Молекулярно-генетическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий i типа в республике башкортостан
На правах рукописи
БАГАУТДИНОВА ЭЛЬВИРА ГАЗИНУРОВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ МОТОРНО-СЕНСОРНЫХ НЕЙРОПАТИЙ I ТИПА В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН 03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
УФА – 2007
Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук
Научный консультант: кандидат биологических наук Хидиятова Ирина Михайловна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич доктор биологических наук профессор Мустафина Ольга Евгеньевна
Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н. Н. Вавилова РАН.
Защита диссертации состоится _ ноября 2007 г. в часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, Просп. Октября, 71.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН
Автореферат разослан _ октября 2007 г.
Ученый секретарь регионального диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Наследственные моторно-сенсорные нейропатии (НМСН) или болезнь Шарко-Мари-Тута (ШМТ) – это генетически и клинически гетерогенная группа заболеваний периферической нервной системы, поражающих миелиновые оболочки, аксоны двигательных и чувствительных волокон, а также спинно-мозговых корешков. В среднем, в мире их распространенность составляет 10,0 на 100000 населения, варьируя от 0,1 до 41,0 на 100000 населения (Руденская., 1998;
Emery et al., 1991;
Ionasescu et al., 1995). В Башкортостане распространенность всех типов НМСН составляет 10,3 на 100000 населения (Крупина и др., 2006).
В зависимости от характера поражения нервных волокон, НМСН подразделяются на два основных типа – димиелинезирующий (НМСН I) и аксональный (НМСН II), клиническая дифференциация которых возможна только на основе электронейромиогрфического исследования, выявляющего скорость проведения импульса (СПИ) по срединному нерву. К каждому из этих типов заболевания относится целый ряд генетически различных форм заболевания. В настоящее время картировано более 25 генов, ответственных за развитие НМСН, 22 из которых идентифицированы (http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html). Известные формы НМСН, несмотря на существование определенных особенностей, имеют много общих как клинических, так и электронейромиографических признаков, что значительно затрудняет их диагностику, в том числе дифференциальную.
Поэтому самым точным методом диагностики НМСН, становящимся все более доступным в наше время, является ДНК-анализ, позволяющий проводить не только дифференциальную, но также пренатальную и пресимптоматическую диагностику в отягощенных НМСН семьях. При этом, молекулярно генетическое исследование НМСН является и основой изучения патогенеза данной группы заболеваний.
Большинство из известных генов, мутации в которых приводят к развитию НМСН, кодируют белки, непосредственно участвующие в структурной и функциональной организации миелина периферических нервных волокон. Согласно литературным данным, в странах Европы и США наиболее распространена НМСН I типа, среди которого наиболее частой является форма НМСН1А (СМТ1А). Генетической причиной развития данной формы является дупликация 1,5 Mb в хромосомной области 17р11.2-12, включающей ген белка периферического миелина (РМР22) (Timmerman et al., 1990, Patel et al., 1990, Lebo et al., 1992). Наряду с дупликацией/делецией, в гене PMP22 обнаружено более 60 точковых мутаций, приводящих к развитию НМСН. Второй по частоте считается Х-сцепленная форма НМСН IX, обусловленная мутациями в гене коннексина 32 (Cx32, GJB1). Другим важным геном, мутации в котором приводят к развитию целого ряда форм НМСН, является ген MPZ (myelin protein zero, Ро). Более редкой, но все же имеющей место причиной НМСН I типа, является нарушение структуры гена EGR2 (early growth response gene – 2). Следует отметить, что мутации в выше указанных генах могут приводить к различным формам НМСН, относящимся не только к НМСН I типа, но также к НМСН II и промежуточного типов. Поэтому, при проведении молекулярно-генетического изучения данной группы заболеваний в определенном регионе, как правило, в первую очередь исследуются именно эти гены.
В Республике Башкортостан (РБ) эпидемиологическое и молекулярно генетическое исследование НМСН начато в последние годы: установлена территориальная и этническая неравномерность распространения заболевания, преобладание по частоте НМСН I типа. Однако, молекулярно-генетический анализ включал только определение дупликации/делеции гена PMP22, показавшее несколько более низкий уровень частоты данной мутации в РБ (45% среди НМСН I) (Крупина с соавт., 2006), по сравнению с другими регионами России. В связи с этим, актуальным является продолжение исследования роли ряда известных генов в развитии НМСН у больных из РБ, являющееся основой для разработки наиболее оптимального для региона алгоритма ДНК-диагностики данной группы заболеваний.
При проведении идентификации дупликации/делеции гена РМР методом регистрации дозы гена с помощью двух микросателлитных маркеров, в ряде случаев возникала необходимость анализа полиморфизма дополнительных ДНК-локусов. Это определило актуальность подбора высокополиморфных маркеров, сцепленных с геном PMP22, удобных для ПЦР анализа и характеризующихся высокой степенью гетерозиготности среди населения исследуемого региона.
Целью исследования являлся анализ структурных особенностей генов PMP22, GJB1, MPZ, EGR2 у больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан и разработка оптимального для региона алгоритма ДНК – диагностики данной группы заболеваний.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Провести поиск мутаций и полиморфных вариантов генов PMP22, GJB1(Cx32), MPZ и EGR2 у больных с НМСН из РБ и в контрольной выборке.
2. У больных с выявленными мутациями определить гаплотипы по полиморфным локусам, маркирующие мутантные хромосомы.
3. Охарактеризовать клинические особенности НМСН у больных с выявленными мутациями в исследованных генах.
4. С целью оптимизации метода выявления дупликации/делеции гена РМР22 провести анализ полиморфизма трех сцепленных с геном микросателлитных ДНК – локусов в выборках здоровых житилей Республики Башкортостан, этнических русских, башкир и татар.
5. Разработать на основе полученных данных оптимальный для населения Республики Башкортостан алгоритм ДНК-диагностики НМСН.
Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые в Республике Башкортостан изучены спектр и частота мутаций в генах РМР22, GJB1(Сх32), MPZ и EGR2 при НМСН I типа. Выявлено 4 различных мутации в гене GJB1, одна из которых (Pro87Ala) является частой в РБ (19,40% среди НМСН I типа), сцепленной с общим гаплотипом;
мутация Thr86Ile, выявленная с частотой 1,49% среди НМСН I типа, ранее не описана. С целью оптимизации метода идентификации дупликации/делеции гена РМР22 проведен анализ полиморфизма трех сцепленных с геном микросателлитных локусов среди жителей РБ, показавший высокие показатели гетерозиготности и возможности их использования для диагностики данной мутации.
Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических причинах развития НМСН в Башкортостане. На основе данных по спектру и частоте генетических вариантов НМСН разработан оптимальный для нашего региона алгоритм поиска мутаций у больных с НМСН I типа. Полученные результаты могут быть использованы для уточнения диагноза, а также позволяют проводить пренатальную ДНК-диагностику НМСН в семьях с идентифицированными мутациями. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту:
1. Высокая частота распространения формы НМСН IА среди больных НМСН из Республики Башкортостан.
2. Высокий уровень гетерозиготности трех микросателлитных локусов, сцепленных с геном РМР22, у жителей РБ и возможность их использования для диагностики дупликации/делеции данного гена.
3. Спектр и частоты мутаций в генах РМР22, GJB1, MPZ и EGR2 у больных НМСН I типа из РБ. Впервые обнаружены мутации Thr86Ile (c.257CT) в гене GJB1 и полиморфизм Ser239Ser (c.714CT) в гене MPZ.
4. Высокая частота мутации Pro87Ala в гене GJB1 среди больных НМСН I типа из РБ, связанная с эффектом основателя.
5. Основные клинические характеристики больных НМСН I с выявленными мутациями в гене GJB1.
6. Оптимальный для жителей РБ алгоритм молекулярно-генетического обследования больных НМСН I типа, основанный на анализе генов РМР22 и GJB1.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Ежегодных конференциях Европейского общества генетиков человека (Амстердам 2006, Ницца 2007), 10-й Пущинской школе - конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН, девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), IX Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006), Ежегодной Балканской конференции генетиков человека (Balkan Meeting on Human Genetics, Скопье, 2006), международной школе молодых ученых «Геномика и биотехнология» (Звенигород, 2006), 31-ом конгрессе федерального европейского биохимического общества (FEBS congress, Стамбул, 2006), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатовисследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает источников.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность заведующему кафедрой неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета д.м.н., профессору Магжанову Риму Валеевичу за консультативную помощь и организацию забора материала.
Материал исследования. В работе использованы образцы геномной ДНК больных с клиническим диагнозом наследственная моторно-сенсорная нейропатия, состоящих на диспансерном учете в Медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра (МГК РПЦ) г. Уфы, членов их семей, а также здоровых доноров, проживающих в Башкортостане.
Клинический осмотр и забор крови больных проводился сотрудниками кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета. Исследуемая выборка представлена 173 больными НМСН из 131 семьи и 60 здоровыми членами семей. Из 131 семьи на основании данных ЭНМГ диагноз НМСН I типа был установлен в 67 семьях, II типа – в 9 семьях, у больных из 55 семей данные ЭНМГ отсутствовали, в связи с чем в исследование были включены все больные с НМСН, без дифференциации на типы, а расчет частоты выявленных мутаций представлен как для 67 неродственных больных НМСН I типа, так и для всей выборки неродственных больных НМСН. По этнической принадлежности семьи распределились следующим образом: 42 русских, татарских, 27 башкирских, 3 украинских, по одной семье чувашской, марийской и азербайджанской. В 19-ти семьях пробанды происходили из межнациональных браков.
Методы исследования. Выделение ДНК проводили методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции из цельной венозной крови (Mathew, 1984). Идентификацию дупликации гена РМР22 проводили методом мультиплексной ПЦР с помощью набора реактивов «CMT-dup», выпускаемого ООО «Центр Молекулярной Генетики» (г. Москва), согласно прилагаемой инструкции. Анализ полиморфизма трех микросателлитных ДНК – локусов, сцепленных с геном РМР22, проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с использованием праймеров, предложенных (Latour et al., 2001). Поиск мутаций в генах РМР22, Сх32, MPZ и EGR2 осуществляли методом конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP-анализ). Результаты SSCP-анализа оценивали в 10%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием азотнокислым серебром. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism, модель 310 (Applied Biosystems).
Статистическая обработка полученных результатов. Математическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ статистического анализа “Rows x Columns” [Roff., 1989], Statistica ver.6. (StatSoft, Inc., 2003) с использованием критерия «хи-квадрат», критерия Стъюдента (t).
Неравновесие по сцеплению между аллелями локусов Х-хромосомы (Pd Pn ).
рассчитывали по формуле Статистическую значимость = (1 Pn) неравновесия по сцеплению оценивали с помощью точного критерия Фишера, используя пакет STATS системы R 2.5.1 для статистического анализа и программирования (R Development Core Team, 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение частоты дупликации/делеции гена РМР22 в выборке больных НМСН из Башкортостана.
В выборке больных с клиническим диагнозом болезнь «Шарко-Мари Тута» был проведен анализ частоты дупликации гена РМР22. В исследовании приняло участие 173 больных из 131 семьи, в 67 из которых с помощью клинических методов исследования и ЭНМГ была установлена НМСН I типа.
В результате скрининга дупликации гена PMP22 (рис. 1) данная мутация обнаружена у 46 больных из 35 неродственных семей без дифференциации на типы НМСН. В пересчете на неродственных больных, частота данной мутации составила 26,72% из НМСН всех типов и 52,24% - из НМСН I типа, что оказалось несколько ниже по сравнению с аналогичными показателями по России и странам Европы. В трех основных этнических группах больных, без дифференциации на типы НМСН, наибольшая частота дупликации выявлена у лиц татарской этнической принадлежности - 37,14%, наименьшая - у башкир – 14,78%;
для русских этот показатель составил 31,43%, для метисов – 17,14%.
Все полученные значения можно считать достаточно высокими, указывающими на необходимость первоочередного поиска данной мутации при проведении ДНК-диагностики заболевания.
}dup }dup Рис 1. Электрофореграмма ПЦР-анализа для идентификации дупликации гена PMP22: дорожки № 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13 – отсутствие дупликации, дорожки № 6, и 11 – наличие дупликации;
дорожка 1 – делеция гена PMP22.
У двух пациентов (1,53%) выявлена делеция гена PMP22, ведущая к развитию наследственной нейропатии со склонностью к параличам от сдавления. В 3-х из 35 семей (8,57%) дупликация гена PMP22 являлась мутацией de novo.
2. Анализ полиморфизма трех STR-локусов, сцепленных с геном РМР22, в некоторых этнических группах Башкортостана.
На сегодняшний день наиболее дешевым, быстрым и простым в исполнении методом детекции дупликации/делеции гена РМР22 является регистрация дозы аллелей полиморфных микро- или минисателлитных ДНК локусов, расположенных внутригенно или рядом с геном. При этом, важной характеристикой используемых в этих целях полиморфных маркеров является их гетерозиготность в популяциях. Чем выше степень гетерозиготности полиморфного ДНК- локуса, тем меньше вероятность наличия гомозиготного состояния аллелей, затрудняющего интерпретацию результата.
С целью оптимизации метода идентификации дупликации/делеции гена РМР22 был проведен анализ полиморфизма трех микросателлитных локусов (4А, 9А, 9В), описанных в работе Latour с соавторами (2001), в выборке здоровых доноров из Башкортостана, представляющих три этнические группы – русских, башкир и татар. На рисунке 2 представлено схематическое расположение изученных авторами ДНК-локусов относительно гена РМР22.
Они захватывают область размером в 0,55 Mb в центре дупликации.
Рис. 2 Полиморфные ДНК-локусы, сцепленные с дуплицируемой областью гена РМР22 (Latour et al., 2001).
По локусу 4А в выборках доноров русской и татарской этнической принадлежности выявлено по 6 аллельных вариантов, в выборке башкир – 8. Во всех этнических группах наиболее часто встречаются 4 аллельных варианта, частота которых варьирует в пределах 16-32% (рис. 3) Для данного ДНК-локуса установленные значения гетерозиготности варьировали от 57% у русских до 66% у татар (таблица 1). Такие показатели не считаются высокими, т.к.
существует множество полиморфных локусов, гетерозиготность которых может достигать более 80%. Однако, ввиду того, что 4 аллельных варианта распределены среди населения с частотой, не превышающей 40%, и аллели легко идентифицируются методом ПЦР и электрофореза, данный полиморфный локус можно считать пригодным для использования при диагностике дупликации/делеции гена PMP22.
При анализе локуса 9А наиболее часто во всех трех обследованных выборках встречаются аллели №№ 2,3,4 и 5, их частота находится в пределах 18-26% среди русских, 7-32% среди татар и 14-30% среди башкир (рис. 4).
Гетерозиготность по данному локусу оказалась выше, чем по локусу 4А, составив 75% во всех исследованных группах, что свидетельствует о возможности использования его для идентификации дупликации гена PMP22.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 2 3 4 5 6 7 русские татары башкиры Рис. 3. Распределение частот аллелей полиморфного ДНК-локуса 4А в некоторых этнических группах Башкортостана. По оси абсцисс указаны номера аллелей(собственное обозначение аллелей: 1 – аллель с минимальным размером фрагмента, 8 – с максимальным), по оси ординат - их частоты.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 2 3 4 5 6 7 русские татары башкиры Рис. 4. Распределение частот аллелей полиморфного ДНК-локуса 9А в некоторых этнических группах Башкортостана.
По полиморфному локусу 9В выявлено 7 аллелей в выборке русских и по 6 аллелей в выборках татар и башкир. Наиболее частыми во всех группах являются аллели №№ 2, 3, 4 и 5, их частота варьирует от 13 до 35% среди русских, от 14 до 37% среди татар и от 16 до 30% среди башкир (рис. 5).
Показатели фактической гетерозиготности по данному локусу варьируют от 68% среди русских до 83% у башкир (таблица 1). Таким образом, локус 9В является достаточно информативным полиморфным маркером, особенно для башкир.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 2 3 4 5 6 русские татары башкиры Рис. 5. Распределение частот аллелей полиморфного ДНК-локуса 9В в некоторых этнических группах Башкортостана.
Таблица 1. Индексы фактической и теоретической гетерозиготности полиморфных локусов 4А, 9А и 9В в этнических группах русских, татар и башкир.
Гетерозиготность В целом Русские Татары Башкиры Локус факти- теорети- факти- теорети факти- теорети- фак- теор ческая ческая ческая ческая ческая ческая тич. тич.
0,61 0, 4А 0,57 0,77 0,66 0,70 0,60 0, 0,75 0, 9А 0,75 0,79 0,75 0,77 0,75 0, 0,74 0, 9В 0,68 0,76 0,70 0,73 0,83 0, 3. Поиск мутаций и полиморфизмов в генах PMP22, GJB1, MPZ и EGR2.
В семьях больных без дупликации гена РМР22 (127 больных из 94 семей) проведен SSCP-анализ всех экзонов генов PMP22, GJB1, MPZ, и EGR2.
В гене РМР22 обнаружен один тип изменения подвижности однонитевой ДНК в участке, включающем часть третьего интрона и четвертый экзон (рис 6).
Последующее секвенирование данного образца выявило замену гуанина на аденин в интронной области гена РМР22 в положении с.309-29GA (рис.6).
Рис.6. SSCP-анализ и секвенирование 4 экзона гена РМР Поскольку данное изменение ранее не описано в литературе, а в нашей выборке обнаружено в единичном случае, достаточно сложно предположить о его роли в развитии НМСН. В результате данной нуклеотидной замены не происходит изменения сайта рестрикции для каких-либо из известных эндонуклеаз.
В результате SSCP-анализа единственного кодирующего экзона гена GJB было выявлено 4 различных типа изменения подвижности однонитевой ДНК.
При последующем секвенировании определены четыре мутации: Pro87Ala, Arg22Gln, Thr86Ile и Arg15Gln.
С наибольшей частотой (9,92% в общей выборке больных с НМСН и 19,40% среди больных с НМСН I) среди пациентов НМСН из Башкортостана выявлена трансверсия С на G в 259 положении нуклеотидной последовательности, приводящая к замене пролина (CCC) на аланин (CGC) в положении аминокислотной последовательности белка (Pro87Ala) (рис. 7). С наибольшей частотой данная мутация выявлена среди больных – башкир по этнической принадлежности (18,52% в выборке больных башкир, без дифференциации на типы НМСН), реже – среди русских (11,9%) и татар (5,40%). Согласно опубликованным данным, эта мутация встречается у пациентов из Бельгии (Nelis et al., 1997) и не обнаружена ранее среди больных НМСН из России. Мутация локализована во втором трансмембранном домене белка и, согласно данным (Abrams et al., 2000), приводит к уменьшению диаметра каналов щелевого соединения, что препятствует прохождению по нему относительно крупных молекул.
1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 7. SSCP – анализ и секвенирование первого типа изменения подвижности однонитевой ДНК гена GJB1 (259CG). Дорожка 5 - маркер молекулярного веса. 3,4 образцы ДНК контрольных здоровых индивидов, 2, 6 - одноцепочечные фрагменты ДНК больных НМСН с измененной подвижностью первого типа.
Мутация была подтверждена с помощью ПДРФ-анализа с использованием рестриктазы AciI в стандартных условиях.
Секвенционный анализ образцов ДНК со II типом изменения подвижности однонитевой ДНК (рис. 8) выявил наличие замены гуанина на аденин в 65 положении (65GA), что приводит к замене аргинина (CGA) на глутамин (CAA) в 22 положении аминокислотной последовательности белка (Arg22Gln). Миссенс мутация Аrg22Gln выявлена у трех больных из двух семей татарской этнической принадлежности, что составило 1,53% для общей выборки неродственных пациентов из РБ, без дифференциации на типы заболевания и 2,98% для больных НМСН I типа. Данная мутация ранее описана в семьях больных Японии (Matsuyama et al.,2001), Германии (Senderek et al., 1998), Финляндии (Silander et al., 1997), а также обнаружена в России (Фетодов, 2003).
Рис. 8. SSCP-анализ и секвенирование II типа изменения в гене GJB1 (65GA).
При III типе SSCP- изменения в одной семье татарской этнической принадлежности выявлена мутация - замена цитозина на тимин в положении нуклеотидной последовательности, приводящая к замене треонина на изолейцин в 86 положении аминокислотной последовательности белка Сх (Thr86Ile) (рис. 9). Частота мутации составила 0,76% для общей выборки больных НМСН и 1,49% для НМСН I типа.
Рис. 9. Картина SSCP-анализа и секвенирования III типа изменения в гене GJB (257CT).
Данная мутация ранее не описана в литературе и не зафиксирована в базе данных (www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations). Относительно функциональной значимости мутации Thr86Ile можно сделать предположение на основании места ее расположения – во втором трансмембранном домене белка Сх32, в непосредственной близости с кодоном 87, где описана мутация Pro87Ala.
Вероятно, что мутация Thr86Ile, так же, как и Pro87Ala, может приводить к нарушению межклеточного транспорта за счет изменения структуры молекул коннексина 32 в составе коннексонов и, соответственно, образуемых ими щелевых соединений. Можно также отметить, что при данной мутации полярная аминокислота треонин, способная формировать сложные водородные связи в структуре молекулы белка, заменяется на неполярную аминокислоту изолейцин, обладающую, благодаря наличию углеводородного радикала, гидрофобными свойствами. Вероятно, что такое замещение аминокислот в последовательности белка играет немаловажную роль в его структуре и функции.
При четвертом типе SSCP-изменения (рис. 10) в гене GJB1 у двух неродственных больных идентифицирована замена гуанина на аденин в положении нуклеотидной последовательности (44GA), что привело к замене аргинина на глутамин в 15 положении аминокислотной последовательности (Arg15Gln). Частота мутации составила 1,53% для общей выборки больных НМСН и 2,98% для больных с НМСН I типа. Мутация локализована в цитоплазматическом домене белка. Согласно литературным данным, эта мутация изменяет функцию белка, влияя на проведение возбуждающих импульсов (Fairweather et al., 1994).
Рис. 10. SSCP-анализ и секвенирование IV типа изменения гена GJB1 (44GA).
Для всех выявленных мутаций в гене GJB1 были определены генотипы и гаплотипы по 8 полиморфным микросателлитным ДНК-локусам, сцепленным с геном (таблица 2). Для 5 из этих 8 локусов было проведено исследование полиморфизма в контрольной выборке здоровых мужчин из РБ, Таблица 2. Генотипы и гаплотипы по 8 полиморфным маркерам у больных НМСН I с мутациями в гене GJB1.
Больные НМСН Pro87Ala Arg22Gln Thr86Ile Координата Маркер т.п.н. 8.0 27.0 29.0 32.0 43.0 58.0 64.0 70.0 72.0 73.0 80.0 88.0 89.0 25.0 65.0 69.0 66. М м ж ж м м м ж ж м м м м м м ж м DXS8040 68163 4 3 3/4 3/4 4 3 4 3/3 3/3 4 4 3 3 3 3 4/5 DXS1216 68281 4 3 4/4 3/4 4 4 4 3/2 2/4 4 4 4 4 3 2 2/3 DXS8111 68410 3 2 4/3 1/3 3 3 3 3/3 3/3 3 3 3 3 1 1 1/3 DXS983 69365 3 3 3/3 3/3 3 3 4 4/4 3/3 3 3 3 3 2 3 3/4 DXS8107 69637 2 2 2/2 2/2 2 2 2 2/3 2/2 2 2 2 2 2 2 2/2 DXS8052 69730 6 6 6/7 6/5 6 6 6 7/6 6/7 6 6 6 2 7 7 7/9 GJB DXS6743 71281 3 3 3/3 1/3 3 3 3 1/3 1/3 3 3 3 3 1 1 1/1 DXS8070 72572 2 2 1/1 2/2 2 2 2 2/2 2/2 2 2 2 2 1 1 1/2 что позволило рассчитать показатели неравновесия по сцеплению выявленных у больных аллелей с частой мутацией Pro87Ala (таблица 3).
Таблица 3. Частоты аллелей полиморфных локусов гена GJB1 у больных с мутацией Pro87Ala и в контрольных выборках, и их неравновесие по сцеплению с данной мутацией.
Частоты аллелей 2 P Маркер Аллель больные здоровые 3 0,50 0,53 0,05 0,0001 -0, DXS 4 0,50 0,35 1,09 0,35 0, 4 0,86 - - - DXS 3 0,14 - - - 0, 3 0,93 0,33 16,27 0, DXS 2 0,07 0,43 6,42 0,62 -0, 0,86 0, 3 0,43 8,16 0, DXS 4 0,14 0,30 1,42 0,33 -0, 1,0 0,75 4,76 0,03 DXS 1,0 0,15 38,29 0,0001 DXS Pro87Ala GJB 1, 3 - - - DXS 0, 3 - - - DXS 1 0,07 - - - Примечание: Для выборки здоровых доноров приведены только аллели, выявленные у больных.
Как видно из таблицы 3, наибольшие значения показателя неравновесия по сцеплению установлены для аллелей локусов DXS8107 и DXS8052 (100% сцепление), достаточно высоки они и для локусов DXS8111 (аллель3) и DXS (аллель 3). По локусам DXS1216, DXS6743 и DXS8070 анализ полиморфизма среди здоровых доноров не проведен, что не позволило рассчитать показатели неравновесия по сцеплению, однако по этим локусам у больных наблюдается высокая частота определенных аллелей, что, с большой вероятностью, может свидетельствовать о их сцеплении с мутацией. Подтверждение этому может являться и тот факт, что по локусам DXS1216 и DXS8070 аллели, не совпадающие у разных больных, отличаются между собой на один динуклеотидный повтор, что может быть результатом мутации, характерной для микросателлитных ДНК локусов (таблица 2).
Таким образом, у всех больных с НМСН I из РБ, имеющих мутацию Pro87Ala в гене GJB1, определяется общий гаплотип по локусам DXS1216-DXS8111 DXS983-DXS8107-DXS8052-DXS6743-DXS8070: 4-4-3-3-2-6-3-2, что свидетельствует о распространении данной мутации на территории РБ в результате эффекта основателя.
Всего в гене GJB1 мутации были выявлены у 26 больных НМСН I из неродственных семей. Мутация Pro87Ala обнаружена у 21 больного из неродственных семей, Arg22Gln – у 3 неродственных больных, Thr86Ile – у больного и его тети, не имеющей клинических признаков НМСН, Arg15Gln- у неродственных больных. В контрольной группе здоровых доноров ни одна из этих мутаций не обнаружена.
У большинства больных с выявленными мутациями в гене GJB1 были проанализированы основные клинические признаки НМСН. При мутации Pro87Ala были выявлены парезы в дистальных отделах нижних конечностей у 20 (95,2%) человек, в большинстве случаев (57,1%) – тяжелой, реже умеренной (23,8%) и легкой (14,3%) степени. Верхние дистальные парапарезы встречались у 16 (76,2%) больных, из них у 4 (19,0%) пациентов – тяжелой, у 7 (33,3%) – средней и у 5 (23,8%) – легкой степени тяжести. У всех пациентов данной группы (100,0%) выявлено снижение или отсутствие глубоких рефлексов в нижних конечностях, гипорефелексия в верхних конечностях обнаружена у человек (76,2%). Гипотрофии в дистальных отделах ног наблюдались у (95,2%) пациентов, в дистальных отделах рук – у 19 (90,5%). Гипотрофии в проксимальных отделах конечностей отмечены лишь у 10 (47,6%) больных. У 18 (85,7%) обследованных отмечалась деформация стоп. У 14 (66,7%) больных наблюдались контрактуры в суставах. У 10 (47,6%) больных выявлено снижение поверхностной, у 7 (33,3%) – глубокой чувствительности.
Постуральный тремор в пальцах кистей рук отмечен у 11 (52,4%) обследованных. Выраженный тремор конечностей, головы наблюдался у (4,8%) пациента. Вегетативно-трофические расстройства были выявлены у (52,4%) больных.
У больных с мутацией Arg22Gln наблюдались нижние парапарезы легкой степени тяжести у 2 (66,7%) больных, тяжелый парапарез дистальных отделов нижних конечностей - у 1 (33,3%) больного. В верхних конечностях у пациентов выявлены парезы легкой и умеренной степени тяжести, составившие 33,3% для каждой степени, соответственно. У всех 3 пациентов (100,0%) выявлена гипорефлексия в руках, снижение глубоких рефлексов в ногах отмечено лишь у 1 (33,3%) обследованного. Гипотрофии в дистальных отделах ног выявлены у всех больных, в дистальных отделах рук – у 2 (66,7%). Ни у одного пациента не отмечено расстройств поверхностной чувствительности, лишь у 1 (33,3%) обнаружено снижение глубокой чувствительности.
Гипотрофии в проксимальных отделах конечностей, постуральный тремор у пациентов данной группы не встречались. Вегетативно-трофические расстройства наблюдались у 1 (33,3%) больного.
У одного больного с впервые выявленной мутацией Thr86Ile первые признаки заболевания (трудности при ходьбе, спотыкание) появились в возрасте 13 лет. Со стороны черепных нервов отмечен горизонтальный билатеральный мелкоразмашистый нистагм. Обнаружено нарушение осанки в виде сколиоза. Стопы деформированы по типу pes cavus. Отсутствовали парезы в мышцах дистальных отделов нижних конечностей, выявлялось легкое снижение силы мышц дистальных отделов верхних конечностей. В проксимальных отделах ног сила мышц была снижена до 4 баллов, в проксимальных отделах рук парезов не было. Глубокие и периостальные рефлексы в конечностях отсутствовали. У пациента наблюдалась умеренная гипотрофия мышц голеней и стоп, легкая – мышц кистей. Клиническими особенностями, выявленными при обследовании, являлись спонтанные и вызванные фасцикуляции в мышцах бедер и плеч. При обследовании сестры матери пробанда, являющейся носительницей мутантного гена, было выявлено, что она фенотипически здорова.
В гене MPZ у больных НМСН с отсутствием дупликации гена РМР проведен SSCP-анализ всех шести экзонов и промоторной области, который выявил наличие одного типа изменения в структуре однонитевой ДНК в шестом экзоне гена. Секвенционный анализ данного образца идентифицировал замену цитозина на тимин в 714 положении нуклеотидной последовательности (714СT), что привело к синонимичной замене аминокислоты серина в (AGCAGT) положении белка миелина (Po - myelin protein zero). Данное изменение обнаружено в гетерозиготном состоянии у двух лиц татарской этнической принадлежности с диагнозом НМСН I типа. Для подтверждения наличия данной нуклеотидной замены был проведен ПДРФ-анализ с использованием фермента Rsa I. Нормальная последовательность 673 CAG ACG CCA GTG CTG TAT GCA ATG CTG GAC CAC AGC AGA AGC 225 Gln Thr Pro Val Leu Tyr Ala Met Leu Asp His Ser Arg Ser Измененная последовательность 673 CAG ACG CCA GTG CTG TAT GCA ATG CTG GAC CAC AGC AGA AGТ 225 Gln Thr Pro Val Leu Tyr Ala Met Leu Asp His Ser Arg Ser В гене EGR2 у больных НМСН из Башкортостана был проведен SSCP – анализ всех кодирующих последовательностей, который не выявил никаких изменений подвижности однонитевой ДНК.
Таким образом, в результате анализа четырех генов методами SSCP анализа и последующего секвенирования у больных с НМСН I типа из Республики Башкортостан было установлено, что наиболее частыми являются дупликация гена PMP22 и мутации в гене коннексина 32 (GJB1), являющиеся причиной заболевания в 79,1% семей. На основании проведенного исследования был разработан алгоритм ДНК-диагностики НМСН, оптимальный для исследованного региона (рис. 11).
НМСН I (СПИ38 м/c) Определение дупликации/делеции гена РМР Мутация обнаружена Мутация не обнаружена поиск мутаций в гене GJB1, в НМСН IA первую очередь – Pro87Ala.
Мутация обнаружена Мутация не обнаружена поиск мутаций в генах НМСН IX РМР22, MPZ.
Мутация обнаружена Мутация не форма НМСН обнаружена установлена Рис. 11. Схема алгоритма ДНК-диагностики НМСН I в РБ.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что в Республике Башкортостан среди наследственных моторно-сенсорных нейропатий преобладающей формой заболевания является НМСН1А, обусловленная дупликацией гена РМР22, частота которой составляет 52,24% среди НМСН I типа и 26% -среди всех форм НМСН. В результате поиска других мутаций в гене РМР22 выявлен интронный полиморфизм 309-29 GA у одного больного НМСН I, не обнаруженный в контрольной группе.
2. В результате анализа полиморфизма трех ДНК-локусов, сцепленных с геном PMP22, определены частоты их аллелей и показатели гетерозиготности в выборках здоровых доноров русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан, свидетельствующие о возможности использования данных ДНК-маркеров для идентификации дупликации/делеции гена PMP22 у больных НМСН из РБ.
3. В гене коннексина 32 (GJB1) у больных с НМСН из РБ выявлено мутации: Pro87Ala (c.259CG), с частотой 19,40% среди больных НМСН I типа;
Arg22Gln (c.65GA) (2,98%);
Arg15Gln (c.44GA) (2,98%) и Thr86Ile (c.257CT) (1,49%), последняя из которых ранее не описана 4. Мутации в генах MPZ и EGR2 являются редкой причиной развития НМСН у больных из РБ: в гене MPZ у двух больных татарской этнической принадлежности обнаружен полиморфизм Ser239Ser (c. CT) в гетерозиготном состоянии (2,98%), не выявленный в группе контроля, ранее не описанный;
в гене EGR2 изменений нуклеотидных последовательностей у больных с НМСН не выявлено.
5. По 8-ми полиморфным микросателлитным ДНК-локусам, сцепленным с геном GJB1, установлен общий для больных гаплотип, сцепленный с мутацией Pro87Ala, что свидетельствует о ее распространении в регионе в результате эффекта основателя.
6. Определены основные клинические характеристики больных НМСН I c выявленными мутациями. Разработан алгоритм молекулярно генетического обследования больных НМСН I, оптимальный для жителей Республики Башкортостан.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Latypova E. G. (Bagautdinova), Krupina N., Magzhanov R., Khusnutdinova E., Khidiytova I. Genes PMP22 duplication screening in patients with hereditary motor and sensory neuropathy from Bashkortostan. // European Journal of Human Genetics - European Human Genetics Conference. Amsterdam, 2006. - V.14. - P.306.
2. Латыпова Э. Г. (Багаутдинова), Крупина Н. Б., Магжанов Р. В., Хуснутдинова Э. К., Хидиятова И. М. Скрининг дупликации гена РМР у больных наследственной моторно-сенсорной нейропатией из Башкортостана. // Тезисы докладов 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – наука XXI века». - Пущино, 2006. – с.76.
3. Латыпова Э. Г. (Багаутдинова), Крупина Н. Б., Хидиятова И. М. Анализ дупликации гена РМР22 и поиск мутаций в гене Сх32 у больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями из Республики Башкортостан. // Тезисы докладов научно-практической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-петербург, 2006. – с.153.
4. Latypova E. (Bagautdinova), Krupina N., Magzhanov R., Khusnutdinova E., I.
Khidiytova I. Duplication frequency analysis of PMP22 gene in hereditary motor and sensory neuropathy patients from Bashkortostan //Balkan Journal of Medical Genetics. – 7th Balkan Meeting on Human Genetics. – Skopje, 2006.
– V.9. – P.86.
5. Крупина Н. Б., Латыпова Э. Г. (Багаутдинова), Магжанов Р. В.
Эпидемиологическое изучение наследственных моторно-сенсорных нейропатий и анализ частоты дупликации гена РМР22 у больных в Республике Башкортостан. // Тезисы IX Всероссийского съезда неврологов. – Ярославль, 2006. – с. 6. Крупина Н. Б., Хидиятова И. М., Латыпова Э. Г. (Багаутдинова), Магжанов Р. В., Xуснутдинова Э. К. Клинико-эпидемиологическое исследование наследственных моторон-сенсорных нейропатий и скрининг дупликации гена РМР22 у больных в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. – 2006. - №11. – с.126-128.
7. Latypova E. G. (Bagautdinova), Khidiytova I. M., Krupina N. B., Magzhanov R. V., Khusnutdinova E. K. Analysis of connexin 32 gene (GJB1, Cx32) in the hereditary motor and sensory neuropathy (HMSN) patients from Bashkortostan. // Abstracts of European Journal of Human Genetics Conference. Nice 2007. European Human Genetics. - V.15. - P.202.
8. Латыпова Э. Г. (Багаутдинова), Крупина Н. Б., Магжанов Р. В., Хуснутдинова Э. К., Хидиятова И. М. Анализ гена коннексина 32 (GJB1, Cx32) у больных с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями (НМСН) из Башкортостана. // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона. – Уфа, 2007. – с.76.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота НМСН – наследственная моторно-сенсорная нейропатия ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР – полимеразная цепная реакция РБ – Республика Башкортостан ЭНМГ - электронейромиография Cx32 – connexin 32, коннексин EGR2 – early growth response, фактор раннего роста GJB1 – gap junction betta MPZ – myelin protein zero, миелиновый гликопротеин P(0) PMP 22 – peripheral myelin protein 22, структурный белок периферического миелина SSCP – single strand conformation polymorphism, анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК