Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов
На правах рукописи
ОСИПОВ ДМИТРИЙ ОЛЕГОВИЧ ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАРБОГИДРАЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ОСАХАРИВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА – 2011
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович доктор биологических наук, профессор Королева Ольга Владимировна
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино 1400 часов на заседании
Защита состоится «2» июня 2011 года в диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.
Автореферат разослан «»_ 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.
Актуальность темы исследования. В современном мире истощение запасов ископаемых источников энергии является актуальной проблемой. Кроме этого, существуют серьезные экологические проблемы, связанные с увеличением объема выброса парниковых газов в атмосферу. Биотехнологическая переработка сельскохозяйственных и лесотехнических отходов снизит нагрузку на экосистему Земли, используя возобновляемый и наиболее распространенный на нашей планете растительный биоматериал – лигноцеллюлозную биомассу. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо – этанол, бутанол, а также другие полезные продукты – органические и аминокислоты, кормовые продукты, адгезивные материалы, биосинтезируемые лекарственные препараты, биоразлагаемые пластики и другие полезные продукты.
Главными компонентами клеточной стенки растений являются природные полисахариды: целлюлоза и гемицеллюлоза. Деградация полисахаридов клеточной стенки происходит под действием комплекса ферментов карбогидраз (целлюлаз и гемицеллюлаз), от сбалансированности состава которого зависит эффективность гидролиза растительной биомассы. В мировой практике основными микроорганизмами, продуцирующими ферментные комплексы карбогидраз, являются микроскопические грибы рода Trichoderma. Однако ферментные препараты (ФП), получаемые на основе штаммов Trichoderma, характеризуются относительно невысокой удельной активностью и обладают низким содержанием -глюкозидазы – одного из ключевых ферментов целлюлолитического комплекса, что приводит к недостаточно эффективному использованию ФП в промышленной биотехнологии. В отличие от грибов рода Trichoderma, секретируемый ферментный комплекс низшего гриба Penicillium verruculosum имеет более высокую удельную активность, лучше сбалансирован по составу целлюлолитических ферментов, поэтому ферментные препараты, полученные на его основе, обладают большей эффективностью при осахаривании целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ). Тем не менее, очевидно, что необходимо искать пути дельнейшего увеличения активности ферментного комплекса P.verruculosum – этого можно добиться привнесением в комплекс дополнительных целлюлолитических ферментов, а также ферментов гемицеллюлаз (ксиланаз, маннаназ), обеспечивающих деградацию гемицеллюлозной матрицы растительного сырья и, как следствие, облегчающих доступ целлюлаз к целлюлозному субстрату.
Таким образом, получение новых мультиферментных комплексов карбогидраз на основе штамма гриба P.verruculosum, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и актуальной задачей, поскольку их применение будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки ЦСМ.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось увеличение эффективности гидролиза целлюлозосодержащего сырья с использованием новых комплексных ферментных препаратов, обладающих высокими значениями целлюлазных и гемицеллюлазных активностей, полученных на основе высокопродуктивных рекомбинантных штаммов P.verruculosum. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
1. Получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены гемицеллюлаз (эндо 1,4--ксиланазы А (xylA), эндо-1,4--ксиланазы III (xyl3), эндо-1,4--маннаназы В (manB), эндо-1,4--ксиланазы III (xyl3)) и целлюлаз (эндо-1,4--глюканазы IV (egl4), эндо-1,4--глюканазы I (eglI) и целлобиогидролазы II (cbhII)) T.reesei и P.canescens;
2. Провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD-) и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности (ксиланазную, маннаназную, КМЦ-азную, авицелазную), удостовериться в стабильности новых рекомбинантных штаммов;
3. Исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными рекомбинантнвми штаммами;
4. Проанализировать осахаривающую способность новых ферментных комплексов карбогидраз по отношению к различным видам ЦСМ (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью имеющихся коммерческих и лабораторных ферментных препаратов;
5. Определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой осахаривающей способностью.
Научная новизна. Впервые созданы плазмидные конструкции, обеспечивающие экспрессию целевых генов (целлюлаз и гемицеллюлаз) под контролем индуцибельного промотора cbhI гена мажорного секреторного белка целлобиогидролазы I (ЦБГI) в штамме-реципиенте P. verruculosum 537. На базе наилучших штаммов-продуцентов целевых ферментов впервые получены новые мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной осахаривающей способностью, определен их компонентный состав и описаны биохимические свойства. Найдены корреляции между составом растительного сырья, составом полученных комплексов и результатами осахаривания природных субстратов. На основе полученных экспериментальных данных впервые предложена методика получения мультиферментных комплексов заданного состава.
Практическая значимость работы. Показано, что ферментные комплексы карбогидраз обладают увеличенной осахаривающей способностью (за счет привнесения в их состав новых гетерологичных ферментов). Применение новых ФП при гидролизе различных видов ЦСМ (измельченной багассы, измельченной осиновой древесины, измельченной сосновой древесины, микрокристаллической целлюлозы) позволяет увеличить выход сбраживаемых сахаров на 10-130% по сравнению с существующими лабораторными и коммерческими ферментными препаратами.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications;» (Архангельск, 2009), московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва, 2010), Sixth International Conference on Renewable Resources and Biorefineries (Dsseldorf, 2010), седьмой всероссийской научной молодежной школы с международным участием (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения;
литературного обзора;
отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования;
четырех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение;
выводов и списка литературы, содержащего _ ссылок на публикации в отечественных и зарубежных журналах. Объем диссертации составляет _ страниц и включает рисунков и таблиц.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Получение рекомбинантных штаммов на основе штамма P. verruculosum Получение экспрессионных конструкций и трансформация штамма реципиента. Используя геномные ДНК P.canescens и T.reesei в качестве матрицы, методом ПЦР были амплифицированы и выделены фрагменты соответствующие целевым генам (эндо--1,4-ксиланаза А P.canescens – xylA, эндо--1,4-ксиланаза III T.reesei - xyl3, эндо--1,4-маннаназа В T.reesei – manB, эндо--1,4-эндоглюканаза IV T.reesei – eglIV, эндо--1,4-эндоглюканаза I T.reesei - egl1, целлобиогидролаза II T.reesei – cbhII,), которые были клонированы в вектор, содержащий нуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной и терминаторной области гена ЦБГI (cbhI) P.verruculosum, а также необходимые генетические элементы для репликации в клетках E.coli. Далее, полученные экспрессионные плазмиды были трансформированы в компетентные клетки E.coli MachI. Таким образом, были получены экспрессионные конструкции, приведенные на рис.1.
А Б В Г Д Е Рисунок 1. Схематическое изображение экспрессионных плазмид (А – плазмида, несущая ген xylA, Б – manB, В – eglI, Г – egl4, Д – cbhII, Е – xyl3).
Была проведена серия котрансформаций штамма-реципиента P.verruculosum (niaD-) полученными плазмидами совместно с плазмидой pSTA10, несущей ген нитратредуктазы (niaD), обеспечивающей комплементацию дефектного гена нитратредуктазы в штамме реципиенте для обеспечения позитивной селекции трансформантов на средах с нитратом натрия. Проводили тест на стабильность трансформантов, состоящий в 4-х последовательных пересевах на селекционную среду, содержащую нитрат натрия в качестве источника азота. Стабильные трансформанты подвергали дальнейшему скринингу.
Первичный скрининг трансформантов (на примере трансформантов с гетерологичной эндо--1,4-ксиланазой А P.canescens). Трансформанты культивировали в колбах на стандартных средах роста штамма P.verruculosum. В культуральной жидкости (КЖ) определяли целевую (ксиланазную) и базовые активности (КМЦ-азную и авицелазную, табл.1): КМЦ-азную активность определяли по гидролизу Na-соли карбоксиметилцеллюлозы, ксиланазную – по гидролизу ксилана березы, авицелазную – по гидролизу микрокисталлической целлюлозы (МКЦ), маннаназную – по гидролизу галактоманнана. На рис.2 приведены электрофореграммы образцов КЖ, полученных при культивировании трансфор мантов. В качестве контроля использовали КЖ, полученную с помощью исходного штамма P.verruculosum В1-221-151.
Таблица 1. Активности в КЖ трансформантов с гетерологичной ксиланазой А (обозначения даны в тексте).
КМЦ- КМЦ Авицелаза, Авицелаза, Ксиланаза, Ксиланаза, № аза, № аза, ед/мл ед/мл ед/мл ед/мл ед/мл ед/мл 1 461±23 20±1 2.65±0,13 13 511±25 14±1 0.42±0, 2 384±19 25±1 2.65±0,13 14 793±40 13±1 0.40±0, 3 350±17 37±2 3.89±0,19 15 287±14 36±2 0.51±0, 4 338±15 54±3 2.69±0,13 16 309±15 25±1 0,48±0, 5 261±13 25±1 0.48±0,02 17 349±17 36±2 3.68±0, 18 343±17 30±2 3.14±0, 6 678±34 22±1 2.29±0, 7 741±37 13±1 0.27±0,01 19 266±13 55±3 3.98±0, 8 712±35 14±1 0.37±0,02 20 318±16 26±1 3.73±0, 9 339±17 27±2 1.92±0,06 21 382±19 41±2 4.39±0, 10 390±19 26±2 3.80±0,19 22 265±13 37±2 3.62±0, 11 511±25 35±2 2.46±0,12 23 460±23 24±1 3.04±0, 24 463±23 6±1 0.28±0, 12 341±17 27±2 4.51±0, Контроль 173±8 50±3 2.97±0, Очевидно, что на этапе первичного скрининга можно выделить две группы трансформантов, различающихся значениями целевой и базовых активностей: к первой группе относятся трансформанты с высоким значением в КЖ целевой ксиланазной активности, но низкими базовыми активностями (отмечены в табл. жирным шрифтом;
на рис.2 обозначены сплошной стрелкой). Ко второй группе относятся трансформанты с меньшими значениями целевой активности, но сохранившие базовые активности на уровне исходного штамма (отмечены в табл. жирным курсивом;
на рис.2 обозначены пунктирной стрелкой).
В1-221- Рисунок 2. Электрофореграмма образцов КЖ трансформантов, содержащих гетерологичную ксиланазу А (нумерация трансформантов соответствует нумерации в табл.1).
Доказательством, свидетельствующим в пользу наличия экспрессии целевых белков (эндо--1,4-ксиланазы А, эндо--1,4-ксиланазы III, эндо--1,4-маннаназы В, эндо--1,4-глюканаз IV и I и целлобиогидролазы II) в КЖ, являлись данные MALDI TOF масс-спектрометрии. Для получения этих данных проводили ДДС-ЭФ КЖ соответствующих трансформантов, вырезали образцы геля, соотвествующие по молекулярной массе целевому рекомбинантному ферменту, подвергали их гидролизу трипсином, и далее полученные пептиды анализировали методом MALDI-TOF масс спектрометрии. Анализ результатов и поиск целевых пептидов проводили с использованием программы Bruker DataAnalysis. Данные о полученных пептидах после трипсинолиза сравнивали с теоретическими пептидными после довательностями, полученными с использованием программы PeptideMass (http://expasy.org/tools/peptide-mass.html) для первичной аминокислотной после довательности гетерологичных ферментов.
На рис.3-4 приведены MALDI-TOF масс-спектры трипсинового гидролизата и результаты идентификации пептидов на примере эндо--1,4-ксиланазы А – на основании этих данных с достоверностью можно утверждать о наличии эндо--1,4 ксиланазы А P.canescens в КЖ трансформантов P.verruculosum, полученных с помощью экспрессионной конструкции pPrCBHI-XylA. Подобным образом было доказано наличие экспресии и других целевых генов.
Intens.
x 1833 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 m/z Рисунок 3. MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата полосы, соответствующей эндо--1,4-ксиланазе А P.canescens.
1 MVQLKTAALA LLFAGQALSG PVDSRQASVS IDAKFKAHGK KYLGTIGDQY TLTKNTKNPA 61 IIKADFGQLT PENSMKWDAT EPNRGQFTFS GSDYLVNFAQ SNGKLIRGHT LVWHSQLPGW 121 VSSITDKNTL ISVLKNHITT VMTRYKGKIY AWDVLNEIFN EDGSLRNSVF YNVIGEDYVR 181 IAFETARSVD PNAKLYINDY NLDSAGYSKV NGMVSHVKKW LAAGIPIDGI GSQTHLGAGA 241 GSAVAGALNA LASAGTKEIA ITELDIAGAS STDYVNVVNA CLNQAKCVGI TVWGVADPDS 301 WRSSSSPLLF DGNYNPKAAY NAIANAL Рисунок 4. Аминокислотная последовательность эндо--1,4-ксиланазы А P.canescens.
Пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, выделены жирным шрифтом.
Получение ферментных препаратов. С помощью выбранных рекомбинантных штаммов была проведена наработка КЖ трансформантов в ферментёрах объемом 1 л на ферментационной среде для P.verruculosum. После отделения грибной биомассы КЖ были лиофильно высушены. Всего для дальнейших исследований было получено 33 ферментных сухих препарата (табл.2).
Свойства ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов 2.
P. verruculosum Были исследованы молекулярные параметры (молекулярная масса, pI) гетерологичных белков входящих в состав ферментных препаратов. Определена активность ферментных препаратов по широкому кругу природных и синтетических субстратов, температурные и рН-оптимумы действия, стабильность в различных условиях.
Таблица 2. Рекомбинантные штаммы и полученные ферментные препараты.
Промотор/ Сигнальный Ферментные Штамм Ген терминатор пептид препараты cbhI xylA xylA B1/CBHI_XylA КсилА-(1-8) (P.verruculosum) (P.canescens) (P.canescens) cbhI manB B1/CBHI_Man manB (T.reesei) МанВ-(1-8) (P.verruculosum) (T.reesei) B1/CBHI_ cbhI cbhI eglIV ЭГIV-(1-8) EGIV (P.verruculosum) (P.verruculosum) (T.reesei) cbhI cbhI egl B1/CBHI_ EGI ЭГI-(1-4) (P.verruculosum) (P.verruculosum) (T.reesei) B1/CBHI_CBH cbhI cbhI cbhII ЦБГII-(1-4) II (P.verruculosum) (P.verruculosum) (T.reesei) cbhI xyl3 xyl B1/CBHI_Xyl3 КсилIII- (P.verruculosum) (T.reesei) (T.reesei) Электрофорез и изоэлектрофокусирование. Был проведен ДДC-электрофорез сухих ферментных препаратов (рис.5). На электрофореграммах обозначены полосы, соответствующие эндо--1,4-эндоглюканазе IV T.reesei (~39 кДа), эндо--1,4 эндоглюканазе I T.reesei (~55 кДа), целлобиогидролазе II T.reesei (~55 кДа), эндо- 1,4-ксиланазе А P.canescens (~31 кДа), эндо--1,4-ксиланазе III T.reesei (~38 кДа), эндо--1,4-маннаназе В T.reesei (~50 кДаА).
Анализ электрофореграмм свидетельствует, что при увеличении экспрессии целевых белков, уменьшается экспрессия ЦБГI. Это связано с использованием фланкирующих элементов гена cbhI, что приводит в некоторых случаях к частичной замене гена cbhI на ген гетерологичного белка в процессе гомологичной рекомбинации.
По данным изоэлектрофокусирования значения pI рекомбинантных ферментов имели следующие значения: эндо--1,4-эндоглюканазы IV T.reesei – 2,8;
эндо--1,4 эндоглюканазы I T.reesei – 4,6;
целлобиогидролазы II T.reesei – 5,7;
эндо--1,4 маннаназы В T.reesei – 4,55, эндо--1,4-ксиланазы А P.canescens – 8,5, эндо--1,4 ксиланазы III T.reesei – 9,1.
Активность ферментных препаратов. В табл.3 представлены данные, характеризующие активность ФП, содержащих рекомбинантные целлюлазы и гемицеллюлазы, по отношению к различным субстратам (препараты ЭГ I ЭГ IV ЦБГ II Ксиланаза А Ксиланаза III Маннаназа В Рисунок 5. Электрофореграммы ферментных препаратов, содержащих рекомбинатные гетерологичные целлюлазы и гемицеллюлазы (стрелками указаны полосы, соответствующие рекомбинантными ферментам).
Таблица 3. Удельные активности ферментных препаратов, содержащих рекомбинатные ферменты по отношению к различным субстратам (50 °С, рН 5).
Диапазон значений удельных активностей (ед/мг) Содержание Группа белка в препа- Контроль, рекомбинантных Рекомбинант ратов Активность P.verruculosum препаратах (мг/г) ные препараты В1-221- Ксиланазная 22,5 - 69,6 12, КсилА-1- Авицелазная 0,1 - 0,2 0, 336 - КМЦ-азная 1,2 - 2,9 13, -глюкозидазная 0,5 - 3,3 1, Маннаназная 14,7 - 53,7 отсутствует МанВ-1- Ксиланазная 1,3 - 9,7 12, Авицелазная 0,1 - 0,3 0,3 378 - КМЦ-азная 2,1 - 17,0 13, -глюкозидазная 0,3 - 1,1 1, Ксиланазная 12,5 - 33,3 12, ЭГIV-1- Авицелазная 0,1 - 0,2 0, 620 – КМЦ-азная 4,9 - 10,9 13, -глюкозидазная 0,8 - 1,6 1, Ксиланазная 9,1 - 17,2 12, ЭГI-1- Авицелазная 0,7 - 0,9 0, 685 - КМЦ-азная 10,7 - 24,2 13, -глюкозидазная 1,0 - 1,2 1, Ксиланазная 15,2 - 21,5 12, ЦБГII-1- Авицелазная 0,9 - 1,4 0, 751 - КМЦ-азная 14,7 - 19,8 13, -глюкозидазная 1,1 - 1,5 1, Ксиланазная 20,8 12, КсилIII- Авицелазная 0,1 0, КМЦ-азная 18,0 13, -глюкозидазная 1,1 1, разбиты на группы, относящиеся к определенным рекомбинантным ферментам ферментам, жирным шрифтом отмечены целевые для определенных групп активности).
Анализируя данные, приведенные в табл.3, следует заключить, что целевые активности различных ферментных препаратов варьируют в широком диапазоне значений и в несколько раз превосходят, значения соответствующих активностей контрольного ферментного препарата, полученного с помощью исходного штамма P.verruculosum В1-221-151: удельная ксиланазная активность возросла в 2-5 раз, КМЦ-азная – в 2 раза, авицелазная – в 3-4 раза, маннаназная активность в исходном препарате отсутствовала, но достигала значительного уровня в соответствующих рекомбинантных ферментных препаратах.
рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов. Важными характеристиками ферментных препаратов являются рН- и температурные оптимумы целевой активности, а также их стабильность при различных рН и температуре - эти параметры во многих случаях являются ключевыми при выборе ферментов для различных биотехнологических процессов. В табл.4 приведены результаты исследований ферментных препаратов, касающиеся влияния рН и температуры на целевые активности (рН50% и Т50% интервал значений рН и Т, при которых активности ФП выше 50% от максимального значения).
Таблица 4. Влияние температуры и рН на целевую активность и стабильность ферментных препаратов.
xylА xyl3 manB eglI eglIV cbhII Целевой ген P.canescens T.reesei T.reesei T.reesei T.reesei T.reesei № препарата КсилА-4 КсилIII-1 МанВ-6 ЭГI-4 ЭГIV-2 ЦБГII- Активность по Глюкуроно- Глюкуро- Галакто КМЦ КМЦ МКЦ отношению к ксилан ноксилан маннан субстрату рН-оптимум 5,5 3,5 3,5 4,1 4,1 4, (рН50%) (4,2-6,7) (2,5-6,5) (2,5-7) (2,8-5,8) (2,5-5,9) (2,5-5,8) Т-оптимум 55 55 80 60 60 (Т50%) (35-60) (37-67) (60-85) (44-71) (43-76) (40-66) Остаточная 50°С 30 34 76 75 61 активность после 3 ч инкубации, 60°С Н.с Н.с 75 52 45 рН 5,0 (в %) 50°С 85 150 180 180 180 Время полуинакти вации, рН 60°С 4,6 7 180 180 100 5,0 (мин) 70°С 2,4 4,3 30 5 5 3, Ферментные препараты проявляли наибольшую стабильность целевой активности при 50 0С (время полуинактивации 1,5-3 часа), наименьшую – при 70 0С (все препараты имели время полуинактивации до пяти минут, препараты, содержащие эндо--1,4-маннаназу В - 30 мин).
Инкубирование ферментных препаратов при 500С незначительно влияло на их активность, определенную по гидролизу МКЦ (90% от начальной активности после 3 ч инкубации), активность по гидролизу КМЦ и галактоманнану уменьшалась быстрее (60-75% и 40-75% от начальной активности после 3 ч инкубации, соответственно). Наиболее быстро происходило падение активности по глюкуроноксилану (35-50% от начальной активности после 3 ч инкубации при 50 С).
Значения рН-оптимумов препаратов располагались в слабокислой области (рН 3,5-5,5). Следует отметить, что ферментные препараты обладали широкими диапазонами значений рН50% (рН 2,5-7,1) и T50% (30-85 0С).
3. Результаты гидролиза различных видов ЦСМ ферментными препаратами, полученными с помощью рекомбинантных штаммов P.verruculosum С целью исследования осахаривающей способности полученных ФП был проведен гидролиз различных видов ЦСМ: в качестве субстратов использовали измельченную осину, измельченную обессмоленную сосну, измельченную багассу, а также МКЦ. Эффективность осахаривания зависит как от качественного и количественного состава ФП, так и от состава предобработанных субстратов. Таким образом, результаты гидролиза различных субстратов позволят понять, какой компонентный состав ферментного препарата наилучшим образом подходит для осахаривания конкретного вида.
Гидролиз проводили в течение 48 часов при 50 С и различной дозировке ферментных препаратов по белку (2, 5 и 10 мг белка на 1 г субстрата) в присутствии избытка целлобиазного ферментного препарата F10 (40 ед целлобиазы на 1 г субстрата). Через 3, 24 и 48 часов из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию восстанавливающих сахаров (ВС) и глюкозы.
Была исследована осахаривающая способность 33-х полученных ФП. В каждой группе препаратов было отобрано по одному, показавшему наилучший осахаривающий эффект на определенных субстратах. В качестве контрольных препаратов были использованы: препарат B1-221-151, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum В1-221-151, коммерческие препараты на основе T.ressei: Spezyme CP, Celluclast 1.5L, Accellerase 1000 (данные по активностям контрольных препаратов представлены в табл.5). На рис.6 представлены результаты гидролиза – в данном случае приведен выход глюкозы и ВС за 24 часа при дозировке ферментных препаратов 5 мг/г субстрата.
Таблица 5. Активности контрольных препаратов по отношению к различным субстратам и содержание белка в контрольных препаратах (50 °С, рН 5).
Название Содержание -глюкози ферментного белка, мг/г КМЦ-аза Авицелаза Ксиланаза даза препарата (*мг/мл) Контроль, препарат P.verruculosum 847±33 13,0±0,5 0,30±0,02 1,10±0,05 12,9±0, В1-221- Spezyme CP* 118±5 27,7±1,1 2,02±0,08 0,57±0,02 7,5±0, Celluclast 1.5L* 184±7 17,5±0,7 1,29±0,05 0,15±0,01 2,9±0, Accellerase1000* 103±4 30,7±1,2 2,11±0,08 2,94±0,12 3,3±0, Рекомбинантные ферментные препараты обладают высокой осахаривающей способностью по отношению к измельченным осине и багассе и превосходят по эффективности гидролиза этих видов ЦСМ как контрольный препарат, полученный с помощью исходного штамма P.verruculosum В1-221-151, так и коммерческие ферментные препараты. В случае измельченной обессмоленной сосны рекомбинантные ферментные препараты несколько уступили по осахаривающей способности коммерческому прапарат Spezyme SP, но превзошли контрольный препарат P.verruculosum В1-221-151.
При гидролизе измельченной осиновой древесины наилучшими для осахаривания рекомбинантными ферментными препаратами являются КсилА-4, ЭГIV-2 и КсилIII-1;
измельченной обессмоленной сосны - КсилA-4, и КсилIII-1;
измельченной багассы – КсилА-4 и ЭГIV-2.
В табл.6 представлены более подробные данные, характеризующие увеличение выхода ВС и глюкозы при гидролизе разных видов ЦСМ при использовании различных групп рекомбинантных ферментных препаратов по сравнению с контрольным препаратом, полученным с помощью исходного штамма P.verruculosum В1-221-151.
А ВС Глюкоза Б В L - - I- CP II. А В III IV ЭГ БГ t ан ил ил 1 e ЭГ se ym as Ц М Кс Кс ra cl 1 ez le lu B Sp el el cc C A Рисунок 6. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных природных целлюло зосодержащих материалов: А) измельченная осина;
Б) измельченная обессмоленная сосна;
В) измельченная багасса. Условия: 50 0С, рН 5, [S]= 100 г/л (сухой вес), [E]= 5 мг/г субстрата, перемешивание – 250 об/мин.
Среди препаратов с рекомбинантной эндо--1,4-ксиланазой А максимальный выход сахаров наблюдался в случае препарата КсилA-4;
с рекомбинантной эндо- 1,4-ксиланазой III наилучшим показал себя препарат КсилIII-1;
с рекомбинантной эндо--1,4-маннаназой – препарат МанB-2;
с рекомбинантной эндо--1,4-глюканазой IV – препараты ЭГIV-1 и ЭГIV-2;
с рекомбинантной эндо--1,4-глюканазой I – препарат ЭГI-4;
с рекомбинантной целлобиогидролазой II – препарат ЦБГII-1.
Характерно, что при увеличении дозировки рекомбинантных ферментных препаратов наблюдается относительно меньшее (в %) увеличение выхода ВС и глюкозы по сравнению с контрольным препаратом, что обусловлено исчерпыванием субстрата и выхода сахаров, близкого к максимальному.
Таблица 6. Выход ВС и глюкозы при гидролизе измельченной осины, измельченной обессмоленной сосны, измельченной багассы и МКЦ (условия гидролиза те же, что на рис.6).
Увеличение выхода Выход сахаров по сравнению с Дозировка при действии использованием Субстрат Лучшие рекомбинантных контроля (препарат (мг белка препараты препаратов, г/л P.verruculosum на 1 г В1-221-151), % субстрата) ВС Глюкоза ВС Глюкоза 2 35 30 48 древесина Осиновая КсилA-4, 5 42 40 17 ЭГIV-2, КсилIII- 10 48 44 10 КсилA-4, ЦБГII-1, 2 32 30 26 древесина КсилIII- Сосновая ЭГIV-2 5 40 38 18 МанB-2 10 43 40 11 ЭГI-4 2 35 25 119 Багасса КсилA-4, ЭГI-4 5 47 37 28 ЭГI-4 10 55 48 30 КсилIII-1, ЭГIV-1 2 26 23 136 МКЦ КсилA-4 5 41 38 71 КсилA-4, ЭГI-4 10 54 48 54 На рис.7 представлены кинетические кривые гидролиза измельченной осиновой древесины рекомбинантными ферментными препаратами (КсилА-4, ЭГIV-2), препаратом В1-221-151 и коммерческими препаратами.
КсилА- 45 B1-221- Spezyme CP Celluclast 1.5L 35 Accellerase [ВС], г/л А 0 12 24 36 [ВС], г/л Б 0 12 24 36 [ВС], г/л В 0 12 24 Время, ч 36 Рисунок 7. Кинетические кривые гидролиза измельченной осиновой древесины препаратом КсилА-4 и контрольными препаратами: А) 2 мг на 1 г субстрата, Б) 5 мг на 1 г субстрата, В) 10 мг на 1 г субстрата. Условия: 50 0С, рН 5, [S]= 100 г/л (сухой вес), 250 об/мин.
Из приведенных данных следует, что при гидролизе измельченной осиновой древесины лучший ферментный препарат КсилА-4 превосходит по глубине и скорости гидролиза контрольный препарат P.verruculosum В1-221-151 и коммерческие препараты. Наибольший выход ВС наблюдался через 24 и 48 часов гидролиза. При дозировке 10 мг на 1 г субстрата максимальный выход ВС при гидролизе измельченной осиновой древесины препаратами КсилА-4 и В1-221- достигается через 24 часа, в отличие от коммерческих препаратов (в случае их использования максимальный выход продуктов гидролиза достигали за 48 часов), что позволяет снизить время гидролиза.
4. Состав мультиферментного комплекса полученных препаратов Эффективность процесса получения сахаров из ЦСМ в значительной степени зависит от состава мультиферментного комплекса и кинетического взаимодействия индивидуальных ферментов в нем. Знания о количественном содержании секретируемых мультиферментных комплексов позволят найти объяснение результатам осахаривания определенных видов ЦСМ и оптимизировать состав целлюлазных и гемицеллюлазных мультиферментных композиций для достижения максимальной эффективности осахаривания.
Для определения состава были выбраны ферментные препараты, обеспечившие наибольший выход ВС и глюкозы при гидролизе ЦСМ. Состав ферментных препаратов определяли с помощью разработанного в нашей лаборатории экспресс метода хроматографического фракционирование ферментных препаратов.
Схема фракционирования включала три стадии:
• обессоливание растворенного препарата методом гельпроникающей хроматографии;
• грубое фракционирование ферментного комплекса с помощью ионообменной хроматографии на носителе Source 15Q, с последующим анализом специфических активностей собранных белковых фракций, а также проведением ДДС-ЭФ (на рис.8 представлено фракционирование лучшего ферментного препарата КсилА-4);
• тонкое фракционирование, включающую дополнительное разделение (гидрофобная хроматография на носителе Source 15Iso) белковых фракций, отобранных в ходе предыдущей стадии и содержащих смесь целлобиогидролаз и глюкозидазы, анализ специфических активностей полученных фракций, а также проведением ДДС-ЭФ.
Рисунок 8. Фракционирование ферментного препарата КсилА 4 с помощью анионообменной хроматографии на носителе Source 15Q, рН 6,8.
Зная содержания белка и удельную активность соответствующих ферментов во фракциях, определялся компонентный состав препаратов. Результаты, характеризующие компонентный состав рекомбинантных ферментных препаратов:
КсилА-4, МанВ-2, ЦБГII-1, ЭГIV-2, ЭГI-1, а также контрольного ферментного препарата P.verruculosum В1-221-151, представлены в табл.7.
Сравнивая данные хроматографического разделения с результатами гидролиза можно сделать вывод о том, что наибольшей осахаривающей способностью обладают те ФП, в которых не только в значительном количестве присутствуют рекомбинантные (гетерологичные) белки, но и сохраняется собственный целлюлолитический комплекс, например, в препаратах КсилА-4 (18% рекомбинантной эндо--1,4-ксиланазы А и 47% целлобиогидролаз), МанВ-2 (45% рекомбинантной эндо--1,4-маннаназы В, 31% целлобиогидролаз). Препараты с другим соотношением рекомбинантных ферментов и целлобиогидролаз, например, КсилА-3 (50% рекомбинантной эндо--1,4-ксиланазы А и 38% целлобиогидролаз), МанВ-1 (70% рекомбинантной маннаназы В, 17% целлобиогидролаз), характеризуются менее высокой осахаривающей способностью.
Таблица 7. Компонентный состав ферментных препаратов.
Компонент Эндо--1,4-ксиланаза А P.canescens Эндо--1,4-глюканаза IV T.reesei Эндо--1,4-глюканаза I T.reesei Эндо--1,4-маннаназа T.reesei Целлобиогидролаза II T.reesei Эндо--1,4-ксиланаза T.reesei Эндо--1,4-глюканазы Эндо--1,4-ксиланазы Целлобиогидролаза II Целлобиогидролаза I Ксилоглюканазы -глюкозидаза Препарат КсилА-4 35 12 - 10 - - - 2 - 18 2 КсилIII-1 25 14 - 25 - - - 5 17 - 3 МанВ-2 13 18 - 10 - - 45 2 - - 2 ЦБГII-2 44 12 2 27 - - - 7 - - 4 ЭГIV-2 32 28 - 10 - 15 - 6 - - 3 ЭГI-4 39 21 - 24 3 - - 1 - - 3 B1-221-151 35 34 - 16 - - - 4 - - 2 Кроме того, сравнивая результаты гидролиза и фракционирования ФП, можно прийти к выводу, что препараты с высоким содержанием гетерологичных ксиланаз (КсилА-4 и КсилIII-1) более эффективно гидролизуют ксилансодержащие субстраты – багассу и осиновую древесину;
препарат МанВ-2 с высоким содержанием гетерологичной маннаназы эффективнее гидролизует маннансодержащий субстрат – сосновую древесину;
препараты с увеличенным содержанием гетерологичных эндоглюканаз (ЭГIV-2, ЭГI-4) более эффективно гидролизуют субстраты с высокой долей целлюлозы в своем составе – сосновую и осиновую древесину и МКЦ. Таким образом, наблюдается зависимость между составом ЦСМ и составом ферментного комплекса для осахаривания.
Целлобиогидролазы – основные гидролитические ферменты. Их содержание в контрольном ферментном препарате P.verruculosum В1-221-151 и в различных новых рекомбинантных препаратах неодинаково. Так, в препарате В1-221-151 общее содержание целлобиогидролаз около 70%. В препаратах, содержащих рекомбинантные гемицеллюлазы (КсилА-4, КсилIII-1, МанВ-2), содержание целлобиогидролаз в 1,5-2 раза меньше (по причине оттитровки промотора ЦБГI), но их осахаривающая способность выше за счет активности привнесенных гетерологичных ферментов.
В препарате ЭГIV-2 не только сохранялся высокий уровень содержания целлобиогидролаз (60%), но и в значительном количестве (15%) присутствовала гетерологичная эндо--1,4-глюканаза IV.
Препараты ЦБГII-2 и ЭГI-4 со слабой осахаривающей способностью, характеризовались относительно высоким содержанием ЦБГ I и II (66 и 60% соответственно), но низким содержанием гетерологичных ферментов (2 и 3% соответственно).
Препарат на основе исходного штамма P.verruculosum В1-221-151 обладает высокой осахаривающей способностью за счет наличия высокоактивных целлобиогидролаз и высокого содержания -глюкозидазы.
*** Таким образом, основываясь на изложенных результатах, можно утверждать, что ФП, полученные на основе рекомбинантных штаммов P.verruculosum, обладают повышенной осахаривающей способностью ЦСМ по сравнению с коммерческими препаратами и препаратом на основе исходного штамма P.verruculosum В1-221-151.
Наиболее эффективными среди полученных ФП являются: препарат ЭГIV-2 для гидролиза измельченной багассы, препарат КсилА-4 для гидролиза измельченной осиновой древесины и препарат МанВ-2 для гидролиза измельченной сосновой древесины. Показано, что применение индуцибельной системы экспрессии дает возможность получения мультиферментных комплексов заданного состава, использование которых приводит к улучшению осахаривающих свойств ФП, необходимых в технологической цепочке биоконверсии ЦСМ на стадии получения сахаров из полисахаридов клеточной стенки растений.
ВЫВОДЫ 1. Методами генетической инженерии сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гетерологичные гены из Trichoderma reesei и Penicillium canescens, созданные на основе векторов, содержащих регуляторные области промотор и терминатор гена cbhI P verruculosum.
2. Созданы новые рекомбинантные штаммы P.verruculosum, продуцирующие мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной целлюлазной активностью (за счет экспрессии эндо--1,4-глюканазы IV T.reesei), а также с увеличенной гемицеллюлазной активностью (за счет экспрессии эндо--1,4 ксиланаз P.canescens и T.reesei или эндо--1,4-маннаназы T.reesei) 3. На основе рекомбинантных штаммов P.verruculosum получены ферментные препараты карбогидраз и проанализирована их осахаривающая способность по отношению к различным видам растительных субстратов.
Установлено, что наибольший выход сахаров при осахаривании измельченной багассы, а также микрокристаллической целлюлозы обеспечивают ферментные препараты, имеющие в своем составе рекомбинантную эндо--1,4-глюканазу IV;
при осахаривании измельченной осиновой древесины – имеющие рекомбинантную эндо -1,4-ксиланазу, при гидролизе измельченной сосновой древесины – рекомбинантную эндо--1,4-маннаназу. Увеличение выхода сахаров составило 10-130% по сравнению с действием контрольного ферментного препарата, полученного с помощью исходного штамма P.verruculosum.
4. Определен компонентный состав новых ферментных препаратов и установлено, что наиболее высокой осахаривающей способностью обладают препараты ЭГIV-2, КсилА-4, КсилIII-1, МанВ-2, в которых вместе с высоким содержанием целевого привнесенного фермента (эндо--1,4-глюканазы IV, эндо- 1,4-ксиланазы, эндо--1,4-маннанзы) сохраняются ключевые целлюлолитические ферменты P.verruculosum (целлобиогидролазы I и II).
5. Исследованы физико-химические и биохимические свойства ферментных препаратов, обладающих наибольшей осахаривающей способностью.
Установлено, что оптимумы действия ферментных препаратов располагаются в области рН 3,5-5,5 и при температурах от 50 до 80°С, а также стабильны в широком температурном диапазоне (T50% 30-85 0С).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи в рецензируемых журналах:
1. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. Cellulase complex of the fungus Penicillium verruculosum:
properties of major endoglucanases and cellobiohydrolases. Biotechnology Journal, 2010, v.5, №8, pр.871-880.
2. Osipov D.O., Rozhkova A.M., Matys V.J., Koshelev A.V., Okunev O.N., Rubtsova E.A., Pravilnikov A.G., Zorov. I. N., Sinitsyna O. A., Oveshnikov I. N., Davidov E.R., Sinitsyn A.P. Production of biocatalysts on the basis of recombinant heterologous xylanase producer strains in the Penicillium verruculosum fungus: their application in the hydrolysis of timber and wood processing industry wastes. Catalysis in Industry, 2011, v.3, №1, pp.34-40.
Тезисы докладов.
1. Osipov D.O., Koshelev А.V., Zorov I.N., Matys V.Yu., Bubnova T.V., Nemashkalov V.А., Okunev O.N., Rozhkova А.M., Sinitsyn A.P. Simultaneous fermentation of fungi Trichoderma longibrachiatum and Penicillium verruculosum as a tool for obtaining cellulase complex with increased -glucosidase activity. Abstracts of International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications;», 19- June, Arkhangelsk, p.107.
2. Осипов Д.О., Синицын А.П., Рожкова А.М., Зоров И.Н.
Высокоэффективный комплекс гемицеллюлаз рекомбинантных штаммов микромицета Penicillium для ферментативного гидролиза багассы Московская международная научно-практическая конференция "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов", 15-17 Марта, Москва, стр.309-310.
3. Осипов Д.О., Рожкова А.М., Правильников А.Г., Зоров И.Н., Синицын А.П. Высокоэффективный комплекс гемицеллюлаз рекомбинантных штаммов микромицета Penicillium sp. для ферментативного гидролиза хвойной древесины.
Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO», 12-15 Апреля, Москва, стр.140.
4. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Федорова Е.А., Семенова М.В., Саттрудинов А.Д., Короткова О.Г., Андрианов Р.М., Правильников А.Г., Волков П.В., Осипов Д.О., Бушина Е.В., Кондратьева Е.А., Гусаков А.В., Немашкалов В.А., Беккаревич А.О., Матыс В.Ю., Бубнова Т.В., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Комплекс ферментов для эффективного осахаривания лигноцеллюлозных материалов, Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO», 12- Апреля, Москва, стр.162-163.
5. Осипов Д.О. Увеличение выхода сбраживаемых сахаров при гидролизе растительного сырья ферментными комплексами грибов, содержащими гетерологичные ксиланазы, Материалы Седьмой Всероссийской Научной Молодежной Школы с Международным Участием, 24-26 Ноября 2010, Москва, стр.254-258.