Микроорганизмы глубинных хранилищ жидких радиоактивных отходов и взаимодействие их с радионуклидами
На правах рукописи
ЛУКЬЯНОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА Микроорганизмы глубинных хранилищ жидких радиоактивных отходов и взаимодействие их с радионуклидами Специальность 03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2008 1
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и в Учреждении Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им. А.Н.
Фрумкина РАН.
Научные руководители: Доктор биологических наук Т.Н. Назина Кандидат химических наук Е.В. Захарова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Н.В. Пименов доктор химических наук А.П. Новиков
Ведущая организация:
МГУ имени М.В. Ломоносова, Факультет почвоведения, г. Москва.
Защита диссертации состоится “13“ октября 2008 г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат диссертации разослан 11 сентября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Развитие атомной промышленности тесно связано с решением проблемы утилизации радиоактивных отходов (РАО).
На начальных этапах радиоактивные отходы удаляли в пресные и морские водоемы, в подземные горизонты (Лаверов и соавт., 1991, 2000).
Впоследствии в США, Канаде и европейских странах, производящих радионуклиды, была принята концепция многобарьерного варианта захоронения радиоактивных отходов, которые сначала цементируют или остекловывают, затем в контейнерах помещают в хранилище, размещенное в геологической формации.
В России одним из методов захоронения радиоактивных отходов среднего и низкого уровня активности является их нагнетание в жидком виде в глубинные водоносные геологические формации – пласты коллекторы (Рыбальченко и соавт., 1994;
Адушкин и соавт., 1999).
По данным многолетних наблюдений за эксплуатацией глубинных хранилищ жидких РАО установлено, что за счёт процессов сорбции на песчано-глинистых породах основное количество радионуклидов переходит в твёрдую фазу и локализуется на незначительном расстоянии от нагнетательных скважин (Захарова и соавт., 2003). В результате уровень активности в межпоровом пространстве пород по мере удаления от нагнетательной скважины (100–150 м) снижается до значений ниже регламентированных для радиоактивных отходов (НРБ, 1999).
Несмотря на большое количество данных, накопленных по миграции радионуклидов в глубинных хранилищах жидких РАО, сведения о влиянии микроорганизмов на формы нахождения и подвижность радионуклидов в этой экосистеме ограничены (Francis et al., 1998;
Francis, 1998).
Известно, что взаимодействие микроорганизмов с радионуклидами может происходить по разным механизмам: биосорбция (адсорбция на клеточной поверхности), биоаккумуляция (проникновение и накопление внутри клетки), биотрансформация (изменение степени окисления радионуклида за счёт биохимических процессов) и др. (Lovley, Anderson, 2000;
Lloyd, Macaskie, 2000;
Gadd, 2000;
Nealson, Saffarini, 1994).
Имеется обширная литература о составе микроорганизмов на поверхности контейнеров с отвержденными РАО и в окружающих породах, исследованы процессы образования биопленок и биогенной коррозии материалов, из которых сделаны контейнеры (West et al., 1982;
Pedersen et al., 1996;
Stroes-Gascoyne, West, 1997;
Pedersen, 1996;
McKinley et al., 1997;
Humphreys et al., 1997). Результаты этих микробиологических исследований невозможно однозначно экстраполировать на глубинные хранилища жидких РАО (Nazina et al., 2004;
Косарева и соавт., 2007).
Основными компонентами средне- и низкоактивных отходов являются нитрат- и сульфат-ионы, ацетат и детергенты;
радионуклиды представлены главным образом продуктами деления: 141, 144Ce, 90Sr, 137Cs, 95Zr, 95Nb, 103, Ru и 3Н (Рыбальченко и соавт., 1994). Долгоживущие альфа-излучающие нуклиды могут содержаться в следовых количествах. В связи с вышесказанным, необходимо исследование глубинных хранилищ РАО как среды обитания микроорганизмов, изучение основных групп микроорганизмов, которые по теоретическим предположениям могут участвовать в преобразовании химических и радиоактивных компонентов отходов (денитрифицирующие, сульфат- и железоредуцирующие и другие).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение распространения, биоразнообразия и геохимической деятельности микроорганизмов в глубинном хранилище жидких радиоактивных отходов и выяснение роли микроорганизмов в преобразовании радионуклидов (урана и трансурановых элементов).
Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.
1. Исследовать экологические условия в глубинных горизонтах, используемых для захоронения жидких радиоактивных отходов, определить численность микроорганизмов основных физиологических групп и оценить скорости биогенных процессов в зоне дисперсии отходов и вне этой зоны.
2. Выяснить биоразнообразие микробного сообщества глубинных горизонтов методом ГХ-МС анализа жирных кислот суммарной биомассы сообщества и молекулярно-биологическим методом анализа генов 16S рРНК.
3. Выделить чистые культуры аэробных органотрофных и анаэробных сульфат- и железо-редуцирующих бактерий из глубинных горизонтов. Определить таксономическое положение и исследовать физиолого-биохимические свойства чистых культур.
4. Оценить способность выделенных микроорганизмов участвовать в восстановлении нитрат-ионов и трансформации и концентрировании урана и трансурановых элементов.
Научная новизна работы. Впервые микробное сообщество глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов исследовано с использованием микробиологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов. На примере глубинных хранилищ РАО ФГУП «Сибирский Химический Комбинат» показано, что плотность микробной популяции и скорости процессов денитрификации и сульфатредукции в пластовых водах были низки и возрастали в зоне дисперсии отходов.
Методом анализа генов 16S рРНК пластовой воды показано, что в глубинных горизонтах доминировали Alpha-, Beta-, Gamma- и Delta proteobacteria, выявлены также представители порядков Nitrospirales, Actinobacteriales, Verrucomicrobiales, Planctomycetes, Dehalococcoidetes и некультивируемых групп домена Bacteria. Археи включали метаногенов семейства Methanomicrobiaceae и Methanobacteriaceae и некультивируемые кренархеоты. Эти результаты подтверждены микробиологическими методами, позволившими выявить грамотрицательных протеобактерий и грамположительных актинобактерий в пластовой воде, содержащей компоненты низкоактивных отходов (НАО).
Из глубинных горизонтов выделено более 50 штаммов разных физиологических групп, относящихся к известным видам родов Kocuria, Microbacterium, Pseudomonas, Pantoea, Acinetobacter, Enterobacter, Klebsiella, Stenotrophomonas, Sphingomonas, Acidivorax, Shewanella и Desulfosporosinus. Два штамма, имеющие 98% сходства генов 16S рРНК с таковыми вида Cellulomonas flavigena, вероятно, относятся к новому виду.
В составе пластовой микрофлоры обнаружены микроорганизмы, способные участвовать в преобразовании химических и радиоактивных компонентов отходов. Денитрифицирующие бактерии восстанавливали нитрат-ионы до N2. Бактерии рода Shewanella и сульфатредуцирующие бактерии восстанавливали 233U(VI) и 237Np(V) в присутствии разных органических субстратов, что свидетельствует о возможном участии их в осаждении и концентрировании радионуклидов в глубинном хранилище.
Обнаружены бактерии Klebsiella oxytoca, способные окислять сульфид железа за счет восстановления нитрат- до нитрит-иона, и таким образом способствовать растворению труднорастворимых соединений металлов и их дальнейшей миграции.
Аэробные бактерии сорбировали (аккумулировали) актиниды и другие трансурановые элементы, входящие в состав отходов – 238Pu, 237Np, U, 241Am и 90Sr, и не сорбировали 137Cs и 99Tc. Максимум сорбции 237Np наблюдается при pH 7–9;
а 238Pu, 241Am и 233U при pH 3–5. Показано, что в сорбции урана клетками грамотрицательных бактерий P. fluorescens и P.
grimontii участвуют органические фосфаты. Выявлен конкурентный характер биосорбции 238Pu, 241Am и 237Np из карбонатных растворов, близких по составу пластовой воде, что в целом позволяет считать незначительным вклад биосорбции в концентрирование радионуклидов в глубинном хранилище жидких радиоактивных отходов.
Научно-практическая значимость работы. Результаты изучения микробных процессов в глубинных хранилищах жидких радиоактивных отходов могут быть использованы при составлении прогнозов миграции радиоактивных и химических компонентов отходов в подземных горизонтах. Выделены штаммы, избирательно сорбирующие 241Am, 237Np, Pu и 233U из разбавленных растворов. Показана перспективность поиска микроорганизмов для разработки биотехнологий сорбционной очистки жидких отходов от радионуклидов в поверхностных хранилищах.
Снижение концентрации нитрат-ионов путем активации жизнедеятельности денитрифицирующих бактерий в глубинном горизонте будет способствовать повышению радиоэкологической безопасности глубинных хранилищ жидких радиоактивных отходов и предотвращению миграции радионуклидов.
Исследования выполняли в 2004–2007 гг. при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 05-04-49556, 05-03-32129 и 06-03-33193).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на пятой Российской конференции по радиохимии "Радиохимия–2006" (Дубна, 2006);
четвертом Международном конгрессе "Биотехнология:
состояние и перспективы развития" (Москва, 2007);
четвертой молодежной научно-практической конференции "Ядерно-промышленный комплекс Урала: Проблемы и перспективы" (Озерск, 2007) и на Всероссийской межведомственной научно-технической конференции "Подземное захоронение жидких радиоактивных отходов: прошлое настоящее будущее" (Северск, 2007).
Личный вклад соискателя состоял в проведении экологических, микробиологических и радиохимических исследований и обработке экспериментальных данных. Радиохимические анализы выполняли в лаборатории экологических проблем обращения с радиоактивными и токсичными отходами ИФХЭ РАН (зав. лаб., к.х.н. Е.В. Захарова), микробиологические исследования – в лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН (зав. лаб., д.б.н., профессор С.С. Беляев).
Электронно-микроскопические исследования проводили совместно с Н.А.
Кострикиной (ИНМИ РАН), молекулярно-биологические – с А.Б.
Полтараусом (ИМБ РАН), Н.К. Павловой, Е.М. Михайловой и Т.П.
Туровой (ИНМИ РАН). Автор приносит благодарность соавторам Л.И.
Константиновой, И.М. Прошину, В.С. Ивойлову, Г.А. Осипову и И.Г.
Тананаеву, а также всем коллегам и друзьям за содействие и поддержку.
Публикации. Материалы диссертации представлены в 6 печатных работах, включая 3 статьи и 3 тезисах конференций.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 178 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 23 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, содержащей разделы "Объекты и методы исследования", "Результаты исследований и их обсуждение", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы", включающий отечественных и 220 зарубежных наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика объектов исследования. В работе исследовали микроорганизмы пластовых жидкостей из наблюдательных скважин участков захоронения среднеактивных (технологических) и низкоактивных (нетехнологических) отходов глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов ФГУП СХК (г. Северск, Томской обл.).
На СХК отходы захоранивают в песчано-глинистые пласты-коллекторы, расположенные на глубинах 349–386 м (II горизонт) и 270–320 м (III горизонт). Оба горизонта имеют температуру 10-12С, содержат пластовые воды с минерализацией 0.3–0.4 г/л. Естественное движение вод имеет южное и юго-западное направление и характеризуется скоростями 3– м/год. Анализировали также декантаты из поверхностных хранилищ низкоактивных отходов СХК.
Кроме того, исследовали микроорганизмы в 31 пробе подземных вод из наблюдательных скважин, расположенных на периферии ореолов загрязнения в районе промышленных водоемов (озеро Карачай и Старое Болото) ФГУП ПО «Маяк».
Состав сред и условия культивирования микроорганизмов.
Численность микроорганизмов основных физиологических групп определяли путем посева пластовой воды в жидкие среды для пресноводных микроорганизмов методом десятикратных разведений в двух повторностях. Аэробные органотрофные бактерии выделяли на плотной среде (Plate count agar, Difco), содержащей (г/л): бакто-триптон (5.0), дрожжевой экстракт (2.5), глюкозу (1.0) и агар-агар (15), pH 7.0;
численность определяли посевом пластовой воды в жидкую среду того же состава (GTE) (без агара), культивировали в пенициллиновых флаконах с воздушной газовой фазой.
Среды для анаэробных бактерий готовили, используя анаэробную технику Хангейта (Hungate, 1969). Минеральную основу готовили и стерилизовали отдельно. Дополнительные компоненты вносили в виде стерильных растворов в охлажденную среду. В качестве газовой фазы использовали очищенный от кислорода аргон или смесь H2+CO2 для литоавтотрофных метаногенов. Все среды инокулировали пластовой водой, используя шприцы. Бродильные бактерии определяли в среде с пептоном (4 г/л) и глюкозой (10 г/л), измеряя образование H2 в конечных разведениях, и микроскопически (Postgate, 1965). Сульфатредуцирующие бактерии анализировали по образованию H2S в конечных разведениях в среде Видделя (Widdel, 1980) с лактатом натрия (4 г/л), восстановленной 200 мг Na2S·9H20. Денитрифицирующие бактерии учитывали по появлению N2 в среде (Adkins et al., 1992) с нитратом натрия (0.85 г/л), дополненной ацетатом натрия (2 г/л) или H2. Метаногенов учитывали по появлению CH4 в среде (Zeikus et al., 1975) с ацетатом (2.2 г/л) или H2+CO2, дополненной микроэлементами (Wolin et al., 1963), дрожжевым экстрактом (0.5 г/л) и Na2S·9H20 (0.5 г/л). Железоредуцирующие бактерии учитывали в среде (Lovley, Phillips, 1992) с цитратом железа (III), дополненной ацетатом или H2. Посевы инкубировали при температуре 18 20С и обследовали в световом микроскопе Olympus с фазово контрастным устройством.
Аналитические методы. Прирост биомассы в жидкой среде оценивали по величине оптической плотности на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro (Amersham Biosciences) при длине волны 600 нм.
Содержание белка в микробной биомассе определяли колориметрическим методом Лоури (Lowry et al., 1951). Метан, водород, азот и летучие жирные кислоты определяли газохроматографическими методами, приведенными ранее (Nazina et al., 2004). Сероводород определяли колориметрическим методом Пахмайра с N,N-диметил-р фенилендиамином в модификации (Trper, Schlegel, 1964).
Методы оценки скоростей анаэробных микробных процессов.
Скорости сульфатредукции и метаногенеза в пластовых водах определяли радиоизотопными методами, используя Na235S04, 14CH3-COONa, NaH14CO (Иванов, 1966;
Беляев, Иванов, 1975;
Лауринавичус, Беляев, 1978).
Состав микробного сообщества подземных вод определяли методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС) микробных липидных маркеров, выделенных из биомассы пластовой воды, как описано ранее (Осипов, 1993;
Nazina et al., 2004) и методом анализа генов 16S рРНК. Тотальную ДНК из пластовой воды выделяли, используя набор «DiatomtmDNAprep» (ИБХ РАН, Москва). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). Гены 16S рРНК амплифицировали с использованием универсальных, архейных и бактериальных праймеров: A8F, A109f, A517R, А800f, A1041r, B8-27f, U519r, U1492r (Edwards et al., 1989;
Grokopf et al., 1998;
Колганова и соавт, 2002). Выделение и очистку ПЦР-продуктов проводили с помощью набора для экстракции ДНК из геля (V-gene DNA Gel Extraction Kit;
China). Фрагменты гена 16S рРНК архей и бактерий клонировали в плазмидный вектор pGEM-Т (Promega) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Трансформацию ДНК в клетки E. coli проводили на электропораторе фирмы “Bio-Rad”. Для скрининга клонов использовали ПЦР с универсальными плазмидными праймерами. Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе «ABI 3100 Avant Genetic Analyser», используя набор для секвенирования (Dyenamic Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit, Amersham). Полученные фрагменты генов 16S рРНК сравнивали с последовательностями, приведенными в базе данных GenBank, используя программы BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) и CLUSTALW v 1.75. Филогенетические деревья создавали с помощью программ TREECON W (Van de Peer, De Wachter, 1994) и PHYLIP (Felsenstein, 1989).
Метод определения сорбции радионуклидов микробной биомассой. Биомассу бактерий наращивали в жидкой питательной среде GTE, собирали центрифугированием и получали суспензию в физрастворе (OD600 1.0). В работе использовали растворы (М): 1·10-10 90Sr;
1·10-9 137Cs;
6·10-10 238Pu(IV);
1·10-9 241Am(III);
1·10-7 233U(VI) и 1.02·10-6 237Np(V), которые нейтрализовали до величины pH 5–6 0.2 N растворами HCl и NaOH. В физраствор, содержащий радионуклид известной концентрации, вносили аликвоту суспензии бактерий. Эксперименты выполняли в тефлоновых пробирках при комнатной температуре и постоянном перемешивании на шейкере при 150 об/мин в течение двух часов.
Биомассу отделяли центрифугированием (8000 об/мин, 15 мин).
Активность радионуклидов (кроме 137Cs) в растворе определяли методом жидкостной сцинтилляционной спектрометрии (сцинтиллятор OptiFase “HiSafe” 3, Fin.) на спектрометре СКС-07П-Б11 (Россия). 137Cs определяли на полупроводниковом гамма спектрометре с коаксиальным детектором из сверхчистого германия (Gc-2520, Canberra). Сорбцию радионуклидов биомассой бактерий выражали в процентах по отношению к исходной концентрации радионуклида в растворе.
Метод оптической флуоресценции. Флуоресценцию микробных клеток с ураном измеряли на флуориметре Fluorolog-3 (Instruments S.A., Inc., США). Спектры обрабатывали, используя программы Grams- (Galactic Industries Corp.) и Peak Fit (AISN Software Inc.).
Метод жидкостной экстракции. Степень окисления актинидов, сорбированных клетками, определяли методом жидкостной экстракции 1 (2-теноил)-3,3,3-трифторацетоном (Morgenstern, Choppin, 2002).
Электронно-микроскопические исследования. Биомассу фиксировали 1% раствором осмиевой кислоты, затем заключали в агар, обезвоживали спиртом возрастающей крепости и заключали в эпон (Ryter, Kellenberger, 1958). Срезы изготавливали на ультрамикротоме LKB 4800 A и исследовали в электронном микроскопе JEM 100С.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Химическая и микробиологическая характеристика растворов, направляемых на подземное захоронение, и пластовой воды из глубинных горизонтов хранилища жидких РАО СХК Начиная с 2002 г., нами было исследовано 44 пробы жидкостей отобранных из наблюдательных скважин, расположенных на участках захоронения средне- и низкоактивных отходов, и из поверхностных хранилищ. Исходно подземные горизонты представляли собой низкотемпературное пресноводное олиготрофное местообитание. В пробах природных подземных вод содержатся щелочные и щелочноземельные элементы, в небольших концентрациях присутствует железо (0.4-5.8 мг/л). Основным анионом является бикарбонат, ниже концентрации сульфатов и нитратов, pH около 7.0 (табл. 1).
Полигон подземного захоронения жидких РАО включает комплекс поверхностных сооружений и глубинные хранилища. Жидкие низкоактивные отходы (НАО) формируются путем смешения пресных низкоактивных отходов из водохранилища и растворов из пульпохранилища, характеризующихся высокой минерализацией (до г/л), повышенным содержанием нитратов (до 20.3 г/л) и сульфатов (0. г/л). В низкоактивных слабощелочных отходах, направляемых на захоронение, основными катионами являются натрий, аммоний и щелочноземельные металлы, а основными анионами – нитрат-, бикарбонат-, сульфат и хлорид-ионы;
отходы содержат радионуклиды.
Среднеактивные отходы радиохимического производства поступают непосредственно в глубинное хранилище. Диапазоны концентраций компонентов в исследованных пробах приведены в таблице 1.
Поступление низкоактивных отходов во II и III подземные горизонты и среднеактивных отходов во II горизонт хранилища привело к возрастанию общей минерализации пластовой воды, повышению содержания нитратов, сульфатов, кальция и магния, увеличению рН пластовой воды от 6.6 до 8.6, Eh – от –59 до 186.5 мВ. По данным лаборатории СХК, с отходами в пласт поступает органическое вещество, содержание которого варьируется (величина ХПК – от 12.4 до 150.2 мг/л, величина БПК – от 1.25 до 126.6 мг/л). Отходы содержат нефтепродукты Таблица 1. Химический состав нагнетаемых отходов и жидкостей из глубинных хранилищ низкоактивных и среднеактивных отходов Содержание, мг/л Гори- Солесодер Проба pH зонт жание, мг/л Na++K+ NH4+ Са2+ Mg2+ NO3- HCO3- SO42 Feоб.
Природные подземные III 200-322 6.7-7.2 31-37 0.6-0.9 28-39 12-14 2.1-3.9 0.2-2.2 232-250 7.5- воды Низкоактивные отходы и 790- 1595- 104 декантаты 2900-35000 8.1-8.6 210-2500 21-50 20-6 1.1-3.0 290- 12000 20300 поверхностных хранилищ Хранилище 1.0 II 260-3473 6.7-8.2 32-99 0.5-18 25-247 11-110 0.3-13 170-299 21- низкоактивных отходов 0.3 III 387-2758 6.6-8.1 37-418 0.1-2.27 41-366 30-214 0.8-23 239-561 31- Хранилище 90 среднеактивных II 505-7056 6.8-8.6 26-840 0.8-8.4 39-957 26-540 0.1-81 208-518 19- отходов Радионуклиды: 141, 144Ce, 90Sr, 137Cs, 95Zr, 95Nb, 103, 106Ru и 3Н. Суммарная активность нагнетаемых низкоактивных отходов составляла 10-5 Ки/л, среднеактивных – от 10-5 до 1 Ки/л.
(неполярные и малополярные соединения, растворимые в гексане, то есть углеводороды) и синтетические поверхностно-активные вещества. На удалении более 100 м от нагнетательных скважин продукты распада и альфа-излучающие нуклиды фиксировались в количествах существенно ниже уровня вмешательства. Летучие кислоты в подземных водах обнаруживались в низких концентрациях (4 мг уксусной кислоты в 1 л).
В нагнетаемых отходах и пластовых водах нами была определена численность микроорганизмов основных физиологических групп – аэробных органотрофных бактерий (Аэроб.), анаэробных бактерий с бродильным типом метаболизма (Брод.), автотрофных (Дн H2) и гетеротрофных (Дн ац) денитрифицирующих бактерий, железо- и сульфат редуцирующих (СРБ) и метаногенов, растущих в среде с H2+CO2 (Мет Н2), или ацетатом (Мет ац). Из рисунка 1 видно, что в жидкостях из поверхностных хранилищ доминировали аэробные микроорганизмы, численность которых в водохранилище достигала 109 кл/мл. С отходами в Хранилище среднеактивных Хранилище отходов низкоактивных отходов Природные lg числа кл/мл подземные воды Аэроб Брод СРБ Водохр.
Пульпохр Дн ац Р- Дн Н П- П- А- Мет Н А- А- А- Мет ац А- С- С- С- С- Проба Рис. 1. Численность микроорганизмов в жидкостях из наземных хранилищ (водохранилище и пульпохранилище), в природных пластовых водах (скв.
Р-23) и водах участков захоронения низкоактивных (II и III горизонты) и среднеактивных (II горизонт) отходов пласты поступали аэробные и анаэробные органотрофы (103-4 кл/мл), денитрифицирующие (102 кл/мл), сульфатвосстанавливающие (до кл/мл) и метанобразующие (102 кл/мл) микроорганизмы.
В природных пластовых водах (скв. Р-23) численность микроорганизмов не превышала 102-103 кл/мл. В водах II и III горизонтов участка захоронения НАО численность микроорганизмов была в среднем на порядок выше, чем в исходных пластовых водах. В пластовой воде обнаружены аэробные органотрофные бактерии (до 104 кл/мл), а также бактерии с бродильным типом метаболизма (102-105 кл/мл), денитрифицирующие (10-104 кл/мл) и сульфатредуцирующие (0-10 кл/мл) бактерии и метаногены (0-102 кл/мл). Железоредуцирующие бактерии выявлены в 50% исследованных проб.
Воды участка захоронения среднеактивных отходов (скважины С 64, С-49, С-37 и С-50) характеризовались более высоким уровнем численности микроорганизмов, достигающим кл/мл.
Сульфатредуцирующие бактерии были выявлены лишь в 20% обследованных проб (10–104 кл/мл), вероятно, высокие концентрации нитратов (достигающие 7284.0 мг/л) в зоне дисперсии отходов подавляли их рост и активность.
Полученные результаты свидетельствуют о присутствии в природных пластовых водах малочисленной, но метаболически разнообразной аэробной и анаэробной микрофлоры. С отходами в пласты поступали нитрат- и сульфат-ионы, органическое вещество и микроорганизмы, стимулируя рост микробного сообщества подземных горизонтов.
2.2. Скорости анаэробных процессов в пластах-коллекторах и влияние возможных макрокомпонентов отходов (ацетат, сульфат и нитрат) на микробные процессы Радиоизотопными методами был выявлен низкий уровень сульфатредукции и метаногенеза. в большинстве проб пластовых вод СХК. Скорость метаногенеза из ацетата была на грани чувствительности метода. Скорость литоавтотрофного метаногенеза в четырёх пробах (скважины П-7, А-6, А-47 и С-37) была в интервале 0.16-0.55 мкг CH4 л- сут-1, в остальных пробах не превышала 0.049 мкг CH4 л-1 сут-1. В зоне дисперсии отходов (скважины А-4, А-44, А-47 и А-6) скорость сульфатредукции была в интервале от 0.1 до 0.7 мкг S2- л-1 сут-1, в остальных пробах вод она была не более 0.05 мкг S2- л-1 сут-1. Скорости сульфатредукции и метаногенеза в глубинных горизонтах полигона СХК были сравнимы с таковыми в глубинных горизонтах Горно-химического комбината (г. Железногорск, Красноярский край) (Nazina et al., 2004).
Внесение возможных макрокомпонентов отходов (ацетат, нитрат, сульфат), а также молекулярного водорода в герметично закрытые пробы пластовой воды стимулировало активность подземного микробного сообщества (рис. 2).
Внесение H2 стимулировало сульфатредукцию и метаногенез.
Особое внимание к группе сульфатредуцирующих бактерий обусловлено тем, что образуемый ими сероводород химически взаимодействует с ионами различных металлов, приводя к осаждению сульфидов. Кроме того, ряд штаммов способен получать энергию за счет восстановления радионуклидов, что может способствовать снижению миграции радионуклидов. Внесение Н2 или ацетата в сочетании с сульфатом стимулировало сульфатредукцию. Экзогенные доноры и акцепторы электронов оказывали воздействие на скорости анаэробных процессов не во всех пробах, вероятно из-за низкой численности и активности сульфатредуцирующих и метанобразующих микроорганизмов.
1, 1, Рис. 2. Влияние Н2, ацетата Сульфатредукция и сульфатов на скорость мкг S /л х сут сульфатредукции в пробах 0, пластовых вод глубинного 0, 2 хранилища НАО 0, 0, А-4 А-6 А-44 А-46 А- Проба Без стимуляции H2+SO42 Ацетат Ацетат+SO42 Внесение Н2 в пробы пластовых вод, содержащих нитрат-ионы, стимулировало образование молекулярного азота. Добавление Н2 или ацетата в сочетании с нитратом стимулировало образование N2 во всех исследованных пробах пластовой воды. Поступление нитрат- и сульфат ионов с отходами может стимулировать активность денитрифицирующих и сульфатредуцирующих бактерий в подземных горизонтах. При наличии жизнеспособных бактерий и доступных акцепторов электронов скорости обоих процессов будут лимитироваться наличием доноров электронов (органическое вещество или Н2) и биогенов (фосфатов).
Нами дана предварительная оценка скорости денитрификации микроорганизмами пластовой воды газохроматографическим методом, которая варьировала от 0 до 0.1 мг N2/л сут. Эти данные были использованы на ФГУП «СХК» при сопоставлении общего содержания нитратов, удаленных с отходами с начала эксплуатации полигона, с их современным содержанием в пласте. По результатам анализов проб из контрольных скважин были построены контуры распределения подземных вод с разной концентрацией нитратов. Расчеты показали, что к настоящему времени нитраты, удаленные в пласт-коллектор до 1983 г., уже полностью разложились. С учетом убыли нитратов за счет денитрификации и депонирования в глины баланс нитратов на 11-16% не совпадает с их содержанием в пласте в настоящее время. Полученные данные свидетельствуют о потенциальной возможности создания биогеохимических барьеров (путем активации деятельности денитрифицирующих микроорганизмов в глубинном горизонте) для удаления нитратов из отходов.
2.3. Состав микробного сообщества хранилища жидких радиоактивных отходов СХК по результатам хромато-масс спектрометрического анализа жирных кислот суммарной биомассы пластовой воды и анализа генов 16S рРНК Расчет состава микробного сообщества, выполненный на основе созданной Г.А. Осиповым (1993) базы данных профилей жирных кислот и маркеров микроорганизмов c учетом специфики исследуемых проб, позволил выявить 52 таксона или группы микроорганизмов.
В нагнетаемых отходах присутствовала разнообразная микрофлора, представленная грибами, простейшими, растительными клетками, неидентифицированными эукариотами и прокариотами. В пробах пластовой воды из скважин А-6, А-4 и А-47, расположенных в зоне дисперсии низкоактивных отходов, преобладали грамположительные актинобактерии родов Rhodococcus, Corynebacterium, Nocardia, Pseudonocardia и неизвестные организмы этой группы. Аналогичный состав сообщества был обнаружен в пробе из скважины С-15, не подверженной влиянию отходов. Спорообразующие микроорганизмы принадлежали к родам Bacillus и Clostridium. Грамотрицательные бактерии относились к родам Pseudomonas, Sphingomonas, Brevundimonas, Aeromonas, Methylococcus и др. Анаэробные микроорганизмы включали бактерий родов Desulfovibrio, Clostridium, Butyrivibrio, Bacteroides и др. В пластовой воде содержалось также маркерные соединения грибов и растений.
Пластовую жидкость из двух скважин А-6 и Р-23 использовали для клонирования генов 16S рРНК. Тотальная ДНК, выделенная из воды, служила в качестве матрицы для ПЦР с универсальными, архейными и бактериальными праймерами. Филогенетический анализ библиотеки клонов архей позволил выявить последовательности 16S рДНК метаногенов семейства Methanobacteriaceae (виды Methanobacterium alcaliphilum и M. espanolae) и Methanomicrobiaceae и некультивируемых кренархеот, близких родам Sulfolobus и Thermofilum. Гены 16S рРНК бактериальных клонов относились имущественно к классу Proteobacteria и включали Alphaproteobacteria (роды Brevundimonas, Sphingomonas, Afipia), Betaproteobacteria (Ralstonia), Gammaproteobacteria (Acinetobacter) и Deltaproteobacteria (Desulfobacca, Syntrophus, Smithella, Algimarinum).
Минорные таксономические подразделения включали представителей порядков Nirospirales (Thermodesulfovibrio), Verrucomicrobiales (Verrucomicrobium), Dehalococcoidetes и некультивируемые бактерии. В пластовой жидкости, содержащей компоненты НАО (скв. А-6), не были выявлены бактерии подразделения Firmicutes и актинобактерии, представленные в природной пластовой воде (скв. Р-23).
Полученные результаты дают представление о варьировании состава микроорганизмов в водах II горизонта СХК и могут служить фоновыми значениями для последующего микробиологического мониторинга хранилища.
2.4. Выделение аэробных и анаэробных микроорганизмов из глубинных хранилищ и определение их таксономического положения Из проб пластовой воды с использованием соответствующих питательных сред были выделены 52 чистые культуры аэробных бактерий и 2 штамма сульфатредуцирующих бактерий. Все штаммы были идентифицированы методом определения фрагмента последовательности гена 16S рРНК размером 450-600 нуклеотидов или 1400 нуклеотидов (у штаммов).
В результате сравнительного филогенетического анализа полученных последовательностей пять штаммов были отнесены к разным родам подразделения грамположительных бактерий с высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК - Kocuria erythromyxa (100% сходства генов 16S рРНК), Microbacterium oxydans (100% сходства), Microbacterium flavescens (99 % сходства), Microbacterium oral (98% сходства) и Microbacterium maritipicum (99% сходства).
Представители Gammaproteobacteria были наиболее многочисленными среди выделенных штаммов. 25 штаммов относились к разным видам рода Pseudomonas (99–100% сходства): P. fluorescens ( штаммов), P. stutzeri (6 шт.), P. veronii (2 шт.), P. gessardii, P. grimontii, P.
marginalis, P. putida, P. reactans, P. rhodesiae и P. synxantha. По одному штамму принадлежали к видам Acinetobacter johnsonii (100% сходства), Enterobacter cowanii (99%), Klebsiella pneumoniae (99%) и Shewanella putrefaciens (100%). По два штамма относились к Klebsiella oxytoca (99%), Enterobacter hormaechei (99%), Pantoea agglomerans (99% и 100%) и Stenotrophomonas maltophilia (99%). Альфа-протеобактерии были филогенетически близки виду Sphingomonas panii (99%), бета протеобактерии – виду Acidivorax delafieldii (99%).
Анаэробные микроорганизмы были представлены сульфатредуцирующим бактериями родов Desulfosporosinus orientis (100% сходства) и Desulfomicrobium (99% сходства).
Результаты молекулярно-биологической идентификации выделенных чистых культур коррелировали с результатами ГХ–МС анализа подземного микробного сообщества СХК (Назина и соавт., 2006), также обнаружившего бактерий родов Pseudomonas, Sphingomonas, Acinetobacter и различных актинобактерий.
Чистые культуры аэробных бактерий, выделенные из наблюдательных скважин ФГУП «ПО «Маяк», расположенных в зоне озера Карачай, были филогенетически близки (99% сходства генов 16S рРНК) известным видам Paenibacillus odorifer, Microbacterium flavescens, Pseudomonas reactans, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas veronii и Stenotrophomonas rhizophila. Два штамма имели 97-98% сходства генов 16S рРНК с видами рода Cellulomonas, и вероятно, принадлежат к новому виду этого рода.
У выделенных микроорганизмов была исследована способность к восстановлению нитратов и концентрированию урана и трансурановых элементов. В среде с лактатом или ацетатом денитрификацию с образованием N2 осуществлял ряд бактерий рода Pseudomonas – P.
fluorescens, P. gessardii, P. marginalis, P. putida, P. reactans, P. veronii, P.
synxantha, P. stutzeri, P. rhodesiae. Кроме того, выделен уникальный штамм Klebsiella oxytoca, способный расти в среде с сульфидом железа (II), восстанавливая нитраты до нитрита. Растворение сульфидов металлов в присутствии нитратов может приводить к миграции металлов (радионуклидов), и важно для оценки безопасности хранилищ РАО.
2.5. Биосорбция радионуклидов биомассой микроорганизмов, выделенных из подземных горизонтов Одним из механизмов воздействия подземных микроорганизмов на радиоактивные компоненты отходов является биосорбция радионуклидов микробной биомассой. Биомасса 35 выделенных чистых культур аэробных бактерий была использована для оценки биосорбции 238Pu(IV), 237Np(V), U(VI), 241Am(III), 90Sr(II) и 137Cs(I). У 10 штаммов была исследована сорбция 99Tc(VII).
Показано, что уровень сорбции разных радионуклидов для каждого штамма существенно различался (рис. 3). В нейтральной среде максимум сорбции Pu составил 77%, Np – 92%, U – 76%, Am – 72%, Sr – 33%. 30 из 35 исследованных штаммов не сорбировали Cs. 10 проверенных штаммов не сорбировали технеций. Наибольшей сорбционной способностью обладали бактерии рода Pseudomonas.
Исследована зависимость биосорбции Pu, Am, U и Np штаммами Pseudomonas fluorescens С-64-1, Pseudomonas grimontii С-61-1, Shewanella putrefaciens A-4-3 и Kocuria erythromyxa А44-3 от количества биомассы и величины pH, и определены эффективные десорбирующие растворы.
Показано, что уровень сорбции радионуклидов этими штаммами возрастал с увеличением концентрации живой и термически обработанной биомассы, но эта зависимость имела нелинейный характер.
В целом термически обработанная биомасса бактерий обладала более низкой сорбционной способностью, чем живая. В экспериментах с постоянными концентрациями биомассы бактерий и радионуклидов максимум сорбции Np наблюдали в слабо-щелочной среде при pH 7–9;
тогда как максимум сорбции Pu, Am и U наблюдали в слабо-кислой среде при pH 3–5 (рис. 4). В целом характер зависимостей сорбции радионуклидов от pH практически для всех штаммов был сходный.
Отмечена общая тенденция увеличения биосорбции радионуклидов U, Pu и Am клетками P. fluorescens С-64-1, P. grimontii С-61-1 и K.
erythromyxa А44-3 с увеличением их концентрации в растворе.
Исследована конкурентная биосорбция Pu, Am и Np из смешанных растворов в присутствии основных компонентов пластовой воды – NaCl или NaHCO3. Показано, что в карбонатных растворах, содержащих радионуклида, сорбция радионуклидов всеми исследованными штаммами была существенно ниже, чем сорбция из растворов отдельных радионуклидов.
А Сорбция, % 789 Am 10 11 12 Pu 13 14 15 Sr 16 18 19 Штамм Б Сорбция, % Np 10 11 13 14 15 U 16 17 19 20 Штамм Рис. 3. Сорбция радионуклидов 90Sr(II), 238Pu(IV) и 241Am(III) (А) и U(VI) и 237Np(V) (Б) аэробными бактериями из глубинных горизонтов 1 – K. erythromyxa, 2 – M. oxydans, 3 – M. flavescens, 4 – M. oral, 5 – M.
maritipicum, 6 – P. agglomerans, 7 – P. fluorescens, 8 – P. gessardii, 9 – P.
grimontii, 10 – P. reactans, 11 – P. rhodesiae, 12 – P. synxantha, 13 – P.
stutzeri, 14 – P. veronii, 15 – A. detafieldii, 16 – A. johnsonii, 17 – E. cowanii, 18 – K. pneumoniae, 19 – S. putrefaciens, 20 – S. maltophilia, 21 – S. panii Cорбция, % Рис. 4. Сорбция радионуклидов биомассой бактерии P. fluorescens C64- при различных значениях pH U раствора 10 Pu Am 3 Np pH Таким образом, в исходных пластовых водах хранилища, содержащих бикарбонат в качестве основного аниона и низкую плотность микробной популяции, биосорбция радионуклидов вряд ли будет значительной. Радионуклиды связываются в основном глинистыми минералами вмещающих пород [Захарова и соавт., 2001]. В зоне поступления отходов, содержащих радионуклиды и органическое вещество, численность микроорганизмов возрастает, что может способствовать биосорбции металлов. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности поиска микроорганизмов для сорбции радионуклидов в поверхностных хранилищах РАО.
Характеристика U и Np, сорбированных клетками P. fluorescens С-64-1, P. grimontii С-61-1, S. putrefaciens A-4-3 и K. erythromyxa А44-3.
Методом жидкостной экстракции показано, что нептуний и уран, сорбированные штаммами С-64-1, С-61-1 и A-4-3, и уран, сорбированный штаммом А44-3, не меняли своей валентности.
С помощью метода оптической флуоресценции, который позволяет определить ближайшее лигандное окружение сорбированного уранил иона U(VI)O22+, были исследованы суспензии клеток P. fluorescens С-64-1, P. grimontii С-61-1 и K. erythromyxa А44-3. Спектр флуоресценции уранила в суспензиях бактерий P. fluorescens С-64-1 и P. grimontii С-61-1 был аналогичен спектру комплекса уранила с глицерол-1-фосфатом, что указывает на то, что органические фосфаты участвуют в сорбции урана.
клетками грамотрицательных бактерий.
2.6. Электронно-микроскопические исследования локализации Am, U и Np на клетках P. fluorescens С-64-1, P. grimontii С-61-1 и Kocuria erythromyxa А44- С помощью электронной микроскопии показано, что штамм P.
fluorescens С-64-1 накапливал U и Am внутри клетки, а Np – в периплазматическом пространстве клеток – между наружной липопротеидной мембраной и клеточной стенкой (рис. 5а). Клетки P.
grimontii С-61-1 накапливали U, Am и Np внутри клетки (рис. 5б).
Локализацию U, сорбированного клетками K. erythromyxa А44-3, определить не удалось. Вероятно, радионуклид был диффузно рассеян и не образовывал выраженных скоплений. Совокупность полученных результатов – определение локализации радионуклидов в клетке, их валентного состояния, выявление участия макромолекулярных фосфатов в биосорбции радионуклидов грамотрицательными бактериями, описание процесса биосорбции разных радионуклидов изотермами Ленгмюра или Френдлиха (данные не представлены), – свидетельствует о том, что один и тот же штамм сорбирует разные радионуклиды по разным механизмам.
а А Б В Г б А Б В Г Рис. 5. Субмикроскопическая организация клеток P. fluorescens С-64-1 (а) и P. grimontii С-61-1 (б) без радионуклида (А), в присутствии U (Б), Am (В) и Np (Г). Размер линейки соответствует 1 мкм.
2.7. Восстановление U(VI) и Np(V) накопительными культурами сульфатредуцирующих бактерий и штаммом S. putrefaciens A-4- Восстановление радионуклидов микроорганизмами из глубинных горизонтов исследовали, используя чистые и накопительные культуры сульфатредуцирующих бактерий и бактерии рода Shewanella.
Биомассу сульфатредуцирующих бактерий наращивали в жидкой среде без железа, восстановителем служил аскорбат натрия, донорами и акцепторами электронов – натриевые соли молочной и фумаровой кислот соответственно. Биомассу отделяли центрифугированием, затем получали суспензию в карбонатном растворе, которую дополняли следующими соединениями: 1) уранил ацетатом (0.5 молей/л);
2) уранил ацетатом в сочетании с лактатом натрия (3.5 г/л);
3) уранил ацетатом в сочетании лактатом и сульфатом натрия (1 г/л). Суспензии бактерий инкубировали при температуре 18–20С и измеряли содержание окисленного урана в растворе во времени.
В контрольных экспериментах суспензии микроорганизмов, убитых стерилизацией, уран не восстанавливали. Накопительные культуры сульфатредуцирующих бактерий восстанавливали U(VI) в присутствии лактата натрия. Небольшое удаление окисленного урана из раствора, наблюдали также в среде с одним уранил ацетатом (без лактата натрия), вероятно, за счет бактерий, способных расти на ацетате, восстанавливая А Б 0, 0, Восстановление, % U(VI), мм/л 0, 0,2 0,1 0 20 40 60 80 100 Время, час ацетат лактат триптон A-6+лак А-6+лак+SO42 U(VI) Np(V) A-6 А-6М Рис. 6. Восстановление U(VI) накопительной культурой сульфатредуцирующих бактерий А-6 (А) и восстановление U(VI) и Np(V) штаммом S. putrefaciens А-4-3 в присутствии разных органических субстратов (Б) уран (VI) (рис. 6). Тот факт, что за восстановление урана в культурах отвечали сульфатредуцирующие бактерии, доказывается опытом, в котором в среду наряду с уранил ацетатом и лактатом натрия вносили сульфат натрия. Убыль окисленного урана из раствора в этом варианте была существенно больше, вероятно, за счет связывания части урана образующимся сероводородом.
Из глубинных хранилищ нами была выделена чистая культура Shewanella putrefaciens A-4-3. Известно, что бактерии рода Shewanella способны восстанавливать Fe(III), Mn(IV), нитраты, нитриты, фумарат, тиосульфат, сульфит, U(VI), Np(V) и Tc(VII). Выделенный штамм S.
putrefaciens A-4-3 восстанавливал U(VI) и Np(V) в присутствии разных органических субстратов (рис. 6б).
Полученные результаты свидетельствуют о возможности биогенного осаждения и концентрирования радионуклидов в глубинном хранилище жидких РАО.
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования численности, активности и биоразнообразия микроорганизмов глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов Сибирского химического комбината с использованием микробиологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов позволили выявить метаболически разнообразное и геохимически активное микробное сообщество.
Впервые непосредственно из глубинного хранилища радиоактивных отходов получена обширная коллекция микроорганизмов разных физиологических групп. Из подземных горизонтов выделены представители родов Kocuria, Microbacterium, Pseudomonas, Pantoea, Acinetobacter, Enterobacter, Klebsiella, Stenotrophomonas, Sphingomonas, Acidivorax, Shewanella и Desulfosporosinus.
Исследована способность выделенных бактерий к восстановлению нитратов и концентрированию урана и трансурановых элементов.
Обнаружен ряд штаммов рода Pseudomonas (Pseudomonas fluorescens, P.
gessardii, P. marginalis, P. putida, P. reactans, P. rhodesiae, P. synxantha, P.
stutzeri, P. veronii.), способных в гетеротрофных условиях осуществлять денитрификацию с образованием N2. Выделен уникальный штамм Klebsiella oxytoca, способный расти в среде с сульфидом железа, восстанавливая нитраты до нитрита. Растворение восстановленных металлов в присутствии нитратов важно для оценки миграции радионуклидов и безопасности хранилищ РАО.
На примере 40 штаммов, выделенных из подземных горизонтов, определен уровень сорбции радионуклидов. Наибольшей сорбционной способностью обладали бактерии рода Pseudomonas. Определены оптимальные условия сорбции Am, Np, Pu и U для штаммов рода Pseudomonas, Shewanella putrefaciens A-4-3 и Kocuria erythromyxa А44-3.
Исследована локализация и физико-химические формы радионуклидов, сорбированных клетками P. fluorescens, P. grimontii и K. erythromyxa.
Установлено, что в процессе сорбции урана клетками грамотрицательных бактерий участвуют органические фосфаты.
В природных пластовых водах хранилища, содержащих бикарбонат в качестве основного аниона и низкую плотность микробной популяции, биосорбция радионуклидов вряд ли будет значительной. Обнаружение штаммов, эффективно сорбирующих радионуклиды из разбавленных растворов, свидетельствуют о перспективности поиска микроорганизмов, способных сорбировать радионуклиды в поверхностных хранилищах РАО.
Из глубинного хранилища РАО выделены бактерии Shewanella putrefaciens A-4-3 и накопительные культуры сульфатвосстанавливающих бактерий, способные восстанавливать Np(V) и U(VI).
В условиях изменения состава подземных вод при поступлении отходов важно контролировать состав и активность подземного микробного сообщества в динамике. Наличие жизнеспособных микроорганизмов, обладающих разными метаболическими свойствами, свидетельствует о необходимости включения микробиологических исследований в систему мониторинга глубинного хранилища РАО;
особенно важны исследования микроорганизмов образующих газы (денитрифицирующих бактерий) и сульфат- и металл-редуцирующих бактерий, способных участвовать в осаждении тяжелых металлов и радионуклидов.
ВЫВОДЫ 1. Впервые микробное сообщество глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов исследовано с использованием микробиологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов. Установлено, что в пластовых водах глубинных горизонтов обитает разнообразное микробное сообщество, включающее аэробные органотрофные бактерии, анаэробные бактерии с бродильным типом метаболизма, денитрифицирующие, железо- и сульфатредуцирующие и метанобразующие микроорганизмы. Плотность микробной популяции и скорости процессов сульфатредукции и метаногенеза в большинстве проб пластовых вод низки и возрастают в зоне дисперсии отходов.
2. Показано, что бактерии глубинных горизонтов относятся к классам Alpha-, Beta-, Gamma- и Delta-proteobacteria, Actinobacteria, к порядкам Nirospirales, Verrucomicrobiales, Dehalococcoidetes и некультивируемым группам. Археи близки метаногенам семейства Methanomicrobiaceae и Methanobacteriaceae и некультивируемым кренархеотам. В пластовой воде, содержащей компоненты низкоактивных отходов, доминировали грамотрицательные протеобактерии, тогда как в исходной пластовой воде преобладали грамположительные актинобактерии.
3. Из глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов выделено в чистую культуру более 50 штаммов, относящихся к родам Kocuria, Microbacterium, Pseudomonas, Pantoea, Acinetobacter, Enterobacter, Klebsiella, Stenotrophomonas, Sphingomonas, Acidivorax, Shewanella и Desulfosporosinus.
Большинство выделенных аэробных бактерий способны сорбировать (аккумулировать) актиниды и другие трансурановые элементы, входящие в состав отходов [238Pu(IV), 237Np(V), 233U(VI), Am(III) и 90Sr(II)], и не сорбируют 137Cs и 99Tc. В сорбции урана клетками грамотрицательных бактерий P. fluorescens и P. grimontii участвуют органические фосфаты.
4. Показано, что биосорбция 238Pu(IV), 241Am(III), 233U(VI) и Np(V) штаммами P. fluorescens, P. grimontii, S. putrefaciens и K.
erythromyxa зависит от pH среды. Максимум сорбции Np наблюдается при pH 7-9;
тогда как максимум сорбции Pu, Am и U - при pH 3-5. Выявлена конкурентная сорбция Pu, Am и Np из смешанных карбонатных растворов.
Вклад биосорбции в концентрирование металлов в хранилище радиоактивных отходов представляется незначительным.
5. Бактерии рода Shewanella и сульфатредуцирующие бактерии, выделенные из подземных горизонтов, восстанавливали U(VI) и Np(V) в присутствии разных органических субстратов, что свидетельствует о возможности биогенного осаждения и концентрирования радионуклидов в глубинном хранилище жидких РАО.
6. В подземных горизонтах обнаружены денитрифицирующие бактерии, а также микроорганизмы, способные окислять металлы за счет восстановления нитратов. Создание биогеохимического барьера для нитрат-ионов путем активации жизнедеятельности денитрифицирующих бактерий в глубинном горизонте будет способствовать снижению концентрации нитрат-ионов и миграции радионуклидов и повышению радиоэкологической безопасности глубинных хранилищ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Экспериментальные статьи 1. Назина Т.Н., Лукьянова Е.А., Захарова Е.В., Ивойлов В.С., Полтараус А.Б., Калмыков С.Н., Беляев С.С., Зубков А.А. Распространение и активность микроорганизмов в глубинном хранилище жидких радиоактивных отходов Сибирского химического комбината. // Микробиология. 2006. Т. 75. № 6. С. 836-848.
2. Лукьянова Е.А., Захарова Е.В., Константинова Л.И., Назина Т.Н.
Сорбция радионуклидов микроорганизмами из глубинного хранилища жидких низкоактивных отходов. //Радиохимия. 2008. Т. 50. Вып. 1. С. 75 80.
3. Назина Т.Н., Лукьянова Е.А., Тананаев И.Г., Ровный С.И.
Биосорбция радионуклидов микроорганизмами, существующими в подземных водах в районе расположения ФГУП “ПО «Маяк»”. // Вопросы радиационной безопасности. 2008. № 1. С. 29-36.
4. Назина Т.Н., Лукьянова Е.А., Захарова Е.В., Зубков А.А.
Микробиологические процессы в подземных горизонтах хранилища жидких низкоактивных отходов Сибирского химического комбината. // Сборник докладов Всероссийской межведомственной научно-технической конференции «Подземное захоронение жидких радиоактивных отходов:
прошлое настоящее будущее». (10-13 октября 2007 г. г. Северск). 2008.
Принята в печать.
Тезисы 5. Лукьянова Е.А., Назина Т.Н., Захарова Е.В., Калмыков С.Н., Зубков А.А. Биосорбция радионуклидов микроорганизмами из глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов. // Пятая Российская конференция по радиохимии. Радиохимия-2006. Тезисы докладов. Дубна, 23-27 октября 2006 г. – Озерск: ФГУП «ПО «Маяк», 2006. С. 228.
6. Лукьянова Е.А. Участие микроорганизмов в преобразовании радионуклидов в глубинных подземных формациях, подверженных техногенному воздействию. // Материалы четвертого Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 12-16 марта, 2007 г.). М.: ЗАО «Экспо-биохим технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. ч. 2. С. 342.
7. Лукьянова Е.А., Захарова Е.В., Назина Т.Н., Константинова Л.И.
Взаимодействие 238Pu(IV), 241Am(III), 233U(VI) и 237Np(V) с клетками Pseudomonas fluorescens С-64-1 и Pseudomonas grimontii С-61-1. // Четвертая молодежная научно-практическая конференция «Ядерно промышленный комплекс Урала: Проблемы и перспективы» (18-20 апреля 2007 г. г. Озерск). Озерск: РИЦ ВРБ ФГУП "ПО "Маяк". Тезисы докладов.
С. 139-140.