Молекулярно-генетические подходы к получению ферментных препаратов карбогидраз с улучшенными гидролитическими свойствами
На правах рукописи
ВОЛКОВ ПАВЕЛ ВАЛЕРЬЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ КАРБОГИДРАЗ С УЛУЧШЕННЫМИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ Специальность 03.01.04 – «биохимия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА – 2012
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Королева Ольга Владимировна доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, г. Пущино «27» марта 2012 года в 1300 часов на заседании диссертационного
Защита состоится совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.
Автореферат разослан « 25 » февраля 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. В мировой практике для создания биотехнологически важных ферментных препаратов используют различные молекулярно генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генетической инженерии и микробиологии для получения рекомбинантных ферментных препаратов с заданными свойствами, которые, в свою очередь, определяются типом гидролизуемого субстрата.
Наиболее востребованными ферментными препаратами, осуществляющими гидролиз таких сложных полимеров, как инулин и целлюлоза, являются инулиназы эндо и экзо-деполимеразного действия, а также комплекс гидролитических ферментов, включающий в себя эндо-1,4--глюканазу, экзо-целлобиогидролазу и -глюкозидазу соответственно.
Известно, что инулин является важным полисахаридом клетки растений семейства сложноцветных, в частности, топинамбура, представляющим собой линейные цепи -2,1 связанных молекул D-фруктофуранозы, которые заканчиваются остатком глюкозы на невосстанавливающем конце молекулы биополимера. Клубни топинамбура, урожайность которых в среднем составляет 30-40 т/га, обогащены инулином, содержание которого в клубнях достигает 80-90% от массы сухого вещества. Поэтому, применение ферментных препаратов инулиназ может не только увеличить эффективность гидролиза инулосодержащего сырья до простых сахаров – фруктозы и глюкозы, но и позволит получать фруктоолигосахариды, являющиеся необходимыми компонентами функционального питания.
С другой стороны, основными полисахаридами клеточной стенки высших растений являются целлюлоза и гемицеллюлозы, составляющие, соответственно 40-50% и 30-40% от массы растительного сырья. Оптимизированный состав смесей основных компонентов целлюлазного гидролитического комплекса позволит сделать вывод о наиболее эффективном соотношении основных ключевых ферментов при гидролизе природных целлюлозосодержащих материалов.
В лаборатории биотехнологии ферментов ИНБИ РАН ведутся работы со штаммом низшего гриба Penicillium canescens, зарекомендовавшим себя как простая и удобная лабораторная модель для получения рекомбинантных штаммов с заданными свойствами.
Таким образом, актуальной задачей представлялось получение рекомбинантных ферментных препаратов, а также оптимизация их смесей для максимально эффективного гидролиза природного сырья до простых сахаров, используя грибной реципиентный штамм Penicillium canescens.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в применении молекулярно-генетических подходов к созданию рекомбинантных ферментных препаратов, обладающих высоким гидролитическим потенциалом по отношению к целлюлозо- и инулосодержащим субстратам, а также поиск оптимальных соотношений ферментных препаратов для высокоэффективного гидролиза природного сырья.
В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
1. Получить плазмидные конструкции, несущие гены инулиназ (экзоинулиназы (inu1)) Aspergillus awamori, эндоинулиназы (inuA) A.niger, а также -фруктофуранозидазы (fopA) A.oryzae на основе векторов, содержащих промоторы гена xylA (кодирующего ксиланазу А Penicillium canescens), гена bgal (кодирующего -галактозидазу P.canescens) и гена abfB (кодирующего арабинофранозидазу А P. canescens);
2. Получить плазмидные конструкции, несущие гены целлюлаз (целлобиогидролазы I и II (cbh1 и cbh2)), эндоглюканазы II (egl2) P.verruculosum, а также -глюкозидазы (bgl1) A.niger) на основе экспрессионного вектора, содержащего промотор гена ксиланазы А (xylA) P. canescens;
3. Провести трансформацию полученными плазмидами штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7 niaD и осуществить скрининг трансформантов. Получить новые ферментные препараты инулиназ и целлюлаз и исследовать их свойства;
4. Выделить в гомогенном виде и изучить свойства экзоинулиназы и эндоинулиназы, сравнить со свойствами соответствующих ферментов из природных штаммов;
5. Исследовать гидролитические свойства ферментных препаратов по отношению к целлюлозосодержащему и инулосодержащему сырью, а также определить оптимальное соотношение в них ключевых ферментов;
6. Определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой эффективностью гидролиза растительного сырья.
Научная новизна и практическая значимость работы. Новизна работы состоит в получении новых эффективных ферментных препаратов с улучшенными гидролитическими свойствами на основе лабораторного грибного штамма P.canescens с использованием современных ДНК-технологий. Показано, что ферментные комплексы инулиназ и целлюлаз, полученные путем смешения новых ферментных препаратов, обладают увеличенной гидролитической активностью. Применение полученных в результате выполнения работы индивидуальных ферментных препаратов, а также их смесей, при гидролизе различных видов инулосодержащего (инулин топинамбура и измельчённые клубни топинамбура), а также целлюлозосодержащего (микрокристаллическая целлюлоза и измельчённая осиновая древесина) сырья позволяет достичь высокой степени его конверсии, что может быть использовано в ряде технологических процессов пищевой и биотехнологической промышленности.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва, 2010), четвёртой международной школе молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Москва, 2010), шестом московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), а также московской школе конференции «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (159 ссылок). Диссертация содержит 130 страниц печатного текста, включает 52 рисунка и 28 таблиц.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ИНУЛИНАЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ P.canescens RN3-11-7.
1. Получение экспрессионных конструкций и трансформация штамма P.canescens RN3-11-7. Используя в качестве матрицы геномные ДНК A.awamori, A.niger и A.oryzae методом Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) были амплифицированы полинуклеотидные последовательности, соответствующие целевым генам. Фрагменты ДНК, соответствующие генам экзоинулиназы (inu1) и эндоинулиназы (inuA) были клонированы в вектор, содержащий полинуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной области гена ксиланазы А P.canescens и терминаторной области гена eglIII P.verruculosum. Аналогично, ПЦР-амплификаты, соответствующие генам эндоинулиназы (inuA) и -фруктофуранозидазы (fopA) были клонированы в вектора, содержащие гомологичные промоторные области генов bgal и abfA. Таким образом, были получены следующие плазмиды – pABF-FOPA, pPrXylA-INUA, pPrXylA-INU1 и pBGAS INUA (рис.1).
С полученными плазмидами была проведена серия трансформаций ауксотрофного штамма-реципиента P.canescens RN-3-11-7 niaD, совместно с плазмидой pSTA10, несущей ген нитратредуктазы, обеспечивающей комплементацию дефектного гена нитратредуктазы в штамме-реципиенте и возможности селекции трансформантов на средах с нитратом натрия.
BglII (23) BglIIBglII (32) Nco I (139) NcoI (369) Nco I (421) xylA promoter abfA promoter BglII (995) APr APr EcoRI (733) BglII (871) LIC5 Nhe I (901) LIC BamHI (1047) BamHI (2039) pPrXylA-INUA fopA A.oryzae pABF-FOPA 8392 bp NdeI (2096) 7669 bp ORI BamHI (2413) ORI NheI (2045) N co (2467) I BamHI (1070) N otI (5518) BamHI (2663) EcoRI (2360) XbaI (5511) NotI (4795) inuA A.niger LIC3 EcoRI (5494) EcoRI (4771) LIC HindIII (548 2) Bam HI (2559) HindIII (4759) eglIII terminator Nhe I (2642) NdeI (3506) eglIII terminator А Б BglII (23) HindIII (340) xylA promoter APr bgaS promoter APr BglII (995) NcoI (1510) HindIII (1892) HindIII (1720) bgaS Signal Peptide EcoRI (1985) pPrXylA-INU1 pBGAS-INUA BamHI (1990) ORI 8574 bp 9245 bp LIC ORI HindIII (2723) exon1 NotI (6371) bgaS signal peptide NotI (5700) EcoRI (6347) BamHI (2895) inu1 A.awamori HindIII (6335) EcoRI (5676) BamHI (2844) N co (3056) I INUA A.niger Hi ndIII (5664) exon 2 BamHI (2821) BamHI (3269) LIC3 LIC3 NcoI (3323) eglIII terminator В Г eglIII terminator BamHI (3519) Рисунок 1. Схематическое изображение экспрессионных плазмид с генами: А – fopA, кодирующего -фруктофуранозидазу, Б – inuA, кодирующего эндоинулиназу под контролем xylA промотора, В – inu1, кодирующего экзоинулиназу под контролем xylA промотора и Г- inuA, кодирующего эндоинулиназу под контролем bgaS промотора.
Трансформанты были последовательно пересеяны на селективную среду c нитратом натрия (4 и более раз), и показано, что биосинтез целевых ферментов стабилен.
2. Первичный скрининг трансформантов на примере трансформантов с гетерологичной экзоинулиназой A.awamori. Трансформанты культивировались в колбах на стандартной ферментационной среде штамма P.canescens RN 3-11-7. В культуральной жидкости (КЖ) определялась целевая (инулиназная) и базовая (ксиланазная) активности:
инулиназную активность определяли по гидролизу инулина топинамбура, ксиланазную – по гидролизу берёзового ксилана (табл.1).
На рис.2 приведена электрофореграмма образцов КЖ, полученных при культивировании трансформантов в 100 мл ферментационной среды. В качестве контроля использовали КЖ, полученную при культивировании исходного штамма P.canescens RN3 11-7 niaD.
Таблица 1. Активности ферментов Активность Активность № по инулину КЖ трансформантов с гетеро по ксилану, трансформанта топинамбура, логичной экзоинулиназой.
ед/мл ед/мл По сравнению с контролем на A5 2232±158 150± A6 2119±140 170±12 электрофореграмме трансформантов A7 1284±113 175±15 обнаруживаются полосы в районе A8 1751±103 170±12 кДа, соответствующие молекулярной A10 1638±160 125±11 массе экзо-инулиназы. Исходя из 2910±179 100±9, A12 полученных данных, были отобраны B4 1723±118 130±11 два клона обладающие максимальной B5 2656±263 110±10 активностью по отношению к 3467±242 97± B10 инулину топинамбура (А12 и В10) B12 1497±122 112±11 для получения ферментных C5 2367±197 100±9 препаратов (ФП).
C10 959±80 200± D3 1273±117 175± RN3-11- 2±0,2 220± (контроль) экзоинулиназа Рисунок 2. Электрофореграмма образцов КЖ трансформантов, содержащих гетерологичную экзоинулиназу (нумерация трансформантов, соответствует нумерации в табл.1).
Все полученные ФП были проанализированы по схеме, представленной на рис.3.
Анализ ФП состоял из следующих стадий: измерение целевой активности, проведение ДДС-электрофореза с последующим анализом трипсинового гидролизата полосы целевого белка с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа;
хроматографический анализ качественного и количественного состава ферментных препаратов, а также, выделение целевых рекомбинантных ферментов в гомогенном виде;
сравнение свойств нативных и рекомбинантных целевых ферментов;
изучение гидролитической способности полученных ФП при гидролизе растительного сырья.
Измерение целевой Ферментный активности и препарат (ФП) ДДС-электрофорез Анализ компонентного состава с помощью FPLC Масс-спектрометрический анализ целевого белка Изучение свойств Изучение осахаривающей гомогенных рекомбинантных способности белков ФП Рисунок 3. Схема анализа рекомбинантных ферментных препаратов.
Были использованы также молекулярно-генетические подходы к получению мультиферментных комплексов инулолитических ферментов, состоящий в одновременной экспрессии трех различных ферментов, таких как эндо- и экзоинулиназы и -фруктофуранозидазы (Триплеты 1 и 2), в пределах одного штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7. niaD. Предполагалось, что мультиферментные препараты, полученные таким образом, будут обладать большей эффективностью при гидролизе инулосодержащего сырья за счет синергетического эффекта действия 3-х ферментов. Для этого были разработаны следующие подходы.
Первый подход заключался в использовании промотора гена ксиланазы А (xylA) для экспрессии экзоинулиназы и эндоинулиназы, а также промотора гена арабинофуранозидазы А (abfA) для экспрессии -фруктофуранозидазы, с последующей трансформацией трёх плазмид в один реципиентный штамм. Второй подход заключался в использовании промоторов гена ксиланазы А (xylA) для экспрессии экзоинулиназы, промотор гена -галактозидазы для экспрессии эндоинулиназы, и промотор гена арабинофуранозидазы А (abfA) для экспрессии -фруктофуранозидазы, с последующей трансформацией трёх плазмид в один реципиентный штамм.
Для скрининга целевых генов был применён ПЦР-метод с использованием спор грибных трансформантов как матрицы для проведения ПЦР и специфических праймеров на целевые гены. Было обнаружено два клона, где были обнаружены все три искомых гена. На основе отобранных трансформантов были получены ФП, именуемые в дальнейшем - Триплеты 1 и 2.
Экзоинулиназа (pI 4,3) -фруктофуранозидаза (pI 3,4) Эндоинулиназа (pI 3) Рисунок 4. Результаты изоэлектрофокусирования ферментных препаратов Триплет 1 и (Обозначения: 1-маркёры, 2- ферментный препарат Триплет1, 3 – ферментный препарат Триплет2) Поскольку у эндоинулиназы, экзоинулиназы и -фруктофуранозидазы молекулярные массы очень близки ( молекулярные массы экзоинулиназы - 60, эндоинулиназы - 56, фруктофуранозидазы - 63 кДа), метод ДДС-электрофореза не позволил идентифицировать эти ферменты. Для их идентификации был использован метод ИЭФ (pI экзоинулиназы, эндоинулиназы и -фруктофуранозидазы по литературным данным составили 4,3, 3 и 3,4 соответственно). На рис. 4 видно, что все три гетерологичных фермента входят в состав полученного ФП Триплет 1 и 2.
3. Свойства ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов P.canescens. Были определены целевая (инулиназная) и базовая (ксиланазная) активности полученных ФП (табл.2). Из данных, приведённых в таблице видно, что эти ФП обладают на порядки более высокой удельной активностью по инулину топинамбура по сравнению с контролем.
Таблица 2. Удельная активность полученных ферментных препаратов Ферментный Содержание Активность по Активность препарат белка, мг/г инулину по ксилану, топинамбура, ед/мг ед/мг Экзоинулиназа (ЭКЗИН) 245±21 87 ± 9 77,6 ± 6, Эндоинулиназа (ЭНДИН) 237±19 11,6 ± 1 11,8 ± 1, Триплет 1 552±43 8,4 ± 0,8 25,6 ± Триплет 2 445±39 18 ± 1,5 121 ± RN3-11-7 (контроль) 336±29 0,05 ± 0,01 80 ± Результаты гидролиза инулина топинамбура новыми рекомбинантными ФП инулиназ. Для исследования гидролитической активности полученных ФП был проведён гидролиз инулина топинамбура и измельчённых клубней топинамбура. Эффективность их конверсии зависит как от оптимального соотношения ключевых ферментов в ФП, так и от свойств и состава субстрата. Таким образом, результаты гидролиза выбранных субстратов позволят установить наиболее эффективные ферментные комплексы, а также оптимальное соотношение ключевых ферментов.
Гидролиз проводили в течение 24 часов при 50С и различной дозировке ФП по белку. Через 30 мин, 3 и 24 ч из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию восстанавливающих сахаров (ВС), фруктозы и глюкозы.
При гидролизе инулина ФП экзоинулиназы (ЭКЗИН) с дозировкой белка 0,5 мг/г сухого субстрата через 3 ч выход ВС составил 45 г/л (рис.5), при этом степень конверсии субстрата составила 80%. Ферментный препарат эндоинулиназы (ЭНДИН) значительно уступает по гидролитической способности ФП экзоинулиназы, выход ВС за 3 ч составил всего 16 г/л. При использовании смесей ФП экзо- и эндоинулиназы различного состава, наилучшей оказалась смесь 0,5 мг ФП ЭКЗИН + 0,5 мг ФП ЭНДИН на 1 г сухого субстрата, при этом выход ВС через 3 ч составил 52 г/л. Степень конверсии субстрата в этом случае приближалась к 100%.
Гл Фр ВС Концентрация сахаров, г/л RN3 1 мг Эндо- 0,5 мг Экзо - 0,05 мг Экзо - 0,1 мг Экзо - 0,5 мг Эндо+экзо: Эндо+экзо: Эндо+экзо:
0,5+0,05 0,5+0,1 0,5+0, Рисунок 5. Выход ВС, фруктозы и глюкозы при гидролизе инулина топинамбура ФП ЭКЗИН и ЭНДИН. Условия: 50оС, рН 5, натрий-ацетатный буфер, [S]=50 г/л (сухой вес), дозировка белка приведена на оси абсцисс, перемешивание - 250 об./мин, время реакции – 3ч.
Результаты гидролиза инулина топинамбура ФП Триплет 1 и 2 приведены на рис.6.
При минимальной из использованных дозировок (0,5 мг/г сухого субстрата) было показано, что ФП экзоинулиназы обеспечил более высокую скорость гидролиза по сравнению с ФП Триплет 1. Таким образом, молекулярно-генетический подход, состоящий в получении продуцента всего искомого мультиферментного комплекса, с технологической точки зрения не выгоден. Поэтому в дальнейшей работе было акцентировано внимание на смешивании ФП, полученных с помощью рекомбинантных штаммов – продуцентов индивидуальных целевых ферментов, а также определении оптимального соотношения ключевых ферментов в смесях ФП.
Гл Фр ВС Концентрация сахаров, г/л Экзо - 0,5 мг Триплет1 - Триплет2 - Экзо - 0,5 мг Триплет1 - Триплет2 - Экзо - 0,5 мг Триплет1 - Триплет2 0,5мг 0,5мг 0,5мг 0,5мг 0,5мг 0,5мг 30 мин 3ч 24 ч Рисунок 6. Выход ВС, фруктозы и глюкозы при гидролизе инулина топинамбура ФП Триплет 1 и 2. Условия: 50оС, рН 5, натрий-ацетатный буфер, [S]=50 г/л (сухой вес), дозировка ФП по белку приведена на оси абсцисс, перемешивание - 250 об./мин, время реакции – 24 ч.
Результаты гидролиза клубней топинамбура новыми рекомбинантными инулиназными ферментными препаратами. Был проведён гидролиз измельчённых клубней топинамбура полученными ФП. Максимальный выход фруктозы наблюдали пр ФП экзоинулиназы (ЭКЗИН). При дозировке ФП по белку 5 мг/г сухого субстрата через ч реакции концентрация фруктозы (основного продукта гидролиза), составила 60 г/л.
Следует отметить, что при использовании ФП эндоинулиназы (ЭНДИН) при гидролизе клубней топинамбура могут быть получены фруктоолигосахариды (ФОС) с различной степенью полимеризации (СП).
Результаты анализа хроматографических данных, характеризующих состав ФОС представлены в табл. 3. Исходя из полученных результатов, очевидно, что максимальная концентрация ФОС приходится на 3 часа гидролиза при данных условиях проведения реакции.
Таблица 3. Состав продуктов гидролиза клубней топинамбура ФП ЭНДИН с дозировкой белка 0,5 мг/г сухого субстрата Выход продуктов гидролиза, г/л Продукты 30 мин 3ч 24 ч гидролиза гидролиза гидролиза гидролиза Глюкоза (Г) 3,4 0, 5, Фруктоза (Ф) 3 Ф2 1 Г-Ф2 2 Ф3 7 8, Г-Ф3 4 Ф4 4,5 1, Ферментные препараты экзо- и эндоинулиназы смешивали в различных соотношениях, представленных на оси абсцисс (рис. 7). Наиболее оптимальным соотношением, как и при гидролизе инулина топинамбура, оказалось 0,5 мг ФП ЭКЗИН + 0,5 мг ФП ЭНДИН на 1 г сухого субстрата, при этом соотношении ФП через 3 часа гидролиза выход ВС составил 65 г/л.
Гл Фр ВС Концентрация сахаров, г/л S РСА10 - 5 мг Эндо+экзо: Эндо+экзо: Эндо+экзо: Эндо+экзо: Эндо+экзо:
RN3 5 мг 0,05+5 0,1+2 0,5+0,5 2+0,1 5+0, Рисунок 7. Выход ВС, фруктозы и глюкозы при гидролизе измельчённых клубней топинамбура ФП ЭКЗИН и ЭНДИН. Условия: 50оС, рН 5, [S]=100 г/л (сухой вес), дозировка белка приведена на оси абсцисс, перемешивание - 250 об./мин, время реакции – 3 ч.
Также показана возможность применения ФП экзоинулиназы при обработке сиропов из топинамбура. В результате гидролиза при дозировке ФП ЭКЗИИН по белку 0,5 мг/г наблюдалась полная конверсия ФОС во фруктозо-глюкозный сироп (ФГС) (рис.8), с содержанием фруктозы порядка 95%, что существенно увеличивает сроки его хранения, и как следствие, снимает необходимость добавления консервантов в ФГС.
Рисунок 8. Хроматограмма, характеризующая состав сахаров при гидролизе сиропа из топинамбура под действием ФП ЭКЗИН (Условные обозначения: Г – глюкоза, Ф – фруктоза, С – сахароза, ФОС - фруктоолигосахариды) 4. Анализ компонентного состава ферментного препарата на примере препарата эндоинулиназы (ЭНДИН). Для определения состава ФП эндоинулиназы мы использовали разработанный в нашей лаборатории экспресс-метод хроматографического фракционирования ФП. Протокол включает три стадии: на первой – ФП растворяли и обессоливали на колонке с носителем Биогель П4, на второй – обессоленный образец наносили на колонку с анионообменным носителем Source 15Q (pH6,8) и собирали фракции белков в линейном градиенте NaCl от 0 до 0,4М (рис.9). На третьей стадии проводили фракционирование с помощью гидрофобной хроматографии на носителе Source 15ISO. Связавшийся белок элюировали, уменьшая концентрацию сульфата аммония в элюенте. Во фракциях были измерены активности по отношению к следующим субстратам – инулин топинамбура, ксилан берёзы, пНФ--L-арабинофуранозид и пНФ- D-галактопранозид.
На хроматограмме (рис.9) видно, что эндоинулиназа выходит в середине градиента соли при фракционировании на колонке Source 15Q и находится во фракциях с 9-13, что подтверждается соответствующей полосой в районе 70 кДа на ДДС-электрофореграмме (рис.10).
Source 15Q, 1 ml, pH 6.8 Bis-Tris/HCl 1,0 1, АБФ 60 кДа 0,8 0, Ксил 31 кДа Эндо-инулиназа 56 кДа (A.nig) 0,6 0, [NaCl], M A 0,4 0, АФ 70kДа b-Гал 118kДа 0,2 0, 2 4 3 9 5 0,0 0, NB -10 0 10 20 30 Объем элюента, мл Рисунок 9. Фракционирование ферментного препарата эндоинулиназы (ЭНДИН) с помощью анионообменной хроматографии на носителе Source 15Q, pH 6,8, градиент соли приведён серым цветом.
Рисунок 10. Электрофореграмма гомогенной эндоинулиназы, полученной после разделения фракций 9-13 на гидрофобном носителе Source 15ISO Доказательством наличия целевых белков (экзоинулиназы, эндоинулиназы и сахаразы) в ФП, являлись данные MALDI-TOF масс-спектрометрии. Для этого образцы геля с белковыми полосами, полученными в результате проведения ДДС-электрофореза и соответствующие предполагаемым массам целевых белков, обрабатывали трипсином.
Полученные пептиды анализировали MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ результатов и поиск целевых пептидов проводили с использованием программы Bruker DataAnalysis. Данные о полученных пептидах после трипсинолиза сравнивали с теоретическими пептидными последовательностями, полученными с использованием программы PeptideMass для первичной аминокислотной последовательности гетерологичных ферментов.
На рис. 11. приведён MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата и результаты идентификации пептидов на примере эндоинулиназы – на основании этих данных можно с достоверностью утверждать о наличии целевого белка в комплексе.
Подобным образом было доказано наличие экспрессии и других целевых генов.
Intens.
x10 MLNPKVAYMVWMTCLGLTLPSQAQSNDYRPSYHFTPDQY WMNEPNGLIKIGSTWHLFFQHNPTANVWGNICWGHATST 1, DLMHWAHKPTAIADENGVEAFTGTAYYDPNNASGLGDSA NPPYLAWFTGYTVSSQTQDQRLAFSVDNGATWTKFQGNP IISTSQEAPHDITGGLESRDPKVFFHRQSGNWIMVLAHG GQDKLSFWTSADTINWTWQSDLKSTSINGLSSDITGWEV 0, PDMFELPVEGTEETTWVVMMTPAEGSPAGGNGVLAITGS FDGKSFTADPVDASTMWLNNGRDFDGALSWVNVPASDGR RIIAAVMNSYGSNPPTTTWKGMLSFPRTLSLKKVGTQQH FVQQPITELDTISTSLQTLENQTITPGQTLLSSIRGTAL 0, DVRVAFYPDAGSVLSLAVRKGASEQTVIKYTQSDATLSV DRTESGDTSYDPAASGVHTAKLEEDDTGLVSIRVLVDTC SVEVFGGQGEAVISDLIFPSDSSDGLALEVTGGNAVLQS 0,4 VDVRSVSLE 0, 0, 1000 1500 2000 2500 3000 3500 m/z Рисунок 11. MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата полосы, соответствующей эндоинулиназе A.niger Таблица 4. Компонентный состав ферментных препаратов инулиназ (ЭКЗИН и ЭНДИН (в % от общего содержания белка).
Компонент препарата ЭКЗИН ЭНДИН Инулиназа 51 Ксиланаза 16 12, Арабинофуранозидаза 20 Б-галактозидаза 5 Другие белки 7 37, На основании данных о содержании белка и активности соответствущих ферментов во фракциях был определён компонентный состав ФП, содержащих экзо- и эндоинулиназу (табл. 4). ФП ЭКЗИН содержал 51% экзоинулиназы, ЭНДИН - 15 % эндоинулиназы от общего пула белка ФП. Отметим, что аналогичный подход был применен для определия компонентного состава всех изученных в данной работе ФП.
5. Биохимические свойства гомогенных экзоинулиназы и эндоинулиназы. После выделения и очистки экзо- и эндоинулиназы в гомогенном виде по схеме, предложенной выше, были определены следующие свойства гомогенных ферментов: специфичность, тип действия фермента на субстрат, кинетические параметры, а также рН- и температурные оптимумы действия ферментов. Полученные данные сведены в табл.5.
Таблица 5. Биохимические свойства гомогенных экзо- и эндоинулиназ.
Параметры Экзоинулиназа Эндоинулиназа М(теор.), кДа 60 pI 4,3 3, Тип действия Экзо-деполимераза Эндо-деполимераза Удельная активность, ед/мг белка, рН 5,0 50оС 2,2 ±0, Инулин агавы 325± 90 ±8 32 ±2, Инулин цикория 10 ±1 10 ± Инулин артишока 80 ±6 31 ±2, Инулин топинамбура 80 ±6 8 ±0, Сахароза Кинетические параметры гидролиза инулина 27 ±2,5 12 ± Км, г/л (инулин топинамбура) 25 ±2,1 15 ±1, Км, г/л (инулин георгина) 11 ±1 4,9 ±0, Км, г/л (инулин цикория) 159 ±14 100 ± Kcat, мин-1(инулин топинамбура) 138 ±11 50 ±4, Kcat, мин-1(инулин георгина) 73 ±6 36 ±3, Kcat, мин-1(инулин цикория) Оптимумы активности ферментов рН – оптимум 4,0-4,5 5,5-6, Т – оптимум 50°С 55°С Отметим, что эндоинулиназа обладает наибольшей активностью (определенной по начальным скоростям гидролиза) по отношению к инулину цикория и топинамбура, экзоинулиназа – по отношению к инулину агавы. Оба фермента проявляли активность к сахарозе. рН и температурный оптимум эндоинулиназы составил 4,0-4,5 и 50°С, и экзоинулиназы – 5,5-6,0 и 50°С, соответственно. Свойства рекомбинантных ферментов, в целом, совпадают со свойствами ферментов, полученных из природных штаммов продуцентов.
II. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ P.canescens РСА-10.
1. Получение экспрессионных конструкций и трансформация штамма-реципиента.
Используя геномные ДНК P.verruculosum и A.niger в качестве матрицы, методом ПЦР были амплифицированы и выделены фрагменты ДНК соответствующие целевым генам (целлобиогидролаза I (cbh1), целлобиогидролаза II (cbh2), эндо--1,4-глюканаза (egl2) II P.verruculosum и -глюкозидаза (bgl1) A.niger), которые были клонированы в вектор, содержащий нуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной области гена мажорного белка – ксиланазы A (xylA) P.canescens и терминаторной области гена эндоглюканазы III (eglIII) P.verruculosum. Полученные экспрессионные плазмиды (рис.12) были трансформированы в штамм-реципиент P.canescens niaD совместно с плазмидой pSTA10 с геном нитратредуктазы, обеспечивающей комплементацию дефектного гена нитратредуктазы. Далее был проведен скрининг трансформантов, проверена стабильность полученных трансформантов и проведена наработка рекомбинантных ФП.
А Б Г В Рисунок 12. Схематическое изображение экспрессионных плазмид (А – плазмида с геном целлобиогидролазы I P.verruculosum, Б – с геном целлобиогидролазы II P.verruculosum, В – с геном эндоглюканазы II P.verruculosum, Г – c геном -глюкозидазы A.niger).
2. Свойства ферментных препаратов целлюлаз. Были определены активности полученных рекомбинантных ФП по отношению к ряду субстратов: к нерастворимой микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), что характеризует целлобиогидролазную активность, к растворимой Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) – эндоглюканазная активность, берёзовому ксилану – ксиланазная активность, а также по п-нитрофенил--D -глюкозидазная глюкопиранозиду (ПНФГ) – (целлобиазная) активность. ФП рекомбинантной эндоглюканазы имели увеличенную удельную активность по КМЦ, ФП целлобиогидролазы – увеличенную активность по МКЦ, ФП -глюкозидазы – увеличенную удельную активность по ПНФГ (табл. 6).
Таблица 6. Удельные активности ферментных препаратов по отношению к разным субстратам, ед/мг белка.
Ферментный Содержание КМЦ МКЦ Ксилан ПНФ Г препарат белка, мг/г 450±36 0,13±0,01 17,1±1,2 0,3±0, ЭГII-1 24,8±2, 515±41 0,1±0,01 19,2±1,3 0,16±0, ЭГII-2 25,7±1, 792±65 0,31±0,03 5,8±0,4 0,13±0, ЭГII-3 21,3±1, 767±71 0,37±0,02 6,9±0,6 0,13±0, ЭГII-4 21,4±1, 796±75 0,35±0,02 6,8±0,5 0,07±0, ЭГII-5 20,2±1, 758±81 0,29±0,01 8,4±0,9 0,05±0, ЭГII-6 20,3±1, 330±31 3,9±0,2 48,5±0,31 0,17±0, ЦБ Г I 0,51±0, 390±32 5,1±0,3 55,1±5,2 0,3±0, ЦБГII 0,45±0, 245±21 0,75±0,05 0,05±0,01 2,6±0, Б ГЛ 5,8±0, PCA- 336±32 2,89±0,5 0,1±0,01 70±5,6 0,12±0, контроль Результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы и измельчённой осиновой древесины новыми рекомбинантными ферментными препаратами целлюлаз. Для исследования гидролитической способности полученных рекомбинантных ФП были выбраны два субстрата: МКЦ – как модельный субстрат для изучения действия ферментов целлюлолитического комплекса, и измельчённая осиновая древесина как быстровозобновляемое сырье, являющееся отходом деревообрабатывающей промышленности. Гидролиз проводили в течение 24 часов при 50С и различной дозировке ПФ по белку. Через 3, 24 и 48 ч из реакционной смеси отбирали пробы, в которых измеряли концентрацию ВС и глюкозы (Гл).
Среди полученных шести ФП гетерологичной эндоглюканазы лучшим с точки зрения гидролитической активности, как при гидролизе МКЦ, так и при гидролизе измельчённой осиновой древесины, оказался препарат ЭГII-6, рис.13. При дозировке по белку 10 мг/г сухого субстрата этот ФП обеспечивает увеличение выхода ВС в среднем на 65% по сравнению с результатами гидролиза контрольным препаратом, исходного штамма-реципиента P.canescens PCA-10. На основании полученных данных, для дальнейших экспериментов были выбраны следующие ФП: ЦБГI, ЦБГII, ЭГII-6 и БГЛ.
А Б Рисунок 13. Выход ВС при гидролизе МКЦ (А) и измельчённой осиновой древесины (Б) ФП ЭГII-6. Условия: 50оС, рН 5, [S]=100г/л (сухой вес), дозировка ФП по белку составила от 2-10 мг/г сухого субстрата, перемешивание - 250 об./мин, время реакции – 48 ч.
Для изучения совместного действия на целлюлозосодержащие материалы рекомбинантных ФП целлобиогидролаз и эндоглюканаз их смешивали в следующих соотношениях: 2+8, 4+6, 6+4 и 8+2 мг/г сухого субстрата (соотношения представлены на оси абсцисс, рис.14). Гидролиз проводили в присутствии препарата БГЛ из расчёта 40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата. Данные, приведенные на рис. 14 позволяют заключить, что наиболее эффективным соотношением ФП, при котором наблюдались максимальные выходы ВС и Гл при гидролизе МКЦ - 8 мг/г (по белку) ФП ЦБГI к 2 мг/г ФП ЭГII-6. Выход ВС и Гл в этом случае составил 31 и 30 г/л, что в 6 и 10 раз больше, чем при гидролизе МКЦ контрольным ФП, полученным с помощью исходного штамма реципиента P.canescens PCA-10 (рис.14 а).
В случае использования смеси ФП ЦБГII и ЭГII-6 соотношение ФП 8 мг/г (по белку) к 2 мг/г также оказалось наиболее оптимальным: ВС и Гл в этом случае составил 19 и г/л, что в 6 и 7 раз больше, чем при гидролизе контрольным ФП (рис.14 б).
А Концентрация сахаров, г/л PCA 10 2+8 4+6 6+4 8+ ВС Гл Б Концентрация сахаров, г/л ВС + БГЛ Гл + БГЛ PCA 10 2+8 4+6 6+4 8+ Рисунок 14. Выход ВС и Гл при гидролизе МКЦ смесью ФП ЦБГI + ЭГII-6 (А) и ЦБГII + ЭГII-6 (Б). Условия: 50оС, рН 5, [S]=100г/л (сухой вес), [Е]= 2+8, 4+6, 6+4 и 8+2 мг на 1 г, в присутствии ФП БГЛ (40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата), перемешивание – 250 об./мин, время реакции - 48 ч.
Наиболее эффективным соотношением ФП при гидролизе измельчённой осиновой древесины для препаратов ЦБГI и ЭГII-6 также являлось 8 к 2, рис.15а. Выход ВС и Гл при этом составил 62 и 38 г/л, соответственно, что в 5 и 4 раз выше, чем при гидролизе измельчённой осиновой древесины контрольным ФП. Аналогичный результат наблюдался и для совместного использования ФП ЦБГII и ЭГII-6 – выход ВС и Гл составил 56 и г/л, что в 4,5 и 4 раза выше, чем при использовании контрольного ФП (рис.15б).
Концентрация сахаров, г/л 70 А РСА 10 2+8 4+6 6+4 8+ ВС Гл Концентрация сахаров, г/л Б ВС + БГЛ Гл + БГЛ РСА 10 2+8 4+6 6+4 8+ Рисунок 15. Выход ВС и Гл при гидролизе осиновой древесины смесью ФП ЦБГI + ЭГII 6 (А) и ЦБГII + ЭГII-6 (Б). Условия: 50оС, рН 5, [S]=100г/л (сухой вес), [Е]= 2+8, 4+6, 6+ и 8+2 мг на 1 г, в присутствии ФП БГЛ (40 ед целлобиазной активности на 1 г субстрата), перемешивание – 250 об./мин, время реакции - 48 ч.
3. Анализ компонентного состава рекомбинантных ферментных препаратов целлюлаз. Компонентный состав ФП ЦБГI, ЦБГII, ЭГII-6 и БГЛ, определённый с помощью аналитического фракционирования с помощью методов FPLC, приведён на рис.16.
Анализ состава контрольного ФП РСА-10, полученного на основе исходного штамма-реципиента, показал превалирующее содержание в нём ксиланазы – 57% от общего пула белка. ФП ЦБГI содержат 27% целлобиогидролазы I, ЦБГII - 20% целлобиогидролазы II, ЭГII-6 – 42% эндоглюканазы II, БГЛ – 20% -глюкозидазы (содержание целевых ферментов на рис.16 обозначены чёрным сектором).
А В Д Б Г Рисунок 16. Компонентный состав рекомбинантных ферментных препаратов целлюлаз (А- ФП ЦБГI, Б - ФП ЦБГII, В – ФП БГЛ, Г – ФП ЭГII-6, Д – контрольный ФП РСА-10) Все рекомбинантные ФП содержали гомологичную ксиланазу P.canescens (от 13 до 38%) – наличие ксиланазы в составе рекомбинантных ФП способствует увеличению эффективности процесса гидролиза богатых ксиланами видов растительного сырья, в том числе осиновой древесины.
***** Таким образом, на основании изложенных выше результатов, установлено, что рекомбинантные ферментные препараты инулиназ и целлюлаз, полученные с использованием молекулярно-генетических подходов обладают повышенной гидролитической способностью по отношению к инулосодержащему и целлюлозосодержащему сырью, причём для достижения максимальной глубины гидролиза соответствующих субстратов необходимо оптимальное соотношение ключевых ферментов в составе ФП, полученных на основе рекомбинантных штаммов P.canescens.
ВЫВОДЫ Получены плазмиды с гетерологичными генами inuI и inuA, кодирующими 1.
экзоинулиназу A.awamori и эндоинулиназу A.niger, геном fopA, кодирующим фруктофуранозидазу A.oryzae, cbhI, cbhII и eglII, кодирующими целлобиогидролазу I, целлобиогидролазу II и эндоглюканазу II P.verruculosum, а также bglI, кодирующим глюкозидазу A.niger, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых белков в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов-продуцентов гриба Penicillium canescens.
2. Используя молекулярно-генетические подходы были созданы штаммы гриба P.canescens, обладающие способностью к продукции гетерологичных экзоинулиназы A.awamori, A.niger, -фруктофуранозидазы A.oryzae, эндоинулиназы а также целлобиогидролазы I, целлобиогидролазы II, эндоглюканазы II P.verruculosum и глюкозидазы A.niger. На основе наиболее активных отобранных штаммов-продуцентов целевых ферментов получены рекомбинантные ферментные препараты и изучены их биохимические свойства.
3. Получение наиболее эффективного гидролитического комплекса было достигнуто путём смешения ферментных препаратов. Показано, что оптимальным соотношением ферментных препаратов экзо- и эндоинулиназ для эффективного гидролиза инулина и клубней топинамбура является 0,5 мг ЭКЗИН + 0,5 мг ФП ЭНДИН на 1 г сухого вещества субстрата.
4. Изучен компонентный состав и содержание целевых ферментов в ферментных препаратах инулиназ, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов продуцентов и установлено, что содержание экзоинулиназы составляет 51%, а содержание эндоинулиназы – 15% от общего пула секреторного белка.
A.awamori 5. Выделены рекомбинантные гомогенные экзоинулиназа и эндоинулиназа A.niger и показано, что по своим свойствам - субстратной специфичности, кинетическим параметрам, pI, зависимости активности от pH- и термостабильности – рекомбинантные ферменты не отличаются от аналогичных ферментов природных штаммов.
6. Исследованы гидролитические свойства целлюлазных ферментных препаратов и показано, что состав смеси ФП ЦБГI (или ЦБГII) и ЭГII в соотношении 8 мг (ЦБГI или ЦБГII) + 2 мг (ЭГII) на 1 г сухого субстрата является наиболее оптимальным для достижения максимальной глубины гидролиза целлюлозосодержащих субстратов – микрокристаллической целлюлозы (30% конверсии до восстанавливающих сахаров) и измельченной осиновой древесины (62% конверсии до восстанавливающих сахаров).
7. Изучен компонентный состав и содержание целевых ферментов в ферментных препаратах целлюлаз, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов продуцентов и установлено, что содержание целлобиогидролазы I составляет 27%, целлобиогидролазы II - 20%, эндоглюканазы II - 42%, а -глюкозидазы - 20% от общего пула секреторного белка.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. Рожкова А.М., Волков П.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Бушина Е.В., Зоров И.Н., Синицына О.А., Синицын А.П., Кошелев А.В., Беккаревич О.А., Бубнова Т.В., Окунев О.Н. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Penicillium canescens // Хранение и переработка сельхозсырья.- 2010, №7, с.37-39.
2. Волков П.В., Рожкова А.М., Правильников А.Г., Андрианов Р.М., Доценко Г.С., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Зоров И.Н., Синицын А.П. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Penicillium canescens с высокой способностью к гидролизу растительного сырья // Прикладная биохимия и микробиология. -2012, Т. 48, №1, с. 66- 3. Волков П.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Цурикова Н.В., Нефёдова Л.И., Окунев О.Н., Кошелев А.В., Синицын А.П.. Получение ферментных препаратов эндоинулиназы для высокоэффективного гидролиза клубней топинамбура // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2012, №2, с.12-15.
4. Волков П.В., Синицына О.А., Фёдорова Е.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Зоров И.Н., Окунев О.Н., Гусаков А.В., Синицын А.П. Изучение ферментных препаратов инулиназ Aspergillus sp. Выделение и свойства рекомбинантных ферментов // Биохимия. 2012, Т.77, вып.5 (в печати).
Тезисы докладов 1. Волков П.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Семенова М.В., Синицын А.П.
рекомбинантном штамме гриба Penicillium Экспрессия гетерологичной липазы в сanescens. Второй Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по Биотехнологии, Биоэнергетике и Биоэкономике «EURASIABIO», 13-15 Апреля, 2010, Москва, с. 2. Волков П.В., Рожкова А.М., Синицын А.П. Создание системы экспрессии генов в рекомбинантном штамме Penicillium canescens на основе промотора гена -L арабинофуранозидазы. Московская международная научно-практическая конференция "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов", 15-17 Марта, Москва, 2010, с.318-319.
Волков П.В. Использование промоторов xylA, bgaS и abfA в системах экспрессии 3.
целевых ферментов в рекомбинантном штамме Penicillium canescens. IV Международная Школа молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки», ноября - 3 декабря 2010 г., Москва-Звенигород, с.62-64.
4. Волков П.В., Рожкова А.М., Синицын А.П. Получение оптимального ферментативного комплекса целлюлолитических ферментов для осахаривания измельчённой осиновой древесины. VI Московский Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», 21-25 марта, часть 1, Москва, с.385-386.
5. Волков П.В. Получение ферментных препаратов инулиназ на основе рекомбинантного гриба Penicillium canescens для высокоэффективного гидролиза топинамбура. Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины. Школа конференция. Москва. Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 29-30 сентября 2011 г.:
Сборник материалов, 2011. с.86.