Разработка биокаталитических методов получения (r)- и (s)-энантиомеров 1-фенилэтанола и эйкозапентаеновой кислоты
На правах рукописи
КАЛИМУЛЛИНА ЛИЛИЯ ЯГФАРЬЕВНА РАЗРАБОТКА БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ (R)- И (S)-ЭНАНТИОМЕРОВ 1-ФЕНИЛЭТАНОЛА И ЭЙКОЗАПЕНТАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ 03.00.23 – Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
Казань – 2008
Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета.
Научный руководитель доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семеновна кандидат технических наук, доцент Кусова Ирина Валерьевна Ведущая организация Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук
Защита состоится «12» ноября 2008 года в 14:00 на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу:
420015, г. Казань, ул. К.Маркса, 68, зал заседаний Ученого Совета (А-330).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного технологического университета.
Электронный вариант автореферата размещен на сайте Казанского государственного технологического университета (www.kstu.ru)
Автореферат разослан « » октября 2008 года.
Ученый секретарь совета Сироткин А.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Процессы биотрансформации органических соединений, осуществляемые с помощью оксидоредуктаз микроорганизмов (карбонилредуктаз и де сатураз), представляют значительный интерес для создания перспективных методов получения практически важных веществ, таких как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), (R)- и (S)-энантиомеры 1-фенилэтанола (1-ФЭ) и др.
ЭПК используется в качестве диетарных добавок при лечении и для профилакти ки различных хронических и воспалительных заболеваний, включая сердечно сосудистые заболевания, ревматоидные артриты, астму, экзему, псориаз и рак.
(R)- и (S)-энантиомеры 1-фенилэтанола а также их производные являются синто нами лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным и антирабическим действием. Эти соединения используются также при получении жид ких кристаллов и в синтезе оптически активных полимеров, применяемых для разделе ния рацемических смесей органических веществ.
Получение этих соединений химическими методами представляется мало эффек тивным.
В связи с этим создание высокоэффективных биокаталитических систем и разра ботка на их основе регио- и стереонаправленных методов получения ЭПК и оптически чистых энантиомеров 1-ФЭ, а также поиск методов их интенсификации являются акту альной задачей.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой про граммой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундамен тальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой «Развитие научного потенциала высшей школы» (2006-2008 гг., № РНП.2.2.3.1.5668).
Цель работы. Разработка регио- и стереоселективных биокаталитических мето дов получения эйкозапентаеновой кислоты и оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола из доступного сырья.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
• проведение скрининга микроорганизмов, способных осуществлять энантиоселек тивное восстановление ацетофенона (АФ) при высоких концентрациях субстрата;
• разработка энантиоселективных биокатализаторов на основе клеток микроорга низмов для получения оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола;
• разработка методов получения (S)- и (R)-энантиомеров 1-фенилэтанола с помо щью разработанных биокатализаторов;
• разработка эффективного метода получения эйкозапентаеновой кислоты био трансформацией доступных растительных масел.
Научная новизна. Создан новый биокатализатор на основе гриба Geotrichum sp. 85-1 и найдены условия, в которых с его участием осуществляется энантио селективное восстановление ацетофенона в S-энантиомер 1-фенилэтанола при высоких концентрациях субстрата.
Обнаружена реакция изомеризации рацемической смеси (S)-изомера 1-фенилэтанола в (R)-изомер при инкубировании биомассами культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13 и Candida sake 777.
Показана способность гриба Mortierella alpina 18-1 или его галорезистентного мутан та ХН1 трансформировать соевое, подсолнечное и оливковое масла в липиды, обогащен ные эйкозапентаеновой кислотой.
Практическая значимость. Разработаны методы получения эйкозапентаеновой ки слоты с помощью гриба Mortierella alpina 18-1 биотрансформацией растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с выходом 5,2 – 7,9 г/кг среды.
Созданы методы получения (S)-(-)-1-фенилэтанола энантиоселективным биовосста новлением ацетофенона с помощью культуры микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 с выхо дом 83,6% и оптической чистотой не менее 99%ее, а также (R)-(+)-1-фенилэтанола изоме ризацией S-энантиомера рацемической смеси с помощью культуры микроорганизма Can dida sp. 81-12 с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее.
Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных ра бот и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 24.09.01 - Биотехнология в Уфимском государственном нефтяном техническом универси тете.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV, V Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образо вания в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа,2005-2006), VI Все российском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа,2007).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и тезисы 3 докладов.
Структура и объем работы: Диссертация включает введение, обзор литературы ( глава), описание объектов и методов исследования (2 глава), обсуждение результатов (3 гла ва), выводы, список цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 143 страни цах машинописного текста, содержит 34 рисунка, 19 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1 Разработка биокаталитических методов получения оптически активных (S)- и (R)-1-фенилэтанолов 1.1 Скрининг микроорганизмов Основным недостатком известных биокатализаторов, энантиоселективно восста навливающих ацетофенон (АФ), является необходимость проведения реакции при низ ких концентрациях токсичного субстрата, а также использование большого количества биомассы.
Поиск микроорганизмов, обладающих карбонилредуктазной активностью в от ношении АФ, осуществляли среди дрожжей из музея кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, у которых ранее была выявлена способность к энантиоселективному восстановлению этилацетоацетата в S- и R-этил-3 оксибутираты. Кроме того, были выделены 3 изолята грибов рода Geotrichum, так как согласно литературным данным представители этих грибов являются наиболее эффек тивными восстановителями АФ.
В результате исследования были выявлены 4 культуры микроорганизмов, способ ные восстанавливать АФ в высокой концентрации (5 г/л) с выходом более 75 % 1-ФЭ за 24 ч трансформации (таблица 1). Дрожжевые культуры восстанавливали субстрат пре имущественно в (S)-1-ФЭ, тогда как гриб Geotrichum sp. 85-1 в основном накапливал (R)-1-ФЭ.
Таблица 1 – Удельная активность биомассы, оптические свойства продуктов и конвер сия субстрата при трансформации АФ клетками микроорганизмов [ ] Выход Оптическая Удельная ак- D Конверсия, Микроорганизм чистота, 1-ФЭ, тивность, (конфи % % ее % ммоль/(г(асв)*ч) гурация) Geotrichum sp. 85-1 98,6 0,18 76,8 + 17,5 (R) 29, Candida sake 777 89,6 0,07 80,4 – 42,4 (S) 74, Candida sp. 81-12 98,6 0,09 85,6 – 41,3 (S) 72, Metschnikowia sp. 84-13 91,6 0,1 87,8 – 38,0 (S) 66, Условия реакции: 30 оС;
0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0;
биомасса - 80 г (асв)/л;
АФ - 5 г/л;
время реакции - 24 ч. Стандартная величина удельного вращения: (S)-(-)-1-фенилэтанола [ ] 25 = -57 (с=5,12;
CHCl3), (R)-(+)-1-фенилэтанола [ ] 25 = +58,7 (с=1,03;
CHCl3).
D D Оптическая чистота,%ee R Рисунок 1 - Изменение оптической чистоты 1-ФЭ при трансформации АФ с помощью биомассы гриба Geotrichum sp. 85- S - Условия реакции: 30 оС;
0,1М фосфатный - буфер рН 7,0;
биомасса - 80 г (асв)/л;
0 24 48 72 АФ - 5 г/л.
Время, ч Однако, исследование зависимости энантиоселективности трансформации АФ грибом Geotrichum sp. 85-1 от продолжительности реакции показало, что вначале реак ции также превалирует (S)-1-ФЭ (рисунок 1), но затем увеличивается содержание (R)-энантиомера в реакционной среде.
Изменение энантиомерного состава продуктов в процессе трансформации АФ в сто рону обогащения (R)-энантиомером происходило также и в случае остальных культур мик роорганизмов (таблица 1 и 2).
Таблица 2 - Оптические свойства 1-фенилэтанола, полученного при трансформации АФ дрожжевыми микроорганизмами [ ] 25 Оптическая чистота, D Микроорганизм % ее (конфигурация) Candida sp. 81-12 – 22,0 (S) 38, Metschnikowia sp. 84-13 – 19,2 (S) 33, Candida sake 777 + 12,4 (R) 21, Условия реакции:30 оС;
0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0;
биомасса - 80 г(асв)/л;
АФ - 5 г/л;
48 ч.
Возможным объяснением этого явления может служить изомеризация (S)-энантиомера 1-ФЭ, образующегося первоначально в качестве основного оптического изомера при восстановлении АФ, в (R)-энантиомер.
OH OH O ацетофенон (R)-1-фенилэтанол (S)-1-фенилэтанол В основе такой изомеризации может лежать низкая энантиоселективность фер мента(ов), восстанавливающего АФ, и низкая активность или отсутствие фермента(ов), окисляющего (R)-1-ФЭ.
1.2 Исследование восстановления ацетофенона в биоэмульсиях Одним из подходов, позволяющих повысить энантиоселективность клеточных ка тализаторов восстановления карбонилсодержащих соединений, является подавление не целевых ферментов с помощью органического растворителя (гексана, гептана, изопро панола, ацетона и др.). При использовании гидрофобных растворителей перспективным представляется проведение данных трансформаций в биоэмульсиях, образованных клетками микроорганизмов.
Исследование эмульгуриющих свойств биомассы микроорганизмов показало, что водные суспензии всех исследуемых культур образуют эмульсии типа «масло в воде» с органическими растворителями (н-гексадеканом, н-тетрадеканом, н-деканом, изоокта ном, хлороформом, этилацетатом, метилэтилкетоном). Образованные эмульсии характе ризуются высокими значениями индекса эмульгирующей активности (более 50%).
При микроскопировании препаратов эмульсий обнаружено, что клетки микроор ганизмов иммобилизуются на поверхности капель органической фазы (рисунок 2).
Рисунок 2 - Микрофотография эмуль сии декана в воде, образованная био массой дрожжей Candida sp. 81- (х 250) На основании результатов исследования распределения субстрата и продукта, жизнеспособности микроорганизмов и их карбонилредуктазной активности в органиче ских растворителях при проведении трансформации АФ в биоэмульсиях с органически ми растворителями была выбрана система буфер-изооктан.
Сравнение выхода 1-ФЭ при трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в буферном растворе и биоэмульсии показало, что наибольший вы ход продукта может быть получен при проведении реакции в биоэмульсиях (рисунок 3).
Выход 1-ФЭ, г/л Рисунок 3 – Сравнение выхода 1-ФЭ при трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в буфер ном растворе и биоэмульсии 5 10 Условия реакции: биомасса - 80 г (асв)/л;
Концентрация ацетофенона, г/л 30 оС;
24 ч.
буфер эмульсия Таблица 3 – Выход и оптические свойства 1-фенилэтанола, полученного при трансформа ции АФ исследуемыми культурами микроорганизмов в биоэмульсии Выход Оптическая [ ] Концентрация D Микроорганизм чистота, 1-ФЭ, АФ, г/л (конфигурация) % ее % 5 88,0 – 4,5 (S) 7, Geotrichum sp. 85-1 10 87,0 - 4,0 (S) 7, 15 80,6 – 4,3 (S) 7, Candida sp. 81-12 5 74,0 - 42,1 (S) 73, Metschnicowia sp. 84-13 5 75,0 - 40,6 (S) 71, Candida sake 777 5 71,1 - 41,4 (S) 72, Условия реакции: 30 оС;
вода – изооктан в соотношении 1:1;
биомасса - 80 г (асв)/л;
АФ - 5 г/л;
24 ч.
Установлено, что в биоэмульсиях во всех вариантах преимущественно накаплива ется S-энантиомер (таблица 3). Однако, оптическая чистота продукта при этом не пре вышала 74% ее.
1.3 Трансформация ацетофенона в буфере с помощью пермеабилизованных клеток Другим из известных подходов увеличения селективности биокатализаторов, яв ляется использование пермеабилизованных органическими растворителями клеток, в присутствии экзогенного донора и кофермента (NADPH).
Пермеабилизацию клеток микроорганизмов осуществляли обработкой биомассы с помощью ацетона или изопропанола. В качестве экзогенного восстановителя был ис пользован изопропанол.
OH O NAD(P)+ пермеабилизованная NAD(P)H клетка OH O Таблица 4 - Трансформация АФ пермеабилизованными клетками микроорганизмов [ ] Кон- Выход Оптиче Удельная D Микроорганизм версия ская чис 1-ФЭ, активность, (конфи (растворитель) ммоль/(г(асв)*ч) АФ, % тота, % ее % гурация) Geotrichum sp. 85- 0,078 79,4 49,4 – 56,9 (S) (ацетон) Geotrichum sp. 85- 0,053 91,4 56,6 – 57,0 (S) (изопропанол) Candida sake 0,093 80,6 67,6 – 51,8 (S) 90, (ацетон) Candida sp. 81- 0,088 94,0 92,2 – 42,8 (S) 75, (ацетон) Metschnikowia sp. 84- 0,078 98,4 98,0 – 42,1 (S) 73, (ацетон) Условия реакции: 30-32 оС;
0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0;
АФ - 5 г/л;
пермеабилизованные клетки - 80 г/л;
NADPН – 0,26 г/л;
изопропанол - 0,33%;
аэробные условия;
24 ч.
При трансформации АФ пермеабилизованными клетками микроорганизмов в присутствии изопропанола было показано, что в этом случае достигается более глубо кая, чем в эмульсии конверсия субстрата (79 - 98%) с образованием преимущественно S-энантиомера 1-ФЭ (таблица 4).
При этом в случае гриба Geotrichum sp. 85-1 образуется целевой продукт с высо кой оптической чистотой (не менее 99 % ее). Однако выход (S)-1-ФЭ в этом случае не превышает 49 – 57%.
1.4 Исследование трансформации ацетофенона с помощью гриба Geotrichum sp. 85-1 в системах буфер – изопропанол С целью разработки более эффективного метода получения (S)-1-ФЭ с помощью гриба Geotrichum sp. 85-1 была исследована трансформация АФ интактными клетками в буферном растворе, содержащем изопропанол в различных концентрациях.
Было обнаружено, что в отличие от пермеабилизованных клеток, для активности которых необходимо было вводить NAD(P)Н, в случае использования необработанной органическим растворителем биомассы проявляется высокая карбонилредуктазная ак тивность даже в отсутствие кофермента (таблица 5). Увеличение содержания изопропа нола в реакционной смеси до 33,0 % приводит к возрастанию удельной активности кле ток.
Таблица 5 - Удельная активность биомассы гриба Geotrichum sp. 85- Изопропанол, Удельная активность, NAD(P)H, Биомасса г/л ммоль/(г(асв)*ч) % Предварительно обработанная 0 0 изопропанолом 0,33 0,26 0, 0 0 0, Без предварительной обработ- 0,33 0 0, ки изопропанолом 3,30 0 0, 33,0 0 0, Условия реакции: 30 оС;
0,1М фосфатный буфер рН 7,0;
АФ - 5 г/л;
биомасса - 80 г (асв)/л Установлено также, что добавление в реакционную смесь с необработанной био массой даже небольшого количества изопропанола (0,33%) вызывает изменение стерео направленности реакции, что, возможно, связано с ингибированием R-редуктазы дан ным растворителем.
Таблица 6 – Выход и оптические свойства 1-ФЭ, полученного при трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в системе с изопропанолом Концентрация Выход Оптическая [ ] Конверсия, D Время, ч изопропанола, чистота, 1-ФЭ, % (конфигурация) % ее % % 0 24 98,6 76,1 +17,5 (R) 29, 0,33 24 98,6 82,6 -4,8 (S) 8, 3,3 24 85,2 82,0 -21,5 (S) 37, 3 83,6 72,1 - 5 85,6 83,6 -56,7 (S) 33, 7 90,8 83,2 - 24 62,0 60,0 -56,9 (S) Условия реакции: 30 оС;
0,1М фосфатный буфер рН 7,0;
АФ - 5 г/л;
биомасса - 80 г (асв)/л Было обнаружено, что увеличение содержания изопропанола в реакционной сме си до 33,0 % приводит к возрастанию карбонилредуктазной активности клеток, а также к существенному повышению оптической чистоты продукта до 99% ее (таблица 6).
Вместе с тем, было обнаружено, что при данной концентрации изопропанола вы ход 1-ФЭ через 24 ч составил лишь 60%, что сопоставимо с выходами, полученными при работе с пермеабилизованными клетками микроорганизмов (таблица 4 и 6).
Концентрация, г/л Изопропанол:
Рисунок 4- Кинетика нако 0% пления 1-ФЭ при транс 0,33% формации АФ биомассой 3,30% 1 гриба Geotrichum sp. 85- 33% при различном содержании изопропанола в реакцион 0 6 12 18 ной смеси Время, ч Однако исследование динамики выхода продукта в системе буфер-изопропанол (33,0%) показало, что при менее продолжительной трансформации (5-7 ч) можно полу чить продукт с выходом 83% (рисунок 4). При этом оптическая чистота (S)-1-ФЭ оста ется очень высокой (таблица 6).
1.5 Исследование условий получения (S)-(-)-1-фенилэтанола с помощью гриба Geotrichum sp. 85-1 в системе буфер – изопропанол (33%) При изучении зависимости параметров восстановления АФ в подобранной систе ме буфер – изопропанол (33%) от возраста биомассы было установлено, что карбонил редуктазная активность биокатализатора, а также выход продукта и биомассы достига ют максимального значения на третьи сутки (рисунок 5, 6). Время выращивания био массы практически не влияет на энантиоселективность восстановления АФ (рисунок 5).
Во всех исследуемых вариантах (S)-1-ФЭ получен с высокой оптической чистотой (не менее 99 %ее).
Влияние кислотности среды на выход продукта восстановления АФ в изучаемом диапазоне (рН 6–8) незначительно. Наибольший выход наблюдали при рН в области 7,0.
Оптимальная температура для осуществления реакции лежит в области от о до 32 С, хотя реакция протекает с достаточно высокими выходами во всем исследуемом диапазоне температур от 20 до 50 оС.
Энантиоселективность реакции оставалась неизменно на высоком уровне при всех исследуемых значениях рН и температуры.
Оптическая чистота, %ee 100 100 0,4 Удельная активность, Выход 1-ФЭ, % Биомасса, г(асв)/л 80 ммоль/(г(асв)*ч) 0,3 60 0,2 40 20 20 0,1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 4 Время выращивания биомассы, сут Время выращивания биомассы, сут выход 1-ФЭ оптическая чистота удельная активность биомасса Рисунок 5– Зависимость оптической Рисунок 6 – Динамика роста и чистоты и выхода 1-ФЭ от возраста карбонилредуктазной активности биомассы Geotrichum sp. 85-1 биокатализатора В результате исследования зависимости выхода целевого продукта от начальной концентрации АФ было обнаружено, что трехсуточная биомасса Geotrichum sp. 85- в подобранных условиях проявляет высокую устойчивость к токсическому действию этого соединения и может восстанавливать 10 – 15 г/л субстрата в (S)-1-ФЭ высокой оп тической чистоты (рисунок 7).
10 Оптическая чистота, Выход 1-ФЭ, г/л 8 6 %ее Рисунок 7 – Зависимость выхода и 4 оптической чистоты 1-ФЭ от началь 2 20 ной концентрации субстрата 0 Условия: 5 ч при 30 оС;
0,1М фосфатный 0 5 10 буфер рН 7,0;
изопропанол – 33%;
био Начальная концентарция АФ, г/л масса – 80 г (асв)/л;
5 ч выход оптическая чистота При оптимальной концентрации 10 г/л АФ за 5 ч трансформации образуется ~ 7 г/л (S)-1-ФЭ с энантиомерным избытком не менее 99% ее.
1.6 Исследование стереоинверсии рацемического 1-фенилэтанола С целью разработки метода получения (R)-1-ФЭ была исследована трансформа ция рацемического 1-ФЭ с помощью микроорганизмов, для которых была выявлена изомеризация (S)-1-ФЭ в R-энантиомер в ходе восстановления АФ.
Было обнаружено, что исследуемые микроорганизмы осуществляют дерацемиза цию рацемического 1-ФЭ с накоплением (R)-1-ФЭ в реакционной смеси (рисунок 8).
В качестве промежуточного продукта в реакционной смеси обнаруживается АФ (до 0,07 г/л). Выход 1-ФЭ в конце трансформации составляет 91-95% (рисунок 8а).
Оптическая чистота (R)-1 Выход 1-фенилэтанола,% 80 ФЭ, %ее 60 0 1 2 3 4 5 1 2 3 Время, сут а б 1-Geotrichum sp. 85-1;
2-Candida sp. 81-12;
3- Metschnikowia sp. 84-13;
4- Candida sake Рисунок 8 – Выход 1-ФЭ (а) и динамика изменения энантиомерного избытка R-энантиомера 1-ФЭ (б) во времени Условия реакции: 30 оС;
0,1М фосфатный буфер рН 7,0;
биомасса - 80 г (асв)/л;
1-ФЭ - 5 г/л В случае культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Metschnikowia sp. 84-13, Candida sake 777 оптическая чистота (R)-1-ФЭ увеличивается до 45-70%ее за 5 суток трансформации (рисунок 8б). При инкубировании рацемического субстрата с биомассой Candida sp. 81-12 в течение 6 суток энантиомерный избыток (R)-1-ФЭ существенно вы ше и достигает 95,8% ее.
1.7 Принципиальная схема получения оптических изомеров (S)- и (R)-1-фенилэтанола На основе произведенных исследований разработана схема препаративного полу чения оптического изомера (S)-(-)-1-ФЭ путем энантиоселективного восстановления АФ биокатализатором на основе культуры микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 и получения оптического изомера (R)-(+)-1-ФЭ путем стереоинверсии рацемического 1-ФЭ биоката лизатором на основе культуры микроорганизма Candida sp. 81-12, состоящая из 3 ста дий: получения биокатализатора, энантиоселективного восстановления/стереоинверсии и выделения полученного энантиомера из реакционной смеси (рисунок 9).
Биомассу микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 выращивают в ферментере 1 в те чение 72 ч при температуре 28 - 30 оС и рН 6,2. Биомассу микроорганизма Candida sp. 81-12 выращивают в ферментере 1 в течение 72 ч при температуре 28 - 30 оС и рН 6,5. Выращенная биомасса подается в центрифугу 2. Осажденная биомасса посту пает в емкость 3, в которой она суспендируется в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,0).
Полученная суспензия поступает в реактор 4. Туда же подается изопропанол и субстрат трансформации. В случае восстановления АФ трансформация осуществляется в течение 5 ч при температуре 30 оС и непрерывном перемешивании. При трансформа ции рацемического 1-ФЭ процесс дерацемизации осуществляется в течение 6 сут при температуре 30 оС и непрерывном перемешивании.
субстрат биокатализатор хлороформ ПС Ин СВ хв 4 гв MgSO отработанный биокатализатор буфер NaCl 9 MgSO хлороформ культуральная жидкость I (S)-(-)-1-ФЭ II (R)-(+)-1-ФЭ 1 - ферментер;
2 - центрифуга;
3, 6, 8 - ёмкости с мешалкой;
4 - реактор;
5, 9 – фильтры;
7 экстрактор;
10-вакуумный испаритель;
11 – ёмкость. ПС – питательная среда;
Ин – инокулят;
СВ - стерильный воздух.
Рисунок 9 - Принципиальная технологическая схема получения (S)-(-)-1-фенилэтанола биокатализатором на основе культуры Geotrichum sp. 85-1 и (R)-(+)-1-фенилэтанола биокатализатором на основе культуры Candida sp. 81- После трансформации биомасса удаляется из реакционной смеси на фильтре 5.
Фильтрат собирается в емкость 6, куда также добавляется NaCl (до насыщения) для вы саливания продуктов реакции. Полученная смесь направляется в экстрактор 7 для экс тракции продуктов хлороформом. Хлороформная фракция обезвоживается с помощью MgSO4 в емкости 8. Обезвоженный экстракт фильтруется на фильтре 9 и направляется в испаритель 10 для отгонки растворителя. Готовые продукты собираются в емкости 11.
2 Разработка методов биоконверсии растительных масел в грибные липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой 2.1 Исследование трансформации льняного масла галорезистентным грибом Mortierella alpinа ХН-1 на среде ОГ с 5% NaCl Ранее было показано, что гриб M. alpinа 18-1 может трансформировать -линолевую кислоту, содержащейся в льняном масле, в ЭПК с выходом 1,48 г/кг среды за 13 сут трансформации10-ти суточным мицелием. Предполагается, что в этом процес се участвуют те же ферменты, что и в биосинтезе арахидоновой кислоты, продуцентом которой является данный гриб.
Олеиновая 12-десатураза COOH COOH кислота Альфа-линоленовая кислота 18:1 w9 Линолевая кислота 18:3 w 18:2 w 9-десатураза 6-десатураза 6-десатураза Глюкоза Стеариновая COOH COOH (глицерин) кислота 18:0 Гамма-линоленовая кислота Стеаридоновая кислота 18:3 w6 18:4 w элонгаза элонгаза COOH COOH Дигомо-гамма -линоленовая кислота Эйкозатетраеновая кислота 20:3 w6 20:4 w 5-десатураза 5-десатураза COOH 5% NaCl COOH w3-десатураза Эйкозапентаеновая кислота Арахидоновая кислота.
20:4 w6 20:5 w.
В связи с низким выходом ЭПК в данной работе решались 3 основные задачи, на правленные на интенсификацию получения ЭПК: исследование возможности замены гриба M. alpinа 18-1 его галорезистентным мутантом ХН1, который, как известно, мо жет синтезировать эту кислоту de novo из глицерина;
исследование трансформации льняного масла биомассой дикого и мутантного грибов, полученной на оптимизирован ной среде с сульфатом цинка;
исследование возможности получения ЭПК трансформа цией других доступных растительных масел.
При исследовании возможности использования для трансформации льняного масла галорезистентного мутанта ХН1 были получены грибные липиды, содержащее 21,9 % ЭПК (рисунок 10). При этом выход ЭПК через 10 суток трансформации составил 1,35 г/кг среды, что сопоставимо с выходом этого соединения, полученным ранее с по мощью исходного гриба M. alpinа 18-1, но за 13 суток.
25, Жирные кислоты, % 25 21, (от суммы ЖК) 18, 15, 13, 15 Рисунок 10 – Жирнокислотный 10 профиль 20-суточного мицелия гри 5 1,1 1,6 2,2 ба M. alpinа ХН1 при трансформа 0 ции льняного масла на среде ОГ с 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' NaCl (5%) Вместе с тем, следует отметить, что в обоих случаях выход целевого продукта не достаточно высок и требуется поиск способов интенсификации разрабатываемых био трансформаций.
2.2 Исследование влияния сульфата цинка на синтез ЭПК de novo у галорезистентного мутанта Одним из подходов к такой интенсификации является подбор условий культиви рования гриба, обеспечивающий эффективный синтез высокоактивной биомассы мик роорганизма. В этом аспекте заслуживает внимание факт стимулирования липидообра зования у микроорганизмов ионами некоторых двухвалентных металлов. В частности известно, что ионы цинка и магния активируют ацетил-СоА-карбоксилазу – ключевой фермент синтеза жирных кислот. Активация этого фермента ионами металлов должна приводить к ускорению синтеза жирных кислот. Положительное влияние ионов цинка на синтез арахидоновой кислоты de novo грибом M. alpina 18-1 было выявлено ранее.
В результате исследования влияния сульфата цинка на рост и липидообразование галорезистентного мутанта ХН1 было обнаружено, что введение цинка в среду приводит к существенному увеличению выхода биомассы в конце культивирования (таблица 7).
Таблица 7 – Влияние ионов цинка на выход биомассы и липидов при росте гриба ХН на овсяной среде с глицерином и хлоридом натрия Среда Нелипидные Содержание Время, Липиды, Биомасса, Липиды, компоненты, сут % от асв г/кг г/кг Обозначение сульфата г/кг цинка, % ОГ с NaCl 0 21 43,5 14,51 8,2 6, ОГЦ с NaCl 0,01 21 64 23,15 8,34 14, При этом содержание липидов в 21-суточной биомассе гриба, растущего на ОГЦ среде с 5 % NaCl, достигало 64 %, тогда как на среде без сульфата цинка липиды состав ляли лишь около 43 % грибной массы. В тоже время выход нелипидных компонентов гриба остается на том же уровне.
При исследовании состава липидной фракции 18-суточного гриба M. alpinа ХН1, выращенного на среде ОГЦ, содержащей 5% NaCl, было обнаружено, что в ней содер жится свыше 22 % ЭПК (рисунок 11).
34, Жирные кислоты, % (от 25 22, суммы ЖК) 15 12, Рисунок 11 – Жирнокислотный 8,9 9, 5,4 5,1 профиль липидов 18-суточного 5 1, 0 0 мицелия M. alpinа ХН1 на среде 14:' 16:' 18:' 20:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n ОГЦ с NaCl (5%) Выход этого соединения при выращивании гриба на среде ОГЦ в течение 18 су ток составил 2,71 г/кг среды. Ранее на аналогичной среде без цинка с помощью галоре зистентного гриба удалось получить ЭПК только с выходом 0,95 г/кг за 23 суток куль тивирования.
2.3 Исследование трансформации льняного масла грибами, выращенными на средах с сульфатом цинка Были исследованы процессы трансформации льняного масла с помощью биомас сы исходного и галорезистентного грибов, полученной на овсяной среде с глицерином в присутствии 0,01 % сульфата цинка.
При трансформации льняного масла в течение 10 суток с помощью биомассы га лорезистентного гриба M. alpinа ХН1, выращенной на среде ОГЦ с хлоридом натрия (5%), были получены липиды с более высоким содержанием ЭПК (таблица 8), чем на среде без цинка. При этом также существенно возрастает доля всех С20 ПНЖК (с 40, до 86,4 %). Выход ЭПК при трансформации льняного масла грибом M. alpinа ХН1 на среде с сульфатом цинка достигает 5,63 г/кг, что почти в 4 раза выше, чем на среде без ионов цинка (1,35 г/кг).
Таблица 8 – Содержание ПНЖК при трансформации льняного масла на средах с суль фатом цинка Содержание ПНЖК, % Выход Микроорга- Дигомо-- Арахидо- Эйкозапен Среда ЭПК, низм линоленовая новая таеновая г/кг кислота кислота кислота M. alpinа ХН1 ОГ с NaCl 0 18,6 21,9 1, M. alpinа ХН1 ОГЦ с NaCl 22,2 27,3 36,9 5, ОГЦ M. alpinа 18-1 17,6 38,8 26,2 5, При трансформации льняного масла с помощью биомассы исходного гриба, по лученной на овсяной среде с глицерином в присутствии сульфата цинка, обнаружено, что выход ЭПК в расчете на 1 кг среды также существенно увеличился (с 1,48 на среде ОГ до 5,2 г/кг на среде ОГЦ).
2.4 Исследование трансформации растительных масел, обедненных или несодержащих -линоленовую кислоту Была исследована возможность получения ЭПК, а также других ценных ПНЖК, с помощью исследуемых грибов M. alpinа путем трансформации других растительных масел, несодержащих или содержащих лишь небольшие количества -линоленовой ки слоты. В качестве субстратов использовали соевое, подсолнечное и оливковое масла.
Преобладающей жирной кислотой в соевом и подсолнечном масле является линолевая кислота (54 и 67 %, соответственно), а в оливковом масле – олеиновая кислота (80 %).
Доля -линоленовой кислоты в данных маслах колеблется от 0,2 до 8 %.
32,7 40,5 Жирные кислоты, % Жирные кислоты, % 40 33,3 (от суммы ЖК) (от суммы ЖК) 17, 25 20 15 10, 15 9, 10 3,2 2,8 4, 4,1 3, 1 2, 5 5 14:' 16:' 18:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' а Mortierella alpinа 18-1 а Mortierella alpinа ХН 32,6 27, 35 30, 24, Жирные кислоты, % Жирные кислоты, % 30 (от суммы ЖК) (от суммы ЖК) 20, 16, 20 13, 15 10, 15 10, 9, 3, 1, 5 0 0 14:' 16:' 18:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n б Mortierella alpinа 18-1 б Mortierella alpinа ХН 35, Жирные кислоты, % 35 29, (от суммы ЖК) 15 9, Рисунок 12 – Жирнокислотный профиль липи 2,1 5 дов грибов при трансформации соевого (а), 18:1n 18:2n 18:3n 20:3n 20:4n 20:5n 14:' 16:' 18:' оливкового (б) и подсолнечного (в) масел на средах с 0,01% сульфатом цинка в Mortierella alpinа 18- Было обнаружено, что ЭПК может быть получена не только из льняного масла, содержащего -линоленовую кислоту, но и из растительных масел, не содержащих это соединение. При трансформации соевого, подсолнечного и оливкового масел содержа ние ЭПК достигало 20-40%. Кроме того, в ряде случаев в липидах в значительных коли чествах обнаружена арахидоновая кислота (до 33% от суммы жирных кислот) (рисунок 12).
2.5 Анализ выхода липидов и ПНЖК при трансформации растительных масел Анализ выхода липидов при трансформации растительных масел показал, что с помощью исследуемых грибов на среде ОГЦ можно получать от 15 до 22 г/кг среды грибного масла (рисунок 13 а). При этом более высокий выход липидов может быть достигнут при трансформации растительных масел с помощью исходного гриба 18-1.
Наиболее высокий выход ценных ПНЖК (17,3 г/кг среды) может быть получен при трансформации грибом M. alpinа 18-1 льняного масла (рисунок 13 б).
17, 25 22, 16 13, 20 14, 19,7 Выход ПНЖК, г/кг Выход липидов, г/кг 20 17,8 14 12, 16, 16 15,3 12 10 7, ЛМ СМ ПМ ОМ ЛМ СМ ПМ ОМ б а – M. alpina 18-1 (среда ОГЦ);
7,9 – M. alpina ХН1 (среда ОГЦ с 5 % NaCl) 8 7, Эйкозапентаеновая 7 5, 5,2 5, кислота, г/кг 6 Масло: ЛМ – льняное, СМ – соевое, ПМ – подсолнечное, ОМ – оливковое 3, Рисунок Выход липидов 13 – (а), 1 ПНЖК (б) и ЭПК (в) при трансформации 0 растительных масел с помощью ЛМ СМ ПМ ОМ исследуемых грибов в Наибольший выход целевой ЭПК (7,2 – 7,9 г/кг среды) был достигнут при транс формации в течении 10 сут соевого и подсолнечного масел с помощью M. alpinа 18-1, что превышает ее выход при трансформации льняного масла, изначально прогнозируе мого как наиболее перспективного источника богатого предшественником ЭПК -линоленовой кислотой (рисунок 13 в).
Согласно литературным данным, одним из наилучших достижений в получении ЭПК является процесс трансформации льняного масла с помощью мутантного гриба M. alpinа, дефицитного по 12-десатуразе, накапливающего около 6,4 % ЭПК от веса биомассы. Нами при трансформации растительных масел на средах с сульфатом цинка с помощью исследуемых грибов удалось получить от 11,9 до 18,3 % ЭПК от веса сухой биомассы.
Помимо ЭПК трансформацией исследуемых масел можно получать сопутствую щую арахидоновую кислоту с выходом 4,3 – 7,6 г/кг среды, а также дигомо- линоленовую кислоту с выходом 3,5 - 3,6 г/кг среды при использовании в качестве суб страта льняного масла.
ВЫВОДЫ 1 В результате скрининга найдены микроорганизмы Geotrichum sp. 85-1, Candida sake 777, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13, проявляющие карбонилредуктазную активность в отношении ацетофенона при высоких концентрациях субстрата (5-15 г/л).
2 Разработаны методы получения (S)-1-фенилэтанола c выходом 56-83% высокой оптической чистоты менее с помощью клеток (не 99%ее) Geotrichum sp. 85-1, пермеабилизованных ацетоном или изопропанолом, а также с по мощью интактных клеток в буфере, содержащем 33% изопропанола.
3 Обнаружена реакция окислительно-восстановительной изомеризации (S)-изомера 1-фенилэтанола в (R)-изомер при инкубировании их рацемической смеси с биомассами микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Candida sake 777, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13.
4 На основе культуры Candida sp. 81-12 предложен метод получения (R)-1-фенилэтанола стереоизомеризацией S-энантиомера рацемического 1-фенилэтанола с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее.
5 Научно обоснована принципиальная технологическая схема получения энантиоселективным восстановлением ацетофенона (S)-(-)-1-фенилэтанола и (R)-(+)-1-фенилэтанола дерацемизаций рацемической смеси 1-фенилэтанола с исполь зованием разработанных биокатализаторов на основе культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1 и Candida sp. 81-12.
6 Показана возможность использования гриба Mortierella alpina 18-1 и его галоре зистентного мутанта ХН1 для трансформации растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с высоким содержанием -линоленовой, линолевой и олеиновой кислот в грибные липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой, обра зующейся с выходом 3,4 – 7,9 г/кг среды в составе других ценных полиненасыщенных жирных кислот (общий выход 7,9 – 17,3 г/кг среды).
7 Выявлена способность гриба Mortierella alpina 18-1 и его галорезистентного му танта ХН1 трансформировать льняное масло в дигомо--линоленовую кислоту с выхо дом 3,5 - 3,6 г/кг среды.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Калимуллина, Л.Я. Скрининг дрожжевых штаммов, способных продуцировать био эмульгаторы / Л.Я. Калимуллина, О.В. Семенова, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Ин теграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии: Материалы IV Всероссийской научной INTERNET-конференции. Уфа: Изд-во Реактив.- 2006.- С.100-101.
Калимуллина, Л.Я. Стереоинверсия 1-фенилэтанола грибом рода Geotrichum / Л.Я.
Калимуллина, Н.И. Петухова, Д.Г. Ханнанова, В.В. Зорин // Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии: Ма териалы V Всероссийской научной INTERNET-конференции.- Уфа: Изд-во Реак тив.- 2007.- С. 63-64.
Ханнанова, Д.Г. Скрининг биокатализаторов для энантиоселективной трансформа ции ацетофенона / Д.Г. Ханнанова, Л.Я. Калимуллина, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2007.- №1.-С.148-150.
Калимуллина, Л.Я. Восстановление карбонилсодержащих соединений в биоэмуль сиях с помощью клеток дрожжей / Л.Я. Калимуллина, Э.Р. Мухитдинов, Н.И. Пе тухова, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2007.– № 1.- С. 151-153.
Сюндюкова, Ю.Р. Разработка методов биоконверсии растительных масел в липиды, обогащенные арахидоновой и экозапентаеновой кислотами / Ю.Р. Сюндюкова, Л.Я.
Калимуллина, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Химия и медицина: Материалы VI Все российского научного семинара с Молодежной научной школой.- Уфа: Гилем. 2007.- С. 227.
Калимуллина, Л.Я. Восстановление ацетофенона с помощью клеток гриба Geotrichum sp. 85-1 в биоэмульсиях / Л.Я. Калимуллина, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2008.– №1. -С. 8-10.
Петухова, Н.И. Биотрансформация льняного масла в липиды, обогащенные эйкоза пентаеновой кислотой / Н.И. Петухова, Л.Я. Калимуллина, Ю.Р. Рахматуллина, В.В. Зорин // Башкирский химический журнал.- 2008.– №1. -С. 19-21.
Соискатель Калимуллина Л.Я.