Генетическое разнообразие энтеровирусов, циркулирующих на территории западной сибири и сахалинской области. молекулярно-биологический анализ геномов потенциально онколитических энтеровирусов коксаки а
На правах рукописи
Демина Анна Владимировна Генетическое разнообразие энтеровирусов, циркулирующих на территории Западной Сибири и Сахалинской области.
Молекулярно-биологический анализ геномов потенциально онколитических энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6 03.02.02 – вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Кольцово-2012 2 Раб бота выполнен в Федеральн бюджетном учреждении науки «Госуд на ном м и дарственный нау учный центр ви ирусологии и б биотехнологии «Вектор»» М и Минздравсоцра азвития Рос ссии Нау учный член-к корреспондент РАН, доктор биологически наук, т р их рук ководитель профеессор Нетесов Сергей Викто орович Оф фициальные Бочар Евгений Федорович - док ров ктор медицинс ских наук, опп поненты: профеессор, ФБУН Г ГНЦ ВБ «Вект тор», помощниик генерального дирек ктора по экспер ртно-аналитич ческой и научн но-образовател льной работе Рябчи икова Елена Ив вановна - докт биологичес тор ских наук, профе ессор, ИХБФМ СО РАН, ста М арший научный сотрудник й Вед дущая организ зация Учреж ждение россий йской академии медицинских наук и х Инсти итут полиомие елита и вирусн энцефалит имени ных тов М.П. Чумакова РАМ МН Защ щита состоится « 25 » мая я 2012 г. в 9.00 часов на з заседании дисс сертационногоо сов вета Д 208.020.01 при ФБУ «Государс УН ственный науч чный центр вирусологии и в био отехнологии « «Вектор»» по а адресу: 630559 р.п. Кольцо 9, ово, Новосибиррского района а Новосибирской ообласти, тел. ( 383)336-74- Сд диссертацией м можно ознаком миться в библи иотеке ФБУН Г ГНЦ ВБ «Вект тор» Авт тореферат разо ослан «_» » _2012 г.
Ученый секретар диссертацио рь онного совета д.б.н. Г.П. Трошкова Г
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Энтеровирусы человека принадлежат к роду Enterovirus семейства Picornaviridae, порядок Picornavirales. В настоящее время известно более 100 различных генотипов энтеровирусов. В соответствии с современной классификацией, которая базируется на молекулярно-генетических характеристиках геномов вирусов, выделяют 4 вида энтеровирусов человека (A, B, C, D) (King, 2011).
Одними из наиболее изученных представителей рода Enterovirus являются полиовирусы, которые относятся к виду энтеровирусов человека С. Вирусы полиомиелита (I, II и III типов) в течение долгого времени являлись причиной высокой заболеваемости людей, приводящей к инвалидизации части заболевших и даже к смерти. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в одном из 200 случаев инфицирования развивается необратимый паралич (обычно ног), 5 10% из числа таких парализованных людей умирают из-за наступающего паралича дыхательных мышц (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs114/ru/index.html). В результате проведенных научных исследований вирусов полиомиелита и разработки вакцин в борьбе с данной инфекцией достигнут значительный успех, ведущий к возможному искоренению этой инфекции. Так, по данным ВОЗ за период с 1988 по 2011 гг. число случаев заболевания полиомиелитом уменьшилось более чем на 99% – с 350000 случаев до 1349. В первой половине 2011 года лишь четыре страны – Афганистан, Индия, Нигерия и Пакистан – оставались эндемичными по полиомиелиту, в то время как в 1988 году число таких стран превышало (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs114/ru/index.html).
Таким образом, всемирная программа ликвидации полиомиелита постепенно реализуется и в недалеком будущем может быть успешно завершена.
Однако в последние годы значительно возросла роль неполиомиелитных энтеровирусов в возникновении инфекционных заболеваний, что подтверждается результатами научных исследований. Например, вирус Коксаки А7 был первым из числа неполиомиелитных энтеровирусов, который уже в 50-е годы стал известен как возбудитель полиомиелитоподобного паралитического заболевания. В 1952-1968 гг.
вирус Коксаки А7 вызвал вспышки полиомиелитоподобной инфекции среди детского населения в Казахстане, Шотландии, Швеции, Швейцарии. В 80-х годах выявили новое заболевание глаз, которое вызвали вирулентные варианты вирусов ECHO19 и ECHO11, в результате оно получило название «острый энтеровирусный увеит». В России в 1980-1989 гг. зарегистрировано пять вспышек энтеровирусной инфекции, осложненной увеитом, в трех крупных городах Сибири (Красноярск и край 1980-1981;
1982, 1986;
Омск 1987-1988;
Иркутск 1988-1989).
Современные научные исследования показали возможную роль энтеровирусов в возникновении заболеваний, которые, как считалось ранее, не имели отношения к вирусам. Например, острые и хронические миокардиты могут быть вызваны вирусами Коксаки В. При первично диагностированном инсулинзависимом сахарном диабете у пациентов в три раза чаще обнаруживают антитела IgM к вирусам Коксаки А9, В1, В2, В3 и В5, чем у контрольных лиц;
кроме того, у таких больных, нередко выявляют энтеровирусы молекулярными методами.
В настоящее время наиболее важным широко наблюдаемым проявлением энтеровирусной инфекции является серозный менингит. Первый подъем заболеваемости серозным менингитом энтеровирусной этиологии был зарегистрирован в мире в конце 40-х годов XX века. После периода относительного благополучия, на фоне снижения и отсутствия эпидемического полиомиелита, с начала 70-х годов во всем мире начался второй эпидемический подъем заболеваемости энтеровирусным серозным менингитом.
В Новосибирске и Новосибирской области за период с 1993 по 2004 гг.
зафиксировано три значительных вспышки серозного менингита энтеровирусной этиологии, в которые были вовлечены 365 человек (http://54.rospotrebnadzor.ru).
Анализ архивных материалов санитарно-эпидемиологической службы показал, что энтеровирусные заболевания начали эпизодически регистрироваться в России в составе острых кишечных инфекций неясной этиологии только с 1960-х годов. При этом не было надежных и дешевых средств диагностики, и поэтому сведения об их встречаемости в России носили отрывочный характер. Элементы эпидемиологического надзора за энтеровирусными (неполио) инфекциями на территории Российской Федерации введены лишь с 2006 г., и поэтому исследования, посвященные выявлению эпидемиологического значения неполиомиелитных энтеровирусов, немногочисленны.
Таким образом, роль неполиомиелитных энтеровирусов в возникновении инфекционных заболеваний велика, что требует углубления научных исследований и совершенствования практической медицины в этой области.
В настоящее время самыми информативными являются молекулярно эпидемиологические исследования энтеровирусных инфекций, поскольку их результаты позволят уточнить источники и пути передачи этих патогенов, предсказать возможные вспышки этих инфекций, а также наметить наиболее важные пути разработки вакцин против этих патогенов.
Цели исследования: изучение генетического разнообразия энтеровирусов человека в Западной Сибири и на Дальнем Востоке, а также молекулярно генетический анализ геномов штаммов энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6 с потенциальными онколитическими свойствами.
Задачи исследования:
1. Сбор и создание коллекции образцов ликвора и фекалий от пациентов с подозрением на энтеровирусную инфекцию для вирусологического и молекулярно-биологического исследования.
2. Исследование указанных образцов на наличие РНК энтеровирусов.
3. Изучение возможности культивирования изолятов энтеровирусов на культурах клеток.
4. Генотипирование изолятов энтеровирусов человека, встречающихся в Западной Сибири и на Дальнем Востоке.
5. Выявление возможных связей между генотипами изолятов энтеровирусов человека и клиническими синдромами, которые они вызывают.
6. Определение и молекулярно-генетический анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов потенциальных онколитических штаммов энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6.
7. Исследование инфекционных (цитолитических) свойств штаммов потенциально онколитических энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6.
Научно-практическая значимость. Впервые проведено исследование заболеваемости энтеровирусными инфекциями, в том числе одной из наиболее социально значимых ее форм – серозным менингитом – в Новосибирске и Новосибирской области, а также исследование вспышки желудочно-кишечной инфекции в 2010 году в Сахалинской области.
Впервые установлены генотипы энтеровирусов, циркулирующих на территории Новосибирска, Новосибирской области и Сахалинской области.
Собрана коллекция биопроб от больных с энтеровирусной инфекцией, а также от больных с серозными менингитами различной этиологии: энтеровирусной, герпесвирусной и др.
Впервые проведен молекулярно-генетический анализ и исследование инфекционных (цитолитических) свойств геномов штаммов потенциально онколитических энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6.
Результаты проведенных исследований показывают несомненную необходимость молекулярно-эпидемиологического контроля над энтеровирусной инфекцией, в частности за серозным менингитом энтеровирусной этиологии и кишечными инфекциями.
Использованные в работе методики могут быть применены в практической медицине, в работе эпидемиологических служб при диагностике энтеровирусных инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
1. Основным типом энтеровирусов, циркулирующих на территории Новосибирска и Новосибирской области и определяющим заболеваемость серозными менингитами в 2008 г., был ECHO30 (72%).
2. Случай энтеровирусной экзантемы полости рта и конечностей в г. Новосибирске, вызван вирусом Coxsackie A6.
3. Во время вспышки острой кишечной инфекции в августе 2010 г. в Сахалинской области основными возбудителями были энтеровирусы Cox A (45%) и Cox A4 (34%). Выделенные в Сахалинской обл. изоляты имеют наиболее высокую гомологию по нуклеотидной последовательности с энтеровирусами, выявленными в Восточной Азии: Японии (P 2346/CB1/Kanagawa/2003 (AB162750), 1095-LPS1 (AB550333)), Китае (SSM CVB3 (GU109481)), Корее (2000/CSF/KOR (AY875692)) в 2000-2010 гг.
Вклад автора:
Сбор клинических образцов, анализ историй болезни пациентов с подозрением на энтеровирусную инфекцию на базе ГИКБ №1 г. Новосибирска, создание коллекции образцов РНК энтеровирусов, выделенных из различных биологических проб, собранных в Новосибирской и Сахалинской областях, тестирование олигонуклеотидных праймеров для генодиагностики и генотипирования РНК энтеровирусов выполнено лично автором. Выявление РНК энтеровирусов в поступивших образцах и определение нуклеотидных последовательностей выявленных вариантов, филогенетический анализ фрагментов геномов энтеровирусов, выявленных в Новосибирской и Сахалинской областях выполнено лично автором при участии В.А.Тернового. Определение полных нуклеотидных последовательностей и молекулярно-генетический анализ геномов штаммов LEV8 и LEV15 – совместно с В.А.Терновым, В.А.Святченко и А.Ю.Тикуновым.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 222 работы: 32 – отечественных авторов, 174 – зарубежных и 16 ссылок на электронный ресурс.
Работа иллюстрирована рисунками, 3 фотографиями и включает 19 таблиц.
Апробация результатов диссертации и публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций;
а также подана заявка на патент РФ №2011125215, дата приоритета 17.06.2011 г. (решение о выдаче патента от 05.03.2012 г.).
Полученные результаты исследований были доложены на Российских и Международных конференциях: на XV Научно-практической конференции врачей (г. Новосибирск, 2005);
на XI Международном Симпозиуме по респираторным вирусным инфекциям (г. Бангкок, Таиланд, 2009);
на I Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2009);
на 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (г. Вена, Австрия, 2010);
на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (г. Москва, 2010);
на 21-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (г. Милан, Италия, 2011);
на 2-ой Международной конференции «Астана Биотех 2011» (г. Астана, Казахстан, 2011);
на IV Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2012);
на 22-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (г. Лондон, Великобритания, 2012);
на заседаниях Новосибирского областного общества эпидемиологов и инфекционистов в 2004-2011 гг.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы в НИИ Химической биологии и Фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) и ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и очищены двукратной жидкостной хроматографией.
Штаммы энтеровирусов LEV8 и LEV15 любезно предоставлены П.М.
Чумаковым.
Клинический материал. В настоящей работе были использованы образцы спинномозговой жидкости и фекалий от 246 пациентов с диагнозом «серозный менингит», а также с подозрением на энтеровирусную инфекцию. Клинический материал был собран в МБУЗ г. Новосибирска Городской инфекционной клинической больнице №1 и в МУЗ г. Новосибирска Детской городской клинической больнице № в течение 2008 – 2009 гг.
Также в работе использованы образцы фекалий от 100 пациентов с острой кишечной инфекцией, 1 проба воды насосной и 1 проба 20% сметаны производства ОАО «Южно-Сахалинский молочный комбинат», поступивших из ФГУЗ ЦГиЭ Сахалинской области 01 сентября 2010 года.
Суспензию фекалий готовили интенсивным перемешиванием на приборе Vortex 1-3 г материала в 500 мкл 0,1М Na-фосфатном буфере pH 7,4, центрифугировали 15 мин при 4800g для удаления дебриса. Полученный супернатант хранили при -70°С и применяли в дальнейшем исследовании.
Для выделения РНК из спинномозговой жидкости брали по 100 мкл пробы.
Выделение нуклеиновых кислот производили из 100 мкл образца с использованием наборов «РИБО-сорб» (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя.
Обратная транскрипция. Комплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием набора реагентов «Реверта-L» (с random праймерами) (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя.
Полимеразная цепная реакция. Для проведения ПЦР готовили смесь компонентов следующего состава (из расчета на одну пробу в 30 мкл смеси): 0,2 мM каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1,5 мМ MgCl2, 30 мM Трис-HCl (рН 8, при +25°С), 16 мМ (NH4)2SO4, 0,1% Nonidet P40 («Sigma»), по 0,15 мкМ специфических олигонуклеотидных праймеров и 1,5 еа Taq ДНК полимеразы («СибЭнзим», Россия), 3 мкл исследуемой кДНК на 30 мкл реакционной смеси.
Температурные условия амплификации для разных пар праймеров подбирали экспериментально (типичные условия: 95°С – 5 min, Тотжига-30 sec, 72°С – 10 sec;
72°С – 7 min, 45 циклов).
Электрофоретический анализ и выделение ампликонов из геля. Продукты амплификации разделялись на 2% агарозном геле в буфере ТАЕ. Для визуализации ДНК гель окрашивался бромистым этидием. Гель фотографировали с использованием системы видеодокументирования Molecular Imager ChemiDoc XRS System 170- (BIO-RAD, США). Для выделения продуктов амплификации из геля использовали набор Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США).
Определение нуклеотидных последовательностей. После проведения ПЦР с праймерами к 5'-UTR и VP1 регионам образцы очищали с использованием набора Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System производства «Promega» (США) и секвенировали по прямой и обратной цепи ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей проводилось на автоматическом секвенаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) (США). Все последовательности были определены дважды в независимых экспериментах.
Анализ последовательностей. Для генотипирования выявленных вариантов энтеровирусов проводили филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов 5’-UTR длиной 350 – 450 н.о. и VP1 длиной 350 – 400 н.о. Для сравнения использовали последовательности прототипных изолятов.
Множественное сравнение последовательностей осуществляли с использованием пакета программного обеспечения LaserGene 8. Филогенетический анализ и расчет молекулярных часов проводили с помощью программ MEGA 5 и TREE-PUZZLE (Schmidt, 2002), а также при помощи программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Настоящая работа выполнена на базе МБУЗ г. Новосибирска Городской Инфекционной Клинической больницы №1 – анализ архива историй болезни пациентов с диагнозом серозный менингит с 1993 по 2011 гг., непосредственное участие в диагностике и лечении пациентов с серозными менингитами с 2004 по гг., сбор коллекции биологических сред (ликвора и фекалий) от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию, в том числе с серозными менингитами в 2008 – 2009 гг.
Лабораторная часть исследования выполнена в лаборатории молекулярной эпидемиологии ООИ Отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» – выделение энтеровирусов из биологических сред, генотипирование изолятов и секвенирование выделенных изолятов, а также в вирусологической лаборатории Swedish Institute for Infection Disease Control, г. Стокгольм, Швеция.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Расчет праймеров для определения генотипов энтеровирусов Ввиду отсутствия коммерчески доступных олигонуклеотидов для генотипирования энтеровирусов нами был проведен дизайн уникальных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для выявления и генотипирования энтеровирусов видов A, B, C, D (на 5’UTR).
Структуры праймеров, рассчитанных нами на основании сравнения нуклеотидных последовательностей различных штаммов энтеровирусов вида А, В, С, D, депонированных в международной базе данных GenBank, и использованных для амплификации фрагментов геномов энтеровирусов 5’UTR, а также VP1 приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Праймеры, использованные для анализа проб методом ПЦР.
Название Район Нуклеотидная последовательность Позиция Т отжига (0 С) праймера генома ЭВ в геноме в направлении F903-30 5’UTR CAAGNACTTCTGTTNCCYCGGACNGA 72-98 R41-32 5’UTR ATNTNTCAATTGTCANCATAAGCAGCCA 493-521 F40-31 5’UTR GAAGAGTCTATTGAGCTARTTGGT 328-352 R42-33 5’UTR ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC 446-472 Z951 5’UTR FAM–CCTYCGGCNCCTGAYTGCGGCTAATCC– 354- BHQ F224 VP3 GCIATGYTIGGIACICAYRT 1977-1996 F292 VP1 MIGCIGYIGARACNGG 2612-2627 R222 VP1 CICCIGGIGGIAYRWACAT 2969-2951 Праймеры для определения полной нуклеотидной последовательности энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В Для определения полной нуклеотидной последовательности энтеровирусов Коксаки А7 и Коксаки В6 при помощи пакета программного обеспечения LaserGene на основе сравнения известных полных нуклеотидных последовательностей геномов Коксаки А7 и Коксаки В6 были рассчитаны 60 олигонуклеотидных праймеров.
Исследование биологических проб от пациентов, поступивших в ГИКБ №1 г. Новосибирска с подозрением на серозный менингит и/или энтеровирусную инфекцию В период с 2006 по 2009 гг. был проведен анализ историй болезни пациентов с серозными менингитами, поступивших в ГИКБ №1 г. Новосибирска. За этот период поступило 293 человека (74 – в 2006 г., 62 – в 2007 г., и 59 – в 2008 г., 98 – в 2009 г.) с диагнозом серозный менингит. Наряду с архивными данными ГИКБ №1 за 1993 – 2005 гг., 2010-2011 гг. это позволило построить следующий график, который отражает динамику госпитализации пациентов с серозными менингитами в течение 19 лет.
(Рис.1).
Количество человек 120 80 74 62 42 36 40 41 60 23 31 Рис. 1. Количество больных с СМ, поступивших в ГИКБ№1 за период 1993 – 2011 гг.
Эти данные указывают на то, что подъем заболеваемости серозными менингитами в г. Новосибирске происходит каждые 5-6 лет.
На следующем рисунке (Рис. 2) представлена сезонная динамика заболеваемости серозными менингитами. Наибольшая заболеваемость пришлась на летне-осенние месяцы.
Количество пациентов 45 35 25 20 15 10 10 9 8 5 2006 2007 2008 июнь-август июнь-август сентябрь-ноябрь июнь-август сентябрь-ноябрь июнь-август декабрь-февраль декабрь-февраль сентябрь-ноябрь декабрь-февраль сентябрь-ноябрь декабрь-февраль март-май март-май март-май март-май Рис. 2. Сезонность заболевания серозными менингитами Заболеваемость не зависела от пола, а наибольшее число заболевших было в возрасте до 30 лет – 233 человека (80%), то есть болеют в основном молодые люди.
Молекулярно-биологическое и эпидемиологическое исследование пациентов ГИКБ №1 в 2008-2009 гг.
Для исследования на наличие РНК энтеровирусов был взят материал от пациентов ГИКБ №1 в 2008-2009 гг. со следующими диагнозами: серозный менингит –165 человек (72,1 %), острая респираторная инфекция – 56 человек (24,5 %), инфекционная диарея – 4 человек (1,7 %), экзантема – 3 человека (1,3 %), герпангина – 1 человек (0,4 %).
Из 246 проб было 199 образцов СМЖ и 47 образцов фекалий. При этом от пациентов с серозным менингитом были собраны как фекалии, так и СМЖ.
Биологический материал от больных исследовался методом ПЦР со специфическими праймерами к 5'UTR и VP1 региону.
5'UTR является относительно консервативным участком генома энтеровирусов и поэтому используется для скрининговой диагностики. ПЦР со специфическими праймерами на VP1 регион позволяет генотипировать энтеровирусы в случае, когда при определении нуклеотидной последовательности 5'UTR не представляется возможным уточнить генотип.
Положительными образцами в данном исследовании считались те, которые были положительны в ПЦР со специфическими праймерами к 5'UTR, всего образцов (67 пациентов). Из них 26 образцов подтверждено в ПЦР по VP1 региону.
Для 42 – была определена нуклеотидная последовательность.
Из 199 проб СМЖ энтеровирусы выявлены в 56 образцах (28,1%), из 47 проб фекалий в 14 образцах (29,8%).
Результаты генотипирования выявленных энтеровирусов Определение нуклеотидных последовательностей по 5’UTR и VP1 региону исследованных нами энтеровирусов выявило их принадлежность к следующим генотипам: Cox A2 (10%), Cox A4 (5%), Cox A6 (3%), Cox A14 (3%), Cox A16 (7%), Cox B5 (7%), ECHO 6 (2%), ECHO 9 (2%), ECHO 2 (2%), ECHO 25 (2%), и наибольший процент был представлен генотипом ECHO 30 (57 %).
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов 5’UTR региона выявил принадлежность 24 изолятов к генотипу энтеровирусов ECHO30 (Рис.3). Наиболее близкие к ним изоляты этого генотипа ранее были выявлены в Австралии (Australia-2006(GU236299), Australia-2006(GU236300)), Франции (France-1997(AM237015), France-1997(AM237014), France-1997(AM237013), France-1991(AM237021), France-1992(AM237034)), США (USA-1995(EU870486)) и Нидерландах (Netherlands-2006(DQ534205)) в 1992-2006 гг.
Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента 5’UTR четырех изолятов выявил их принадлежность к генотипу CoxA2, наиболее близкий изолят был выявлен в Японии в 2003 году (Japan-2003(AB126199)).
Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента 5’UTR трех изолятов выявил их принадлежность к генотипу CoxA16, наиболее близкий изолят выделен в Китае в 2008 г. (China-2008(FJ198212)). Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента 5’UTR трех изолятов выявил их принадлежность к генотипу CoxВ5, наиболее близкий изолят был выявлен в Южной Корее в 2000 г. (South Korea-2000(AY875692)). Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента 5’UTR двух изолятов выявил их принадлежность к генотипу CoxA4, наиболее близкий изолят был выявлен в Японии в 2003 г. (Japan-2003(AB126200)).
Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента 5’UTR изолята L32 выявил его принадлежность к генотипу ECHO25. Наиболее близкий изолят был выявлен в Австралии в 1999 г. (Australia-1999(GU236268)).
Изолят F102 – генотип CoxA14, прототип выявлен в США в 2003 г. (strain G- (AY421769)). Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента 5’UTR изолята F83-2 выявил принадлежность ее к генотипу CoxA6, наиболее близкий изолят был выделен в Сингапуре в 2008 году (Singapore-2008(GU198756)).
L34 5UTR L96 5UTR L33 5UTR L61 5UTR L31 5UTR L28 5UTR L25 5UTR L26 5UTR L22 5UTR L20 5UTR L105 5UTR L108 5UTR L29 5UTR Echo30 Australia-06(GU236299) 80 Echo30 Australia-06(GU236300) Echo30 USA-95(EU870486) Echo30 France-92(AM237034) Echo30 France-97(AM237014) Echo30 France-97(AM237013) Echo30 France-97(AM237015) Echo30 Netherlands-06(DQ534205) Echo30 France-2000(AM237026) Echo25 Australia-99(GU236268) 100 L32 5UTR F83-2 5UTR CoxA6 Singapore-08(GU198756) F67 5UTR CoxA16 China-08(FJ198212) CoxA2 Japan-03(AB126199) BL37 5UTR 77 F84 5UTR 0, Рис. 3. Филогенетическое древо энтеровирусов ECHO 30, ECHO 25, Cox A6, Cox A16, Cox A2, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента генома 5’UTR (72-521 п.о.).
Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием 2-х параметрической модели Кимуры (с помощью программы MEGA5). Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей. Линия отражает генетическую дистанцию.
- прототипные штаммы F, L, BL - идентификационные номера исследуемых образцов Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена VP1 выявил принадлежность изолятов L105, L119 и L56 (2008 г.) к геному энтеровирусов ECHO 30. Наиболее близкие по последовательности изоляты этого генотипа ранее были выявлены в Корее в 2008 г. (South Korea-2008(FJ848358), South Korrea-2008(FJ 8361), South Korea-2008(F FJ848349)), Нидерландах (Netherlands- 06(DQ534205)) и России, в Нижнем Новг ) городе в 2008 г. (Russia- 08(GQ250164),, Rus ssia-2008(GU6646397), Russia a-2008(GU6463 396)). Филоге енетический ан нализ изолята а F83 выявил его принадлежно 3-2 о ость к геному энтеровируса Cox A6, наиб у а более близкие е изо оляты по даннному региону ббыли выделен в Финлянди в 2007-2008 гг. (Finland ны ии 08(GU248466)) и Исландии ( ) (Iceland-2007(G GU248459)).
Встречааемость генотипов энтеровирусов в эпид демические се езоны 2008 и 2009 гг. в г. Но овосибирске На Рис. 4 видно, что в 2008 г. бол льшую часть выявленных энтеровирусов э в сос ставил ECHO 3 (76 %). На д 30 долю генотипа Cox B5 прих а ходится 9 %, Cox A16 – 6 %, C, а н долю Cox A Cox A2 и Cox A4 – по 3 %. В 200 г., в отличи от 2008 г., на A6, 09 ие, обр разцов, содерж жащих ECHO 3 обнаружено не было. В 30, 2009 г. наибольший процентт сре энтеровиру еди усов составил Cox A2 (33 %). Генотип C A4 состав 22%, а на л Cox вил а дол ECHO 6, EC лю CHO 9, ECHO 2 и CoxA 16 п пришлось по 11% на каждый генотип.
й Таким оббразом, среди больных в 2009 г. не в и выявлено ECH HO30, однакоо уве еличилась выяявляемость Co oxA2, CoxA16 и появились новые генот 6 ь типы: CoxA4,, EC CHO 2,6,9.
100% CoxB B5;
3% ECHO25;
3% E ECHO2;
11% CoxA A6;
3% 90% CoxA A2;
3% CoxB B5;
6% ECHO9;
11% E 80% CoxA 16;
6% E ECHO6;
11% 70% 60% CoxA4;
22% C 50% 40% ECHO 30;
72% 30% C CoxA2;
33% 20% 10% CoxA16;
11% 0% 008 Рис 4. Распреде с. еление генотип энтеровир пов русов среди па ациентов с эн нтеровирусной й инф фекцией в 2008 г. и 2009 г.
Связь между серотипами энтеровирусов человека и клиническими синдромами, которые они вызывают У больных c острой респираторной инфекцией выявлены следующие генотипы: Cox A2, Cox A16, ECHO 25 и ECHO 30, причем, как и среди больных серозным менингитом, большая часть приходится на генотип ECHO30 (73%), а на долю генотипов Cox A2, Cox A16 и ECHO 25 приходилось по 9% (Рис. 5).
Среди больных с серозным менингитом более половины случаев (51,7%) были вызваны вирусом генотипа ECHO 30. Также обнаружены энтеровирусы CoxA2 и CoxB5 (по 10,3%), CoxA16 и CoxA4 (по 6,9%) и ECHO6, ECHO9, CoxA14 и ECHO (по 3,4%) (Рис. 6).
У больного с герпангиной обнаружен генотип ECHO 30. У больного с экзантемой выявлен генотип Cox A6, данный клинический случай будет подробно рассмотрен ниже.
CoxA CoxA16 CoxA CoxA2 11,1% 9,1% 9,1% 7,4% ECHO CoxB 9,1% ECHO 11,1% 51,9% CoxA ECHO 7,4% ECHO 72,7% 3,7% ECHO ECHO 3,7% 3,7% Рис. 6. Энтеровирусы, Рис. 5. Энтеровирусы, выделенные у больных с серозным выделенные у больных с ОРВИ менингитом Обсуждение результатов В работе были получены данные о циркуляции энтеровирусов, на территории г. Новосибирска, которые вызывают различные клинические синдромы. Основное количество биологических проб было получено из МБУЗ г. Новосибирска ГИКБ № 1, куда госпитализируется взрослое население города и области от 15 лет, поэтому проб от детей было очень мало.
По результатам исследования видно, что наибольший процент заболевших как среди мужчин, так и среди женщин приходится на возраст до 30 лет. После 30 лет эта цифра значительно снижается. Это может быть связано с тем, что среди энтеровирусов существует множество генотипов и при заражении ЭВИ вырабатываются антитела, специфичные к определенному генотипу. Кроме этого, выработанные антитела могут реагировать перекрестно, т.е. взаимодействовать с несколькими генотипами. Исходя из этих данных, мы предполагаем, что человек, перенесший разные энтеровирусные инфекции, к определенному возрасту имеет специфические антитела, которые будут нейтрализовать разные генотипы энтеровирусов.
При изучении заболеваемости в течение года выявлено, что для энтеровирусной инфекции характерна летне-осенняя сезонность. Эта закономерность коррелирует с данными, опубликованными в мировой литературе (Pallansch, 2007;
Ortner, 2009).
Среди общего количества генотипированных образцов энтеровирусов наибольший процент приходился на ECHO 30. Этот же генотип наиболее распространен среди больных серозным менингитом и среди больных острой респираторно-вирусной инфекцией. В 2008 г. на долю ECHO 30 приходилось 73 % среди генотипированных образцов, однако в 2009 г. этот генотип выделить не удалось. Это говорит о циркуляции ECHO 30 в г. Новосибирске только в 2008 г., что подтверждено также данными об обнаружении энтеровируса этого генотипа в сточных водах в 2008 г. Центром Гигиены и Эпидемиологии г. Новосибирска (Щербатов А.Ф., 2011). При этом в 2009 г. наибольший процент среди генотипированных образцов приходился на Cox A2 (33 %) и Cox A4 (22 %), которые не обнаружены в 2008 г. Такая смена генотипов может быть связана с тем, что значительная доля населения стала иммунной к ECHO30. При этом появление в 2009 г. новых генотипов вызвало подъем заболеваемости серозными менингитами энтеровирусной этиологии, что отражено на Рис. 1. Таким образом, подъем заболеваемости энтеровирусной инфекцией скорее всего обуславливается появлением в циркуляции среди населения новых генотипов.
При анализе филогенетических деревьев можно заметить, что для всех изолятов, для которых определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена 5’UTR, прототипами являются энтеровирусы, выделенные в разных странах. Этот факт и процент гомологии исследуемых образцов с прототипами от 86 до 99% говорит как о широком распространении энтеровирусов, так и о циркуляции специфических для данной территории штаммов, выявленных на территории г. Новосибирска.
Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента генома, кодирующего VP1 регион, позволяет сделать вывод, что генотип изолята L (ECHO 30), циркулировал среди населения г. Новосибирска. Для изолята L119 (ECHO 30) прототипом являются генотипы, выявленные в России. Высокий уровень гомологии изолятов L56 (ECHO 30) с прототипом из Нижнего Новгорода (Russia- (GU646397)) и F83-2 (Cox A6) с прототипом из Финляндии (Iceland-2007(GU248459)) может свидетельствовать о завозе штаммов прототипов на территорию г. Новосибирска из перечисленных регионов.
Изучение случая энтеровирусной экзантемы полости рта и конечностей, вызванного изолятом вируса Coxsackie А В следующей главе диссертации идет речь о заболевании, протекавшем с поражением кожи кистей, стоп, полости рта. В России «энтеровирусная экзантема полости рта и конечностей» отдельно в статистических формах не учитывается. К сожалению, таким больным далеко не всегда сразу выставляют правильный клинический диагноз, и поэтому их пробы не направляют на исследование на энтеровирусную инфекцию. В результате в России нет источника систематических данных о случаях и этиологии данной болезни.
Клинический случай Больная, Н., 28 лет, обратилась к врачу 10 ноября 2008 года с жалобами на лихорадку до 37,7°С, слабость, боли в горле, боль при глотании, сыпь на ладонях, ступнях. Заболела остро 08.11.2008 г., появились боли в горле, недомогание. На следующий день температура повысилась до 37,7°С, боли в горле усилились.
Самостоятельно не лечилась. На третьи сутки от начала заболевания заметила сыпь «в виде пузырьков» на ладонях и подошвах стоп, болезненную при пальпации, после чего обратилась к врачу.
Женщина являлась медицинским работником и накануне заболевания осуществляла уход за больными с серозными менингитами неуточненной этиологии.
Никто из членов ее семьи не заболел.
Status praesens communis: при первичном осмотре - состояние легкой степени тяжести, температура 37,6°С. Кожные покровы нормального цвета, влажные;
на ладонях и подошвах стоп, а также на пальцах рук и ног - экзантема в виде везикул диаметром 2-3 мм с серозным содержимым, выступающих над уровнем кожи, окруженных венчиком гиперемии. Наблюдалась инъекция сосудов склер. Ротоглотка гиперемирована, на слизистой задней стенки глотки - везикулярная энантема.
Миндалины увеличены до I ст., налетов нет. Носовое дыхание свободно.
Подчелюстные лимфатические узлы не увеличены, безболезненные. Костно мышечная система без особенностей и изменений. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца ясные, ритмичные, шумов нет. Живот мягкий, безболезненный.
Печень, селезенка не увеличены, безболезненные. Физиологические отправления в норме.
Клинический материал (фекалии, полученные на 3 сутки от начала заболевания) исследовали методом ПЦР на наличие РНК ротавирусов, астровирусов, коронавирусов, норовирусов, энтеровирусов и ДНК аденовирусов (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, торговые марки «Амплисенс», Россия). В исследованных образцах была обнаружена только РНК энтеровируса. Полученный результат был подтвержден секвенированием. Для этого, с использованием вирусспецифических праймеров, описанных в (Nix, 2006), методом ОТ-ПЦР был получен фрагмент ДНК последовательности гена VP1 (357 п.о.). Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена VP1 выявил ее принадлежность к геному энтеровирусов Коксаки А6. Наиболее близкие по последовательности изоляты этого генотипа были выявлены в Японии в 2000 г. (P-557/CA6/Kanagawa/2000 (AB114101), P-497/CA6/Kanagawa/2000 (AB114095)), в Финляндии в 2009 г. (Fin/Tu (FJ870508), Fin/Ta81125 (FJ870502)), в Индии в 2009 г. (HFMD TS040/09 (GU393306), HFMD VF07/09 (GU393305)) и в Великобритании в 2007 г. (CSF-1739/07 (FJ525951)).
Уровень гомологии последовательности фрагмента гена VP1 выявленного нами изолята с ними составил 98%.
Таким образом, выявленный энтеровирус Коксаки А6, который мы назвали AD/CA6/Novosibirsk/2009 (по аналогии с подобными Коксаки-вирусами), входит в общую кладу с энтеровирусами, выделенными ранее в Юго-Восточной Азии и в Европе (Рис. 7).
82 Fin/Tu 99 Fin/Se Fin/Ta HFMD TS040/ HFMD VF07/ CSF-1739/ 1278/CA6/Hyogo/ P-557/CA6/Kanagawa/ 87 P-536/CA6/Kanagawa/ P-516/CA6/Kanagawa/ 86 P-497/CA6/Kanagawa/ AD/CA6/Novosibirsk/ Gdula P-548/CA5/Kanagawa/ 100 P-526/CA5/Kanagawa/ 0. Рис. 7. Филогенетическое древо энтеровирусов Коксаки А6 и AD/CA6/Novosibirsk/2009, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента гена VP1 (2612 - 2969 п.о.). Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием 2-х параметрической модели Кимуры (с помощью программы MEGA5). Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей. Линия отражает генетическую дистанцию.
- изолят AD/CA6/Novosibirsk/2009, исследованный в нашей работе В выведенных аминокислотных последовательностях фрагмента гена VP1 (c 2612 п.о. по 2969 п.о.) энтеровируса Коксаки А6 AD/CA6/Novosibirsk/2009 каких-либо замен по отношению к вышеуказанным двум штаммам обнаружено не было.
Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента 5’UTR изолята вируса также выявил принадлежность ее к генотипу CoxA6, наиболее близкий изолят был выделен в Сингапуре в 2008 году (Singapore-2008 (GU198756)) (Рис. 3).
Таким образом, приведенный здесь клинический случай энтеровирусной экзантемы полости рта и конечностей – первый описанный случай этой болезни в России, причиной которого явился энтеровирус Коксаки А6. Это еще раз указывает на множественность этиологии данного заболевания (в добавление к ЭВ71, Коксаки А10, А16 и т.п.).
Близость по нуклеотидной последовательности данного изолята к изолятам из Японии, Индии, Сингапура, Финляндии и Великобритании может говорить как о его широкой распространенности, так и о значительной генетической стабильности, хотя окончательный вывод может быть сделан только путем молекулярно эпидемиологического мониторинга этого симптомокомплекса на территории Евразии.
Нуклеотидная последовательность части генома (фрагмент VP1 района) депонирована нами в GenBank (AD/CA6/Novosibirsk/2009 (HM559584)).
Расследование вспышки острой кишечной инфекции, энтеровирусной этиологии в сахалинской области в августе 2010 г.
С использованием праймеров к 5’UTR нами была уточнена этиология вспышки в Сахалинской области в августе 2010 г.
01 августа 2010 г. в г. Южно-Сахалинске началась вспышка заболеваемости острыми кишечными инфекционными заболеваниями (ОКИ). Всего за данный период зарегистрировано 1439 случаев острых кишечных инфекционных заболеваний. В возрастной структуре заболевших доля взрослых составила 30,3%, дети до 17 лет – 69,7%. Из клинических форм преимущественно преобладал острый гастроэнтерит – 63,9%, в остальных случаях – пищевая токсикоинфекция. В 49,2% регистрировалась легкая форма тяжести заболеваний острыми кишечными инфекциями, в 50,8% – среднетяжелая форма, случаев с тяжелой формой не зарегистрировано.
Изучение проб в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» показало, что в исследованных клинических образцах генетический материал (вирусные РНК или ДНК) адено-, норо-, астро-, ротавирусов, а также ДНК Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis и Listeria monocytogenes отсутствует.
Из 102 проб в 91 образце фекалий, в 1 пробе воды насосной и 1 пробе 20% сметаны (91% проб) нами была обнаружена РНК энтеровирусов, из которых образец фекалий (56%) от детей до 14 лет. После определения нуклеотидных последовательностей амплификационных фрагментов ДНК в положительных образцах были идентифицированы энтеровирусы: Коксаки А2 – 42 образца (45%), Коксаки А4 – 31 образец (34%), Энтеровирус 71– 6 образцов (6,5%), Коксаки В5 – образцов (6,5%), Коксаки В3 – 4 образца (4%) и Коксаки В1 – 4 образца (4%).
После проведения 3 последовательных пассажей на культуре клеток Vero были выделены и первично охарактеризованы штаммы Коксаки А2 (штамм Sah51), A (штамм Sah5) и Коксаки В5 (штамм Sah2).
Таким образом, нами было проведено расследование вспышки острой кишечной инфекции в Сахалинской области в августе 2010 г. По результатам лабораторных исследований в биологическом материале от больных в 79% обнаружены РНК энтеровирусов Коксаки A2, Коксаки А4. Связь с водным фактором подтвердили обнаруженные РНК энтеровирусов Коксаки A2 в пробе воды питьевой, отобранной на насосной №28 распределительной сети централизованного водоснабжения г. Южно-Сахалинска, связь с молочной продукцией – обнаруженные РНК энтеровирусов Коксаки A2 в пробе 20% сметаны.
Филогенетический анализ показал, что наиболее близкие по нуклеотидным последовательностям штаммы этих генотипов энтеровирусов были выявлены в Японии в 2003 г. (P-2242/CA2/Kanagawa/2003 (AB126199), P 2181/CA2/Kanagawa/2003 (AB126197), P-2329/CA2/Kanagawa/2003 (AB162738)) – для Коксаки А2 и (P-2232/CA4/Kanagawa/2003 (AB126200)) – для Коксаки А4 (Рис.8).
На фоне выявления основных генотипов Коксаки А2 и А4, в 21 % случаев нами обнаружены другие энтеровирусы (Коксаки В5, Коксаки В3, Коксаки В1, Энтеровирус 71) у людей с признаками энтеровирусной инфекции.
Филогенетический анализ показал, что наиболее близкие по нуклеотидным последовательностям штаммы этих генотипов энтеровирусов были выявлены в Японии в 2003 г. для Коксаки В1 (P-2346/CB1/Kanagawa/2003 (AB162750)), в Японии в 2010 г. для Энтеровирусов 71 (1095-LPS1 (AB550333)), в Китае в 2006 г. для Коксаки В3 (SSM-CVB3 (GU109481)), в Корее в 2000 г. для Коксаки В (2000/CSF/KOR (AY875692)) (Рис.9).
Определенные нуклеотидные последовательности (фрагменты 5’UTR) депонированы нами в GenBank (JN603367 – JN603368, JQ041369 – JQ041371, JQ065869 – JQ065870).
SRN17 12- SRN23 12- SRN15 12- SRN9 12- SRN7 12- SRN5 12- SR62-002 10- SR56-005 10- SR55-003 10- SF74- SF7- SF1- SRN27 12- SRN28 12- SRN30 12- SF73- SRN31 12- CoxA2 Japan-03(AB126199) CoxA2 Japan-03(AB126197) CoxA2 Japan-03(AB162738) SRN21 12- SF51-001 10- SF52-003 10- SF72- SRN16 12- SR75-009 10- SR71-001 10- SRN29 12- SR54-001 10- SR57-007 10- SR66- SR76-011 10- 87 SR81-004 10- SRN12 12- SRN22 12- SRN25 12- SR58-009 10- SR80-015 10- SRN8 12- 63 SRN10 12- Polio3 China-10(FJ859192) Aphthovirus India-09(EF120403) 0, Рис. 8. Филогенетическое древо энтеровирусов Коксаки А2, построенное по последовательности фрагмента гена 5’UTR (c 73 п.о. по 520 п.о.). Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием 2-х параметрической модели Кимуры (с помощью программы MEGA5). Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей. Линия отражает генетическую дистанцию.
*- ввиду большого количества определенных нуклеотидных последовательностей построено два филогенетических древа;
наиболее гомологичные последовательности не включены.
- прототипные штаммы;
– аутгруппа (группа сравнения);
SRN, SR, SF – идентификационные номера исследуемых образцов.
SRN2 12- SRN6 12- SRN26 12- SRN11 12- SRN24 12- SR77-013 10- SRN32 12- SR82-004 10- SRN19 12- SR74-007 10- SR69- SF70- CoxA4 Japan-03(AB126200) SRN18 12- SR60-013 10- SRN14 12- CoxB1 Japan-03(AB162750) SF6- 60 SF8- 93 CoxB3 China-06(GU109481) SF2- SF80- SF53-005 10- CoxB5 Korea-00(AY875692) SF4- SF13- EV71 Japan-10(AB550333) Aphthovirus India-09(EF120403) Polio3 China-10(FJ859192) МБ-7/4647(EU251188) 0, Рис. 9. Филогенетическое древо энтеровирусов Коксаки А4, В1, В3, В5, EV71, построенное по последовательности фрагмента гена 5’UTR (c 73 п.о. по 520 п.о.).
Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием 2-х параметрической модели Кимуры (с помощью программы MEGA5). Цифры около узлов отражают индекс поддержки ветвей. Линия отражает генетическую дистанцию.
- прототипные штаммы;
– аутгруппа (группа сравнения);
SRN, SR, SF – идентификационные номера исследуемых образцов Исследование потенциально онколитических энтеровирусов: штаммов LEV8 и LEV П.М. Чумаковым были предоставлены для исследования в НГУ и в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» несколько штаммов энтеровирусов для исследования их потенциальных онколитических свойств и определения полных нуклеотидных последовательностей их геномов.
Ранее в 1960 – 1970-х гг. эти штаммы были исследованы М. К. Ворошиловой с коллегами в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН, г. Москва. Была установлена возможность вирусного лизиса опухолевых клеток под действием непатогенных энтеровирусов и проведены исследования возможности терапии онкологических заболеваний при помощи живых энтеровирусных вакцин (live enterovirus vaccine (LEV)) (Ворошилова, 1979).
Государственный Комитет по Делам Открытий и Изобретений СССР выдал диплом, удостоверяющей это открытие.
В данной части работы нами определены полные нуклеотидные последовательности геномов, проведен молекулярно-генетический анализ, исследованы инфекционные свойства полученных штаммов вирусов LEV8 и LEV15 с целью решения вопроса о возможности использовать данные штаммы при создании онколитических вирусных препаратов.
Исследование цитолитических свойств энтеровирусных штаммов на панели опухолевых и нормальных клеток человека Онколитическая активность штаммов LEV8 и LEV15 определялась in vitro на культурах опухолевых клеток человека различных типов: А431 (эпидермоидная карцинома человека), А549 (эпителиальная аденокарцинома легких человека), SW (аденокарцинома толстой кишки человека), C-33A (HPV-негативная карцинома шейки матки), DU-145 (карцинома предстательной железы), RD (клетки рабдомиосаркомы человека), Mel-8 (клетки меланомы человека) и на нормальных диплоидных культурах клеток человека: ФЭЧ-15 (диплоидная культура кожно-мышечной ткани эмбриона человека) и HEK293 (клетки почки эмбриона человека). Литическую активность исследуемых вирусных штаммов выражали через 50%-ную тканевую цитопатогенную дозу (ТЦПД50/мл). Результаты приведены в таблице 2.
Как выяснилось, вирус штамма LEV8 (Коксаки А7) инфицирует нормальные диплоидные клетки человека, однако существенно эффективнее он лизирует опухолевые культуры C-33A и RD. Вирус штамма LEV15 (Коксаки В6) практически не инфицирует диплоидную культуру кожно-мышечной ткани эмбриона человека ФЭЧ-15 (инфекционный титр 103 ТЦПД50/мл), но инфицирует и эффективно лизирует опухолевые культуры С-33A и DU-145.
Таблица 2.
Инфекционные титры штаммов LEV8 и LEV15 на различных нормальных и опухолевых культурах клеток человека Титр на культуре клеток ТЦПД50/мл Культура клеток Штамм LEV8 Штамм LEV ФЭЧ-15 107 HEK 103 A 103 SW 103 A 103 Mel- 2109 C-33A 104 DU- RD Молекулярно-биологическое исследование штаммов LEV8 и LEV Для установления генотипов штаммов LEV8 и LEV15 образцы вирусного материала после пасcирования на культуре клеток HEK293 (клетки почки эмбриона человека) исследованы методом ОТ-ПЦР с использованием набора олигонуклеотидных праймеров на 5’UTR для диагностики и генотипирования энтеровирусов человека видов A, B, C, D (как описано в главе Материалы и методы).
Полученные фрагменты ДНК секвенировали. По определенной нуклеотидной последовательности 5’UTR генома, была установлена принадлежность штамма LEV к энтеровирусам Коксаки А7, а штамма LEV15 к энтеровирусам Коксаки В6.
После установления генотипов штаммов LEV8 и LEV15 были рассчитаны праймеры на весь геном энтеровируса Коксаки А7 и энтеровируса Коксаки В6. С их использованием были определены полные нуклеотидные последовательности геномов штаммов LEV8 и LEV15.
Филогенетический анализ показал, что наиболее близкие по нуклеотидным последовательностям штаммы этих генотипов энтеровирусов были зарегистрированы в США в 2003 г. (Human coxsackievirus A7 strain Parker, GenBank AY421765) и в Канаде в 1999 г. (Coxsackievirus B6 strain Schmitt, GenBank AF105342).
После повторной наработки на культуре клеток HEK293 проведено ресеквенирование полного генома штамма Coxsackie A7. Последовательность депонирована в международной базе GenBank под номером JQ041367. После повторной наработки вирусов на культуре клеток HEK293 проведено ресеквенирование полного генома штамма Coxsackie B6. Последовательность депонирована в международной базе GenBank под номером JQ041368.
Нуклеотидная последовательность штамма LEV8 вируса Коксаки А составила 7404 н. При сравнении с прототипным штаммом Human coxsackievirus A strain Parker (США, 2004г.) процент гомологии составил 99% для нуклеотидной ( нуклеотидных отличий) и 99% для аминокислотной последовательностей ( аминокислотных отличий).
Нуклеотидная последовательность штамма LEV15 вируса Коксаки В составила 7398 н. При сравнении с прототипным штаммом Coxsackievirus B6 strain Schmitt (Канада, 1999г.) процент гомологии составил 99% для нуклеотидной ( нуклеотидных отличий) и 99% для аминокислотной последовательностей ( аминокислотных отличий).
Штамм Коксаки A7 (LEV8) по сравнению с наиболее близким прототипом Human coxsackievirus A7 strain Parker (США, 2003 г.) имеет 8 аминокислотных замен.
Так, замена N524K находится в белке VP3 в rhv_like регионе. Замены T913A в белке 2А;
A1122V, E1215X, V1412L в белке 2С;
K1442R в белке 3А, D1609X в белке 3С и E2159K в белке 3D. В тоже время, в сравнении с другими генотипами энтеровирусов процент гомологии как по нуклеотидной, так и по аминокислотным последовательностям ниже 91%.
Штамм Коксаки В6 (LEV15), по сравнению с наиболее близким прототипом Coxsackievirus B6 strain Schmitt (Канада, 1999г.), имеет аминокислотные отличия в белке VP1: K654T, V699I и A727T, находящиеся в rhv_like регионе. Кроме того в VP1 присутствует отличие V594E, а в белке 3D имеется отличие V2159I. В тоже время, в сравнении с другими генотипами энтеровирусов процент гомологии как по нуклеотидной, так и по аминокислотным последовательностям ниже 91%.
Таким образом, нами впервые проведено молекулярно-биологическое исследование вирусных штаммов LEV8 – Коксаки А7 (JQ041367) и LEV15 – Коксаки В6 (JQ041368). Показано, что они могут эффективно лизировать некоторые культуры опухолевых клеток человека, к тому же штамм LEV15 не инфицирует диплоидную культуру. Учитывая свойства обоих штаммов, их потенциально можно использовать как онколитические препараты или как основу для таковых.
ВЫВОДЫ 1. В образцах от пациентов с серозным менингитом, ОРВИ, герпангиной и инфекционной экзантемой, собранных в 2008-2009 гг. в г. Новосибирске и Новосибирской области, выявлены энтеровирусы следующих генотипов:
наибольший процент был представлен изолятами ECHO 30 (57 %), а также Cox A2 (10%), Cox A4 (5%), Cox A6 (3%), Cox A14 (3%), Cox A16 (7%), Cox B5 (7%), ECHO 6 (2%), ECHO 9 (2%), ECHO 2 (2%), ECHO 25 (2%).
2. Филогенетический анализ 5’UTR и VP1 региона генов энтеровирусов, выделенных в Новосибирской области, показал, что близкие изоляты ранее были выявлены в Европе, России, Америке, Азии и Австралии в 1992-2009 гг.
3. В образцах от пациентов с острой кишечной инфекцией, а также в пробах воды и молочных продуктов, собранных во время вспышки в августе 2010 г. в Сахалинской области, выявлены энтеровирусы следующих генотипов:
наибольший процент был представлен генотипами Cox A2 (45%) и Cox A (34%), кроме того выявлены EV 71 (6,5%), Cox В5 (6,5%), Cox В3 (4%) и Cox В (4%).
4. Филогенетический анализ 5’UTR геномов энтеровирусов, выделенных в Сахалинской области показал, что наиболее близкие им изоляты были выявлены в странах Восточной Азии: Японии (P-2346/CB1/Kanagawa/2003 (AB162750), 1095-LPS1 (AB550333)), Китае (SSM-CVB3 (GU109481)), Корее (2000/CSF/KOR (AY875692)) в 2000-2010 гг.
5. Установлено, что в клиническом случае энтеровирусной экзантемы полости рта и конечностей в г. Новосибирске в 2008 году возбудителем являлся изолят вируса Coxsackie A6. Филогенетический анализ 5’UTR и VP1 региона генома вируса Coxsackie A6, показал, что близкие изоляты ранее были выявлены в Европе и Юго-Восточной Азии в 2000-2009 гг.
6. Определены и проанализированы полные нуклеотидные последовательности потенциально онколитических штаммов LEV8 (Coxsackie А7 (JQ041367)) и LEV15 (Coxsackie В6 (JQ041368)). Филогенетический анализ показал, что наиболее близкие по нуклеотидным последовательностям штаммы этих генотипов энтеровирусов были определены в США в 2003 г. (Human coxsackievirus A7 strain Parker (AY421765)) и в Канаде в 1999 г. (Coxsackievirus B6 strain Schmitt (AF105342)). Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Демина А.В., Маркович Н.А., Нетесов С.В. Энтеровирусы. Часть 1: история открытия, таксономия, строение генома, эпидемиология.// Бюллетень СО РАМН. 2008. №1 (129). С.92-100.
2. Демина А.В., Нетесов С.В. Энтеровирусы. Часть 2. Энтеровирусные инфекции:
многообразие клинических проявлений // Бюллетень СО РАМН. 2009. №6 (140).
С.116-125.
3. Демина А.В., Терновой В.А., Шульгина Н.И., Нетесов С.В. Энтеровирусы. Часть 3. Лабораторная диагностика, лечение, иммунопрофилактика и профилактичес кие мероприятия в очаге // Бюллетень СО РАМН. 2011. №3 (31). С.115-122.
4. Демина А.В., Терновой В.А., Нордер Х., Нетесов С.В. Случай энтеровирусной экзантемы полости рта и конечностей, вызванный вирусом Coxsackie A6 // Журнал «Эпидемиология и инфекционные болезни». 2011. №3. С.23-26.
5. Демина А.В., Терновой В.А., Дарижапов Б.Б., Якубич Т.В., Семенцова А.О., Демина О.К., Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Агафонов А.П., Нетесов С.В.
Вспышка острой кишечной инфекции энтеровирусной этиологии в Сахалинской области в августе 2010 г. // Вестник РАМН. 2012. №2. С.64-68.
Доклады и тезисы конференций 1. Кузнецова В.Г., Мечетина А.А., Демина А.В., Денисова А.А., Караваева Ю.Ю.
Клинико-эпидемиологическая характеристика энтеровирусного менингита по данным вспышки 2004 года. // Сборник материалов XV Научно-практической конференции врачей. Новосибирск. 26-27 апреля 2005г. С.415-416.
2. Demina A.V., Mechetina A.A., Karavaeva U.U., Burmistrova T.G. Clinical and epidemiological characteristic of enterovirus infection from 1993 until 2007 in Novosibirsk, Russia. // XI International Symposium on Respiratory Viral Infections.
Bangkok, Thailand. February 19 – 22, 2009. http://www.themacraegroup.com.
3. Демина А.В., Мечетина А.А., Караваева Ю.Ю., Нагорная И.Н. Особенности течения энтеровирусных менингитов в Новосибирской области. // I Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва. 30 марта - апреля 2009 г. С.56-57.
4. Demina A.V., Ternovoi V.A. Spread and outbreaks of enterovirus types in Novosibirsk, Russia. // 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Vienna, Austria. April 10-13, 2010. P.1858.
5. Демина А.В., Терновой В.А., Нордер Х., Нетесов С.В. Случай энтеровирусной экзантемы полости рта и конечностей, вызванный вирусом Coxsackie A6. // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика-2010». Москва. 24-26 ноября 2010 г.
www.md2010.org.
6. Demina A.V., Ternovoi V.A., Norder H., Netesov S.V. Hand, Foot and Mouth Disease, caused by Coxsackie A6 virus // 21th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Milan, Italy. May 7-10, 2011. P.2114.
7. Демина А.В., Терновой В.А., Нордер Х., Нетесов С.В. Молекулярная диагностика случая энтеровирусной экзантемы полости рта и конечностей // 2-ая Между народная конференция «Астана Биотех 2011». Астана, Казахстан. 10-11 октября 2011 г. C.32.
8. Демина А.В., Терновой В.А., Дарижапов Б.Б., Якубич Т.В., Семенцова А.О., Демина О.К., Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Агафонов А.П., Нетесов С.В.
Молекулярно-эпидемиологическая характеристика вспышки острой кишечной инфекции в Сахалинской области // IV Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва. 26-28 марта - 2012 г. С.56-57.
9. A. Demina, V. Ternovoi, B. Darizhapov, T. Yakubich, A. Sementsova, O. Demina, E.
Protopopova, V. Loktev, A. Agafonov, S. Netesov. Outbreak of acute enterovirus intestinal infection in Sakhalin region in August 2010 // 22th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. London, United Kingdom. March, 31 April, 3, 2012. P.917.
Благодарности Автор благодарит сотрудников лаборатории молекулярной эпидемиологии ООИ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»: зав. лабораторией к.б.н. В.А. Тернового и зав.
сектором к.б.н. Е.В. Чаусова за обучение методам молекулярной диагностики, участие в проведении экспериментов, а также за терпение, понимание и всестороннюю поддержку. Также признательна коллегам из ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» д.б.н. Локтеву В.Б., к.ф.-м. н. Швалову А.Н., к.б.н. Бондаренко Т.Ю., к.б.н. Ивановой А.В., к.б.н.
Святченко В.А. и к.б.н. Протопоповой Е.В. за плодотворное сотрудничество и ценные предложения;
к.б.н. О.В. Носаревой и А.Е. Нестерову за помощь и поддержку в подготовке диссертации.
Автор выражает благодарность коллегам из вирусологической лаборатории Swedish Institute for Infection Disease Control, г. Стокгольм, Швеция – PhD, Ass Prof.
Helne Norder, Prof. Lars Magnius за помощь в проведении экспериментов и совместный анализ полученных данных.
Также благодарит коллег из Городской Инфекционной Клинической Больницы №1 г. Новосибирска, особенно – коллектив 7 отделения под руководством Бурмистровой Татьяны Германовны, коллектив 4 отделения под руководством Солоповой Татьяны Борисовны, врача-инфекциониста Мечетину Анну Антоновну за помощь в сборе коллекции биологических проб и обработке результатов.
Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю д.б.н., член-корр. РАН, профессору Сергею Викторовичу Нетесову за помощь в выборе темы и направления исследований и всестороннюю поддержку, а также профессору П.М Чумакову за особое внимание к последней части работы и ее поддержку.
Настоящая работа выполнена за счет финансирования по грантам НШ 65387.2010.4 и НШ-2996.2012.4 по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации, по гранту Фонда МФТИ №00012/00049 «Создание региональной референс-лаборатории для ПЦР-диагностики вирусных гепатитов», по Госконтракту № 02.740.11.0767 «Выявление вирусных возбудителей заболеваний, актуальных для здравоохранения Западной Сибири (гепатиты, гастроэнтериты, серозный менингит), изучение их генетического разнообразия в целях разработки и совершенствования диагностикумов» и по Договору НГУ с Министерством образования и науки № 11.G34.31.0034 «Новые подходы к разработке лекарств:
поиск, отбор и конструирование непатогенных для человека штаммов вирусов, перспективных для использования в качестве онколитических препаратов».