Биохимические свойства синтетического пептида октарфина
На правах рукописи
Некрасова Юлия Николаевна Биохимические свойства синтетического пептида октарфина 03.01.04 – Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в лаборатории пептидных биорегуляторов Филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Наволоцкая Елена Витальевна
Официальные оппоненты: Замятнин Александр Александрович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, главный научный сотрудник Марквичева Елена Арнольдовна доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетного учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, ведущий научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное
Ведущая организация:
учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук
Защита состоится « 28 » марта 2013 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д. 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.
Автореферат разослан « » 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Основные системы многоклеточного Актуальность проблемы.
организма – нервная, иммунная, сердечнососудистая и эндокринная – имеют объединяющий механизм, ключевым звеном которого являются пептидные медиаторы. Биологически активные пептиды образуются в организме в результате протеолитического расщепления белков-предшественников.
Нередко активность образующихся фрагментов отличается от активности исходного полипептида. Известно, что основные эффекты биологически активных пептидов реализуются через их взаимодействие со специфическими рецепторами. Например, фрагменты молекул белков гистосовместимости I класса, обеспечивающие связывание с Т-клеточным рецептором, ингибируют лизис антигенов цитотоксическими Т-лимфоцитами. В то время как взаимодействие исходных белков гистосовместимости I класса с Т-клеточным рецепторомам приводит к увеличению литической активности цитотоксических Т-лимфоцитов (Clayberger et al., 1994). Таким образом, в некоторых случаях биологические эффекты пептидов антагонистичны эффектам исходной белковой молекулы.
Известно, что биологически активные пептиды служат удобным инструментом изучения того типа рецептора, к которому они проявляют специфичность. В связи с этим характеристика биохимических свойств синтетического пептида октарфина – центрального фрагмента молекулы -эндорфина человека, важна и актуальна.
В настоящее время на основе природных пептидных гормонов уже создано и успешно применяется в клинике несколько десятков эффективных и безопасных лекарственных препаратов. Поиск и изучение свойств новых пептидов с простой структурой (состоящих из нескольких аминокислотных остатков), высокой устойчивостью к действию протеаз (долгоживущих) и обладающих ценными фармакологическими свойствами - важнейшая задача современной биохимии. В связи с этим изучение спектра биологической активности и механизма действия октарфина является актуальным исследованием, результаты которого могут быть использованы на практике при создании новых лекарственных препаратов на основе пептидов.
Целью настоящей работы было изучение биохимических свойств синтетического пептида октарфина (TPLVTLFK).
Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:
1. Исследовать связывание меченного тритием октарфина ([3H]октарфина) с иммунокомпетентными клетками мыши и мембранными фракциями, выделенными из коры головного мозга, миокарда и коры надпочечников крысы.
2. Изучить влияние октарфина на активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo.
3. Изучить влияние октарфина на функциональную активность миокарда крысы in vivo.
4. Изучить влияния октарфина на функциональную активность коры надпочечников крысы in vitro и in vivo.
Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством того, что синтетический пептид октарфин, соответствующий аминокислотной последовательности 12- молекулы -эндорфина, обладает иммуностимулирующим действием.
Экспериментально показано, что октарфин увеличивает адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов мыши, а также повышает их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro. Внутрибрюшинное введение пептида приводит к активации перитонеальных макрофагов, а также Т- и В-лимфоцитов селезенки мыши. Показано, что иммуностимулирующее действие октарфина опосредовано через налоксон-нечувствительный (неопиоидный) рецептор -эндорфина.
Приоритетными являются результаты исследования налоксон-нечувствительного рецептора -эндорфина мембран, выделенных из коры головного мозга крысы, полученные с помощью меченного тритием октарфина ([3H]октарфина).
Впервые показано, что октарфин обладает выраженным кардиопротекторным и противоишемическим действием. Экспериментально установлено, что он нормализует коронарный кровоток и сократительную активность миокарда, снижает интенсивность цитолиза и перекисного окисления липидов в миокарде, способствует повышению уровня антиоксидантной защиты. С помощью [3H]октарфина доказана экспрессия неопиоидного рецептора -эндорфина на поверхности мембран, выделенных из миокарда крысы, и получены доказательства участия рецептора данного класса в регуляции функций миокарда.
Результаты настоящей работы показывают, что октарфин при связывании с неопиоидным рецептором -эндорфина ингибирует аденилатциклазную активность мембран клеток коры надпочечников и блокирует выброс глюкокортикоидов из надпочечников в кровь. С помощью [3H]октарфина удалось показать, что кратковременный температурный шок приводит к изменению свойств неопиоидного рецептора -эндорфина на поверхности мембран, выделенных из коры надпочечников крысы.
Практическая значимость работы. В виду того, что биологически активные пептиды, производные природных белков, обладают низкой иммуногенностью, токсичностью и аллергенностью (Клуша, 1984), они рассматриваются как потенциальные лекарственные средства нового поколения. Октарфин может служить основой для создания лекарственного препарата, обладающего иммуностимулирующим, кардиопротекторным и стресс-протекторным действием, поскольку доказана способность пептида активировать клетки иммунной системы, увеличивать устойчивость миокарда к гипоксии и ингибировать секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь.
Октарфин является селективным агонистом неопиодного рецептора -эндорфина, и поэтому он может быть успешно использован в качестве инструмента выявления и исследования данного типа рецептора на различных типах клеток. Характеристика биологических эффектов, возникающих под действием октарфина, позволит расширить представления о неопиоидной составляющей в функционировании пептидного гормона -эндорфина.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Карелия, 2011), чтениях памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2011), всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии» (Пущино, 2012), всероссийской молоджной научной школе-конференции "Биология будущего: традиции и новации" (Екатеринбург, 2012), зимних международных школах “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2010, 2011, 2012), на международных научных конференциях «Ломоносов-2010» и «Ломоносов-2011» (Москва, 2010, 2011), Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2010, 2011, 2012).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 24 печатные работы, в том числе 8 статей в журналах из списка, рекомендованного ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов работы, обсуждения результатов работы, выводов и списка цитируемой литературы из наименований. Работа изложена на 160 страницах, содержит 20 рисунков и 17 таблиц.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Связывание октарфина с налоксон-нечувствительным рецептором -эндорфина перитонеальных макрофагов мыши Аминокислотная последовательность октарфина TPLVTLFK соответствует аминокислотной последовательности участка 12-19 в молекуле -эндорфина. Показано, что фрагмент -эндорфина 12-19 принимает участие в связывании с неопиоидным рецептором. Поскольку доказана экспрессия неопиоидного рецептора -эндорфина на поверхности клеток иммунной системы (Hazum et al., 1979), мы изучали связывание меченного тритием октарфина ([3H]октарфина) с перитонеальными макрофагами мыши.
Анализ связывания в координатах Скэтчарда показал, что на поверхности перитонеальных макрофагов мыши присутствует один тип рецепторов (график представляет собой прямую линию), с высоким сродством связывающих [3H]октарфин. Kd составляет 2,3 0,2 нМ (Рис. 1).
Kd =2,3 0,2 нМ B/F 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,1 0,2 0,3 0,4 0, B, нМ Рис. 1. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [ H]октарфина с перитонеальными макрофагами мыши. B и F – молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида, соответственно.
Реакцию проводили в среде 199, содержащей HEPES (25мМ), NaN3 (20мМ), PMSF (0,6 мг/мл), рН 7,4. В пробирки вносили 100 мкл [3H]октарфина (10-10 – 10-7 М, три параллельные пробы для каждой концентрации), 100 мкл среды (общее связывание) или 100 мкл 10-4 М раствора немеченого октарфина в среде (неспецифическое связывание) и 800 мкл суспензии клеток (1,2 107 клеток в 1 мл среды). Величину специфического связывания [3H]октарфина определяли по разности между его общим и неспецифическим связыванием. Величина неспецифического связывания [3H]октарфина в присутствии 10-4 М немеченого октарфина составляла 7,8 0,6 %.
Результаты экспериментов по ингибированию специфического [3H]октарфина с перитонеальными макрофагами (Табл. 1) связывания немечеными пептидами (диапазон концентраций 10-12 – 10-5 М, три повтора для каждой концентрации) показывают, что только немеченые иммунорфин и -эндорфин обладают способностью вытеснять октарфин из лиганд-рецепторного комплекса.
Таблица 1. Ингибирование специфического связывания 5 нМ с перитонеальными макрофагами мыши [ H]октарфина (1,2 10 клеток/мл) налоксоном и немечеными пептидами.
[IC]50 Ki Лиганд нМ ± стандартное отклонение 1 104 1 Налоксон 8,6 ± 0,5 2,7 ± 0, -Эндорфин Иммунорфин 7,7 ± 0,6 2,4 ± 0, 1 1 -Эндорфин 1 104 1 -Эндорфин [Met5]энкефалин 1 104 1 1 104 1 Тафтсин Октарфин 10,9 ± 0,8 3,4 ± 0, 0,3 LPLVTLFK 1,1 1,3 103 0,4 TLLVTLFK 1,1 103 0,4 TPLVLLFK 1,5 103 0,5 TPLVTLLK 1,8 103 0,6 TPLVTLFL Величина константы ингибирования (Ki) для иммунорфина и -эндорфина составляет 2,4 0,2 и 2,7 0,2 нМ, соответственно. Налоксон и агонисты опиоидных рецепторов не ингибировали связывание, Ki 10 мкМ.
Ингибирующая активность немеченых аналогов LPLVTLFK, TLLVTLFK, TPLVLLFK, TPLVTLLK, TPLVTLFL была соответственно в 102, 124, 105, 146, 175 раз ниже активности немеченого октарфина.
Таким образом, [3H]октарфин с высоким сродством (Рис. 1) и высокой специфичностью (Табл. 1) связывается с неопиоидным рецептором -эндорфина на поверхности перитонеальных макрофагов мыши. Показано, что единичные аминокислотные замены в молекуле октарфина приводят к резкому снижению его сродства к рецептору.
2. Влияние октарфина на активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo Было изучено влияние октарфина на активность перитонеальных макрофагов мыши. Результаты экспериментов показали, что октарфин увеличивал адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов мыши in vitro. При концентрации пептида в среде инкубации 1 нМ и 10 нМ способность макрофагов прилипать к пластику увеличивалась по сравнению с контролем на 25,8% и 33,0% (p 0,01), количество макрофагов, имеющих звездчатую форму, было на 37,2% и 73,0% больше, чем в контроле (p 0,01).
Октарфин стимулировал бактерицидную активность перитонеальных макрофагов при фагоцитозе бактерий Salmonella typhimurium 415 in vitro.
В качестве положительного контроля были взяты запатентованный стимулятор фагоцитоза тетрапептид тафтсин и декапептид иммунорфин, первичная структура которого гомологична аминокислотной последовательности участка 10-19 в молекуле -эндорфина. В Таблице 2 приведены значения основных показателей фагоцитоза: фагоцитарная активность (ФА), цитопатическое действие бактерий (ЦПД) и фагоцитарное число (ФЧ), характеризующих фагоцитоз этой бактерии макрофагами без пептидов (контроль) и в присутствии одного из исследуемых пептидов. Результаты контрольных экспериментов показали, что макрофаги активно фагоцитируют бактерии этого штамма: через 2 ч в фагоцитозе участвовало более 2/3 общего числа макрофагов (ФА 75,6 ± 1,7%);
при этом каждый фагоцит содержал в среднем 10 микроорганизмов (ФЧ 10,3 ± 1,3). Поглощенные микробы продолжали активно размножаться внутри фагоцитов, о чем свидетельствует увеличение ФЧ с 10,3 ± 1,3 до 15,7 ± 1,7 между 2 и 7 ч фагоцитоза. Массовая гибель фагоцитов наблюдалась уже к 7 ч фагоцитоза (ЦПД 69,6 ± 4,1%), к 12 ч весь монослой макрофагов был разрушен (ЦПД 99,7 ± 4,4%). Таким образом, в контроле взаимодействие сальмонелл и макрофагов заканчивалось гибелью последних (незавершенный фагоцитоз).
Таблица 2. Влияние октарфина, иммунорфина и тафтсина на фагоцитоз бактерий вирулентного штамма S. typhimurium перитонеальными макрофагами мыши in vitro*.
Пептид ФА (%) ЦПД (%) ФЧ 66,2 3,2 14,0 1,8 3,8 0, 75,6 1,7 12,2 2,3 10,3 1, - (контроль) 64,7 1,9 32,7 2,4 10,7 1, 28,2 2,5 69,6 4,1 15,7 1, 0,1 0,2 99,7 4,4 0,2 0, ** 8,2 1,6** ** 1,3 0, 85,9 1, 93,9 ± 2,4** 1,8 1,5** 9,6 1, ** ** 5,2 1,4** 65,7 2, Октарфин (1 нМ) 7,4 1, 9,0 1,3** 0,9 0,6** 24,3 2, 2,8 0,9** 2,3 1,1** 0,5 0, ** ** 7,6 2,0** 84,1 3,2 1,3 0, 88,7 2,8** 1,6 1,3** 9,1 0, ** 6,1 0,6** Иммунорфин (1 нМ) 64,6 3,9 9,1 1, 10,3 1,4** 1,3 1,0** 27,4 5, 3,6 1,7** 2,3 0,8** 0,7 0, ** 5,6 0,4** 68,2 4,7 1,9 1, 8,0 1,1** 7,4 0,5** 73,4 2, 6,1 0,3** Тафтсин (100 нМ) 60,8 3,1 31,2 3, 36,8 2,7** 32,4 2,0** 3,0 0,2** 9,9 2,5** 7,7 1,5** 1,4 0,4** *Строки для каждого соединения последовательно (сверху вниз) соответствуют данным, полученным через 1, 2, 4, 7 и 12 ч.
**- достоверное отличие от контроля (p0,01).
В присутствии октарфина или иммунорфина в концентрациях 1 нМ переваривающая способность макрофагов возрастала настолько, что к 12 ч фагоцитоза в монослое вообще не было разрушенных клеток, и макрофаги не содержали непереваренных микробов (Табл. 2). При добавлении тафтсина в среду инкубации в концентрации 1нМ значения основных показателей фагоцитоза оставались на уровне контрольных. Было установлено, что тафтсин способен увеличивать переваривающую способность макрофагов при концентрации в 100 раз большей, чем концентрации октарфина и иммунорфина (Табл. 2).
На следующем этапе мы изучили влияние октарфина на активность перитонеальных макрофагов, а также Т- и В-лимфоцитов селезенки мыши in vivo. Пептид вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мкг/животное за 7, 3 и 1 сутки до выделения клеток. Контролем служили клетки, полученные от мышей, которым по той же схеме делали инъекцию физиологического раствора. Было показано, что октарфин повышает способность макрофагов прилипать к пластику на 63,4% по сравнению с макрофагами, полученными от контрольных животных (p 0,01). Обнаружено, что количество распластанных макрофагов в опыте было на 80,3% больше, чем в контроле (p 0,01). На Рис. 2а видно, что у животных, которым вводили октарфин, пролиферативный ответ спленоцитов к конканавалину А (Кон А) был в 1,7 раза выше, чем у контрольных животных (p 0,01). В то же время клетки селезенки, стимулированные липополисахаридом (ЛПС) Salmonella Typhi, включали в 1, раза больше [метил-3Н]тимидина, чем в контроле (p 0,01) (Рис. 2б).
а *б * [метил- H]тимидина [метил- H]тимидина 2, 2, опыт/контроль опыт/контроль * 2, 2, Включение Включение * 1, 1, 1,0 1, 0,5 0, 0,0 0, Контроль КонА КонА + Контроль ЛПС ЛПС + октарфин октарфин Рис. 2. Влияние октарфина на активность T-лимфоцитов селезенки мыши, стимулированных Кон А (5 мкг/мл) (а), и В-лимфоцитов селезенки мыши, стимулированных ЛПС Salmonella Typhi (10 мкг/мл) (б). Приведены средние значения двух независимых экспериментов стандартное отклонение (* - p 0,01).
Таким образом, показано, что октарфин активирует перитонеальные макрофаги мыши in vitro и in vivo: при концентрации 1–10 нМ он увеличивает адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов, а также их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro;
внутрибрюшинное введение пептида также приводило к возрастанию активности перитонеальных макрофагов, а также Т- и В-лимфоцитов селезенки мыши.
3. Связывание октарфина с налоксон-нечувствительным рецептором -эндорфина мембран, выделенных из коры головного мозга крысы Изучено связывание [3H]октарфина и [3H]иммунорфина с мембранами, выделенными из коры головного мозга крысы. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3H]октарфина (Рис. 3, прямая 1) показал, что на поверхности мембран имеется один тип рецепторов к октарфину.
Kd1=2,6 0,2 нМ B/F 0,25 Kd2=2,3 0,2 нМ 0, 0, 0, 0, 0, 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0, B, нМ Рис. 3. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [ H]октарфина (1) и [3H]иммунорфина (2) с мембранами, выделенными из коры головного мозга крысы. B и F – молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида, соответственно. Реакцию проводили в проводили в 50 мМ Tрис-HCl-буферном растворе, содержащем PMSF (0,6 г/л) и налоксон (1мкМ). В пробирки вносили 100 мкл [3H]октарфина или [3H]иммунорфина (10-10 – 10-7 М, три параллельные пробы для каждой концентрации), 100 мкл среды (общее связывание) или 100 мкл 10 -4 М раствора немеченого октарфина (иммунорфина) в среде (неспецифическое связывание) и 800 мкл суспензии мембран (5 мг белка). Величину специфического связывания определяли по разности между общим и неспецифическим связыванием.
Величина неспецифического связывания [3H]октарфина и [3H]иммунорфина в присутствии 10-4 М немеченого октарфина или немеченого иммунорфина составляла 13,3 0,4 % и 11,6 0,7 %, соответственно.
[3H]октарфина Связывание характеризуется высоким сродством (Kd1 = 2,6 0,2 нМ).
[3H]иммунорфина Параллельно было изучено взаимодействие с мембранами, выделенными из коры головного мозга крысы. Результаты экспериментов показали, что на поверхности мембран имеется один класс рецепторов к [3H]иммунорфину (Рис.3, прямая 2). Связывание также характеризуется высоким сродством (Kd2 = 2,3 0,2 нМ).
Результаты экспериментов по ингибированию специфического связывания [3H]октарфина с мембранами, выделенными из коры головного мозга крысы (Табл. 3), немечеными пептидами (диапазон концентраций 10-10 – 10-6 М, три повтора для каждой концентрации) свидетельствуют о том, что только немеченые -эндорфин, иммунорфин и октарфин ингибируют связывание [3H]октарфина с мембранами, выделенными из коры головного мозга крысы, Ki = 2,6 0,2;
2,9 0,2 и 2,7 0,2 нМ, соответственно.
Таблица 3. Ингибирование специфического связывания 5 нМ [ H]октарфина с мембранами, выделенными из коры головного мозга крысы (1 мг белка), налоксоном и немечеными пептидами.
[IC]50 Ki Лиганд нМ ± стандартное отклонение 1 104 1 Налоксон 7,0 ± 0,5 2,4 ± 0, -Эндорфин Иммунорфин 8,4 ± 0,6 2,9 ± 0, 1 1 -Эндорфин 1 104 1 -Эндорфин [Met5]энкефалин 1 104 1 [Leu5]энкефалин 1 104 1 Октарфин 7,8 ± 0,6 2,7 ± 0, 0, 4 LPLVTLFK 1,2 1,5 103 0,5 TLLVTLFK 1,2 103 0,4 TPLVLLFK 1,7 103 0,6 TPLVTLLK 1,9 103 0,7 TPLVTLFL Ингибирующая активность немеченых аналогов LPLVTLFK, TLLVTLFK, TPLVLLFK, TPLVTLLK, TPLVTLFL была соответственно в 158, 191, 161, 219, 245 раз ниже активности немеченого октарфина. Налоксон и агонисты опиоидных рецепторов были неактивны, Ki 10 мкМ (Табл. 3).
Было показано, что специфическое связывания [3H]иммунорфина с мембранами, выделенными из коры головного мозга крысы, ингибируют немеченые -эндорфин и октарфин, Ki = 2,2 0,2 и 2,8 0,2 нМ, соотвественно.
Налоксон и агонисты опиоидных рецепторов были неактивны, Ki 10 мкM.
Таким образом, -эндорфин, октарфин и иммунорфин связываются с общим налоксон-нечувствительным рецептором на поверхности мембран, выделенных из коры головного мозга крысы. Это подтверждается результатами экспериментов по ингибированию связывания и сходными значениями константы диссоциации для [3H]иммунорфина и [3H]октарфина.
4. Влияние октарфина на функциональную активность миокарда крысы Анализ специфического связывания [3H]октарфина с мембранами, выделенными из миокарда крысы в координатах Скэтчарда показал, что в норме на поверхности мембран присутствует один тип рецепторов, с высоким сродством связывающих октарфин (Kd1 = 1,8 0,2 нМ) (Рис. 4, прямая 1).
Показано, что через 3 ч после экспериментального инфаркта миокарда (ЭИМ) аффинность связывания резко снижалась (Kd2 = 13,3 ± 0,4 нМ, прямая 2).
Через 24 ч после ЭИМ сродство [3H]октарфина к рецептору существенно возрастало (Kd3 = 3,6 ± 0,3 нМ, прямая 3), а через 48 ч почти полностью восстанавливалось (Kd4 = 2,2 ± 0,3 нМ, прямая 4).
B/F Kd1 = 1,8 0,2 нМ 0, Kd2 = 13,3 0,4 нМ 0,25 Kd3 = 3,6 0,3 нМ 0, Kd4 = 2,2 0,3 нМ 0,15 0, 0, 0, 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0, B, нM Рис. 4. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [ H]октарфина с мембранами, выделенными из миокарда крысы, в норме (1) и через 3 (2), 24 (3), и 48 (4) ч после ЭИМ. B и F – молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно. Реакцию проводили в проводили в 50 мМ Tрис-HCl-буферном растворе, содержащем PMSF (0,6 г/л) и налоксон (1мкМ). В пробирки вносили 100 мкл [3H]октарфина (10-10 – 10-7 М, три параллельные пробы для каждой концентрации), 100 мкл среды (общее связывание) или 100 мкл 10-4 М раствора немеченого октарфина в среде (неспецифическое связывание) и 800 мкл суспензии мембран (2 мг белка).
Величину специфического связывания [3H]октарфина определяли по разности между их общим и неспецифическим связыванием. Величина 3 - неспецифического связывания [ H]октарфина в присутствии 10 М немеченого октарфина составляла 6,8 1,2 %.
[3H]октарфина Эксперименты по ингибированию связывания с мембранами, выделенными из миокарда крысы (Табл. 4), немеченными пептидами (диапазон концентраций 10-10 – 10-4 М, три повтора для каждой концентрации) показали, что только показали, что только немеченые -эндорфин, иммунорфин и октарфин конкурируют с октарфином при связывании с миокардиальными мембранами, Ki = 1,9 0,2;
2,2 0,3 и 2,1 0,2 нМ, соответственно. Аналоги октарфина, налоксон, -эндорфин, -эндорфин, [Met5]энкефалин и [Leu5]энкефалин были неактивны, Ki 10 мкМ.
Параллельно было изучено связывание [3H]иммунорфина с мембранами, выделенными из миокарда крысы. Показано, что на поверхности мембран имеется один класс рецепторов к иммунорфину. Связывание характеризовалось высоким сродством (Kd = 2,5 0,3 нМ) и специфичностью: взаимодействие [3H]иммунорфина с мембранами, выделенными из миокарда крысы, ингибировали немеченые -эндорфин и октарфин (Ki = 2,3 0,3 и 2,4 0,3 нМ, соответственно). Налоксон и агонисты и агонисты опиоидных рецепторов были неактивны, Ki 10 мкM.
Таблица 4. Ингибирование специфического связывания 5 нМ [ H]октарфина с мембранами, выделенными из миокарда крысы (1,5 мг белка), немечеными пептидами и налоксоном.
[IC]50 Ki Лиганд нМ ± стандартное отклонение 1 104 1 Налоксон 7,0 ± 0,2 1,8 ± 0, -Эндорфин Иммунорфин 7,8 ± 0,3 2,2 ± 0, 1 1 -Эндорфин 1 104 1 -Эндорфин [Met5]энкефалин 1 104 1 [Leu5]энкефалин 1 104 1 Октарфин 7,4 ± 0,4 2,0 ± 0, 1 LPLVTLFK 1 1 103 1 TLLVTLFK 1 103 1 TPLVLLFK 1 103 1 TPLVTLLK 1 103 1 TPLVTLFL Результаты экспериментов показали, что [3H]октарфин с высоким сродством и высокой специфичностью связывается с неопиоидным рецептором -эндорфина мембран, выделенных из миокарда крысы. Изменение сродства [3H]октарфина к обнаруженному рецептору, наблюдающееся после ЭИМ, свидетельствует об изменении свойств неопиоидного рецептора -эндорфина при стрессовом воздействии.
Было изучено влияние октарфина на электрокардиографические, биохимические и гистологические показатели крыс, подвергнутых ЭИМ.
Октарфин в дозе 2 мкг/кг и 20 мкг/кг в объеме 20 мкл вводили интраназально один раз в сутки курсом 7 дней после ЭИМ. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Снижение сегмента ST на электрокардиограмме (ЭКГ) ниже изолинии, наблюдающиеся после ЭИМ, свидетельствует о недостаточности кровоснабжения и гипоксии миокарда.
Результаты, приведенные в Таблице 5, показывают, что величина депрессии сегмента ST через 3 суток после ЭИМ у крыс с введением октарфина в дозе 2 и 20 мкг/кг была соответственно в 1,5 и 1,9 раза меньше, чем у крыс после ЭИМ с введением физиологического раствора. Показано, что октарфин при введении в дозе 20 мкг/кг приводил к достоверному снижению депрессии сегмента ST в 2,1 раза на 7 сутки после операции по сравнению со сроком 3 суток после ЭИМ;
и в 5,4 раза по сравнению со сроком наблюдения 7 суток после ЭИМ с введением физиологического раствора.
Таблица 5. Влияние октарфина на величину сегмента ST у крыс с ЭИМ.
Величина сегмента ST, мм (М m) Время после Экспериментальная группа операции ЭИМ + ЭИМ + ЭИМ октарфин 2 мкг/кг октарфин 20 мкг/кг 1ч 1,42 ± 0,14 1,39 ± 0,15 1,48 ± 0, 3 суток -0,93 ± 0,11 -0,64 ± 0,13* -0,49 ± 0,15* 7 суток -1,24 ± 0,11 -0,77 ± 0,16* -0,23 ± 0,11* * - p0,05 по сравнению с крысами, подвергнутыми ЭИМ с введением физиологического раствора Таким образом, октарфин повышает устойчивость миокарда к гипоксии.
У крыс, подвергнутых ЭИМ, отмечалось уменьшение в 2 раза амплитуды зубца R на ЭКГ по сравнению со сроком наблюдения 1 ч и до операции (Табл. 6) и удлинение сегментов PQ и QT в 2,2 и 1,9 раза по сравнению со сроком наблюдения до ЭИМ (Табл. 6), что свидетельствует об угнетении сократительной активности миокарда и стойком прогрессирующем нарушении атриовентрикулярной и внутрижелудочковой проводимости. Было показано, что введение октарфина в дозе 2 и 20 мкг/кг не приводило к достоверному снижению амплитуды зубца R и наблюдалось достоверное (в 2 раза) повышение амплитуды зубца Т. Однако сохранялись достоверные нарушения внутрижелудочковой проводимости (удлинение QT в 1,3 и 1,5 раза через 1 ч и 7 суток по сравнению со сроком наблюдения до ЭИМ), но, одновременно, наблюдалась нормализация атриовентрикулярной проводимости (Табл. 6).
Таблица 6. Влияние октарфина на показатели ЭКГ у крыс с ЭИМ.
Время после Показатель (М m) операции R S T PQ QT ЭИМ 1ч 2,01±0,43 0,048±0,02 0,26±0,13 30±5 64± 7 суток 0,038±0,01 0,22±0,17 80±8* 0,80±0,19* 90±15* ЭИМ + октарфин 2 мкг/кг 1ч 2,02±0,42 0,054±0,02 0,26±0,13 35±7 60± 7 суток 1,94±0,40 0,043±0,01 28± 0,57±0,21 72± ЭИМ + октарфин 20 мкг/кг 1ч 1,93±0,46 0,047±0,009 0,25±0,12 28±5 63± 7 суток 1,81±0,41 0,039±0,01 0,58±0,20* 55±1* 70± * - p0,05 по сравнению со сроком наблюдения 1 ч;
- p0,05 по сравнению сроком наблюдения до ЭИМ.
Результаты гистологических исследований свидетельствуют о том, что на 3-е сутки после операции в зоне инфаркта кардиомиоциты утрачивали ядра и поперечную исчерченность (Рис. 5а).
а б в г Рис. 5. Гистологическая картина миокарда левого желудочка сердца крысы: через 3 суток после ЭИМ с введением физиологического раствора (а), октарфина в дозе 20 мкг/кг (б) и через 7 суток после ЭИМ с введением физиологического раствора (в) и октарфина в дозе 20 мкг/кг (г). Окраска по Ван Гизону, увеличение 407.
Большая часть некротизированных волокон находилась в состоянии лизиса и окрашивалась очень бледно. На 3-е сутки после ЭИМ кардиомиоциты крыс с введением октарфина в дозе 20 мкг/кг сохраняли ядра и поперечную исчерченность (Рис. 5б). На 7-е сутки в зоне инфаркта миокарда на месте некротизированных волокон наблюдалась пролиферативная реакция стромы с большим количеством клеток фибробластического ряда (Рис. 5в,г). При этом размеры очага пролиферации у крыс с введением октарфина в дозе 20 мкг/кг были значительно меньше, по сравнению с зоной пролиферации у крыс с введением физиологического раствора (Рис. 5г).
Результаты биохимических исследований, показывают, что октарфин достоверно снижал активность АЛТ, АСТ, КФ и ЛДГ крови. Октарфин нормализовал относительную массу сердца, а также содержание молочной кислоты, малонового диальдегида (МДА), увеличивал содержание гликогена и АТФ в миокарде.
Таким образом, октарфин улучшает коронарный кровоток, увеличивает сократительную активность миокарда и способствует нормализации нарушений атриовентрикулярной проводимости миокарда в постинфарктный период.
Пептид также снижает интенсивность цитолиза в миокарде, интенсивность перекисного окисления липидов, способствует повышению уровня антиоксидантной защиты.
5. Влияние октарфина на функциональную активность коры надпочечников крысы Изучение связывания [3H]октарфина с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы, показало, что в нормальных условиях на поверхности мембран присутствует один тип рецепторов, с высоким сродством связывающих октарфин (Kd1 = 36,3 2,5 нМ) (Рис. 6, прямая 1). Для создания модели холодового шока крыс выдерживали в течение 3 мин в состоянии свободного плавания в кювете с водой при 4°. Для создания модели теплового шока крыс помещали в вентилируемую термокамеру при 40° на 1 ч. Было показано, что холодовое и тепловое воздействие приводило к снижению аффинности связывания (Kd2 = 55,6 4,2 нМ и Kd3 = 122,7 5,6 нМ, соответственно) (Рис. 6, прямые 2 и 3).
Kd1 = 36,3 2,5 нМ B/F 0,24 Kd2 = 55,6 4,2 нМ 0,20 Kd3 = 122,7 5,6 нМ 0, 0, 0, 0, 0, В, нМ Рис. 6. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [ H]октарфина с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы, в норме (1) и после холодового (2) и теплового (3) шока. B и F – молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида, соответственно. Реакцию проводили в проводили в 50 мМ Tрис-HCl-буферном растворе, содержащем PMSF (0,6 г/л) и налоксон (1мкМ). В пробирки вносили 100 мкл [3H]октарфина (10-10 – 10-7 М, три параллельные пробы для каждой концентрации), 100 мкл среды (общее связывание) или 100 мкл 10 -4 М раствора немеченого октарфина в среде (неспецифическое связывание) и 800 мкл суспензии мембран (0,2 мг белка). Величину специфического связывания [3H]октарфина определяли по разности между их общим и неспецифическим связыванием. Величина неспецифического связывания [3H]октарфина в присутствии 10-4 М немеченого октарфина составляла 12,3 2,4 %.
Таким образом, даже кратковременный температурный шок приводит к изменению свойств рецептора, связывающего октарфин на поверхности мембран, выделенных из коры надпочечников крысы.
Результаты экспериментов по ингибированию специфического связывания [3H]октарфина с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы, немечеными пептидами (диапазон концентраций 10 -12 – 10-5 М, три повтора для каждой концентрации) показали, что только немеченые -эндорфин, иммунорфин и октарфин ингибировали связывание [ 3H]октарфина с мембранами (Табл. 7), Ki = 33,9 ± 3,6;
36,8 ± 3,3 и 37,3 ± 3,2 нМ, [Met5]энкефалин, соответственно. Налоксон, -эндорфин, -эндорфин, [Leu5]энкефалин и кортикотропин были неактивны, Ki 10 мкМ.
Таблица 7. Ингибирование специфического связывания 20 нМ [3H]октарфина с мембранами, выделенными из коры надпочечников крысы (0,2 мг белка), налоксоном и немечеными пептидами.
[IC]50 Ki Лиганд нМ ± стандартное отклонение 1 104 1 Налоксон 52,6 ± 4,2 33,9 ± 3, -Эндорфин 1 1 -Эндорфин 1 104 1 -Эндорфин [Met5]энкефалин 1 104 1 [Leu5]энкефалин 1 104 1 1 104 1 Кортикотропин Иммунорфин 57,0 ± 4,5 36,8 ± 3, Октарфин 57,8 ± 4,3 37,3 ± 3, Таким образом, [3H]октарфин с высоким сродством и высокой специфичностью связывается с неопиоидным рецептором -эндорфина мембран, выделенных из коры надпочечников крысы. Кратковременный температурный шок приводит к изменению свойств обнаруженного рецептора.
Эксперименты по изучению влияния октарфина на аденилатциклазную активность мембран, выделенных из коры надпочечников крысы показали, что пептид в концентрациях 1–1000 нМ снижал активность аденилатциклазы.
Было изучено влияние октарфина на продукцию КС клетками коры надпочечников крысы. Пептид в дозе 5 и 20 мкг/животное в объеме 100 мкл вводили интраназально один раз за 1, 6 и 24 ч до определения концентрации КС. Уровень КС у крыс контрольной группы определялся в утренние часы, спустя час от интраназального введения физиологического раствора.
Результаты экспериментов показывают, что через 1 и 6 ч после интраназального введения пептида наблюдалось увеличение содержания КС в надпочечниках (Рис. 7а) и снижение его содержания в плазме крови (Рис. 7б).
а в надпочечниках (мкг/г) 1ч 6ч 24 ч ** ** Концентрация КС * * * * ар ин ь кг кт н 2 кг 2 кг г 20 кг ар ин кг кт ф ол кт ф мк м м О ин м ин м О ар 0 м О ар тр ф ф н ар ф кт он ар и К и кт ф кт О О О в плазме крови (мкг/мл) б 6ч 1ч 24 ч Концентрация КС 0, 0, * * * * * 0, * 0, 0, 0, 0, ар и ль 20 кг мг 20 кг кг г 20 мк кг О ин м кт ф мк ин м кт арф о м р ин ф н нт фн ф ин ар и Ко ар ф кт р О ар О кта кт кт О О О Рис. 7. Влияние октарфина на уровень КС в надпочечниках (а) и плазме крови (б) крыс через 1, 6 и 24 часа после интраназального введения пептида в дозе 5 мкг/животное (светло-серый столбик) и 20 мкг/животное (темно-серый столбик). Приведены средние значения двух независимых экспериментов стандартное отклонение (* - p0,02, ** - p0,001).
Через 24 ч после интраназального введения октарфина в дозах 5 и 20 мкг/животное содержание КС в плазме снижается более чем на 50% (Рис. 7б), при этом происходит незначительное увеличение уровня КС в надпочечниках (Рис. 7а), что говорит об ингибирующем действии октарфина как на секрецию, так и на синтез КС. Таким образом связывание октарфина с неопиоидным рецептором -эндорфина на поверхности мембран клеток коры надпочечников крысы приводит к ингибированию активности аденилатциклазы и блокированию выброса кортикостерона из надпочечников в кровь.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе проведения экспериментов с использованием синтетического пептида октарфина (TPLVTLFK) – фрагмента 12-19 молекулы -эндорфина удалось изучить распределение неопиоидного рецептора -эндорфина в организме и охарактеризовать эффекты, развивающиеся при его активации.
Оказалось, что данный тип рецептора имеется на клетках иммунной (перитонеальные макрофаги), нервной (мембраны, выделенные из коры головного мозга), сердечнососудистой (мембраны, выделенные из миокарда) и эндокринной (мембраны, выделенные из коры надпочечников) систем.
Показано, что неопиоидный рецептор -эндорфина чувствителен к воздействию стресса, поскольку наблюдалось изменение сродства октарфина к данному типу рецептора при экспериментальном инфаркте миокарда и кратковременном температурном шоке. Связывание октарфина с неопиоидным рецептором -эндорфина характеризуется высокой специфичностью. Это подтверждается данными о том, что единичные аминокислотные замены в молекуле пептида приводят к резкому снижению его сродства к рецептору. Полученные результаты свидетельствуют о том, что связывание -эндорфина с неопиоидным рецептором обеспечивает фрагмент гормона 12- (последовательность октарфина).
Были получены данные о действии октарфина на клетки иммунной, сердечнососудистой и эндокринной систем. Показано, что пептид активирует перитонеальные макрофаги, а также Т- и В-лимфоциты селезенки мыши;
нормализует электрокадиографические, гистологические и биохимические показателей крыс при экспериментальном инфаркте миокарда;
ингибирует аденилатциклазную активность мембран, выделенных из коры надпочечников крысы, и подавляет секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь.
Таким образом, показано, что октарфин обладает выраженным иммуностимулирующим, противошемическим, кардиопротекторным и стресс-протекторным действием.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что меченный тритием октарфин ([3H]октарфин) с высоким сродством и высокой специфичностью связывается с налоксон-нечувствительным рецептором -эндорфина на поверхности перитонеальных макрофагов мыши и на поверхности мембран, выделенных из коры головного мозга, миокарда и коры надпочечников крысы.
2. Обнаружено, что октарфин стимулирует активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro: он увеличивает адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов, а также их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415.
Показано, что внутрибрюшинное введение октарфина приводит к возрастанию активности перитонеальных макрофагов, а также увеличивает активность T- и В-лимфоцитов селезенки.
3. Установлено, что октарфин обладает выраженным противоишемическим и кардиопротекторным действием: улучшает коронарный кровоток, повышает сократительную активность миокарда, снижает интенсивность цитолиза, сокращает скорость перекисного окисления липидов в миокарде, способствует повышению уровня антиоксидантной защиты.
4. Показано, что октарфин in vitro ингибирует активность аденилатциклазы коры надпочечников крысы и подавляет in vivo секрецию кортикостерона из надпочечников в кровь.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Некрасова Ю.Н., Садовников В.Б., Золотарев Ю.А., Наволоцкая Е.В.
Свойства и механизм действия синтетического пептида октарфина.
Биоорганическая химия. 2010, 36(45), 638-645.
2. Nekrasova Yu.N., Sadovnikov V.B., Zolotarev Yu.A., Navolotskaya E.V.
Binding of synthetic peptide TPLVTLFK to nonopioid beta-endorphin receptor on rat brain membranes. Journal of Peptide Science. 2010, 16(2), 263-268.
3. Ковалицкая Ю.А., Некрасова Ю.Н., Садовников В.Б., Золотарев Ю.А., Наволоцкая Е.В. Иммуностимулирующее действие синтетического пептида октарфина, соответствующего фрагменту 12-19 -эндорфина.
Биохимия. 2011, 76(5), 729-739.
4. Некрасова Ю.Н., Наволоцкая Е.В. Синтетический пептид октарфин TPLVTLFK – селективный агонист неопиоидного рецептора -эндорфина. Биологические мембраны. 2011, 28(6), 523-532.
5. Некрасова Ю.Н., Золотарев Ю.А., Наволоцкая Е.В. Взаимодействие синтетического пептида октарфина с мембранами миокарда крысы.
Биохимия. 2011, 76(12), 1659-1664.
6. Nekrasova Yu.N., Zolotarev Yu.A., Navolotskaya E.V. Detection of nonopioid -endorphin receptor in the rat myocardium. Journal of Peptide Science. 2012, 18(2), 83-87.
7. Nekrasova Yu.N., Zolotarev Yu.A., Navolotskaya E.V. Synthetic peptide TPLVTLFK (octarphin) reduces the corticosterone production by rat adrenal cortex through nonopioid -endorphin receptor. Journal of Peptide Science.
2012, 18(8), 495-499.
8. Некрасова Ю.Н., Золотарев Ю.А., Наволоцкая Е.В. Взаимодействие синтетического пептида октарфина с мембранами коры надпочечников крысы. Биохимия. 2012, 77(12), 1693-1698.