Разработка и сравнительная характеристика систем экспрессного иммунохимического определения микотоксинов
На правах рукописи
Урусов Александр Евгеньевич РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ ЭКСПРЕССНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ специальность 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2012
Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук Научные руководители:
доктор химических наук, профессор Дзантиев Борис Борисович кандидат биологических наук Жердев Анатолий Виталиевич
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Ярополов Александр Иванович доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук
Защита состоится 29 марта 2012 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу:
119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.
Автореферат разослан « 28 » февраля 2012 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Микотоксины – низкомолекулярные вторич ные метаболиты плесневых грибов, которые обладают высокой токсичностью и при попадании в продукты питания и корма могут причинять значительный вред здоровью человека и сельскохозяйственных животных. Мониторинг со держания микотоксинов на всех стадиях производства, транспортировки и хранения является необходимой и сложной задачей. Традиционные физико химические методы анализа, хотя и обеспечивают высокую чувствительность, сопряжены с использованием дорогого стационарного оборудования и дли тельными процедурами пробоподготовки. В связи с этим крайне актуально создание иммунохимических методов определения микотоксинов, сочетаю щих экспрессность, низкую стоимость и простоту применения. Однако, так как допустимый уровень содержания этих соединений в пищевых продуктах край не низок, известные иммунохимические методы их определения не всегда удовлетворяют практическим требованиям.
В связи с этим данное исследование направлено на разработку новых подходов с использованием конъюгатов антител и наночастиц коллоидного золота для создания двух высокочувствительных и экспрессных систем опре деления микотоксинов – иммунохроматографического анализа и иммуносен сорного анализа на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса.
Несмотря на широкое применение конъюгатов антител с коллоидным зо лотом в аналитических целях, вопросы, связанные с влиянием состава конъю гатов и реакционной способности антител в них на характеристики иммуно аналитических систем, остаются малоизученными. Проведенное в работе исследование этих взаимосвязей позволяет направленно оптимизировать тест-системы с применением коллоидного золота и расширить возможности их использования для детектирования как микотоксинов, так и других биоло гически активных соединений.
Используемые сокращения: антиАТ – антивидовые антитела, АФВ1 – афлатоксин В1, БСА – бычий сывороточный альбумин, ИФА – иммуноферментный анализ, ИХА – иммунохроматографический анализ, КЗ – коллоидное золото, опт.ед. – оптическая единица, ОТА – охратоксин А, отн.ед. – относительная единица, ППР – поверхност ный плазмонный резонанс, ФБС – 50 мМ K-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М NaCl, ФБСТ – ФБС, содержащий 0,05% детергента Тритон Х-100, HEPES-В – 10 мM HEPES буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 M NaCl и 0,005% детергента Твин-20, OD – оптическая плотность, RU – резонансная единица.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействий нативных и иммобилизованных на коллоидном золоте анти тел с микотоксинами для разработки универсальных подходов, позволяющих снизить пределы обнаружения иммуноаналитических систем.
Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:
• изучить взаимосвязь между составом и свойствами конъюгатов антител с коллоидным золотом;
• разработать и охарактеризовать методы усиления сигнала в проточных аналитических системах;
• провести сравнительную оценку пределов обнаружения микотоксинов в различных форматах иммуноанализа;
• апробировать разработанные тест-системы для анализа растительных проб, содержащих микотоксины.
Научная новизна. Проведено изучение и сопоставление реакционной способности свободных и конъюгированных с коллоидным золотом антител.
Получены сравнительные характеристики пределов обнаружения имму носенсорного анализа при использовании свободных антител и разных спосо бов введения наночастиц коллоидного золота в качестве маркера иммунных комплексов.
Предложена схема усиления регистрируемого сигнала и снижения пре дела обнаружения в иммунохроматографическом анализе, основанная на ис пользовании конъюгата антивидовых антител с коллоидным золотом.
Практическая значимость работы. Достигнуто десятикратное снижение пределов обнаружения микотоксинов в иммунохроматографическом и имму носенсорном анализе благодаря применению немеченых специфических ан тител в сочетании с конъюгатом антивидовые антитела – коллоидное золото.
Показано, что данная комплектация тест-систем позволяет существенно уменьшить расход дорогостоящих специфических антител.
Разработаны методы высокочувствительного и экспрессного определения охратоксина А и афлатоксина В1 на основе иммунохроматографии и иммуно сенсорного анализа с регистрацией поверхностного плазмонного резонанса.
Связь работы с государственными программами. Работа поддержана ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы» и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих научных мероприятиях: V и VI международные конгрессы «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011), международная научная конференция по биоорганической химии, биотехно логии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения акаде мика Ю.А. Овчинникова (Москва – Пущино, 2009), конференция «Экотоксико логия–2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Тула – Пущино, 2009), IV международный симпозиум «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2009), междисциплинарный микологический форум (Москва, 2010), международная конференция «Mycotoxin reduction – Global solutions» (Кейптаун, ЮАР, 2011), VIII всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика–2011» (Архангельск, 2011), международная конференция «Strategies to reduce the impact of myco toxins in Latin America in a global context» (Мендоза, Аргентина, 2011).
Решением Ученого Совета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2009 г. соискатель удостоен стипендии имени чл.-корр. РАН В.Л. Кретовича.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных ра бот, в том числе 3 статьи в журналах, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 10 тезисов в материалах отечественных и международных конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введе ния, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, ре зультатов и их обсуждения (4 главы) и списка литературы (255 наименова ний). Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит рисунок и 14 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Моноклональные антитела против охратоксина А (ОТА) получены во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения, про тив афлатоксина В1 (АФВ1) – в ООО «Тест-Пущино» (Россия). Поликлональ ные антитела козы против иммуноглобулинов мыши (антивидовые антитела, антиАТ) производства «Arista Biologicals» (США). Меченные пероксидазной меткой поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши производ ства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Конъюга ты ОТА–БСА, АФВ1–пероксидаза, растительные экстракты с нулевым содер жанием микотоксинов получены в ООО «Тест-Пущино». Конъюгаты АФВ1– БСА и стрептавидин–полипероксидаза производства «Sigma–Aldrich» (США).
Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали мембраны производства «Advanced Microdevices» (Индия) и «Millipore» (США).
Проведение иммуноферментного анализа (ИФА). В лунках микроплан шета в 50 мМ K-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl (ФБС), иммобилизовали конъюгат микотоксин–белок. После отмывки вносили пробы – разведения ОТА, АФB1 в ФБСТ (ФБС, содержащем 0,05% детергента Три тон Х-100) или смеси растительных экстрактов с ФБСТ (с конечным 25%-ным содержанием метанола), а затем добавляли нативные или биотинилирован ные антитела против соответствующего микотоксина. После инкубации и от мывки в лунки вносили раствор конъюгата антивидовые антитела– пероксидаза или стрептавидин–полипероксидаза. По завершении инкубации микропланшет отмывали, вносили раствор субстрата (3,3',5,5' тетраметилбензидин + Н2О2) и проводили детекцию оптической плотности (OD450) с использованием микропланшетного фотометра Zenyth 3100 («Anthos Labtec Instruments», Австрия). Полученные зависимости OD450 от концентра ции микотоксина в пробе аппроксимировали четырехпараметрической сигмо идной функцией, используя программу «Origin» 7.5 («OriginLab», США).
Получение коллоидного золота (КЗ) проводили по методу Френса (Frens, 1973), для чего 0,01% водный раствор HAuCl4 нагревали до кипения, а затем при активном перемешивании добавляли цитрат натрия до концен трации 0,015%. Смесь кипятили в течение 15 мин, затем охлаждали и хранили при 4–6 °С.
Получение флоккуляционной кривой. Готовили ряд разведений анти тел с концентрациями в диапазоне от 880 до 0,44 мкг/мл. По 20 мкл этих рас творов добавляли в лунки микропланшета к 200 мкл раствора КЗ (OD520=1).
После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре в каждую лун ку вносили по 20 мкл 10%-ного раствора NaCl, через 10 мин измеряли OD и строили ее зависимость от концентрации антител.
Иммобилизация антител на КЗ. Раствор КЗ (OD520=1) доводили карбо натом калия до pH 8,5, после чего последовательно добавляли растворы ан тител и БСА в 10 мМ трис-буфере, pH 8,5. После инкубации в течение 15 мин проводили очистку полученного конъюгата от неадсорбировавшихся антител трехкратным центрифугированием при 15.000 g в течение 20 мин.
Определение количества антител, иммобилизованных на КЗ. Препа раты надосадочной жидкости, полученные после каждого осаждения конъюга тов (см. «Иммобилизация антител на КЗ»), и свободные антитела в известной концентрации вносили в лунки микропланшета с предварительно иммобили зованным конъюгатом микотоксин–белок. После инкубации и отмывки добав ляли антивидовые антитела, меченные пероксидазой. По оптической плотно сти продукта реакции связавшегося фермента строили градуировочную зави симость для свободных антител, проводили расчет для препаратов надоса дочной жидкости и, исходя из материального баланса, определяли количество антител, иммобилизованных на КЗ.
Иммуноанализ с использованием проточной сенсорной системы Biacore X («Biacore AB», Швеция). Конъюгат ОТА–БСА ковалентно иммоби лизовали на поверхности чипа СМ5, после чего для реализации трех схем иммуноанализа в ячейку вводили: 1) смесь ОТА и свободных специфических антител;
2) смесь ОТА и конъюгированных с КЗ специфических антител;
3) смесь ОТА и свободных специфических антител, а затем конъюгат антивидо вых антител с КЗ. Полученную зависимость сигнала прибора в резонансных единицах (RU) от концентрации ОТА аппроксимировали так же, как для ИФА.
Чип регенерировали обработкой 100 мМ глициновым буфером, pH 2,0.
Изготовление иммунохроматографических тест-полосок. На нитро целлюлозные рабочие мембраны («Advanced Microdevices», Индия;
«Millipore», США), с помощью диспенсера IsoFlow («Imagene Technology», США) наносили конъюгат микотоксина с белком (аналитическая зона) и анти видовые антитела (контрольная зона). Конъюгат специфические антитела–КЗ наносили на стеклянные мембраны («Millipore», США). Мембраны высушивали в течение суток при комнатной температуре и склеивали. Полученные из мембран с нанесенными иммунореагентами и впитывающих мембран по ликомпозитные листы нарезали на тест-полоски на резаке Index Cutter- («A-Point Technologies», США) и с добавлением силикагеля хранили при ком натной температуре в герметичных пакетах из ламинированной фольги.
Иммунохроматографический анализ (ИХА) проводили при комнатной температуре. Разведения ОТА или АФВ1 вносили в ФБСТ или в экстракты ку курузы, ореха и ячменя смесью метанол : вода (70% : 30%), разбавленные ФБС (с 0,1% Тритона Х-100) в два раза. В лунку микропланшета добавляли 200 мкл полученного раствора и погружали в нее тест-полоску в вертикальном положении. Через 10 мин тест-полоску извлекали, помещали на горизонталь ную поверхность и сканировали (через 5 мин) на сканере Lide 90 («Canon») с разрешением 600 dpi, не используя режимы контрастирования и цветокор рекции. Цифровую обработку изображений осуществляли с помощью про граммы TotalLab («Nonlinear Dynamics», Великобритания). Полученную зави симость интенсивности окрашивания в аналитической зоне тест-полоски от концентрации микотоксина аппроксимировали так же, как для ИФА.
Проведение ИХА по схеме с усилением регистрируемого сигнала.
Для анализа готовили тест-полоски с иммобилизованным конъюгатом АФВ1– белок в аналитической зоне, но не содержащие конъюгата коллоидного золота и мембраны для его нанесения. В лунке микропланшета смешивали (1:1) рас творы специфических антител и АФВ1 в ФБСТ, погружали в нее тест-полоску в вертикальном положении и инкубировали в течение 5 мин. После этого про водили отмывку, пропуская вдоль тест-полоски рабочий буфер (ФБС с добав лением 0,25% Тритона Х-100), а затем на 15 мин погружали тест-полоску в рас твор конъюгата антиАТ–КЗ. Проводили повторную отмывку рабочим буфером и сканирование тест-полоски. Обработку результатов анализа выполняли, как описано выше (см. «Иммунохроматографический анализ (ИХА)»).
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проведение ИФА в равновесном и кинетическом режимах Для тестирования иммунохимических свойств исходных реагентов и по лучения референсных значений пределов обнаружения был использован ме тод микропланшетного ИФА. Было проанализировано 20 клонов антител про тив охратоксина А и афлатоксина В1 и отобраны препараты, дающие мини мальные пределы обнаружения.
Установленные характеристики ИФА (см. табл. 1) получены в равновес ном режиме, требующем инкубации иммунореагентов в течение не менее чем 60 мин на каждой стадии и общей продолжительности анализа 2,5 часа. Изу чение кинетики гетерогенных иммунохимических реакций, применение биоти на с мостиковым участком из 14 атомов углерода и конъюгата стрептавидин– полипероксидаза дало возможность сократить продолжительности стадий до 5–10 мин, что позволило реализовать кинетический ИФА АФВ1 и ОТА без ухудшения чувствительности и точности определения (среднеквадратичное отклонение детектируемых концентраций 6–7%).
Так как микотоксины должны контролироваться в экстрактах с высоким содержанием органических растворителей, то данный метод был апробиро ван в присутствии растительных экстрактов с содержанием метанола 25%.
Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Аналитические характеристики иммуноферментного определения микотоксинов в равновесном и кинетическом режимах Микотоксин Равновесный ИФА Кинетический ИФА, 25% метанола Время опре- Предел обна- Время опре- Предел обна деления, мин ружения, нг/мл деления, мин ружения, нг/мл АФВ1 150 0,05 27 0, ОТА 150 4,0 25 1, Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения данных схем анализа для определения микотоксинов и о пригодности антител для дальнейшего использования при решении поставленных в работе задач.
Исследование иммунохимических взаимодействий с использовани ем оптического сенсора Biacore X Среди биосенсорных систем особое место занимают устройства, осно ванные на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Иммоби лизованный иммунореагент, взаимодействующий с перемещающимися в по токе соединениями, определяет сходство данных биосенсоров с иммунохро матографическими тест-полосками и делает их удобными инструментами для изучения иммунохимических взаимодействий.
Для реализации иммуноанализа в ячейке биосенсорной системы Biacore Х на поверхности чипа был иммобилизован конъюгат ОТА–БСА. Полученный при этом сигнал составил 15.000 резонансных единиц (RU), что соответствует связыванию 15 нг конъюгата на 1 мм2 поверхности чипа и свидетельствует об эффективной иммобилизации конъюгата. Были измерены равновесные константы диссоциации для 10 клонов антител против ОТА, составившие от 1,110-7 до 6,210-8 М. Кинетические константы диссоциации варьировали от 1,310-4 до 6,110-5 с-1.
В оптимальных условиях, установленных с учетом этих данных, было реализовано конкурентное взаимодействие антител со свободным ОТА. По лучена зависимость отклика оптического детектора (в единицах RU) от кон центрации ОТА (рис. 1).
RU 1 10 ОТА, нг/мл Рис. 1. Градуировочная кривая иммунохимического определения охратоксина А с использованием системы Biacore X. Здесь и далее пунктирной линией по казан уровень сигнала при отсутствии антигена в пробе Предел обнаружения ОТА составил 0,4 нг/мл, что существенно ниже это го параметра как для равновесного, так и для кинетического ИФА (4 и 1 нг/мл соответственно, см. табл. 1) с теми же реагентами. В рабочем диапазоне ана лиза (1–15 нг/мл) среднеквадратичное отклонение амплитуды сигнала не пре вышало 7%. Продолжительность одного измерения, включая регенерацию, – 12 мин.
Синтез конъюгатов специфических антител с коллоидным золотом Золотые наночастицы были получены методом Френса и охарактеризо ваны с использованием просвечивающей электронной микроскопии. Средний диаметр частиц (n=182) составил 27±5 нм, среднее соотношение осей – 1,2±0,2, т.е. форма частиц близка к сферической. С использованием этого препарата КЗ был синтезирован ряд конъюгатов с антителами против охра токсина А и афлатоксина В1, отличавшихся соотношением КЗ–антитело.
Был проведен расчет количества антител, необходимого для формиро вания монослоя на поверхности золотой частицы. Площадь частицы диамет ром 27 нм составляет около 2300 нм2. Площадь, занимаемая одним антите лом, в зависимости от конформации и ориентации при сорбции, – от до 120 нм2. Эти данные близки к значениям, измеренным для пленок Ленгмю ра-Блоджета, – 80 нм2 (Dubrovsky et al., 1993). Таким образом, для образова ния монослоя необходимо иммобилизовать от 20 до 50 молекул антител на одной частице КЗ, что соответствует 1.1–2.8 мкг иммуноглобулинов на 1 мл суспензии КЗ (OD520=1).
Характеристика состава и свойств конъюгатов антитела – КЗ Традиционно процесс иммобилизации антител на КЗ характеризуют флоккуляционной кривой, в которой наблюдаемая в присутствии избытка соли агрегация должна отражать наличие поверхности частиц КЗ, не защищенной иммобилизованным белком (Horisberger et al., 1975;
Hermanson, 2008). Прове денные эксперименты показали, что для антител против АФВ1 и ОТА выход флоккуляционных кривых на плато происходит при более высоком содержа нии антител по сравнению с данными расчетов в предыдущем разделе – 7–8 мкг на 1 мл суспензии КЗ (рис. 2).
Оставаясь в рамках интерпретации флоккуляционной кривой как харак теристики, отражающей формирование защитного монослоя антител на по верхности коллоидной частицы, в качестве причины полученного результата можно предложить существенно более низкую степень связывания антител с КЗ (вследствие невысокой константы реакции, определяющей обратимость этого процесса).
0, 0, 0, 0,25 0, OD 0, 0,10 0, 0, 0 4 8 12 16 20 Антитела, мкг/мл Рис. 2. Флоккуляционные кривые, полученные при взаимодействии с КЗ анти тел против ОТА (1) и АФВ1 (2) Для проверки этого предположения была осуществлена эксперименталь ная оценка количества иммобилизовавшихся на КЗ молекул иммуноглобули нов. Данную величину определяли, исходя из содержания несвязавшихся с коллоидом антител, отделяемых от конъюгата при центрифугировании и ко личественно измеряемых методом ИФА.
20 Сорбировано, молекул 15 Сорбировано, мкг Сорбировано, % 85 5 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 Антитела на 1 мл КЗ, мкг Антитела на 1 мл КЗ, мкг А Б Рис. 3. Зависимость процента (А) и количества (Б) сорбировавшихся на КЗ антител от общего количества антител против АФВ1, использованных при синтезе Установлено, что антитела против АФВ1, добавленные в количестве до 10 мкг на 1 мл коллоидной суспензии, сорбируются на КЗ практически пол ностью (доля несвязавшихся антител – менее 10%). При внесении бльших концентраций антител процент их связывания падает, однако вплоть до соот ношения 23 мкг антител на 1 мл коллоидной суспензии количество связав шихся антител продолжает расти, не достигая насыщения. Зависимость сте пени связывания от количества добавленных антител против АФВ1 представ лена на рис. 3. Аналогичные измерения для антител против ОТА показали снижение степени связывания в интервале от 3 мкг до 11 мкг и отсутствие на сыщения вплоть до 80 мкг антител на 1 мл КЗ.
Итак, формирование монослоя антител на поверхности частиц КЗ проис ходит при более низких концентрациях (до 3 мкг/мл), чем могло бы ожидаться, исходя из флоккуляционных кривых (7–8 мкг/мл, см. рис. 2). Использование же бльших количеств антител при синтезе конъюгатов с КЗ должно приводить к формированию полислойных структур сорбированных белковых молекул.
С учетом этого представляется оправданной сравнительная оценка исполь зуемых в иммуноанализе конъюгатов антитело–КЗ по реакционной способно сти и определение взаимосвязи этой характеристики с составом конъюгата.
Характеристика иммунохимических свойств конъюгатов антитело– КЗ, основанная на определении эквивалентного количества свободных антител В качестве меры реакционной способности конъюгата мы рассматривали количество свободных антител, проявляющих те же связывающие свойства при взаимодействии со свободным антигеном, что и конъюгат.
Для экспериментального сравнения свободных антител и конъюгата ан титело–КЗ была разработана схема «двойного конкурентного взаимодейст вия» (рис. 4). В лунки микропланшета с иммобилизованными специфическими антителами вносили раствор микотоксина (АФВ1) и добавляли либо иссле дуемый конъюгат коллоидного золота, либо свободные антитела (см. рис. 4, Б). Микотоксин связывается с антителами, иммобилизованными на полисти роле и находящимися в растворе, в пропорции, отражающей реакционную способность конъюгата или свободных антител. Увеличение содержания ан тител в растворе или рост их реакционной способности приводит к меньшему связыванию микотоксина на поверхности лунок микропланшета, и наоборот.
После данной инкубации микропланшет отмывали от несвязавшихся компо нентов, вносили в лунки конъюгат микотоксина с ферментной меткой (перок сидазой) (см. рис. 4, В) и, после инкубации и отмывки, по оптической плотно сти продукта каталитической реакции связавшегося фермента регистрирова ли количество образовавшихся меченых иммунных комплексов (см. рис. 4, Г).
Рис. 4. Схема оценки реакционной способности антител, находящихся на по верхности золотой частицы (А–Г – стадии проведения тестирования;
1 – спе цифические антитела, 2 – поверхность микропланшета, 3 – антиген, 4 – КЗ, 5 – ферментная метка) Сравнение полученных концентрационных зависимостей для свободных антител и конъюгатов антитело–КЗ позволило охарактеризовать конъюгаты разного состава эквивалентным количеством свободных антител, обладаю щим такой же реакционной способностью. Полученные значения были сопос тавлены с общим количеством иммуноглобулинов в составе конъюгата. Ре зультаты этих расчетов представлены на рис. 5.
Антитела на 1 мл КЗ, молекул Антитела на 1 мл КЗ, молекул Реакционноспособных антител 80 160 80 160 240 на 1 частицу КЗ, молекул % 5 10 5 10 Антитела на 1 мл КЗ, мкг Антитела на 1 мл КЗ, мкг А Б Рис. 5. Характеристика реакционной способности антител на поверхности частицы КЗ (А – эквивалентные реакционноспособные антитела как процент от числа иммобилизованных антител, Б – количество эквивалентных реакци онноспособных антител на одну частицу КЗ) Следует учитывать, что более низкая реакционная способность иммоби лизованных на КЗ антител по сравнению со свободными антителами может в существенной степени быть связана с диффузионными ограничениями при взаимодействии с антигеном на поверхности КЗ. Поэтому наблюдаемое отли чие лишь частично может быть нивелировано за счет режимов иммобилиза ции, уменьшающих конформационные перестройки или обеспечивающих на правленное ориентирование антител.
Рис. 5 отражает отличия процессов иммобилизации антител против АФВ на КЗ при разных соотношениях реагентов. Если для синтеза используется менее 6 мкг антител на 1 мл КЗ, сорбция происходит почти полностью (более 98%, см. рис. 3), но реакционная способность полученного конъюгата низкая.
Отметим, что для препарата, полученного при соотношении 6 мкг антител на 1 мл КЗ, исходя из расчетных данных, первый слой сорбируемых на КЗ ан тител заполнен. При использовании более 6 мкг антител на 1 мл КЗ происхо дит спад степени связывания и в то же время резкий рост реакционной спо собности конъюгата, достигающей максимума при 10–12 мкг иммуноглобули нов, вносимых при синтезе на 1 мл КЗ. Антитела, вносимые в еще бльших количествах, продолжают сорбироваться на КЗ, но это не приводит к получе нию конъюгата с большей реакционной способностью (рис. 5, Б).
Сравнение конъюгатов антител с КЗ в иммунохроматографическом анализе Хотя с увеличением количества антител в комплексе с КЗ возрастает ре акционная способность конъюгата, при проведении конкурентного иммуно анализа (необходимого для детектирования микотоксинов и других низкомо лекулярных антигенов) состав конъюгатов с высокой реакционной способно стью не позволяет обеспечить минимальный предел обнаружения антигена.
Это связано с тем, что при большем содержании антител в конъюгате требу ется большее количество антигена, чтобы обеспечить ингибирование связы вания конъюгата в аналитической зоне.
Для выбора конъюгата антитело–КЗ с оптимальными аналитическими ха рактеристиками были экспериментально сопоставлены препараты с разным содержанием антител против АФВ1 (рис. 6).
Для конъюгатов с наибольшим содержанием антител (15 и 23 мкг на 1 мл КЗ при синтезе) предел обнаружения достигает максимума, а интенсивность окрашивания полосы в аналитической зоне начинает снижаться. С другой стороны, минимальное количество антител (4,5 мкг на 1 мл КЗ при синтезе) позволяет уменьшить предел обнаружения до 0,1 нг/мл АФВ1, но из-за резко го снижения интенсивности окрашивания визуальная детекция становится малодостоверной.
Оптимальным по интенсивности окрашивания и величине предела обна ружения АФВ1 (0,3 нг/мл) является конъюгат, полученный при иммобилизации 7 мкг антител на 1 мл суспензии КЗ.
4,5 4, Антитела, мкг/мл Антитела, мкг/мл 7 10 15 23 10 20 30 40 50 0,1 1 I, отн. ед. Предел обнаружения АФВ1, нг/мл А Б Рис. 6. Интенсивность окрашивания в аналитической зоне (А) и визуальный предел обнаружения (Б) при использовании конъюгатов антитело–КЗ разного состава в иммунохроматографическом определении АФВ1. По оси ординат указано количество антител на 1 мл суспензии КЗ при синтезе. (Здесь и далее I – интенсивность окрашивания аналитической зоны) Разработка иммунохроматографической тест-системы Важнейшим компонентом иммунохроматографической тест-системы яв ляется рабочая мембрана, на которой в ходе анализа происходит формиро вание детектируемых иммунных комплексов. В работе сопоставлены 11 видов нитроцеллюлозных мембран, отличающихся по скорости продольного движе ния жидкости и сорбционной способности. На рис. 7 представлены результаты сравнения этих мембран для детектирования афлатоксина В1.
В качестве оптимальной выбрана мембрана MDI CNPC 15, характери зующаяся максимальной интенсивностью образующихся полос, низким пре делом обнаружения и отсутствием фонового окрашивания тест-полоски вне зон специфического связывания конъюгата.
MDI CNPC MDI CNPC MDI CNPC12 MDI CNPC MDI CNPC15 MDI CNPC MDI CNPF5 MDI CNPF MDI CNPF8 MDI CNPF MDI CNPF10 MDI CNPF MDI CNPH90 MDI CNPH MDI CNPH200 MDI CNPH Millipore HF75 Millipore HF Millipore HF135 Millipore HF Millipore HF240 Millipore HF 0 10 20 30 0,1 1 I, отн. ед. Предел обнаружения АФВ1, нг/мл А Б Рис. 7. Влияние рабочей мембраны на характеристики иммунохроматографи ческого определения АФВ Аналогичные сравнительные исследования проведены для иммунохро матографического определения ОТА. В этом случае выбрана мембрана Milli pore HF 240.
Изучено также влияние остальных компонентов мультимембранного ком позита на характеристики анализа. Установлено, что наиболее существенный вклад в степень связывания конъюгата и величину предела обнаружения вно сит природа впитывающей мембраны, непосредственно контактирующей с тестируемой пробой. Для определения афлатоксина В1 показана оптималь ность использования мембраны Millipore G041, а для охратоксина А – мем браны MDI GFB-R7.
На рис. 8 представлены результаты определения афлатоксина В1 в бу ферном растворе (ФБСТ) с использованием тест-полосок в предложенной оп тимальной комплектации. Предел обнаружения составил 2 нг/мл при визуаль ной детекции (появление окрашивания в аналитической зоне) и 0,08 нг/мл при приборной регистрации (достоверное уменьшение интенсивности окрашива ния по сравнению с пробой, не содержащей АФВ1). Для тест-системы на ОТА данные величины равнялись 100 и 1 нг/мл, соответственно.
Поскольку максимально допустимое содержание в разных видах продук тов питания, кормов и сырья составляет для АФВ1 от 0,15 до 5 нг/мг, а для ОТА – от 0,5 до 10 нг/мг, достигнутые величины пределов обнаружения свидетельствуют о пригодности тест-систем для контроля превышения пре дельных уровней контаминации данными микотоксинами.
5 2, I, отн. ед АФВ1, нг/мл 1, 0, 0, 0, 0, 0,04 0.1 1 АФВ1, нг/мл Б А Рис. 8. Вид аналитических зон тест-полосок для иммунохроматографического определения АФВ1 (А) и градуировочная кривая, полученная в результате ви деоцифровой обработки (Б) Однако матрикс проб может оказать существенное влияние на аналити ческие характеристики тест-систем. Поэтому на следующем этапе работ была проведена характеристика возможности тестирования растительных экстрак тов с использованием разработанных тест-систем.
Апробация иммунохроматографических тест-систем для определе ния микотоксинов в растительных экстрактах Так как микотоксины чаще всего контаминируют твердые растительные продукты, то для их детекции необходима экстракция контролируемого соеди нения. С учетом особенностей растворимости микотоксинов для этой цели в большинстве случаев используется смесь вода : метанол (Trucksess et al., 2002), из чего следует необходимость подтвердить работоспособность имму ноаналитических систем в таких смесях. Было охарактеризовано определение с помощью полученных тест-полосок микотоксинов в смесях вода : метанол разного состава. В качестве оптимальной выбрана смесь, в которой присутст вие 35% (по объему) метанола не оказывало влияния на результаты анализа и при этом не требовало значительного разбавления пробы.
С учетом условий экстракции микотоксинов предложены методики при менения иммунохроматографических тест-полосок для анализа экстрактов различных сельскохозяйственных культур. На рис. 9, 10 представлены ре зультаты, полученные для ОТА и АФВ1, соответственно.
250 I, отн. ед.
ОТА, нг/мл 8 0 1 10 100 ак ОТА, нг/мл А Б Рис. 9. Вид иммунохроматографических тест-полосок при анализе экстрактов кукурузы с разной концентрацией ОТА (А) и концентрационная зависимость интенсивности окрашивания, полученная в результате видеоцифровой обра ботки (Б). а – аналитическая зона, к – контрольная зона I, отн. ед 0,1 1 АФB1, нг/мл Рис. 10. Градуировочные кривые иммунохроматографического определения афлатоксина B1 в растительных экстрактах (1 – ячмень, 2 – орехи) Нижняя граница концентраций ОТА, выявляемых в экстрактах кукурузы по исчезновению окраски в аналитической зоне (рис. 9, А), составляет нг/мл, в то время как при видеоцифровой регистрации предел обнаружения, определяемый по снижению интенсивности окрашивания на достоверную ве личину по отношению к окрашиванию в отсутствии микотоксина (рис. 9, Б), ра вен 2 нг/мл. Время анализа – 10 мин.
При определении афлатоксина В1 в экстрактах ячменя и орехов предел обнаружения составил 10 нг/мл при визуальном определении и 0,2 нг/мл при приборной регистрации. Время анализа – 10 мин.
Согласно установленным в РФ нормативам предельно допустимое со держание АФВ1 в продуктах питания составляет 5 мкг/кг (за исключением детского питания). Разработанная тест-система обеспечивает данный предел обнаружения при приборной регистрации сигнала (1,2 мкг/кг с учетом разбав ления пробы во время анализа). Она может быть использована для предвари тельного скрининга большого количества образцов без дополнительной тру доемкой пробоподготовки, которая необходима при проведении жидкостной хроматографии, широко применяемой сегодня для анализа микотоксинов.
Усиление сигнала коллоидным золотом в иммуносенсорном анализе Для оптимизации условий проведения иммуноанализа в работе предло жено использовать на стадии конкурентного взаимодействия немеченые спе цифические антитела, а высокочувствительное выявление образовавшихся иммунных комплексов проводить с применением конъюгатов антивидовых ан тител с коллоидным золотом. Эффективность данного подхода показана как для иммуносенсорного, так и для иммунохроматографического анализа.
В проточной системе иммуносенсорного анализа ОТА с регистрацией ППР были сопоставлены значения, полученные ранее при использовании свобод ных специфических антител (см. раздел «Исследование иммунохимических взаимодействий с использованием оптического сенсора Biacore Х»), и результаты применения двух схем усиления сигнала с использованием конъ югатов специфических (рис. 11, А) и антивидовых (рис. 11, Б–В) антител с КЗ.
При изучении закономерностей первой схемы усиления было необходимо определить оптимальный конъюгат специфических антител с КЗ, для чего че рез ячейку сенсора Biacore Х с иммобилизованным конъюгатом ОТА–БСА пропускали растворы конъюгатов специфические антитела – КЗ разного со става, стандартизированные по концентрации КЗ (А520 = 0,25). На рис. представлены полученные значения отклика сенсора на введение свободных иммуноглобулинов (кривая 1) и их конъюгатов (кривая 2).
Рис. 11. Схемы проведения конкурентного иммуносенсорного анализа. ОТА:
A – анализ с усилением конъюгатом КЗ – специфические антитела, Б – анализ без усиления, Б–В – анализ с усилением конъюгатом антиАТ–КЗ. 1 – БСА, 2 – OTA, 3 – специфические антитела, 4 – частица КЗ, 5 – антивидовые антитела 4, 3, Усиление сигнала 3, RU 2, 2, 1, 0 1, 100 1000 Антитела, нг/мл Рис. 12. Зависимость сигнала ППР сенсора от количества внесенных свобод ных антител (1), от количества антител, конъюгированных с КЗ (2), и степень усиления – отношение сигналов для кривых 1 и 2 (3) Как видно из вычисленного отношения сенсорных сигналов (см. рис. 12, кривая 3), во всех случаях использование конъюгата коллоидного золота вы зывает рост сигнала. Учитывая, что связывание с одной коллоидной частицей большого числа антител существенно снижает их реакционную способность по сравнению со свободными антителами, следует рассматривать данный эффект прежде всего как проявление плазмонных свойств коллоидного золо та. Максимальное усиление сигнала для коллоидного конъюгата по отноше нию к свободным антителам составляет около 3 и наблюдается при концен трациях антител 0,7–1 мкг/мл.
Конъюгаты также были охарактеризованы в конкурентной схеме имму ноанализа. Несмотря на рост амплитуды сигнала, пределы обнаружения ОТА составили от 30 до 100 нг/мл, что на 2 порядка хуже по сравнению с форма том анализа, основанным на использовании свободных антител (0,4 нг/мл – см. рис. 1). Этот факт подтверждает изложенную выше интерпретацию недос татков конъюгатов КЗ с большим числом антител при проведении конкурент ного иммуноанализа. Значительное число антител на поверхности КЗ доступ но для связывания свободного антигена – как до, так и после образования комплекса с иммобилизованным антигеном. Соответственно для ингибирова ния связывания конъюгата с поверхностью чипа необходимы бльшие коли чества антигена, чем при использовании нативных антител.
Использование конъюгата антиАТ–КЗ (см. рис. 11, Б–В) позволило повы сить сигнал сенсора в 10 раз;
полученный коэффициент усиления близок к аналогичному показателю в других работах (Pieper-Furst et al., 2004;
Mitchell et al., 2009). Это дало возможность снизить концентрацию свободных специ фических антител с 200 до 3 нг/мл. Предел обнаружения ОТА при таких усло виях – 40 пг/мл (рис. 13), что в 10 раз лучше, чем при регистрации взаимодей ствия с немечеными антителами (см. рис. 1). При этом время анализа увели чивается на 15 мин и составляет (вместе со стадией регенерации чипа) 25 мин.
Достигнутый предел обнаружения значительно ниже предельно допусти мых концентраций ОТА в пищевой продукции и кормах, установленных зако нодательными нормами РФ (0,5–10 мкг/кг), что обуславливает практический интерес к данному подходу.
RU 0.01 0.1 1 10 ОТА, нг/мл Рис. 13. Градуировочная кривая иммуносенсорного определения ОТА с ис пользованием усиления сигнала конъюгатом антиАТ–КЗ Иммунохроматографический анализ с разделением стадий специ фического взаимодействия и введения коллоидного маркера Разделение стадий конкурентного взаимодействия и выявления комплек сов с использованием конъюгата антивидовые антитела – КЗ было реализо вано также в иммунохроматографическом анализе. В данном формате анали за тестируемая проба инкубируется 2 мин с раствором свободных специфи ческих антител. Затем в реакционную смесь погружается тест-полоска. После короткой инкубации (5 мин) фронт жидкости доходит до аналитической зоны, где несвязавшиеся антитела, количество которых зависит от количества анти гена в пробе, взаимодействуют с иммобилизованным микотоксином. Затем через тест-полоску пропускают раствор конъюгата КЗ с антивидовыми анти телами, который связывается со специфическими антителами в аналитиче ской зоне, давая окрашенную полосу. Если в пробе присутствует антиген в концентрации выше пороговой, он на первой стадии связывается со специ фическими антителами, не давая им возможности образовать комплекс с им мобилизованным антигеном и исключая образование окрашенной полосы при взаимодействии с мечеными антивидовыми антителами.
В качестве рабочей выбрана мембрана Millipore HF135, которая при вне сении дополнительных детергентов и стабилизаторов обеспечивает высокую скорость и четкую локализацию окрашенного маркера в аналитической зоне.
Рис. 14. Схема конкурентного иммунохроматографического анализа с непря мым мечением специфических антител (1 – БСА, 2 – микотоксин, 3 – специ фические антитела, 4 – коллоидное золото, 5 – антивидовые антитела, 6 – рабочая мембрана, 7 – впитывающая мембрана) После оптимизации условий описанная схема была реализована для оп ределения афлатоксина В1. Изображения тест-полосок для разных концен траций АФВ1 и результаты обработки данных представлены на рис. 15.
310 155 78 АФВ1, пг/мл I, отн. ед.
39 20 10 5 2,5 10 0 АФВ1, нг/мл А Б Рис. 15. Внешний вид аналитических зон тест-полосок для иммунохромато графического определения АФВ1 с использованием конъюгата антивидовых антител с КЗ (А) и градуировочная кривая, полученная в результате видео цифровой обработки (Б) При визуальном детектировании исчезновение окрашивания полосы в аналитической зоне вызывают концентрации АФВ1 начиная со 100 пг/мл, а приборная регистрация характеризуется пределом обнаружения 30 пг/мл.
По сравнению с традиционной схемой иммунохроматографического анализа (см. рис. 8) введение коллоидного золота в конъюгате с антивидовыми анти телами позволяет снизить предел обнаружения в 10 раз.
Другим преимуществом данного подхода является сокращение расхода специфических антител, существенно более дорогих, чем антивидовые анти тела. Предлагаемый формат анализа дает возможность снизить их количест во, необходимое для проведения одного анализа, в 50 раз (с 100 до 2 нг).
Кроме того, в отличие от меченых специфических антител, конъюгат коллоид ного золота с антивидовыми антителами является универсальным реагентом, который может быть применен в данной схеме анализа для иммунодетекции различных соединений.
ВЫВОДЫ 1. Предложен метод характеристики иммунохимических свойств конъюга тов антитела – коллоидное золото, основанный на определении эквивалент ного количества свободных антител. Установлен характер зависимости реак ционной способности синтезируемых конъюгатов от количества специфиче ских иммуноглобулинов.
2. Разработан высокочувствительный метод определения микотоксинов в иммуносенсорной системе с оптической регистрацией поверхностного плаз монного резонанса с использованием конъюгатов антивидовые антитела – коллоидное золото. Показано существенное усиление сигнала и снижение предела обнаружения до 40 пг/мл по сравнению с регистрацией взаимодейст вия с немечеными специфическими антителами.
3. Определены условия проведения иммунохроматографического анализа для контроля содержания микотоксинов в пробах с высоким содержанием ор ганического растворителя (до 35% метанола). Пределы обнаружения в расти тельных экстрактах при визуальной детекции результатов составляют нг/мл для афлатоксина В1 и 50 нг/мл для охратоксина А, а при видеоцифро вой регистрации – 0,2 и 2 нг/мл, соответственно.
4. Предложен новый метод иммунохроматографического анализа, осно ванный на разделении стадий специфического взаимодействия и введения коллоидного маркера. Предел обнаружения афлатоксина В1 данным методом составляет 100 пг/мл, что в 10 раз ниже по сравнению с традиционным фор матом анализа.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:
1. Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохимические методы анализа микотоксинов (обзор). – Прикладная биохимия и микробиология.
2010, т. 46, № 3, сс. 276–290.
2. Urusov A.E., Kostenko S.N., Sveshnikov P.G., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Ochratoxin A immunoassay with surface plasmon resonance registration: Lo wering limit of detection by the use of colloidal gold immunoconjugates. – Sensors and Actuators. B: Chemical. 2011, v. 156, № 1, pp. 343–349.
3. Урусов А.Е., Костенко С.Н., Свешников П.Г., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Определение охратоксина А иммунохроматографическим методом. – Журнал аналитической химии. 2011, т. 66, № 8, сс. 884–890.
Материалы конференций:
4. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Бызова Н.А., Урусов А.Е. Экспрессные иммунотесты для контроля токсичных контаминант в воде и продуктах пита ния. – Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология:
Состояние и перспективы развития». 16–20 марта 2009 г., Москва, ч. 2, с. 21.
5. Бызова Н.А., Жердев А.В., Урусов А.Е., Зверева Е.А., Дзантиев Б.Б.
Иммунохроматографические системы для экспрессной детекции биологически активных соединений. – Международная научная конференция по биооргани ческой химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября – 1 октября 2009 г., Москва – Пущино. Сборник тезисов, т. 1, с. 152.
6. Костенко С.Н., Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохими ческие экспресс-методы определения охратоксина А. – Всероссийская конфе ренция «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии». 26–30 октября 2009 г., Пущино – Тула. Сборник статей, сс. 93–96.
7. Dzantiev B., Byzova N., Urusov A., Zherdev A. Express immunochroma tographic assays for the control of toxic contaminants in foodstuffs. – 4th Interna tional Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA–2009). November 4–6, 2009, Prague, Czech Republic. Book of Abstracts, p. 438.
8. Урусов А.Е., Костенко С.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохро матографическое определение охратоксина А. – Тезисы Междисциплинарного микологического форума. 14–15 апреля 2010 г., Москва. – В журн. Иммунопа тология, аллергология, инфектология. 2010, № 1, с. 211.
9. Урусов А.Е., Костенко С.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Экспресс метод определения охратоксина А с использованием оптического сенсора Biacore. – Тезисы Междисциплинарного микологического форума. 14–15 ап реля 2010 г., Москва. – В журн. Иммунопатология, аллергология, инфектоло гия. 2010, № 1, сс. 211–212.
10. Урусов А.Е., Жердев Б.Б., Возняк М.В., Гришаева А.О., Дзантиев Б.Б.
Разработка систем быстрого иммунохимического определения микотоксинов.
– Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: со стояние и перспективы развития». 21–25 марта 2011 г., Москва, ч. 2, с. 114.
11. Urusov A.E., Kostenko S.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Application of surface plasmon resonance immunosensor and gold nanoparticles enhancement for detection of ochratoxin A. – Abstracts of the Conference «Mycotoxin reduction – Global solutions». April 4–6, 2011, Cape Town, South Africa, pp. 72–73.
12. Бызова Н.А., Урусов А.Е., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б.
Иммунохроматография – экспрессный метод детекции низкомолекулярных за грязнителей окружающей среды. Тезисы докладов VIII Всероссийской конфе ренции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика–2011». июня – 2 июля 2011 г., Архангельск, с. 86.
13. Dzantiev B.B., Urusov A.E., Voznyak V.M., Zherdev A.V. Approaches for lowering the limit of detection for rapid immunoassays of mycotoxins. – Abstracts of the Conference «Strategies to reduce the impact of mycotoxins in Latin America in a global context». November 15–18, 2011, Mendoza, Argentina, p. 98.