольшой разнице в уровнях накопления ртути в организме (табл. 3), количество отложенных коконов незначительно отличалось у животных в обеих группах (0.5 и 0.75 экз./(мес·особь) – соответственно планарии с низким и высоким содержанием ртути в теле).
Количество молоди, вышедшей из одного кокона за один месяц у D.
tigrina уменьшалось с увеличением времени содержания на корме с низким и высоким содержанием ртути соответственно с 0.04 и 0.05 экз. после 3 мес экспозиции до 0.002 и 0.01 экз. после 12 мес экспозиции. У D. lugubris после мес эксперимента этот показатель у обеих групп был одинаков (1. экз./(мес·кокон)).
У Polycelis tenuis с высокими уровнями накопленной ртути, количество молоди после 6 мес экспозиции было значительно меньше (0. экз./(мес·кокон)), по сравнению с животными с низкими уровнями ртути (1. экз./(мес·кокон)).
Таким образом, даже при высоких концентрациях накопленных соединений ртути планарии сохраняли репродуктивную активность.
3.6. Пищевое поведение планарий.
При осуществлении всего комплекса пищевого поведения у планарий происходит последовательная реакция, в которой двигательная активность глотки является продолжением первоначальной реакции приближения к жертве (Шейман и др., 2002). Обе эти реакции интегрированы в единый комплекс, координирующийся нервной системой.
Реакция приближения к жертве. Планарии половой расы Dugesia tigrina (12 мес выращивания на ртутьсодержащем корме) и P. tenuis (6 мес) с низкими концентрациями ртути в организме отдавали предпочтение корму с низким содержанием ртути (рис. 7а,б). Черви с высоким содержанием ртути не проявляли предпочтения в выборе корма, а поиск и приближение к жертве осуществляли менее активно.
Двигательная реакция глотки у планарий. Планарии Dugesia tigrina (половая раса) с низкими концентрациями ртути в организме после 3 и 12 мес выращивания на ртутьсодержащем корме находили пищевой объект в первые минуты наблюдения (рис. 8а,б). У планарий с высокими концентрациями ртути двигательная реакция глотки была слабо выражена и немного возрастала к концу наблюдений. Различия в двигательной реакции глотки у животных с высоким и низким содержанием ртути были достоверны на протяжении всего периода наблюдений.
1 * * * * * * * * * * 5 10 15 20 25 30 35 5 10 15 20 25 30 35 а б Рис. 7. Избирательность питания планарий Dugesia tigrina (а) и Polycelis tenuis (б) с низкой концентрацией ртути в организме. По оси абсцисс – время наблюдений, мин;
по оси ординат – количество планарий, %. 1 – хирономиды или олигохеты с низким содержанием ртути, 2 – с высоким. * отличия между вариантами эксперимента статистически достоверны при р=0.05 (t-критерий Стьюдента).
Накопление планариями ртути в концентрации превышающей 4. мкг/г сырой массы, приводило к угнетению как реакции приближения к добыче, так и двигательной реакции глотки.
100 * * * * * * * * * * 1 1 * * * * 40 * * 0 5 10 15 20 25 30 35 5 10 15 20 25 30 35 а б Рис. 8. Количество планарий Dugesia tigrina (половая раса) внедривших глотки в тело жертвы после 3 (а) и 12 (б) мес выращивания на хирономидах с низким (1) и высоким (2) содержанием соединений ртути. По оси абсцисс – время наблюдений, мин;
по оси ординат – количество планарий, %. * отличия между вариантами эксперимента статистически достоверны при р=0.05 (t-критерий Стьюдента).
ВЫВОДЫ 1. Планарии способны накапливать в своем организме высокие концентрации ртути, которые крайне редко встречаются как у других беспозвоночных так и у позвоночных животных в естественных условиях.
Зарегистрированные уровни ртути не приводят к гибели червей. Это подтверждает предположение, что токсичность ртутьорганических соединений возрастает с развитием нервной системы.
2. Чувствительность изученных физиологических показателей червей к хроническому воздействию ртути различна и убывает в следующем порядке:
восстановление фоторецепторных органов у планарий – восстановление хвостовых сегментов у олигохет – формирование бластемы планарий – процесс заживления надрезов слабого травматического характера – пищевое поведение планарий – репродуктивная активность планарий.
3. Интенсивность заживления надрезов слабого травматического характера не зависит от содержания соединений ртути в теле планарий.
4. У олигохет Lumbriculus variegatus, планарий Dugesia lugubris и Polycelis tenuis скорость восстановления недостающих фрагментов тела снижается с увеличением содержания ртути в организме.
5. Установлено, что замедление формирования фоторецепторных органов у плоских червей начинается с концентрации ртути в организме 0.5-1. мкг/г сырой массы.
6. Планарии способны к половому размножению при очень высоких уровнях накопленной ртути (4.0-15.0 мкг/г сырой массы).
7. Уровни накопленных соединений ртути в теле планарий ниже 4. мкг/г сырой массы не влияют на двигательную реакцию глотки и не нарушают избирательность питания у планарий Dugesia tigrina (половая раса) и Polycelis tenuis.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
Статьи Медведев И. В., Комов В. Т. Воздействие ртутьорганических соединений природного происхождения на регенерацию у двух видов пресноводных планарий Dugesia tigrina и Polycelis tenuis // Онтогенез. 2005.
Т. 36. №1. С. 35-40.
Medvedev I.V., Komov V. T. Influence of methyl mercury compounds of natural origin on feeding behavior in two species of freshwater planarians // Ecohydrology & Hydrobiology. 2005. V. 5. P. 231-235.
Медведев И. В., Гремячих В. А., Желтов С. В., Богданенко О. В., Аксенова И. А. Регенерация фоторецепторных органов у трех видов пресноводных планарий при различных уровнях накопления ртутьорганических соединений природного происхождения // Онтогенез.
2006. Т. 37. №2. С. 136-141.
Медведев И. В. Влияние различных уровней накопления ртутьорганических соединений природного происхождения на реакцию приближения к жертве и двигательную реакцию глотки у трех видов пресноводных планарий // Матер. Всероссийской конф. “Экология пресноводных экосистем и состояние здоровья населения”. Оренбург:
Печатный дом «Димур», 2006. С. 64-73.
Тезисы.
Медведев И. В. Влияние ртутьорганических соединений природного происхождения на воспроизводство, пищевое поведение, регенерацию, фототаксис и тигмотаксис пресноводной планарии Dugesia tigrina Girard // XII Междунар. конф. молодых ученых “Биология внутренних вод: Проблемы экологии и биоразнообразия”: Тез. докл. Борок, 2002. C.185.
Медведев И. В., Комов В. Т. Воздействие ртутьорганических соединений природного происхождения на ключевые этапы пищевого поведения планарий Dugesia tigrina (Girard) и Polycelis nigra (Mller) // Междунар. конф. “Трофические связи в водных сообществах и экосистемах”.
Тез. докл. Борок, 2003. С. 86.
Медведев И. В., Гремячих В. А., Комов. В. Т. Воздействие ртутьорганических соединений природного происхождения на водных беспозвоночных // II Съезд токсикологов России: Тез. докл. Москва, 2003. C.
169.
Медведев И. В., Гремячих В. А., Аксенова И. А., Желтов С. В., Богданенко О. В. Влияние ртутьорганических соединений на размножение, пищевое поведение и восстановление фоторецепторных органов у двух видов пресноводных планарий // Междунар. науч. конф. “Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов”: Тез. докл. Петрозаводск, 6- сентября 2004 г. C. 89-90.