Роль глутаматных рецепторов и na/k-насоса в регуляции окислительного стресса
На правах рукописи
КАЗЕЙ Василий Игоревич РОЛЬ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И Na/K-НАСОСА В РЕГУЛЯЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва- 2007
Работа выполнена в ГУ НИИ неврологии РАМН (г. Москва)
Научный консультант:
Заслуженный деятель науки РФ доктор биологических наук профессор БОЛДЫРЕВ Александр Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук профессор ЛОПИНА Ольга Дмитриевна доктор биологических наук профессор СЫРОЕЖКИН Антон Владимирович
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Защита диссертации состоится _ _ 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г. Москва, ул.
Миклухо-Маклая, д.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, г.
Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан «_» _ 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203. доктор биологических наук, профессор ЛУКАШЕВА Е.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Окислительный стресс, являющийся следствием дисбаланса про- и анти-оксидантных систем клетки и выражающийся в образовании активных форм кислорода (АФК), может являться причиной повреждения различных структур клетки и приводить к клеточной смерти. Показано также, что окислительный Отформатировано: Шрифт:
стресс лежит в основе ряда нейродегенеративных заболеваний. не полужирный Однако активные формы кислорода принимают участие и в нормальной жизнедеятельности клетки. Образование супероксид-аниона и гипохлорита используется клетками иммунной системы при защите от инфекций и опухолевых процессов.
Свободные радикалы, которые образуются в цитозоле клетки в ответ на стимуляцию факторами роста, участвуют в регуляции процесса пролиферации. Образование простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов также требует участие супероксид аниона. Показано, что АФК наряду с другими факторами способны активировать такой транскрипционный фактор как NF-В, что приводит к экспрессии целого ряда различных белков.
Для исследования окислительного стресса применяются различные подходы, позволяющие выяснить молекулярные механизмы этого процесса как in vitro, так и in vivo.
Для моделирования этого процесса можно использовать различные методы. В настоящей работе мы использовали линию животных с ускоренным процессом старения SAMP (Senescence Accelerated Mice Prone, Strain 1), выведенную путем близкородственных скрещиваний из линии AKR/J. Истинным контролем к данной линии является линия SAMR1 (Resistant), также выведенная из линии AKR/J.
Для моделирования окислительного стресса в нейронах in vitro мы использовали N метил-D-аспартат (NMDA) - соединение, активирующее одноименный класс ионотропных глутаматных рецепторов. Инкубируя выделенные из мозжечка нейроны крыс и мышей линии SAMP1 с различными концентрациями NMDA, мы наблюдали дозо- и время зависимый прирост уровня АФК.
Недавно было показано, что центральный фермент ионного гомеостаза, Na/K ATФаза, может принимать участие в процессах окислительного стресса, однако в литературе отсутствует систематическое исследование роли Na/K-ATФазы в этом процессе и ее функциональное взаимодействие с другими клеточными системами, принимающими участие в реализации окислительного стресса.
Целью настоящей работы было установление взаимосвязи между глутаматными рецепторами, окислительным стрессом и Na/K-АТФазой.
Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи: 1) оценить продукцию АФК в клетках мозжечка двух исследуемых линий животных;
2) оценить влияние глутаматных рецепторов и Na/K-АТФазы на развитие окислительного стресса;
3) оценить влияние АФК на физиологические и биохимических параметры животных;
4) охарактеризовать взаимодействие глутаматных рецепторов и Na/K-АТФазы.
Научная новизна и практическая значимость работы. С помощью современных подходов были продемонстрированы различия в уровне АФК в мозге мышей линии SAMP1 и SAMR1. Показано защитное действие Na/K-АТФазы на нейроны в условиях окислительного стресса. Выявлено влияние NMDA и уабаина на этот процесс.
Продемонстрировано влияние АФК на ряд физиологических параметров.
Охарактеризована экспрессия различных изоформ Na/K-ATФазы и разных групп глутаматных рецепторов в мозге крыс в ранний постнатальный период.
Продемонстрировано влияние NMDA на активность Na/K-ATФазы. Дальнейшее изучение взаимоотношений NMDA рецепторов и Na/K-ATФазы позволит выявить возможность коррекции различных патологических состояний.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции по церебральной ишемии (Марбург, Германия, 2002 год), международной конференции-школе по окислительному стрессу (Будапешт, Венгрия, 2003), на международной конференции по исследованию мышей линии SAM (Саппоро, Япония, 2004), на конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы», Пенза, 2006. Апробация работы состоялась на межлабораторном семинаре Института неврологии РАМН в 2006 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Ведения, Обзора литературы, Результатов и их обсуждения, Заключения, Выводов и Списка литературы.
Работа изложена на _ стр. печатного текста, содержит _ рисунков и _ таблиц.
Список литературы включает _ наименований.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. В экспериментах использовали крыс и мышей линии SAMP1 и Отформатировано: русский контрольной к ней SAMR1. Мышей линии SAMP1 и SAMR1 использовали в возрасте 14- (Россия) 16 месяцев, то есть в тот период жизни животных, когда наблюдаются отчетливые различия в их поведении, внешнем виде и ряде биохимических показателей. При работе с нейронами их выделяли из мозжечка молодых (8-15 дней) крыс и мышей линий SAM.
Физиологические методы. Животных обеих исследуемых линий разбивали на две сходные группы (по 5-6 животных в каждой), формируемые на основании тестирования в норковой камере, что сводило к минимуму исходные различия у животных. Подопытной группе вводили MPTP в соответствии с разработанным протоколом, контрольные животные в это же время получали физиологический раствор в таком же объеме.
Физиологическое состояние животных оценивали по различным параметрам, определяемым в тесте «Норковая камера».
Активность Na/K-ATФазы измеряли после разрушений клеток 5-кратным замораживанием-оттаиванием оценивали по высвобождению неорганического фосфата после инкубации проб в присутствии 3 мМ MgАТФ в среде, содержащей 130 мМ NaCl и 20 мМ KCl.
Определение активных форм кислорода проводили тремя разными способами: в присутствии 50 µМ люминола на хемилюминометре LKB 1250 (Швеция), в присутствии Удалено: и с помощью того же количества люминола на счетчике фотонов MARK II (Дания). проточного цитометра:
клеточную супензию ( Определение активности МАО В проводили в митохондриальной фракции мозга клеток/мл) инкубировали с µМ, DCFН2-DA, в течение мин при 37С. 2,2`дихлор методом, разработанным для регистрации активности МАО типа В с бензиламином в дигидрофлуоресцеин, окисляясь перекисью водорода в клетке, качестве субстрата (Минеева, Стволинский, 1996). превращается в дихлорфлуоресцин, соединение определяли по подавлению скорости Активность супероксиддисмутазы с ex=485 нм и em=535 нм.
Средняя интенсивность восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) при генерации супероксидного анион- флуоресценции клеточной популяции пропорциональна среднему уровню АФК в радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой при 560 нм. Реакционная клетках данной популяции смесь, инкубируемая при 25 оC, содержала 50 мМ К,Nа-фосфатный буфер (рH 7,8);
0,1 мМ (Болдырев, 2000).
Отформатировано: русский ЭДТА;
0,1 мМ ксантина;
25.10-3 мМ НСТ (Юнева, 2003). (Россия) Удалено:
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика окислительного стресса в мозге грызунов Настоящий раздел исследования выполнен на клетках мозжечка быстростареющих мышах линии SAMP1. В качестве контроля использовались мыши линии SAMR1.
После добавления 50 µМ люминола к суспензии нейронов, выделенных из мозжечка животных или измеряли стационарный уровень SAMP1 SAMR1, хемилюминесценции, отражающей продукцию свободных форм кислорода. При измерении хемилюминесценции суспензии нейронов SAMP1 и SAMR1 нами была обнаружена существенная разница в продукции активных форм кислорода (Рис. 1).
Очевидно, что данное различие обусловлено нарушениями в метаболизме активных форм кислорода в мозге животных SAMP1 уже на таких ранних стадиях развития (6-10 дней).
Тот факт, что на биохимическом уровне эти различия проступают на более ранних этапах развития, позволяет предполагать, что они являются одной из причин будущих морфологических изменений.
350 геренация АФК, отн. ед.
генерация АФК, отн. ед.
300 250 200 150 SAMR1 SAMP SAMR1 SAMP Рис. 1. Уровень активных форм кислорода в нейронах SAMR1 и SAMP1 в генерация АФК, отн. ед.
стационарном состоянии (слева) и после 10 мин активации клеток 1 µМ ФМА (справа) Добавление 1 µМ ФМА вызвало увеличение уровня активных форм кислорода как SAMR1 SAMP Удалено:
у SAMR1, так и у SAMP1, причем более выражено оно у SAMR1. После 10 мин инкубации с ФМА различие в уровне активных форм кислорода составило 31%, в то время как изначально оно составляло 113%. Такие различия в эффекте ФМА у SAMP1 и SAMR1 позволяет заключить, что ФМА-зависимые протеинкиназы в нейронах SAMP исходно активированы в большей степени, чем у SAMR1.
Хорошо известно, что экзайтотоксические эффекты глутамата могут в геренация АФК, отн. ед.
значительной степени быть опосредованными NMDA-рецепторами. Одной из основных причин гибели клетки при экзайтотоксическом стрессе является повышение внутриклеточной концентрации ионов Ca2+, что приводит к активации протеинкиназы C, росту свободных форм кислорода и апоптозу. В нашем эксперименте инкубация с NMDA вызывала дозо- и время-зависимое повышение уровня активных форм кислорода SAMR1 SAMP нейронами как SAMP1, так и SAMR1 (Рис. 2).
Удалено: о Продукция АФК, отн. ед.
0 минут 10 минут 20 минут Рис. 2. Продукция активных форм кислорода нейронами SAMR1 (белые столбики) и SAMP1 (черные столбики) при их инкубации с 500 µМ NMDA Для оценки влияние Na/K-АТФазы на генерацию АФК, мы инкубировали клетки с различными концентрациями уабаина, ингибитора Na/K-ATФазы (Рис. 3). В случае SAMP1 ингибирование Na/K-ATФазы не приводило к существенному росту продукции АФК, в то время как в случае SAMR1 характер зависимости был иным.
Продукция АФК, отн. ед.
Продукция АФК, отн. ед.
Продукция АФК, отн. ед.
Контроль Удалено:
0 Отформатировано: русский Контроль (Россия) 10E-6 10E-5 10E-3 Контроль 10E-6 10E-5 10E- Рис 3. Влияние различных концентраций уабаина на генерацию АФК клетками мозжечка SAMR1 (белые столбики) и SAMP1 (черные столбики) Продукция АФК, отн. ед.
Максимальный эффект уабаина на АФК достигался в концентрации 10-5М, при прочих концентрациях эффект был менее выражен. Подобные различия в действии уабаина, вероятно, связаны с тем, что у животных линии SAMP1 продукция АФК изначально превосходит таковую у SAMR1 (Рис. 1). Можно предположить, что в нейронах SAMP1 Na/K-АТФаза исходно может находиться в частично заингибированном состоянии. Ранее в нашей лаборатории было показано, что активные формы кислорода Контроль Удалено:
приводят к ингибированию фермента посредством окисления его SH-групп (Курелла и др., 1996). В наших условиях это также вероятно, поскольку мы показали (см. ниже), что подобное ингибирование снимается добавлением восстанавливающих агентов.
2. Влияние МРТР на биохимические и физиологическое характеристики грызунов Биохимическая характеристика Для индукции окислительного стресса в мозге животных мы использовали нейротоксин MPTP, который, метаболизируясь в нейронах, индуцирует образование свободных форм кислорода. Для характеризации влияния MPTP на состояние Удалено: анти-оксидантной антиоксидантной системы мозга мы измеряли активность таких ферментов как СОД (Рис.
4) и МАО B (Рис. 5).
Различие уровня активности СОД у мышей линий SAMP1 и SAMR1 было показано ранее в нашей лаборатории. В настоящей работе нами показано существенное снижение активности СОД в мозге SAMR1, вызванное МРТР, в то время как в случае SAMP наблюдалось небольшое повышение активности фермента.
Отформатировано: Шрифт:
14 пт, разреженный на 0,5 пт Активность СОД, U/мг * SAMR SAMR+MPTP SAMP SAMP+MPTP Рис. 4. Влияние MPTP на активность СОД в митохондриях мозга мышей в разных условиях (достоверное снижение активности относительно контроля отмечено знаком «*») Активность МАО-В, нмоль/мг*час SAMR SAMR+MPTP SAMP SAMP+MPTP Рис. 5. Сравнение активности МАО-В в митохондриях мозга различных группах экспериментальных животных Удалено:
В случае МАО-B МРТР достоверно не влиял на активность этого фермента.
С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии нами был измерен Удалено: мозга суммарный уровень биогенных аминов в стриатуме исследуемых животных (Табл. 1).
Было обнаружено, что уровень дофамина был изначально существенно ниже у SAMP1 по сравнению с SAMR1. Этот факт хорошо сочетается с данными о повышенной активности МАО В, окисляющей дофамин. Вероятно, чем выше активность МАО В, тем меньше наблюдаемый уровень дофамина в тканях.
Уровень других биогенных аминов у животных достоверно не различался.
Поскольку известно, что локомоторная активность зависит от норадренергической Отформатировано: русский системы, закономерно, что концентрации норадреналина у интактных животных SAMP1 и (Россия) Отформатировано: русский SAMR1 не различаются, как не различается их локомоторная активность.
(Россия) Введение МРТР приводило к снижению уровня дофамина в стриатуме у SAMR1, в Отформатировано: русский (Россия) то время как у SAMP1 он оставался на том же (низком) уровне, как и до введения этого Отформатировано: русский (Россия) токсина. Мы предполагаем, что в связи с повышенной продукцией свободных радикалов в Удалено: в SNpc различных структурах головного мозга (в частности, в черной субстанции) мышей Удалено: реакции SAMP к 10 месяцам уже осуществляются нейродегенеративные реакции, что негативно сказывается на уровне дофамина в стриатуме. Это предположение может объяснять низкий уровень этого медиатора.
Под действием МРТР обнаруживалось снижение уровня норадреналина, причем как у быстростареющих мышей, так и у животных контрольной группы. Учитывая, что это явление протекает на фоне снижения уровня дофамина, мы считаем его закономерным, поскольку известно, что норадреналин образуется из дофамина под действием дофамин- гидроксилазы.
Соотношение норадреналин/дофамин в этой области мозга после воздействия Удалено: SAMP МРТР понижалось как у SAMP1, так и у SAMR1, но у первых оно протекало более Удалено: SAMR значительно. Отформатировано: русский (Россия) Таблица 1. Изменение уровня катехоламинов в стриатуме мышей SAMR1/SAMP1 под Удалено: SAMR действием нейротоксина МРТР, нмоль/г ткани. Удалено: SAMP * - P0,05 (отличия от животных этой же линии, получавших физиол. р-р), # - P0, (отличия от контрольной линии SAMR1), t-критерий Стьюдента. Удалено: SAMR Группы Дофамин Норадреналин Серотонин Норадреналин/ животных Дофамин 9, SAMR1 0,27±0,20 2,5±0,44 2,76±0,1 Удалено: SAMR SAMR1 Удалено: SAMR 5, + 0,052±0,07* 0,31±0,16* 2,48±0, MPTP 85,71# SAMP1 0,021±0,01# 1,8±0,50# 2,71±0,2 Удалено: SAMP SAMP1 Удалено: SAMP 4,71* + 0,07±0,03 0,33±0,1* 2,8±2, MPTP Удалено: SAMP Полученные данные находятся в полном соответствии с тем, что в мозге SAMP после введения МРТР наблюдается повышенное накопление продуктов окисления липидов и белков и При измерении (Таблицы 2 3). Fe-индуцированной хемилюминесценции, генерируемой при свободнорадикальном окислении липидов, мы Удалено: SAMP обнаружили, что мембраны мозга SAMP1 характеризуются более высоким уровнем предобразованных гидроперекисей и пониженной резистентностью к окислению (в Удалено: соответствии соответствии с чем, лаг-период в развитии хемилюминесценции укорачивается) по Удалено: SAMR сравнению с животными линии SAMR1 (Таблица 2).
Таблица 2. Окисленность липидов в мембранных препаратах мозга SAMP1 и SAMR после введения МРТР. “*” - р 0.05. (Т-критерий Стьюдента) Группа Предобр. Устойчивость к Скорость Окисляемый животных перекиси, отн. окислению, сек окисления, материал, ед. отн. ед. отн. ед.
SAMR1 99,5±19,1 177±6 1,24±0.13 2612±18 Удалено: SAMR SAMR1+MPTP 88,67±4,2 140±8 1,30±0,11 1849±18 Удалено: SAMR SAMP1 115,0±10,6 130±9* 1,10±0,14 2076±25 Удалено: SAMP SAMP1+MPTP 127,0±15,3* 115±2* 2,03±0,30* 2162±10* Удалено: SAMP Введение МРТР не приводит к изменению в уровне предобразованных Удалено: SAMR гидроперекисей и скорости окисления у SAMR1, что, по-видимому, связано с активностью антиоксидантной системы, предотвращающей формирование окисленных продуктов, при этом резистентность к окислению падает, то есть имеет место истощение Удалено: SAMP антиоксидантной системы под действием МРТР. В противоположность этому, у SAMP1, получавших MPTP, увеличен уровень гидроперекисей (на 16%), и еще больше снижается устойчивость к окислению, а также в 2 раза возрастает скорость окисления липидного материала. Таким образом, ясно выражены снижение антиоксидантной защиты и повышенная продукция свободных радикалов, проявляющаяся в увеличении уровня гидроперекисей.
В соответствии с этими сдвигами находится и еще одно интересное наблюдение.
Общее количество окисляемого липидного материала оказывается существенно Удалено: SAMP пониженным для мембран мозга линии SAMP1 по сравнению с линией SAMR1. Это Удалено: SAMR отчетливо указывает, что состояние окислительного стресса, наблюдаемое у подопытных мышей, индуцирует глубокое окисление мембранных липидов. По этой причине в Удалено: SAMP мембранных препаратах, выделенных из мозга SAMP1 и SAMR1, в первом случае Удалено: SAMR обнаруживается гораздо меньшее количество окисляемого материала. Более того, Удалено: SAMR введение МРТР приводит к окислению липидов и снижает у SAMR1 количество остаточного окисляемого материала, что согласуется с механизмом действия МРТР в Удалено: SAMP организме через формирование свободных радикалов, в то время как у SAMP1 он Удалено: обработки оставляет окисляемый материал на том же низком, как и до введения МРТР, уровне.
Удалено: SAMP Создается впечатление, что фракция легко окисляемых липидов в мозге SAMP значительно окислена еще до введения МРТР.
Таким образом, еще одной причиной большей чувствительности линии SAMP1 к МРТР может являться сниженная резистентность к окислению, которая обеспечивается истощением антиоксидантной системы.
Известно, что повышенная продукция свободных радикалов может приводить к повреждению различных клеточных структур, включая ДНК, липиды и белки. Для оценки влияния MPTP на состояние белка клетки, мы оценивали концентрацию гидроксильных групп белка.
Уровень окисленных белков, измеренных в митохондриальной фракции и в Удалено: SAMP гомогенате мозга мышей SAMP1 и SAMR1, в обеих группах до внесения МРТР был Удалено: SAMR одинаков. Введение МРТР индуцировало накопление карбонильных групп в белках, и этот параметр возрастал гораздо существеннее у мышей с генетически ускоренным темпом старения (Таблица 3).
Таблица 3. Влияние МРТР на уровень карбонильных групп белка (представлены Удалено: окисленных белков средние ± СОШ, нмоль/мг белка;
“*” - P 0,05) Контроль MPTP Группы животных Гомогенат мозга 0,62 ± 0,02 0,77 ± 0, SAMR1 Удалено: SAMR 0,58 ± 0,04 1,04 ± 0,05* SAMP1 Удалено: SAMP Митохондриальная фракция мозга 1,5 ± 0,02 1,6 ± 0, SAMR1 Удалено: SAMR 1,5 ± 0,01 3,1 ± 0,01* SAMP1 Удалено: SAMP Вызывает интерес то обстоятельство, что уровень карбонильных групп белка гораздо выше во фракции митохондрий, чем в целом гомогенате, позволяя предполагать, что митохондриальные белки повреждаются в первую очередь. Это также соответствует представлениям о характере вовлечения МРТР в генерацию свободных радикалов, в котором принимает активное участие митохондриальная МАО В (Kopin I.J, et. al. 1987).
Вероятно, что, в связи с тем, что MPTP превращается в MPP-радикал непосредственно в митохондриях, именно они и повреждаются в первую очередь.
Физиологическа характеристика Помимо биохимических изменений, мы наблюдали и изменения физиологических параметров. Введение МРТР вызывало достоверное снижение веса и ригидности, но Удалено: SAMP только в группе SAMP1. Известно, что MPTP сильнее действует на старых животных.
Отформатировано: русский (Россия) Наши данные полностью это подтверждают. Необходимо отметить, что свой вклад в Удалено: SAMP большую чувствительность SAMP1 к МРТР вносит и дисбаланс прооксидантной и Отформатировано: русский (Россия) антиоксидантной систем, проявляющийся в повышенной продукции свободных радикалов.
Вес животных. На Рис. 6 представлена разница в весе животных до и после введения МРТР в различных экспериментальных группах животных. Наибольшее снижение веса наблюдалось у мышей линии SAMP1, которым вводили МРТР.
Ригидность. На Рис. 7 представлены измерения ригидности в различных экспериментальных группах животных. Ригидность определяли как уменьшение расстояния от шеи до основания хвоста животных. Статистически достоверное изменение ригидности наблюдалось только у животных линии SAMP1, которым вводили МРТР.
Вес до введения - вес после введения, г SAMR1 контроль SAMR1+MPTP SAMP1+контроль SAMP1+MPTP Рис. 6. Влияние MPTP на вес экспериментальных животных до введения после введения Ригидность SAMR1 контроль SAMP1 контроль SAMR1 + MPTP SAMP1 + MPTP Рис.7 Влияние MPTP на ригидность экспериментальных животных. Ригидность определяли как уменьшение расстояния от шеи до основания хвоста Горизонтальная локомоторная активность. На Рис. 8 представлен график локомоторной активности различных экспериментальных групп животных. Локомоторная активность определялась в тесте «норковая камера» как число квадратов, которые животное пересекало за время теста.
до введения после введения Пробег, кв SAMR1 контроль SAMR1 + MPTP SAMP1 контроль SAMP1 + MPTP Рис. 8. Влияние MPTP на локомоторную активность экспериментальных животных до введения после введения Число стоек SAMR1 контроль SAMR1 + MPTP SAMP1 контроль SAMP1 + MPTP Рис. 9 Влияние MPTP на вертикальную активность экспериментальных животных Удалено: SAMP Изначально группы SAMP1 и SAMR1 не различались по локомоторной активности.
Удалено: SAMR Введение МРТР достоверно снижало локомоторную активность SAMR1 в среднем на Удалено: SAMR Удалено: SAMP 39%, тогда как в случае SAMP1 - на 68%. Снижение локомоторной активности указывает на возникновение индуцируемых МРТР повреждений в области черной субстанции и в ответственной за эти функции дофаминергической системе, что характерно для паркинсонического синдрома и описывалось многими исследователями. Необходимо отметить, что, судя по полученным данным, дофаминергическая система повреждалась у Удалено: SAMP SAMP1 в большей степени, чем у SAMR1. Это может быть связано как с повышенной Удалено: SAMR продукцией свободных радикалов, так и со сниженной активностью антиоксидантной системы, поскольку известно, что дофаминергическая система очень чувствительна к окислительному стрессу.
Вертикальная локомоторная активность. Вертикальная локомоторная активность определялась в тесте «норковая камера» как число стоек животного за время тестирования. При исследовании вертикальной активности животных не было найдено достоверных отличий между группами до введения MPTP. Введение нейротоксина Удалено: SAMR снижало вертикальную активность у SAMR1 на 54%, а у SAMP1 - на 68%. Таким образом, Удалено: SAMP и в этом случае мы видим большее влияние нейротоксина на SAMP1. Отформатировано: русский (Россия) Исследовательская активность. Данный физиологический параметр определялся Отформатировано: русский (Россия) как число заглядываний животным в норки в тесте «норковая камера». При анализе Удалено: SAMP исследовательской активности, мы обнаружили различия между двумя группами: Отформатировано: русский (Россия) животные SAMP1 проявляли исследовательскую активность на 54% меньше, чем SAMR1.
Удалено: SAMP Вероятно, в основе этих различий лежит истощенное состояние антиоксидантной Отформатировано: русский (Россия) системы, приводящее к поражению различных клеточных структур. Достоверного Удалено: SAMR влияния MPTP обнаружено не было, что хорошо коррелирует с данными литературы.
до введения Исследовательская активность, после введения число заглядываний SAMR1 контроль SAMR1 + MPTP SAMP1 контроль SAMP1 + MPTP Рис 10. Влияние MPTP на исследовательскую активность экспериментальных Удалено: SAMP животных Удалено: SAMR Удалено: SAMR Груминг. При анализе груминга выявилось, что реакция на MPTP у SAMP1 и Удалено: SAMP SAMR1 оказалась разнонаправленной: введение нейротоксина снижало этот параметр у Удалено: (ссылку) Отформатировано: русский SAMR1 на 77% и повышало у SAMP1 на 181%. Известно, что груминг коррелирует с (Россия) уровнем тревожности у животных [Kalueff AV et al., 2005]. Таким образом, очевидно, что Отформатировано: русский (Россия) МРТР достоверно повышает тревожность у SAMP1, в то время как у SAMR1 она Отформатировано: русский (Россия) снижается. В итоге получается, что если судить по трем параметрам теста из четырех, Отформатировано: русский животные линии SAMP1 более чувствительны к MPTP, что, по-видимому, объясняется (Россия) Отформатировано: русский слабостью их антиоксидантной системы и повышенной продукцией свободных радикалов. (Россия) Удалено: SAMP Снижение двигательной функции и увеличение ригидности считаются в Удалено: SAMR литературе необходимыми физиологическими свидетельствами развития МРТР Удалено: SAMP индуцированного паркинсонизма [Gnanalingham KK, 2000]. Наши данные подтверждают этот вывод и позволяют считать, что эффект МРТР на SAM приводит к тем же самым результатам.
Удалено: SAMP Кроме того, действие МРТР на линию SAMP1 приводит к более выраженным Удалено: SAMR эффектам, чем в случае SAMR1, что связано с дисбалансом прооксидантной и антиоксидантной систем, приводящим к различным метаболическим нарушениям и преждевременному старению. Вероятно, окислительный стресс делает эту группу более восприимчивой к MPTP, поскольку в основе действия этого нейротоксина лежат свободнорадикальные механизмы.
до введения после введения Груминг SAMR1 контроль SAMR1 + MPTP SAMP1 контроль SAMP1 + MPTP Рис. 11. Влияние MPTP на груминговую активность экспериментальных животных Таким образом, использование быстростареющих мышей в опытах с МРТР позволило нам продемонстрировать более выраженное развитие физиологических признаков дегенерации дофаминергических структур черной субстанции, по сравнению с Удалено:, не прибегая ни к контрольными животными. Данный факт, по-видимому, объясняется различным увеличению дозы токсина, ни к изменению протокола введения состоянием про- и антиоксидантных систем, что делает животных SAMP1 более вещества.
Отформатировано: русский чувствительными к окислительному стрессу в мозге, вызываемому нейротоксином MPTP. (Россия) Отформатировано: русский (Россия) Удалено: 3. Экспрессия глутаматных рецепторов и Na-траспортера в возбудимых тканях грызунов Удалено: экспрессию Мы оценивали уровень мРНК различных ионотропных и метаботропных рецепторов в мозжечке 5, 9, и 11-дневных крыс методом полимеразной цепной реакции с обратной Удалено: ОТ-ПЦР транскрипцией (Рис. 12). Различий в экспрессируемых рецепторах между грызунами Удалено: крысами данных возрастов обнаружено не было. Список экспрессируемых рецепторов представлен в Таблице 4.
Удалено: Рецепторы, Таблица 4. Присутствие мРНК, кодирующей различные типы глутаматных экспрессируемые в клетках мозжечка крыс рецепторов.
Группа рецепторов Присутствие NMDA 1 + NMDA 2 + NMDA 3 + AMPA + Kainate + mGlu I + mGlu II + mGlu III + AMPA Kainate Рис. 12. Пример экспрессии ионотропных рецепторов в мозжечке 11-дневных крыс Удалено: молодых Удалено: экспрессии Оценку уровня мРНК, кодирующей различные изоформы Na/K-АТФазы, мы Удалено: х проводили тем же методом. Уровень мРНК анализировали в мозжечках 5, 9 и 11-дневных Удалено: также Удалено: ОТ-ПЦР крыс. Различий в характере экспрессии различных изоформ фермента у животных Удалено: Экспрессию различного возраста обнаружено не было. Была показана экспрессия всех трех изоформ Na/K-ATФазы, причем с заметным преобладанием 3, ответственной за сигнальную функцию Na/K-АТФазы.
1 2 3 1 2 3 1 2 5 дней 9 дней 11 дней Рис. 13. Экспрессия изоформ Na/K-ATФазы в нейронах крыс различного возраста Кроме этого мы изучали характер экспрессии изоформ Na/K-ATФазы в левом желудочке крысы в зависимости от активации -адренергической системы. С помощью осмотического насоса крысам вводился изопреналин, активатор -адренорецепторов. При определении веса различных отделов сердца в контрольной и экспериментальной группах животных, нами была обнаружена гипертрофия левого желудочка сердца.
Проанализировав экспрессию Na/K-ATФазы в этом желудочке, мы обнаружили снижение экспрессии 2 изоформы фермента, в то время как уровень экспрессии 1 не изменялся (Рис. 14).
Экспрессия изоформы 3 также была обнаружена, однако ее уровень был очень низок. Вероятно, что эта изоформа представлена лишь в проводящей системе сердца (волокна Пуркинье), составляющей очень малую по объему часть органа. По-видимому, именно с этим обстоятельством связан исключительно низкий уровень 3 изоформы фермента.
Для того чтобы получить больше информации об изменении основных ферментов ионного гомеостаза под влиянием бета-адренорецепторов, мы анализировали экспрессию Na/Ca-обменника (Рис. 15). Мы обнаружили, что под влиянием изопреналина происходит снижение экспрессии Na/Ca-обменника.
12. 10. % от GAPDH % от GAPDH 7. 5. 2. 0.0 Альфа 1 Альфа 2 Контроль Изопреналин изоформы Na/K-АТФазы Рис. 14 (слева). Влияние изопреналина на экспрессию изоформ Na/K-АТФазы в сердце крыс (белые столбики – контроль, черные – экспериментальная группа животных) Рис. 15 (справа). Влияние изопреналина на экспрессию Na/Ca-обменника в сердце крыс (белые столбики – контроль, черные – экспериментальная группа животных) Таким образом, нам удалось показать, что в сердечной ткани экспрессия таких важнейших ферментов ионного гомеостаза, как Na/K-ATФаза и Na/Ca-обменник, находится под контролем -адренергической системы.
4. Влияние NMDA рецепторов на активность Na/K-ATФазы Мы исследовали влияние различных концентраций NMDA на активность Na/K ATФазы нейронов мозжечка крысы. Нами было обнаружено, что активность Na/K ATФазы падает с увеличением концентрации NMDA, причем при добавлении в реакционную смесь 1 мМ цистеина активность Na/K-ATФазы восстанавливается (Рис. 16).
Активность Na/K-АТФазы, % 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1 мМ цистеин mM NMDA Рис 16. Влияние NMDA на активность Na/K-ATФазы в нейронах мозжечка крысы Вероятно, NMDA влияет на активность Na/K-ATФазы через образование активных форм кислорода (Рис. 17), которые способны окислять цистеины, входящие в состав цитоплазматической части Na/K-ATФазы. Эффект NMDA на образование активных форм кислорода может сниматься 10 µМ дизоцилпина (MK-801), являющегося антагонистом NMDA-регулируемых каналов.
Флуоресценция АФК 0 0.3 0.5 1 MK- mM NMDA Рис 17. Влияние NMDA на образование активных форм кислорода в нейронах мозжечка крыс Сопоставление концентрационной зависимости обоих процессов показывает, что ингибирование Na/K-ATФазы NMDA достигает наибольшей величины уже при концентрации этого лиганда, составляющей 0,5 мМ, в то время как рост уровня активных форм кислорода продолжается при дальнейшем увеличении концентрации NMDA (Рис.
16, 17). По-видимому, это означает, что Na/K-ATФаза, остающаяся в суспензии нейронов после их активации 0,5 мМ NMDA, не чувствительна к АФК.
Известно, что в тканях мозга присутствуют несколько изоформ Na/K-ATФазы, различающихся по содержанию и локализации сульфгидрильных групп в молекуле. Одна из них относительно резистента к уабаину и более устойчива к (1) свободнорадикальному окислению;
другие изоформы (2+3), чувствительные к уабаину, содержат более доступные для модификации SH-группы и окисляются активными формами кислорода в первую очередь. Хотя в онтогенезе мозга (2+3) изоформы появляются позже, чем 1, в мозге 8-12-дневных крыс уже присутствуют все 3 изоформы фермента (Рис. 13). Принимая во внимание тот факт, что в мозжечке крыс этого возраста Na/K-ATФазы представлена в основном (2+3) изоформами (Рис. 13), можно предположить, что окисляемая в условиях активации NMDA-рецепторов доля Na/K ATФазы представлена также в основном 2 и 3 изоформами, так как ее активность подавляется при генерации активных форм кислорода и восстанавливается при внесении мМ цистеина. То обстоятельство, что нейрональная Na/K-ATФаза доступна для активных форм кислорода, генерируемых в ответ на активацию нейронов NMDA, указывает на возможное физиологическое значение регуляции Na-насоса свободными радикалами.
Выводы В нейронах мышей линии SAMP1 обнаружено повышенное образование активных 1.
форм кислорода, сопровождающееся подавлением активности супероксиддисмутазы и повышенной активацией моноаминооксидазы В.
Na/K-АТФаза контролирует генерацию активных форм кислорода в нейрональных 2.
клетках, и окислительный стресс нарушает этот контроль.
Окислительный стресс, индуцируемый МРТР, вызывает окислительную 3.
модификацию липидов и белков головного мозга, приводя к нарушениям физиологического поведения животных.
Удалено: Экспрессия Матричная РНК, кодирующая различные изоформы Na/K-ATФазы и глутаматных 4.
Удалено: р рецепторов в мозге грызунов появляется на самых ранних этапах постнатального Удалено:, обеспечивая развития. взаимодействие этих белков при контроле за окислительным Экспрессия по-видимому, находится под контролем 5. Na/K-АТФазы, стрессом.
адренергической системы, причем наиболее чувствительна к этому контролю 2 изоформа фермента.
Обнаружено взаимодействие между глутаматными рецепторами NMDA-класса и 6.
Na/K-ATФазой, выражающееся во взаимном контроле за их функциональным состоянием.
Активация NDMA-рецепторов приводит к дозо-зависимому увеличению уровня 7.
активных форм кислорода в нейрональной клетке. Положительный вклад в увеличении продукции активных форм кислорода вносит также NMDA-зависимое ингибирование Na/K-АТФазы.
Список публикаций по теме диссертации 1. Бастрикова Н.А., Сорокина Е.В., Казей В.И., Федорова Т.Н., Стволинский С.Л., Болдырев А.А. Модель паркинсонизма, вызываемого введением нейротоксина 1 метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР) быстростареющим мышам линии SAMP1. // Нейрохимия, 2002, 19, 247-253.
2. Sorokina E.V., Bastrikova N.A., Kazey V.I., Stvolinsky S.L., Fedorova T.N., Boldyrev Отформатировано:
A.A. MPTP effects in vivo on some biochemical parameters in SAM brain. // Annual английский (США) Удалено:
reports on SAM studies, 2002, 18, 115-116.
Отформатировано:
3. Kazey V.I., Fedorova T.N. Influence of MPTP on lipid oxidation in the brain of английский (США) senescence accelerated mice. // Abstracts of the 9th International Symposium of Cerebral Ischemia, Marburg, Germany (2002), р. 24.
Удалено:, 4. Kazey V., Petrushanko I., Bulygina E. Na/K-ATPase participates in regulation of ROS Отформатировано:
level in neuronal cells. // Proc. Physiol. Soc. Spring Workshop, Budapest (Hungary), английский (США) Удалено:, (2003) р. 39.
5. Bastrikova N., Sorokina E., Kazey V., Fedorova T., Boldyrev A., MPTP-induced changes Удалено:.
in senescence accelerated mice. // Zbornik (Collection dedicated to Prof. Dusan Удалено: In:
Vuchelich), D. Suznjevic, et al. (Eds.) Holding Inst. Gen. Phys. Chem. Beograd, 2003, Отформатировано:
английский (США) pp. 159-170.
6. Kazey V., Tuneva E., Boldyrev A.A., Production of reactive oxygen species by Отформатировано:
cerebellum granule cells isolated from senescence accelerated mice. // International английский (США) Удалено:, Congress Series 1260 (2004) 245-249.
Удалено: // 7. Boldyrev A., Kazey V., Leinsoo T., Mashkina A., Tyulina O., Johnson P., Tuneva J., Отформатировано:
Chittur Sh., Carpenter D. Rodent lymphocytes express functionally active glutamate английский (США) Удалено:.
receptors. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 324. P. 133-139.
Удалено: Биол. мембраны, 2006.
8. Казей В.И., Шайнер-Бобис Г. Влияние изопреналина на экспрессию Na Отформатировано: русский транспортирующих белков в кардиомиоцитах крысы. // Биологические мембраны, (Россия) Отформатировано:
2006, том 23, N 3, стр 212–216 Обычный, По ширине, Междустр.интервал:
9. Болдырев А.А., Булыгина Е.Р., Казей В.И., Куликов А.В., Махро А.В., Соколова полуторный, нумерованный + Уровень: 1 + Стиль Н.А., Степанова М.С. Молекулярные механизмы экзайтотоксичности глутамата. // нумерации: 1, 2, 3, … + Начать с: 1 + Выравнивание:
в материалах конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические слева + Выровнять по: 0, см + Табуляция после: 1, основы деятельности центральной нервной системы» Пенза,(2006). С. 38-40. см + Отступ: 1,27 см Удалено: Отформатировано:
Междустр.интервал:
полуторный Отформатировано: Шрифт:
Краткая аннотация диссертационной работы В.И. Казея ««Роль глутаматных 12 пт рецепторов и Na/K-насоса в регуляции окислительного стресса » Отформатировано: Шрифт:
12 пт, русский (Россия) Отформатировано: Шрифт:
Диссертационная работа Казея В.И. посвящена функциональной взаимосвязи 12 пт глутаматных рецепторов и Na/K-АТФазы, обусловленной активными формами кислорода (АФК). Работа выполнялась как in vitro на гранулярных клетках мозжечка мозга быстростареющих мышей линии SAMP1 и контрольной линии SAMR1, так и in vivo на этих же животных. Основными результатами работы являются данные, свидетельствующие об экспрессии глутаматных рецепторов и Na/K-АТФазы в раннем постнатальном развитии грызунов, контроле экспрессии Na/K-АТФазы со стороны бета адренергической системы, активном участии Na/K-АТФазы в контроле образования АФК, и функциональном взаимодействии Na/K-АТФазы и глутаматных рецепторов в процессах реализации окислительного стресса. Также диссертантом показаны различия в уровне продукции АФК между животными SAMP1 and SAMR1.
Summary of Ph.D. thesis by V.Kazey entitled “Role of glutamate receptors and Na/K-ATPase in regulation of oxidative stress” Doctorate thesis is dedicated to the functional relationship between glutamate receptors and Na/K-АTPase. In vitro experiments were carried out using cerebellum cells derived from the Отформатировано: Шрифт:
senescence accelerated mice strains SAMP1 and SAMR1, the same animals were used for in 12 пт vivo experiments. The main results of the work include data showing expression of glutamate receptors and Na/K-ATPase in early postnatal development of rodents, evidence that beta adrenergic system controls expression of Na/K-ATPase in cardiomiocytes, demonstration that Na/K-ATPase controls generation of reactive oxygen species, and functional relationship between Na/K-ATPase and glutamate receptors. The data presented in the thesis also shows significant difference in the level of generation of reactive oxygen species between SAMP1 and SAMR1 mice.
Отформатировано:
английский (США)