Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов penicillium verruculosum
На правах рукописи
ПРАВИЛЬНИКОВ АРТЕМ ГЕННАДИЕВИЧ Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum специальность 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА – 2012
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук
Научный консультант: доктор химических наук, профессор А.П.Синицын
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор И.А.Ямсков доктор биологических наук, профессор О.В.Королева
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, г. Пущино
Защита состоится «29» марта 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.
Автореферат разослан «28» февраля 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф.Орловский Актуальность темы исследования. В современном мире четко прослеживается тенденция к приоритетному развитию альтернативной энергетики, основанной на возобновляемых источниках энергии, и сокращению доли углеводородного сырья в глобальном энергетическом балансе. Кроме этого, существуют серьезные экологические проблемы, связанные с увеличением объема выброса парниковых газов в атмосферу.
Биотехнологическая переработка сельскохозяйственных и лесотехнических отходов, а именно лигноцеллюлозной биомассы, являющейся возобновляемым и наиболее распространенным на нашей планете растительным материалом, позволяет значительно снизить нагрузку на экосистему Земли.
Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо – этанол, бутанол, а также другие полезные продукты – органические и аминокислоты, кормовые продукты, адгезивные материалы, биосинтезируемые лекарственные препараты, биоразлагаемые пластики и другие полезные продукты. Таким образом, в будущем растительная биомасса будет играть роль возобновляемого источника сырья, в том числе для получения биотоплива.
Эффективность процесса получения сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени – от состава комплекса целлюлолитических ферментов и синергетического взаимодействия индивидуальных ферментов в нем.
В настоящее время на мировом рынке представлен широкий спектр ферментных препаратов, полученных на основе культуральной жидкости, секретируемой низшими грибами рода Trichoderma. Эти препараты традиционно применяются для гидролиза растительного сырья, однако они обладают рядом существенным недостатком, заключающимся в относительно низкой эффективности гидролиза – в первую очередь из-за недостатка составе ферментных комплексов Trichoderma -глюкозидазы (целлобиазы), что приводит к накоплению в реакционной смеси в качестве одного из продуктов целлобиозы, которая ингибирует ключевые ферменты, участвующие в осахаривании целлобиогидролазы.
Поэтому в настоящее время в области ферментативного гидролиза возобновляемого растительного сырья весьма активно развиваются фундаментальные и прикладные исследования, направленные на поиск и получение новых штаммов суперпродуцентов целлюлаз, гемицеллюлаз и сопутствующих ферментов, обладающих высокой гидролитической способностью и имеющих «управляемый» состав ферментов, так, чтобы комплекс продуцируемых ферментов был наилучшим образом адаптирован к осахариванию тех или иных видов целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ).
Грибы рода Penicillium, в отличие от Trichoderma, продуцируют комплексы целлюлитических ферментов более сбалансированного состава, которые эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие материалы.
Ранее нами были разработаны подходы к получению эффективных ферментных препаратов, основным из которых является создание штаммов продуцентов, содержащих индивидуальные целевые гены целлюлаз. Стратегия создания таких штаммов-продуцентов заключалась в последовательной трансформации штамма-реципиента одной плазмидой, несущей целевой ген, совместно с ко-трансформацией плазмидой pSTA10, позволяющей отбирать трансформанты при культивировании на селективной среде. Основываясь на данных по встройке отдельных целевых генов и распределению целевых активностей в конечных ферментных препаратах, нами была разработана новая стратегия получения штаммов-продуцентов с заданными свойствами, заключающаяся в одновременной трансформации штамма-реципиента несколькими плазмидами с целевыми генами, а также трансформация экспрессионной кассетой, представляющей собой линейный участк ДНК с несколькими целевыми генами.
Таким образом, создание новых рекомбинантных штаммов на основе штамма гриба P.verruculosum, продуцирующих мультиферментные комплексы карбогидраз, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и актуальной задачей, поскольку применение данных мультиферментных комплексов будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки целлюлозосодержащих материалов.
Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось получение новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum и ферментных препаратов на их основе, обладающих увеличенной осахаривающей способностью.
В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
• получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены целлюлаз: эндо-1,4- глюканазы II (egl2) P.verruculosum, целлобиогидролазы II (cbhII) Trichoderma reesei и P.verruculosum и -глюкозидазы (bgl) Aspergillus niger под контролем сильного индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (cbhI);
• провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD-) и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности;
• исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными новыми рекомбинантными штаммами;
• определить компонентный состав ферментных комплексов;
• проанализировать осахаривающую способность наиболее перспективных ферментных комплексов по отношению к различным видам ЦСМ (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью коммерческих и лабораторных ферментных препаратов.
Научная новизна. Впервые с помощью метода одновременной трансформации грибного штамма-реципиента P.verruculosum 537 несколькими плазмидами, несущими индивидуальные гены гомологичных и гетерологичных целлюлаз, созданы новые штаммы P.verruculosum – продуценты высокоактивных целлюлолитических ферментных комплексов. На базе наилучших штаммов-продуцентов целевых ферментов впервые получены новые мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной осахаривающей способностью, определен их компонентный состав и описаны физико-химические свойства. Найдены корреляции между составом растительного сырья, составом полученных комплексов и эффективностью процесса осахаривания природных субстратов.
Практическая значимость работы. Показано, что новая стратегия создания штаммов-продуцентов позволяет получать ферментные комплексы заданного состава.
Ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum, значительно эффективнее (на 19-50%) гидролизуют различные виды предобработанных хвойной и лиственной древесины, а также багассы, чем коммерческие ферментные препараты, получаемые с использованием штаммов гриба Trichoderma sp., и препарат, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения;
литературного обзора;
отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования;
четырех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение;
выводов и списка литературы, содержащего 151 ссылку на публикации в отечественных и зарубежных журналах. Объем диссертации составляет 106 страниц и включает рисунка и 16 таблиц.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Получение рекомбинантных штаммов на основе штамма-реципиента P.
verruculosum Ранее в нашей лаборатории были проведены исследования по получению штаммов-продуцентов различных целлюлаз с помощью системы экспрессии под контролем индуцибельного промотора гена cbh1. При использовании данной системы экспрессии можно получить продукты с высоким содержанием целевого белка в количестве 40-80% от общего количества секреторного белка. При этом возможно снижение общей продуктивности штамма. Поэтому, была разработана новая стратегия создания на основе штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD-) рекомбинантных штаммов, продуцирующих мультиферментные комплексы с повышенным уровнем активности целевых ферментов методом ко-трансформации смесью двух и трех целевых плазмид, несущих индивидуальные гены гомологичных эндо-1,4-глюканазы II (ЭГII 36 кДа), целлобиогидролазы II (ЦБГII 60 кДа), а также гетерологичных целлобиогидролазы II (ЦБГII 57 кДа) T.reesei и -глюкозидазы (ГЛ 120 кДа) A.niger. В случае использования двух плазмид полученные ферментные препараты называли «дуплетами», в случае трех плазмид – «триплетами». Кроме того нами был получен ферментный препарат «тандем» на основе штамма, созданного методом трансформации линейной плазмидой, несущей последовательно 2 гена целлюлаз (гомологичной ЭГII 36 кДа и гетерологичной ГЛ 120 кДа).
Схема получения ферментных препаратов включала следующие стадии:
1) выделение генов целевых ферментов, создание экспрессионных плазмид, получение трансформированных штаммов;
2) проведение первичного скрининга полученных трансформантов;
3) культивирование отобранных трансформантов и наработка сухих ферментных препаратов;
На первом этапе работы был получен ряд экспрессионных конструкций с различной комбинацией целевых генов. Далее была проведена серия трансформаций штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD-) плазмидами (pPrCBHI-Glu_Asp EGII_B1, pPrCBHI-EGII_B1, pPrCBHI-CBHII_B1, pPrCBHISS-CBHII_Tr, pPrCBHI Glu_Asp) совместно с плазмидой pSTA10 с геном нитратредуктазы (niaD). В табл. представлены варианты смесей плазмид, использованных для трансформации.
Таблица 1. Плазмиды и их смеси (композиции), использованные для трансформации реципиентного штамма P. verruculosum 537 (niaD-).
Название Целевые гены Плазмиды и их смеси конструкции ГЛ A.niger «Тандем» pPrCBHI-Glu_Asp-EGII_B ЭГII P.verruculosum ГЛ A.niger pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI-EGII_B ЭГII P.verruculosum ГЛ A.niger pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI «Дуплеты» CBHII P.verruculosum CBHII_B ГЛ A.niger pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHISS CBHII T.reesei CBHII_Tr ГЛ A.niger pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI CBHII P.verruculosum CBHII_B1 + pPrCBHI-EGII_B ЭГII P.verruculosum «Триплеты» ГЛ A.niger pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI CBHII T.reesei CBHII_Tr + pPrCBHI-EGII_B ЭГII P.verruculosum Первичный скрининг трансформантов (на примере трансформантов «дуплет» ГЛ A.niger и ЦБГII P.verruculosum). Были проанализированы трансформанты, полученные с помощью одновременной трансформации плазмид pPrCBHI-Glu_Asp и pPrCBHI-CBHII_B1. Для этого были измерены целевые активности в культуральных жидкостях (КЖ) трансформантов (табл.2), а также проведен ДДС-электрофорез КЖ (рис.1).
Все полученные трансформанты отличались высокой -глюкозидазной активностью, при этом у трансформанта pDuplet2 наблюдалось увеличение значений авицелазной и КМЦ-азной активностей. В качестве контроля использовали КЖ, полученную с помощью исходного штамма P.verruculosum В1-221-151.
Анализ электрофореграммы (рис.1) позволяет заключить, что почти у всех трансформантов наблюдается увеличение интенсивности полосы, соответствующей ГЛ 120 кДа A.niger, у трансформанта pDuplet2 наблюдалось сохранение основного пула собственного целлюлолитического комплекса.
Для идентификации целевых ферментов, белковые полосы после ДДС электрофореза, соответствующие целевым белкам, подвергали обработке трипсином, полученные пептиды анализировали методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Данные MALDI-TOF масс-спектрометрии подтвердили наличие экспрессии целевых белков (-ГЛ, ЦБГII и ЭГII).
Таким образом, клон pDuplet2 и был выбран нами для дальнейших исследований.
Таблица 2. Значения удельных активностей (рН5.0, 50°С) в КЖ трансформантов, полученных с помощью одновременного использования плазмид pPrCBHI-Glu_Asp и pPrCBHI-CBHII_B1 (в ед. на мг белка).
Белок Номер КМЦ-аза, Авицелаза, -глюкозидаза, (Лоури), трансформанта ед/мг ед/мг ед/мг мг/мл pDuplet1 3,53 14 0,81 4, pDuplet2 3,63 26,9 0,65 37, pDuplet3 1,59 4,8 0,11 40, pDuplet4 3,14 12,9 0,77 8, pDuplet5 2,6 12,4 0,63 36, B1 221-151, 4,75 12,9 0,54 1, контроль ГЛ 120 кДа A.niger Рисунок 1. Электрофореграмма образцов КЖ трансформантов, полученных при одновременном использовании плазмид pPrCBHI-Glu_Asp и pPrCBHI-CBHII_B1.
Обработку масс спектров проводили с использованием программы Bruker DataAnalysis. Данные о полученных пептидах после трипсинолиза сравнивали с теоретическими пептидными последовательностями, полученными с использованием программы PeptideMass (http://expasy.org/tools/peptide-mass.html) для установления первичной аминокислотной последовательности гетерологичных ферментов.
На рис.2 приведен MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата и результаты идентификации пептидов на примере -глюкозидазы – на основании этих данных можно с достоверностью утверждать о наличии целевого белка в комплексе экспрессируемых ферментов. Подобным образом было доказано наличие экспресии и других целевых генов.
MRFTLIEAVALTAVSLASADELAYSPPYYPSPWANGQGDWAEAYQRAVDIVSQTTLAEKV NLTTGTGWELELCVGQTGGVPRLGIPGMCAQDSPLGVRDSDYNSAFPAGVNVAATWDKNL AYLRGQAMGQEFSDKGADIQLGPAAGPLGRSPDGGRNWEGFSPDPALSGVLFAETIKGIQ DAGVVATAKHYIAYEQEHFRQAPEAQGYGFNITESGSANLDDKTTHELYLWPFADAIRAG AGAVMCSYNINNSYGCQNSYTLSKLLKAELGFQGFVMSDWAAHHAGVSGALAGLDMSMP GDVDYDSGTSYWGTNLTISVLNGTVPQWRVDDMAVRIMAAYYKVGRDRLWTPPNFSSWTR DEYGFKYYYVSEGPYEKVNQFVNVQRNHSELIRRIGADSTVLLKNDGALPLTGKERLVAL IGEDAGSNPYGANGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLMTPEQAISNEVLKNKNGVFTA TDNWAIDQIEALAKTASVSLVFVNADSGEGYINVDGNLGDRRNLTLWRNGDNVIKAAASN CNNTIVIIHSVGPVLVNEWYDNPNVTAILWGGLPGQESGNSLADVLYGRVNPGAKSPFTW GKTREAYQDYLYTEPNNGNGAPQEDFVEGVFIDYRGFDKRNETPIYEFGYGLSYTTFNYS NLQVEVLSAPAYEPASGETEAAPTFGEVGNASDYLYPDGLQRITKFIYPWLNSTDLEASS GDASYGQDASDYLPEGATDGSAQPILPAGGGAGGNPRLYDELIRVTVTIKNTGKVAGDEV PQLYVSLGGPNEPKIVLRQFERITLQPSEETQWSTTLTRRDLANWNVETQDWEITSYPKM VFVGSSSRKLPLRASLPTVH Рисунок 2. MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата полосы, соответствующей -глюкозидазе A.niger и ее аминокислотная последовательность.
Пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, выделены рамкой.
Получение ферментных препаратов. Была проведена наработка ферментных препаратов, которые представляли собой лиофильно высушенную КЖ наилучших отобранных рекомбинантных штаммов-продуцентов (табл.3).
Таблица 3. Ферментные препараты и экспрессионные конструкции, использованные для их получения препаратов.
Название Полученные Плазмиды конструкции препараты «Тандем» pPrCBHI-Glu_Asp-EGII_B1 Гл+ЭГII Гл-ЭГII- pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI-EGII_B1 Гл-ЭГII- «Дуплеты» Гл-ЭГII- pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI-CBHII_B1 Гл-ЦБГII_P.v.
pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHISS-CBHII_Tr Гл-ЦБГII_T.r.
Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII- pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI-CBHII_B1 + Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII- pPrCBHI-EGII_B Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII- «Триплеты» Гл-ЦБГII_T.r.-ЭГII- Гл-ЦБГII_T.r.-ЭГII- pPrCBHI-Glu_Asp + pPrCBHI-CBHII_Tr + pPrCBHI-EGII_B1 Гл-ЦБГII_T.r.-ЭГII- Гл-ЦБГII_T.r.-ЭГII- Свойства ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов P. verruculosum. Были определены молекулярные массы гомологичных и гетерологичных белков, входящих в состав ферментных препаратов, активность ферментных препаратов по отношению к широкому кругу природных и синтетических субстратов, температурные и рН-оптимумы действия для различных актвностей и их стабильность в различных условиях.
Молекулярные массы индивидуальных ферментов в составе сухих ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов определяли ДДC-электрофорезом (рис.3). На электрофореграммах наблюдаются полосы, соответствующие ЭГII 36 кДа P. verruculosum, ЦБГII 50 кДа P.verruculosum, ЦБГII 60 кДа T. reesei, ЦБГII 60 кДа P. verruculosum, Гл 120 кДа A. niger. По сравнению с контрольным препаратом P.verruculosum B1-221-151 увеличение интенсивности полос, отвечающих Гл 120 кДа A. niger в препаратах Гл+ЭГII, Гл ЦБГII_T.r.-ЭГII-1, Гл-ЦБГII_T.r.-ЭГII-2, Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-3, Гл-ЭГII-1, Гл ЭГII-2, Гл-ЭГII-3, полосы, отвечающие ЦБГII 60 кДа и ЦБГII 50 кДа наблюдались во всех препаратах, за исключением Гл-ЦБГII_T.r., Гл-ЭГII-1, Гл-ЭГII-2, Гл-ЭГII-3.
Значительное увеличение интенсивности полосы, отвечающей ЭГII 36 кДа P.verruculosum, наблюдалось в препаратах Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-3, -ЭГII-1, Гл-ЭГII-2, Гл-ЭГII-3.
Рисунок 3. Электрофореграммы ферментных препаратов (стрелками указаны полосы, соответствующие рекомбинантным ферментам.
Активность ферментных препаратов. В табл.4 представлены данные, характеризующие активность новых ферментных препаратов по отношению к различным субстратам.
Таблица 4. Удельные активности ферментных препаратов, содержащих рекомбинатные ферменты (50°С, рН 5,0).
Диапазон значений удельных активностей (ед/мг) Содержание Группа белка в Контроль, препа- Рекомбинант- рекомбинантных Активность P.verruculosum ратов ные препараты препаратах (мг/г) В1-221- Ксиланазная 7,59±0,38 14,54±0, Тандем Авицелазная 0,66±0,03 0,61±0, 545± КМЦ-азная 12,74±0,64 16,21±0, Целлобиазная 17,78±0,89 0,17±0, 4,37±0,22 Ксиланазная 14,54±0, 19,48±0, 0,43±0,02 Авицелазная 0,61±0, Дуплет 0,91±0, 543±22 - 968± 10,24±0,51 КМЦ-азная 16,21±0, 36,11±1, 1,76±0,09 Целлобиазная 0,17±0, 17,78±0, 6,63±0,33 Ксиланазная 14,54±0, 20,78±1, 0,52±0,03 Авицелазная 0,61±0, Триплет 0,85±0, 510±26 - 886± 9,74±0,49 КМЦ-азная 16,21±0, 26,28±1, 1,17±0,06 Целлобиазная 0,17±0, 22,60±1, Анализируя данные, приведенные в табл.4, следует заключить, что целевые активности различных ферментных препаратов варьируют в широком диапазоне значений и превосходят значения соответствующих активностей контрольного ферментного препарата, полученного с помощью продуцируемого исходным штаммом P.verruculosum В1-221-151.
рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, стабильность ферментных препаратов. Важными характеристиками ферментных препаратов являются рН- и температурные оптимумы целевых активностей, а также их стабильность при различных температурах – эти параметры во многих случаях являются ключевыми при выборе ферментов для конкретных биотехнологических процессов. Данные по изучению рН и температурных оптимумов, а также рН и температурной стабильности (рН50% и Т50% - интервал значений рН и температур, при которых активности ФП выше 50% от максимального значения) ферментных препаратов суммированы в табл.5.
Исследуемые ферментные препараты имели значения рН-оптимумов целлобиазной, КМЦ-азной и авицелазной активности, расположенные в слабокислой области (рН 4,5-5,5), значения температурных оптимумов варьировались от 50 до 600С. Диапазоны значений рН50% составили рН 3,5-6,5, T50% 35-650С. ФП проявляли наибольшую стабильность при 500С, наименьшую – при 700С.
2. Состав мультиферментных комплексов рекомбинантных ферментных препаратов Эффективность процесса получения сахаров из ЦСМ в значительной степени зависит от состава мультиферментного комплекса и кинетического взаимодействия индивидуальных ферментов этого комплекса. Знания о количественном составе мультиферментных комплексов позволят найти объяснение результатам осахаривания определенных видов ЦСМ и оптимизировать состав целлюлазных и гемицеллюлазных мультиферментных композиций для достижения максимальной эффективности процесса осахаривания ЦСМ.
В нашей лаборатории была разработана хроматографическая схема эффективного и быстрого разделения ферментных препаратов на основе штаммов P.verruculosum. Схема включает три стадии:
обессоливание исходного препарата методом гельпроникающей хроматографии;
грубое фракционирование ферментного комплекса (ионообменная хроматографии на носителе Source 15Q), с последующим анализом специфических активностей собранных белковых фракций (на рис.6 в качестве примера представлена хроматограмма разделения ферментного препарата «тандем» Гл+ЭГII);
тонкую очистку, включающую дополнительное разделение (гидрофобная хроматография на носителе Source 15Iso) белковых фракций, полученных в ходе предыдущей стадии, с последующим анализом специфических активностей полученных фракций, а также проведением ДДС-электрофореза;
Рисунок 6. Хроматографический профиль препарата Гл+ЭГII при разделении на ионообменном носителе Source15Q при рН 6,8.
Зная содержания белка и удельную активность соответствующих ферментов во фракциях, определяли компонентный состав ФП. Результаты, характеризующие компонентный состав наиболее эффективных по нашей оценке рекомбинантных ферментных препаратов точки зрения осахаривания ЦСМ, а также контрольного ферментного препарата P.verruculosum В1-221-151, представлены в табл.6.
Таблица 5. рН- и температурные оптимумы активности ферментных препаратов, температурная стабильность ферментных препаратов.
Тандем Дуплет Триплет Тандем Дуплет Триплет Тандем Дуплет Триплет Гл- Гл Гл- Гл Название препарата Гл-ЦБГII_P.v- Гл+ЭГII ЦБГII_P.v- Гл+ЭГII ЦБГII_P.v Гл- ЦБГII_P.v. ЦБГII_P.v.
Гл+ЭГII ЭГII-1 ЭГII- ЦБГII_P.v ЭГII- Активность по субстрату Целлобиоза МКЦ КМЦ 4,5 5,0 5,0 5,5 5,5 4,5 5,0 4,5 5, рН-оптимум (рН50%) (3,5-6,0) (3,0-6,5) (3,5-6,0) (3,5-7) (4,0-6,0) (3,5-6,0) (4,0-6,5) (4,0-6,5) (3,0-6,5) 60 60 60 60 60 50 50 50 Т-оптимум (Т50%) (40-65) (35-65) (40-65) (40-65) (40-65) (45-57) (40-55) (40-55) (40-55) 140 180 120 180 180 180 180 180 50°С Время полуинактивации 6,1 6,8 5 100 180 180 80 55 60°С при рН 5,0, мин 2,7 2,9 2,6 5 30 25 4 2,5 4, 70°С Таблица 6. Компонентный состав наиболее эффективных с точки зрения осахаривания ЦСМ ферментных препаратов.
Содержание основных компонентов в препарате, % Фермент -Гл -Гл ный Целевые гены ЦБГ ЦБГ ЦБГ ЦБГ ЭГ Ксил препарат I 66 I 55 II 60 II 50 P.verruc A.niger ulosum Гл+ЭГII -Гл A.n., ЭГ II P. v. 20 ± 2 10 ± 1 7,0 ± 0,7 7,5 ± 0,7 10 ± 1 2,0 ± 0,1 30 ± 1 1,0 ± 0, «тандем» Гл ЦБГII_P.v. -Гл A.n., ЦБГ II P.v 35 ± 3 18 ± 2 11 ± 1 12 ± 1 13 ± 1 2,0 ± 0,1 8,0 ± 0,8 3,0 ± 0, «дуплет» Гл ЦБГII_P.v- -Гл A.n., ЦБГ II P.v 17 ± 1 35 ± 3 5,0 ± 0,5 6 ± 0,6 25 ± 3 1,0 ± 0,1 3,0 ± 0,3 2,0 ± 0, ЭГII-1 ЭГ II P. v.
«триплет» B1-221-151 Контроль 20± 2 15± 2 17± 2 17± 2 16± 2 4,0± 0,4 0 4,0± 0, Анализ данных о компонентном составе полученных ферментных препаратов позволили выдвинуть следующие предположения:
1. Наибольшей осахаривающей способностью по отношению к измельченной МКЦ будет обладать препарат Гл-ЦБГII_P.v. вследствие высокого содержания ЦБГI и ЦБГII, а также достаточного количества гетерологичной ГЛ 120 кДа A.niger.
2. При гидролизе измельченной и обессмоленной сосновой древесины лучшим окажется ферментный препарат Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1. Данный препарат содержит в своем составе большое количество слабо адсорбирующихся целлобиогидролаз без целлюлозосвязывающего домена (ЦСД) - ЦБГI 55 кДа и ЦБГII 50 кДа, а также обладает высокой целлобиазной активностью. Это позволит ему быстро эффективно осахаривать ЦСМ, содержащие как большое количество как целлюлозы, так и лигнина. Можно предположить, что присутствие ЦСД будет способствовать уменьшению непродуктивной адсорбции целлюлаз на лигнине.
3. Наиболее эффективным ферментным препаратом при гидролизе измельченной осины и багассы будет Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1. Как отмечалось ранее, данный вид ЦСМ отличается наличием большого количества аморфных участков целлюлозы, а также гемицеллюлоз, представленных ксиланами.
Высокое содержание эндоглюканаз, гидролизующие преимущественно аморфные участки целлюлозы, а также высокая ксиланазная активность, позволят ферментному препарату Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1 эффективно расщеплять эти участки, а так же увеличить доступность целлобиогидролаз к целлюлозным микрофибриллам за счет разрушения гемицеллюлозной матрицы.
3. Анализ осахаривающей способности новых ФП по отношению к различным видам ЦСМ.
На данном этапе работы было проведено исследование осахаривающей способности полученных новых ФП. В качестве субстратов использовали измельченные МКЦ, осиновую древесину и багассу, а также измельченную и обессмоленную сосновую древесину. Эффективность осахаривания зависит как от качественного и количественного состава ФП, так и от эффективности предобработки и состава предобработанных субстратов. Таким образом, результаты гидролиза различных предобработанных субстратов позволят понять, какой компонентный состав ФП наилучшим образом подходит для осахаривания конкретного вида ЦСМ.
Гидролиз проводили в течение 48 часов при 50С и различной дозировке ФП по белку (2, 5 и 10 мг белка на 1 г субстрата). Через 3, 24 и 48 часов из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию восстанавливающих сахаров (ВС) и глюкозы.
В качестве контрольных препаратов были использованы: препарат B1 221-151, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum, коммерческие ферментные препараты целлюлаз с низкой -глюкозидазной активностью – Ксибетен–Целл, Celluclast 1.5L и Spezyme CP и препараты целлюлаз, обладающие высокой -глюкозидазной активностью – Accellerase1000, CellicCtec 1 (данные по активностям контрольных препаратов представлены в табл.7).
Таблица 7. Удельная активности контрольных ферментных препаратов по отношению к различным субстратам (50°С, рН 5,0).
Название Содержание ферментного белка, мг/г КМЦ-аза Авицелаза Целлобиаза Ксиланаза препарата (*мг/мл) Контроль, препарат 900±36 14,9±0,6 0,60±0,03 0,73±0,03 15,0±0, P.verruculosum В1-221- Ксибетен-Целл 284±11 10,9±0,4 0,92±0,04 0,120±0,005 1,8±0, Spezyme CP* 118±5 27,7±1,1 2,02±0,08 0,25±0,01 7,5±0, Celluclast 1.5L* 184±7 17,5±0,7 1,29±0,05 0,080±0,003 2,9±0, Accellerase1000* 103±4 30,7±1,2 2,11±0,08 1,18±0,05 3,3±0, CellicCtec 1* 182±7 11,3±0,5 0,26±0,01 2,69±0,11 1,4±0, На рис.7 представлены результаты гидролиза – в данном случае приведены выходы глюкозы и ВС за 24 часа при дозировке ФП 5 мг/г субстрата. Наиболее эффективными с точки зрения осахаривания измельченной МКЦ оказались препараты Гл-ЦБГII_P.v. (содержащий гетерологичную ГЛ A.niger и гомологичную CBHII P.verruculosum) и Гл+ЭГII (содержащий гетерологичную ГЛ A.niger и гомологичную ЭГII P.verruculosum), обладающие наиболее высокой среди полученных рекомбинантных ФП удельной авицелазной активностью – 0,91 ед/мг и 0,66 ед/мг. Кроме того, значительные выходы глюкозы и большую степень конверсии целлюлозы обеспечивала высокая целлобиазная активность новых препаратов.
Лучшими при гидролизе измельченной обессмоленной сосновой древесины оказались препараты Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1 и Гл-ЦБГII_P.v. с повышенным содержанием рекомбинантных ферментов, приводя к образованию одинакового количества глюкозы (40 г/л) и ВС (42 г/л). Однако, в отличие от ферментного препарата Гл-ЦБГII_P.v, препарат Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1 достигает предельных значений выходов конечных продуктов уже через 24 часа.
Наиболее эффективным рекомбинантным ФП при гидролизе измельченной осиновой древесины оказался «триплет» Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1, обладающий повышенным содержанием соответствующих рекомбинантных ферментов, выходы глюкозы и ВС в обоих случаях составили 45 г/л. Отметим, что высокие выходы глюкозы и ВС показал ФП Гл-ЦБГII_P.v.
[Глюкоза], г/л А [ВС], г/л [Глюкоза], г/л Б [ВС], г/л л P L [Глюкоза], г/л В [ВС], г/л P [Глюкоза], г/л Г [ВС], г/л л P L c ел C te. C t 1 e -Ц ym lic se as ен el ra ez cl ет um C le lu Sp иб ce os el C Кс Ac l cu rru ve P.
Рисунок 7. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных природных целлюлозосодержащих материалов: А) имельченная МКЦ Б) измельченная и обессмоленная сосна;
В) измельченная осина;
Г) измельченная багасса. Условия:
50°С, рН 5, [S]= 100 г/л, [E]= 5 мг/г субстрата, перемешивание – 250 об/мин.
При гидролизе измельченной багассы наиболее эффективным оказался препарат Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1 с повышенным содержанием гетерологичной ГЛ A.niger и гомологичной ЭГII P.verruculosum.
В табл.7 представлены более подробные данные, характеризующие увеличение выхода ВС и глюкозы при гидролизе разных видов ЦСМ при использовании различных групп рекомбинантных ФП по сравнению с контрольным препаратом, полученным с помощью исходного штамма P.verruculosum В1-221-151.
Таблица 8. Выход ВС и глюкозы при гидролизе лучшими препаратами различных видов измельченных ЦСМ (100 г/л): [E]= 5 мг/г субстрата, 50С, рН 5,0.
Увеличение выхода по Выход сравнению с конечных Лучшие Время контрольным Субстрат продуктов, г/л препараты гидролиза, ч препаратом В1-221-151), % Глюкоза ВС Глюкоза ВС 3 14,9 15,0 124 Гл-ЦБГII_P.v. 24 45,5 46,4 117 48 49,8 50,6 105 МКЦ 3 15,5 16,7 133 Гл+ЭГII 24 35,3 35,8 69 48 39,3 40,2 62 3 18,7 23,2 124 Сосновая Гл-ЦБГII_P.v 24 38,3 40,1 50 древесина ЭГII- 48 39,5 42,0 32 3 16,9 18,4 87 Гл-ЦБГII_P.v. 24 32,2 32,5 16 48 40,0 42,1 23 Осиновая древесина 3 16,0 16,5 77 Гл-ЦБГII_P.v 24 39,2 40,7 41 ЭГII- 48 44,6 45,7 37 3 12,9 19,4 52 Гл-ЦБГII_P.v. 24 28,6 37,7 5 48 35,3 42,2 14 Багасса 3 12,7 19,4 49 Гл-ЦБГII_P.v 24 32,2 39,5 19 ЭГII- 48 38,3 46,1 24 Анализируя данные, представленные в табл.8, можно сделать следующее заключение:
• при гидролизе измельченной МКЦ и измельченной и обессмоленной сосновой древесины наиболее эффективными оказались препараты «дуплет» Гл-ЦБГII_P.v. (с увеличенным содержанием ГЛ A.niger) и препарат «триплет» Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII- (с увеличенным содержанием ГЛ A.niger и ЭГII P.verruculosum), соответственно.
• при гидролизе измельченных осиновой древесины и багассы наиболее эффективным был препарат Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1.
• реакционная способность различных видов ЦСМ уменьшается в ряду:
измельченная МКЦ измельченная осиновая древесина измельченная и обессмоленная сосновая древесина измельченная багасса.
ВЫВОДЫ 1. Впервые с помощью метода одновременной трансформации несколькими плазмидами, несущими индивидуальные гены гомологичных и гетерологичных целлюлаз, грибного штамма-реципиента Penicillum verruculosum, созданы новые рекомбинантные штаммы, обладающие способностью к повышенной продукции гетерологичной -глюкозидазы Aspergillus niger, а также штаммы с увеличенным уровнем продукции гомологичных эндо-1,4--глюканазы II и целлобиогидролазы II.
2. Анализ компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum Гл+ЭГII (с увеличенным содержанием ГЛ A.niger), Гл-ЦБГII_P.v и Гл-ЦБГII_P.v-ЭГII-1 (с увеличенным содержанием ГЛ A.niger и ЭГII P.verruculosum) показал, что содержание рекомбинантных ферментов в них составляет 2-30% от общего пула секретируемого белка, при этом в целом сохраняется состав целлюлолитического комплекса реципиентного штамма P.verruculosum.
3. Ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов P. verruculosum, значительно эффективнее гидролизуют различные виды предобработанных хвойной и лиственной древесины, а также багассы, обеспечивая увеличение выхода восстанавливающих сахаров и глюкозы на 19-50% по сравнению с коммерческими ферментными препаратами, полученными с использованием штаммов гриба рода Trichoderma, и препаратами, полученными на основе исходного штамма P.verruculosum.
4. Исследованы физико-химические и биохимические свойства ферментных препаратов, обладающих наибольшей осахаривающей способностью.
Установлено, что оптимумы действия ферментных препаратов располагаются в области рН 3,5-6,5 и при температурах от 50 до 600С, а также стабильны в температурном диапазоне 35-650С.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи в рецензируемых журналах:
1. Синицына О.А., Федорова Е.А., Правильников А.Г., Рожкова А.М, Скомаровский А.А., Матыс В.Ю., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства ксилоглюканаз Penicillium sp., Биохимия, 2010, т.75, вып.1, стр. 52-62.
2. О. Г. Короткова, А.М. Рожкова, В.Ю. Матыс, А.В. Кошелев, О.Н. Окунев, А.Г.
Правильников, Р.М. Андрианов, В.А. Немашкалов, Н.В. Цурикова, О.А.
Синицына, А.П. Синицын. Применение нового комплексного ферментного препарата при переработке целлюлозосодержащей биомассы. Хранение и переработка сельхозсырья, 2011, №7, вып.201, стр.44-47.
Тезисы докладов.
1. Sinitsyn A.P., Sinitsyna O.A., Zorov I.N., Fedorova E.A., Rozhkova A.M., Pravilnikov A.G., Bushina E.V., Kondrateva E.A., Satrutdinov A.D., Sereda A.S., Volkov P.V., Bekkarevich A.O., Koshelev A.V., Bubnova T.V., Matys V.Yu., Okunev O.N., Chulkin A.M., Vavilova E.A., Vinetsky Yu.P. Penicillium canescens as a perspective fungal host strain for production of commercial recombinant enzymes. Abstracts of International Conference «BIOCATALYSIS 2009: Fundamentals&Applications;», 19-24 June, Arkhangelsk, p.110.
2. Осипов Д.О., Рожкова А.М., Правильников А.Г., Зоров И.Н., Синицын А.П. Высокоэффективный комплекс гемицеллюлаз рекомбинантных штаммов микромицета Penicillium sp. для ферментативного гидролиза хвойной древесины.
Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO 2010», 12-15 Апреля, Москва, стр.140.
3. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Федорова Е.А., Семенова М.В., Саттрудинов А.Д., Короткова О.Г., Андрианов Р.М., Правильников А.Г., Волков П.В., Осипов Д.О., Бушина Е.В., Кондратьева Е.А., Гусаков А.В., Немашкалов В.А., Беккаревич А.О., Матыс В.Ю., Бубнова Т.В., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Комплекс ферментов для эффективного осахаривания лигноцеллюлозных материалов, Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO 2010», 12-15 Апреля, Москва, стр.162-163.
4. Правильников А.Г., Проскурина О.В., Синицын А. П., Получение оптимального гидролитического комплекса на основе целлюлаз Penicillium sp. и глюкозидазы Aspergillus japonicus для эффективного осахаривания лигноцеллюлозного сырья, VI Московский Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 21-25 марта г, Часть1, Секция 4, стр 366-367.
5. Короткова О.Г., Правильников А.Г., Немашкалов В.А., Рожкова А.М., Синицын А.П., Гидролитическая способность новых ферментных препаратов на основе гриба Penicillium verruculosum, VI Московский Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 21-25 марта г, Часть1, Секция 4, стр. 326-328.