Распространение и функциональная активность сульфатредуцирующих бактерий в гидротермах западного забайкалья
На правах рукописи
ТУДУПОВ Аламжи Владимирович РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ГИДРОТЕРМАХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.08 – экология (биологические наук
и) 03.02.03– микробиология (биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2012 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (ФГБУН ИОЭБ СО РАН) Научный Бархутова Дарима Дондоковна руководитель: кандидат биологических наук Научный Намсараев Баир Бадмабазарович консультант: доктор биологических наук, профессор Официальные Данчинова Галина Анатольевна оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотруд ник Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗС РЧ СО РАМН Дмитриева Ольга Михайловна кандидат биологических наук, старший преподаватель ФГБОУ ВПО БГУ Ведущая Институт природных ресурсов, организация: экологии и криологии СО РАН
Защита диссертации состоится «26» марта 2012 г. в 1400 часов на засе дании диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государствен ном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а, био лого-географический факультет, конференц-зал.
Факс: (3012) E-mail: [email protected] [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государ ственного университета.
Автореферат разослан «_» февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Шорноева Н.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Бактериальное восстановление сульфатов является одним из значимых биогеохимических процессов, играющим су щественную роль на терминальных этапах анаэробной деструкции органи ческого вещества (ОВ). Бактерии и археи, восстанавливающие сульфат, широко распространены в природе, в том числе и в гидротермах (Burggaf S. et.al., 1990;
Hugenholtz et.al., 1998;
Pikuta et.al., 2000;
Friedrich, 2002;
Fishbain et.al., 2003;
Соколова, 2010;
Герасимчук и др., 2010). Их способ ность использовать сульфат как акцептор электрона для получения энер гии в процессе анаэробного роста является ключевым звеном в глобальном биогеохимическом цикле серы и углерода (Иванов, 1983;
Заварзин, 2003;
Бонч-Осмоловская, 2011).
В Забайкалье насчитывается большое количество горячих минеральных источников с различными физическими, химическими и газовыми свойст вами (Борисенко, Замана, 1978). Многие источники характеризуются как слабоминерализованные горячие воды с температурой от 41 до 90С и рН от 7,5 до 10. Щелочные азотные термальные воды являются наиболее из вестными среди них.
Ранее приведенные исследования структуры микробного сообщества и интенсивности биогеохимических процессов в гидротермах Забайкалья показали, что сульфатредукция является одним из доминирующих процес сов на терминальных этапах деструкции ОВ (Намсараев и др., 2006). По этому представляется важным поиск и идентификация сульфатредуци рующих бактерий (СРБ), обитающих в щелочных гидротермах, изучение их функциональной активности в микробном сообществе.
Микробные сообщества щелочных гидротерм относятся к наиболее древним биоценозам Земли. Их изучение играет важную роль в формиро вании представлений об эволюции биосферы (Kelley et.al., 2001;
Marteins son et.al., 2001;
Lowe, Tice, 2004). Исследование распространения и актив ности СРБ при высоких значениях температуры и щелочных значений рН актуально для расширения знаний о многообразии микробного мира и по нимания их роли в круговороте веществ и энергии в экстремальных место обитаниях.
Цель исследования изучение распространения, разнообразия и ак тивности сульфатредуцирующих бактерий в донных отложениях и мик робных матах гидротерм Западного Забайкалья, получение активных на копительных культур сульфатредуцирующих бактерий.
В задачи исследования входило:
1. Изучить физико-химические условия щелочных гидротерм как среды обитания СРБ.
2. Определить численность СРБ в донных отложениях и микробных матах гидротерм.
3. Определить интенсивность сульфатредукции в донных отложениях и микробных матах гидротерм.
4. Получить активные накопительные культуры СРБ из донных отло жений и микробных матов гидротерм и изучить их экофизиологические характеристики.
5. Определить филогенетическое разнообразие сульфатредуцирующих бактерий в микробном сообществе гидротермы Алла.
6. Выявить геохимическую роль сульфатредукторов в микробных со обществах гидротерм.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые исследовано разнообразие и численность термофильных СРБ в гидротермах Забайкалья с помощью микробиологических методов и методов, основанных на ана лизе последовательностей 16S рРНК.
Процесс сульфатредукции с наибольшей скоростью протекал в мик робных матах. Установлено, что в гидротермах Забайкалья развиваются как термофильные, так и мезофильные СРБ. Это говорит о том, что эколо гические условия, созданные в термальных источниках, не препятствуют развитию разных температурных групп бактерий.
Впервые исследовано прокариотическое разнообразие в высокотемпе ратурном микробном мате гидротермы Алла (Забайкалье) с помощью ме тода пиросеквенирования. Разнообразие сульфатредуцирующих бактерий представлено культивируемыми и некультивируемыми бактериями рода Thermodesulfovibrio.
Из гидротерм Забайкалья получены и описаны активные накопитель ные культуры мезофильных и термофильных алкалофильных сульфатре дуцирующей бактерий, способных к окислению лактата и ацетата. Количе ственные данные о численности и активности СРБ дают возможность оце нить их значение в процессах анаэробного распада ОВ и синтеза сероводо рода.
Практическая значимость работы. Полученные результаты расши ряют представление о разнообразии алкалотермофильных сульфатредук торов в природе и могут быть использованы в биотехнологии, бальнеоло гических исследованиях. Выделенные накопительные культуры СРБ пред ставляют интерес для биотехнологии как продуценты термо- и алкало устойчивых ферментов. Сульфатредуцирующие бактерии играют важную роль в формировании лечебного фактора иловых вод, в связи с чем изуче ние процесса сульфатредукции в гидротермах имеет значение для оценки бальнеологического потенциала источников.
Полученный экспериментальный материал может быть использован при чтении курса лекций по предметам «Микробиология», «Экология».
Апробация работы. Результаты исследований были доложены авто ром на Всероссийской конференции с международным участием «Биораз нообразие экосистем Внутренней Азии», Улан-Удэ, 2006;
Всероссийский конференции «Экология Южной Сибири сопредельных территорий», Аба кан, 2008;
V международной конференции по криопедологии «Разнообра зие мерзлотных и сезонно-промерзающих почв и из роль в экосистемах», Улан-Удэ, 2009;
Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2008;
Международной конферен ции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстре мальных местообитаний» (Улан-Удэ – Улаан-Баатар, 2011);
Всероссий ской конференции «Эволюция биогеохимических систем (факторы, про цессы, закономерности) и проблемы природопользования» Геоэкологиче ские, экономические и социальные проблемы природопользования, Чита, 2011.
Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликованы работ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на _ страницах, включая _ таблиц и _ рисунков. Диссертация состо ит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть» (включающая главы «Объекты и методы исследования», «Результа ты и обсуждение», «Заключение»), «Выводы», «Список литературы», «Приложение».
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объектами исследования служили термальные азотные источники За падного Забайкалья, в которых в рамках комплексных микробиологиче ских исследований в 2007-2010 гг. производился ежегодный отбор проб:
Алла, Баунтовский, Гарга, Горячинск, Гусиха, Кучигер, Сеюя, Уро, Сухая, Умхей.
Методы исследования. В полевых условиях определение физико химических параметров воды в местах отбора проб проводили с помощью портативных приборов. Кислотность среды (рН) измеряли рН-метром рНер2 (Португалия), значения общей минерализации – тестер кондуктометром TDS-4 (Сингапур), окислительно-восстановительный по тенциал (Eh) – измерителем редокс-потенциала ORP (Португалия). Темпе ратуру воды и осадков определяли ртутным или сенсорным электротермо метром Prima (Португалия). Концентрацию карбонат- и гидрокарбонат ионов определяли титриметрическим методом (Резников и др., 1970).
В лабораторных условиях определяли: сульфаты – турбидиметрически с BaSO4, хлориды – аргентометрическим методом Мора (Аринушкина, 1970), сульфиды – фотометрически с N'N''-диметил-пара-фенилендиами ном (ДМП) (Trper, Schlegel, 1989). Концентрации ионов Na + и К+ опреде лены с помощью атомно-абсорбционного спектрометра SOLAAR M 2+ (США), Ca был определен комплексометрическим методом с Трилоном Б в присутствии мурексида, Mg2+ по разнице между результатами титро вания суммы Ca2+ и Mg2+ в присутствии эриохрома и результатов опреде ления Ca2+ (Резников и др., 1970).
Органический углерод в осадках анализировали методом мокрого сжи гания по Тюрину (Аринушкина, 1961). Оптическую плотность измеряли на фотоэлектрокалориметре КФК-20 (Россия) и спектрофотометре CECIL СE1021 (Великобритания). Содержание белка определяли по методу Ло ури с использованием реактива Фолина (Практикум по микробиологии, 2005).
Учет численности жизнеспособных клеток микроорганизмов проводи ли методом предельных разведений на элективных средах (Пушева и др., 1999). Для культивирования сульфатредуцирующих бактерий к вышеопи санной среде добавляли (г/л): Na2SO410Н2О – 3;
Na2S9Н2О – 0,05;
на триевые соли молочной или уксусной кислот – 4. В качестве индикатора процесса добавляли 1/3 металлической скрепки или 0,01% раствор FeSO4 в 1% HCl.
Среду перед посевом кипятили и продували азотом для удаления рас творенного кислорода.
Культивирование сульфатредукторов проводили во флаконах, напол ненных средой доверху, и закрытых резиновыми пробками. Численность сульфатредукторов оценивали через 14 суток. О росте бактерий судили по почернению скрепки и образованию осадка сульфида железа. Посевы вы полняли в 3-х повторностях. Культивирование осуществляли в термостате при 30С и 55С. Параллельно ставили химический контроль.
Температурную зависимость роста изучали в области от 10 до 90С.
При исследовании рН-зависимости в диапазоне рН 8,0 – 8,5 использовали раствор по Кларку-Лабсу, для рН 7,0 - фосфатный буфер, а для приготов ления высокощелочных сред (рН 9,0 - 11,0) применяли карбонатные бу ферные растворы (Справочник по биохимии, 1996).
рН среды задавали разными концентрациями растворов NaHCO3 и Na2CO3, в соответствии с природными значениями рН.
При определении возможных доноров электронов их вносили в конеч ной концентрации 0,12%. Способность к автотрофному росту наблюдали с молекулярным водородом (100% газовой фазы).
Рост бактерий фиксировали по изменению оптической плотности сре ды при длине волны 560 нм на фотоколориметре КФК – 3 (Россия), пря мым подсчетом клеток и по образованию конечного продукта реакции – сульфида.
Морфологию клеток бактерий изучали с использованием светового микроскопа AxioStar Plus (Германия) с фазово-контрастным устройством и цифровой фотокамерой с увеличением в 1300 раз.
Для изучения отложения минералов микробные маты упаковывались с сохранением структуры, а в лабораторных условиях разделялись на слои и сушились. Изучение качественного состава минеральных фаз проводилось при помощи сканирующего электронного микроскопа Leo Oxford 1430VP (Германия) и светового Axioskop 2 Plus (Германия). Видовую принадлеж ность цианобактерий определяли по отечественным определителям (Елен кин, 1949;
Голлербах и др., 1953).
Для определения световой и темновой продукции использовали NaH14СO3 (Иванов, 1956;
Кузнецов, Романенко, 1963). В пробы вносили радиометку с активностью 25 мкК. Пробы фиксировали 10N раствором NaOH. Диурон (3-(3,4-дихлорофенил)-1,1-диметилмочевина) в конечной концентрации 7 µМ применяли для ингибирования оксигенного фотосин теза. В ряде экспериментов проводилось стимулирование продукционных процессов цитратом железа в конечной концентрации 0-5 г/л железа. Про бы обрабатывали на установке УЗДН-2 с частотой 22 МГц и мощностью 0,4 мА в течение 2 минут. Фильтровали через мембранные фильтры с диа метром пор 0,2 мкм. Фильтры промывали тремя объемами воды с рН 2-3, высушивали и измеряли радиоактивность.
При определении интенсивности сульфатредукции использовали метод Иванова (1956). Для этого в пробу вносили 0,1-0,2 мл Na235SO4 с активно стью 0,1-1 мкК и инкубировали в течение 0,4-2 суток. Фиксацию интен сивности сульфатредукции производили путем введения в пробу 10-25 % раствора ацетата Cd. Радиоактивность определяли на жидкостном сцин тилляционном счетчике Rackbetta (Швеция).
Измерение содержания стабильных изотопов углерода 12С и 13С в виде газообразной формы СО2 проводили на масс-спектрометре МИ- (СССР). Результаты приведены в виде величин 13С в промилле по отно шению к общепринятым стандартам PDB (Зякун, 2010). Работа выполнена к.б.н Дамбаевым В.Б. в ИБФМ, г. Пущино.
ДНК из биомассы бактерий выделяли с помощью коммерческих набо ров ДНК-сорб и РИБО-сорб (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнад зора, Москва). В работе были использованы праймеры, комплементарные наиболее консервативным участка гена 16S рРНК. Амплификацию фраг мента ДНК, соответствующего гену 16S рРНК, проводили на амплифика торе БИС (Россия). Результаты ПЦР анализировали в 1,5% агрозном геле, продукты нужной длины вырезали и элюировали методом замораживания оттаивания. Секвенирование проводили в Межинститутском центре секве нирования ДНК (г. Новосибирск) на автоматических секвенаторах:
ABI310A и ABI 3130х1 (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, США). Метаге номный анализ проведен на пиросеквенаторе Roche 454 GS-FLX Titanium (Корея).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Экологическая характеристика исследованных гидротерм Физико-химическая характеристика гидротерм Максимальное значение температуры воды (79°С) зафиксировано в ис точнике Алла (табл. 1). Наиболее горячими на выходе были воды гидро терм Гарга (74°С) Гусиха (71,5°С), Уро (69,1°С). Температура воды источ ников Горячинск, Баунтовский и Сеюя была приблизительно одинаковой и составила от 53°С до 55°С. Максимальная температура воды источника Горячинск (53,5°С) зафиксирована зимой. В летнее время температура воды снижается до 44° С.
Таблица Физико-химическая характеристика гидротерм Забайкалья Т, С М, Eh, H2S, Источник Тип воды pH мВ г/дм3 мг/дм (на изливе) сульфатно-гидрокарбонатный Алла 9,9 79,0 0,30 16, натриевый Баунтовс- гидрокарбонатно-сульфатный 53,0 8,4 0,20 7, кий натриевый сульфатно-гидрокарбонатный Гарга 74,0 8,2 +230 0,30 0, натриевый сульфатно-гидрокарбонатный Горячинск 53,0 9,0 0,53 5, натриевый сульфатно-гидрокарбонатный Гусиха 72,0 8,2 +340 0,93 0, натриевый сульфатно-гидрокарбонатный Сеюя 49,0 9,7 0,29 1, натриевый гидрокарбонатно-сульфатный Уро 69,1 9,0 0,50 0, натриевый сульфатно-гидрокарбонатный Кучигер 41,0 9,8 0,30 25, натриевый сульфатно-гидрокарбонатный Умхей 9,0 51,0 0,42 31, натриевый Сухая гидрокарбонатный натриевый 49,0 9,1 0,63 27, Eh – окислительно-восстановительный потенциал;
М – минерализация.
По содержанию сероводорода исследуемые гидротермы подразделяют ся на сульфидные и бессульфидные, в которых концентрация H 2S варьиро вала в пределах от 0 до 31,0 мг/дм3.
Изучение минерального состава вод гидротерм показало преобладание щелочных металлов. Содержание ионов магния колеблется от 0,25 до 15,25 мг/дм3. Содержание ионов кальция в водах источников варьирует в пределах 0,37-32,06 мг/дм3. Максимальное содержание кальция отмечено в термальном источнике Алла, наименьшее количество этого катиона опре делено в гидротерме Сеюя. В воде большинства гидротерм сульфатные ионы преобладают над другими анионами. Их концентрация в воде нахо дилась в пределах 64-480 мг/дм3.
В целях визуализации мест отбора проб проведен анализ методом глав ных компонент (Gelady, 1989;
Gorban, Zinovyev, 2010). Были использованы такие параметры, как температура, рН, окислительно-восстановительный потенциал, содержа ние сульфатов, гидро Axis карбонатов и суль Su Su фидных ионов. В ре зультате анализа были получены кластеры образцов со сходными G физико-химическими условиями (рис. 1). Gu Ga Axis Ku5 Gu Рисунок 1. Разделение Ku3 Ga Ku -3 -2 -1 0 1 2 3 A источников по физико Ku4 A G2 G Ku G химическим параметрам Se A A А1 - Se Se В первой главной - компоненте (РС1), которая объясняет 77% наблюдаемых изменений в сре де образцов, входят содержание сульфатов и сульфидов, а также значения окислительно-восстановительного потенциала. Влияние других факторов на РС1 незначительно. На вторую главную компоненту (РС2) основное влияние оказывают такие параметры, как рН и содержание гидрокарбона тов. Основной вклад в третью компоненту вносит температура.
Количественный и качественный состав органического вещества По содержанию органического углерода (Сорг) циано-бактериальные маты исследованных термальных источников различались (табл. 2). Мак симальное количество Сорг определено в матах гидротермы Гусиха (30,34%), минимальное – в мате источника Гарга (10,04%).
Высокое содержание белка среди исследованных гидротерм было оп ределено в составе матов гидротерм Сеюя (15,79%) и Уро (14,60%). Наи меньшее содержание белка отмечено в микробных матах источника Гуси ха (4,03%).
Таблица Содержание органического углерода, белка и зольных элементов в термальных источниках (в % от сухого веса) Источник Сорг Зольность Белок Гусиха 16,38-30,34 30,3475-10 4,03-9, Уро 16,35-25,58 42,04-68,73 7,48-14, Гарга 10,04-30,30 60,08-67,12 4,23-11, Сеюя 15,37-25,15 51,02-64,31 9,00-9, Алла 16,10 64,22 6, Максимальное количество зольных элементов обнаружено в матах, развивающихся в ручьях гидротерм Гусиха (75,10%) и Уро (68,73%). Наи меньшее количество зольных элементов отмечено в матах, развивающихся у излива источника Гусиха (30,34%).
Исследованные донные осадки характеризовались высоким содержани ем золы (81,45-99,98%), что свидетельствует о накоплении неорганических соединений.
Сравнительный анализ содержания Сорг микробных матов и донных осадков термальных источников показал, что содержание ОВ выше в мик робных матах, что может быть объяснено высокой интенсивностью про дукционных процессов в матах в отличие от донных осадков (Горленко и др., 1987;
Jorgensen, Nelson, 1988;
Navarrete et al., 2000;
Намсараев и др., 2000).
Микробные маты как продуценты органического вещества Ведущая роль в формировании микробных сообществ гидротерм при надлежит оксигенным и аноксигенным фототрофным микроорганизмам, среди которых доминируют цианобактерии. В гидротермах формирова лись микробные маты при значениях температуры от 24 до 65 оС и рН от 8,2 до 9,0. Каждому температурному интервалу соответствовал определен ный тип сообщества. Матообразующими организмами в циано бактериальных матах являются нитчатые цианобактерии рода Phormidium.
Анаэробные фототрофы располагаются под цианобактериями, трофически связанные с сульфатредуцирующими бактериями и приспособленные к использованию водорода и сероводорода. В аноксигенных матах домини ровали зеленые бактерии рода Сhlоroflexus, в серных матах –Thiothrix.
Интенсивность бактериальной продукции органического вещества Скорости микробных процессов продукции органического вещества в высокотемпературных выходах гидротерм Западного Забайкалья были определены радиоизотопным методом. Результаты экспериментов с ис пользованием 14С-бикарбоната показали, что скорость продукции органи ческого вещества в микробных матах за счет фотосинтеза варьирует от 0, до 98 мгС/(дм3сут), при этом вклад аноксигенных фототрофов может дос тигать 100% от общего фотосинтеза. Интегральный показатель активности микробного сообщества, определяемый скоростью темновой фиксацией СО2, достигает 51,67 мгС/(дм3сут) (табл. 3).
Таблица Продукционные процессы гидротермах Забайкалья, мгС/(дм3cут) Фотосинтез Хемосинтез Темновая фиксация Источник Температура, °С д.ос м.м. д.ос м.м. д.ос м.м.
Алла 70 8,81 45,74 5,04 6,61 5,58 10, Уро 56 7,07 32,01 3,81 17,13 6,00 24, Гарга 50-74 8,73 98,58 5,04 5,90 6,03 51, Примечание: здесь и далее: «д.ос.» - донный осадок;
«м.м.» - микробный мат.
Интенсивность сульфатредукции в гидротермах Процесс бактериальной сульфатредукция является доминирующим процессом в терминальной деструкции ОВ щелочных гидротермах. Через этот терминальный процесс в сутки может минерализоваться до 30-61% органического вещества.
Радиоизотопным методом были изучены скорости сульфатредукции в гидротермах при температуре 55-74С (табл. 4). В микробных матах и донных осадках образование сероводорода протекает со скоростью 0,014 15,340 и со скоростью 0,009-0,052 мгS/(дм3сут), соответсвенно. Процессы восстановления сульфата осуществляются, по-видимому, за счет доноров электронов (Н2, органическое вещество), поступающих с водой и синтези руемое в процессе бактериальной продукции.
Таблица Сульфатредукция в гидротермах Забайкалья Скорость, Расход углерода, Источник Тип пробы Температура, С мгS/(дм3 сут) мгС/( дм3 сут) Уро д.ос. 55 0,05 0, Уро м.м. 67 1,33 0, Уро д.ос. 67 0,02 0, Гарга д.ос. 74 4,18 3, Гарга м.м. 57 15,34 11, Алла д.ос. 74 0,01 0, Алла м.м. 65 0,01 0, Распространение сульфатредукторов в источниках В осадках исследуемых источников численность СРБ достигала макси мальных значений (106-108 кл/см3 ила) при использовании лактата в каче стве единственного источника углерода и донора электронов и инкубации проб при температуре 30°С и 55°С. Высокие численности СРБ, растущих как на лактате, так и на ацетате (107 и 108 кл/см3), выявлены в донных осадках гидротерм Кучигер и Горячинск соответственно. Численность СРБ в осадках из Гарги, Сеюи, Гусихи и Аллы не превышала 106 кл/см3.
Численность мезофильных СРБ в источнике Баунтовский, растущих на лактате, достигала 107 кл/см3, тогда как на ацетате – лишь 105 кл/см3. В то же время численность СРБ, растущих при 55°С, достигала 105 кл/см3, при использовании в качестве источника углерода как лактата, так и ацетата.
Было изучено вертикальное распределение в донных осадках гидротерм Сухая, Горячинск и Умхей. Максимальная численность (107-108 кл/см3) выявлены в подповерхностных слоях (3-8 см).
Характеристика накопительных культур СРБ Из микробных матов гидротерм Гусиха, Горячинск и Сеюя выделены три накопительных культур СРБ, а из донных осадков гидротерм Уро, Гар га, Горячинск и Умхей получены тринадцать накопительных культур СРБ.
Условия выделения накопительных культур сульфатредукторов Накопительные культуры сульфатредуцирующих бактерий были полу чены с использованием лактата в качестве единственного источника угле рода. Конечная концентрация субстрата в среде составляла 0,4%. Инкуба цию проводили при двух значениях температур – 30°С и 55°С.
Значения рН в среде устанавливались в соответствии с величиной во дородного показателя в воде источников.
Шесть из шестнадцати накопительных культур были выделены при температуре 30°С, рН 9,0-9,5. Остальные десять накопительных культур СРБ получены при тех же условиях, однако инкубацию проводили при 55°С. Все накопительные культуры получены после 4-5 пересевов.
Морфология накопительных культур сульфатредукторов Полученные накопительные культуры СРБ представлены тонкими не подвижными палочками разной длины, тонкими слегка изогнутыми па лочками и подвижными вибрионами. Клетки одиночные, реже встречают ся сцепленные в цепочки (рис. 2).
10 мкм 10 мкм 10 мкм а) б) в) Рисунок 2. Накопительные культуры Ga-1 (а), Se-08-1-2 (б) и Ur51L (в) Накопительные культуры СРБ, представленные вибрионами, выделе ны из гидротерм Уро, Горячинск и Гарга. В основном все СРБ, представ ленные вибриональным морфотипом, являются мезофилами, за исключе нием накопительных культур Gа-1, Уро-10-ручей, Уро-10-2, у которых температурные оптимумы роста находятся выше 53С.
СРБ, представленые палочковидными формами, встречаются в гидро термах Горячинск, Гарга, Гусиха, Сеюя. Среди них выявлены как мезофи лы (Горячинск), так и термофилы (Гусиха).
Экофизиологические свойства накопительных культур СРБ Температурные интервалы развития мезофильных накопительных куль тур СРБ (инкубация при 30С), составляют 27-55°С, оптимум их роста ра вен 36°С. Для накопительной культуры Гор-10-1 оптимум зафиксирован при 45°С. Их рост выше 55°С не наблюдался.
Таблица Рост СРБ при использовании различных доноров электронов пропионат сукцинат фруктоза формиат фумарат манноза метанол цистеин рамноза пируват глюкоза бутират этанол ацетат лактат серин Д.Э.
н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
– – – – Se-08-1-2 ++ + ++ ++ + + ++ + н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
– Se-08-2 ++ ++ + ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
– – – – – – Ga-1 ++ + ++ ++ + + н.о. н.о. н.о.
– – – – – – – – – Um-09-1 ++ + ++ + + н.о. н.о.
– – – – – – – – – – – Um-09-2 + + + + н.о. н.о. н.о.
– – – – – – – – – – Um-09-3 ++ + + + н.о. н.о.
– – – – – – – Ur51L ++ + + ++ ++ + + + н.о. н.о.
– – – – – – – Ur53L ++ + + + + + ++ Уро-10-ручей (30) н.о. н.о.
– – – ++ + + + + ++ + ++ ++ + + Гор-10-1 (30) н.о. н.о.
– – – – – ++ + + + + + ++ ++ + ++ Гор-10-3 (30) н.о. н.о. н.о. н.о.
– – – – – – – – ++ + + + ++ Уро-10-2 (55) н.о. н.о.
– – ++ + + + + + ++ + + ++ + + ++ Уро-10-ручей (55) н.о. н.о.
– – – ++ + + + + + + + + ++ + + Га-10-3 (55) н.о. н.о.
– – – – – ++ + + + + + ++ ++ + + Гор-10-1 (55) н.о. н.о.
– – – ++ + + + ++ + + ++ + ++ + + Примечания: «++» - активный рост;
«+» - слабый рост;
«–» - нет роста;
«н.о.» - рост не определялся.
Температурный оптимум для накопительных культур Уро-10-ручей и Га-1, полученных при инкубации при 50°С, составил 62°С. Для накопи тельной культуры Уро-10-2 оптимум составил 53°С. Для накопительных культур Se-08-1-2 и Se-08-2 максимальный прирост биомассы клеток за фиксирован при двух значениях температуры – 52°С и 65°С. Темпе 1, ратурные интервалы, при которых развивались накопительные куль 0, туры СРБ, составляет 40-70°С. Та ОП, 560нм ким образом, выше описанные 0, культуры относятся к термофилам 0, (рис. 3).
0, Рисунок 3. Зависимость роста термо 20 40 60 80 Т, оС фильных накопительных культур СРБ от Уро-10-ручей Уро-10-2 Se-08-1-2 Se-08-2 Ga- температуры Все полученные накопительные культуры СРБ являются облигатными алкалофилами, окисляющими источник уг лерода в пределах рН от 8,0 до 10,0 с опти мумом рН 9,1 (рис. 4).
ОП 560 нм Рисунок 4. Зависимость роста термофильные нако пительных культур СРБ от рН Культуры сульфатредукторов активно ис пользуют в качестве источника углерода и донора электронов пируват, сукцинат, цисте 10,5 рН 6,5 7,5 8,5 9, ин, а также ацетат. Некоторые СРБ для роста Уро-10-2 Уро-10-ручей Гор-10-1 Га-10- также используют сахара. Метанол, глюкозу, рамнозу используют лишь немногие накопительные культуры (табл. 5).
Накопительные культуры СРБ проявили способность к автотрофному рос ту.
В качестве акцепторов элек тронов СРБ используют сульфит, тиосульфат и нитрат. Диметил сульфоксид используют лишь некоторые культуры СРБ. (рис.
5).
Рисунок 5. Рост термофильных нако пительных культур СРБ на акцепторах электронов Для двух накопительных куль тур СРБ (мезофильной Ur51L и термофильной Га-10-3) была изучена зависимость роста в градиенте тем пература-рН (рис. 6). Эти два параметра являются одними из основных характеристик исследуемых гидротерм. Уcтановлено, что при одновре менном воздействии двух факторов пределы и оптимум развития мезо фильного сульфатредуктора сужаются и смещаются в сторону более низ ких температур.
а б Рисунок 6. Рост культуры Ur51L (а) и Га-10-3 (б) в градиенте температура-рН Аналогичная картина наблюдается для термофильного сульфатредук тора Га-10-3.
Таким образом, согласно полученным экофизиологическим характери стикам, накопительные культуры являются облигатными алкалофилами.
По отношению к температуре накопительные культуры Ur51L, Ur53L, Гор 10-1, Гор-10-3 являются мезофилами, остальные накопительные культуры (Уро-10-2, Уро-10-ручей, Га-1, Se-08-1-2, Se-08-2) термофилами.
Разнообразие сульфатредукторов Из пробы мата высокотемпературной зоны (73-65°С) гидротермы Алла была выделена тотальная ДНК и получен набор последовательностей ге нов 16S рРНК с помощью метода пиросеквенирования. Набор состоял из 2402 клонов. Наибольшее число полученных последовательностей при надлежит филотипам Deinococcus-Thermus (1084) и Nitrospirae (869). По следовательности генов сульфатредуцирующих бактерий, способных к диссимиляционной сульфатредукции, выявлены только в филотипе Nitros pirae, который представлен последовательностями генов, родственных роду Thermodesulfovibrio. В популяции микробного сообщества сульфат редукторы занимают значительную долю и составляют более трети мик робного сообщества.
Полученные последовательности образуют два кластера: 1 кластер – Thermodesulfovibrio_о (642 клона ) и 2 кластер – Thermodesulfovibrio_о_ис (227 клонов). В первом кластере выявлено четыре последовательности, близкородственные к культивируемым бактериям Thermodesulfovibrio yel lowstonii (98-99% гомологии). Остальные последовательности относятся к некультивируемым представителям Thermodesulfovibrio (83-99% гомоло гии) (рис. 7).
Рисунок 7. Соотношение клонов СРБ в микробном мате гидротермы Алла Геохимическая роль сульфатредуцирующих бактерий Геохимическая деятельность сульфатредуцирующих бактерий связана с их участием в минерализации органического вещества в анаэробных ус ловиях с образованием углекислоты и сероводорода. Образующийся серо водород является активным биогеохимическим агентом и участвует в про цессах хемолитотрофии, изменении физико-химических условий среды, а также влияет на процессы биогенного образования минералов. За счет окисления сероводорода на границе аэробных и анаэробных зон происхо дит синтез ОВ в процессе хемосинтеза и накоплении биомассы автотроф ных микроорганизмов.
Синтезированный сульфатредукторами сероводород вступает в даль нейший круговорот серы, в котором участвуют аноксигенные фототрофы и хемолитотрофные серобактерии, выявленные в исследованных гидро термах. Бактериальный синтез сероводорода происходит в широком диа пазоне температур- от 27 до 70°С.
Микробная продукция СО2 за счет потребления ОВ приводит к осаж дению карбонатных минералов. Этот процесс интенсивно происходит в анаэробных условиях, характеризующимся развитым процессом сульфат редукции, которая сопровождается заметным подщелачиваем воды за счет изъятия иона водорода при образовании сероводорода.
С геохимической деятельностью СРБ связано образование сульфидных минералов, таких как пирит, пирротин, куприт, сфалерит и других (Гамя гин, 2010). В природных микробных матах источника Горячинск было об наружено образование следующих минералов: пирита, кремнезема, суль фата бария с примесями стронция.
В микробных матах гидротермы Горячинск обнаружено отложение пи рита внутри водорослевой клетки, размер которого не превышает 1 мкм (рис. 13). Также среди микробных сообществ обнаружено накопление сфе ролитов пирита, размер которых не более 5 мкм в поперечнике (рис. 8).
В результате деятельности микробного сообщества гидротерм проис ходит фракционирование изотопов углерода и серы. Образование изотоп но-легких карбонатов происходит при анаэробном окислении ОВ, проис ходящем при участии сульфатредуцирующих бактерий (Иванов, 1964).
Изотопный состав 13С карбонатов в микробных матах исследуемых гидро терм изменялся от -4,83 до -12,37‰.
Изотопный состав углерода (13С) органического вещества микробных матов щелочных гидротерм варьировал от -7,17‰ до -32,79‰. Наиболее легкие значения 13С имело органическое вещество мата из гидротермы Ку чигер, где температура воды достигала на выходе 41С. Данные показыва ют, что для продукции органического вещества оксигенные и аноксигенные фототрофы фиксируют вулканогенную и биогенную углекислоту.
Таким образом, в процессе деятельности микробного сообщества в гидротермах идет процесс разделения изотопов углерода. Карбонат каль ция, формирующийся в микробном мате, содержит изотопно-легкий 13С, в микробном мате происходит утяжеление 13С органического вещества.
А Б Рисунок 8. Фото (сканирующий микроскоп): А - кристаллы пирита в микробном сообще стве ист. Горячинск, ст. 1;
Б – элементный состав А Б Рисунок 9. Фото (сканирующий микроскоп): А - кристаллы сферолита пирита (СП);
Б – элементный состав сферолитов пирита ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование комплексных микробиологических, молекулярно биологических, радиоизотопных и стабильно-изотопных данных позволи ло количественно оценить распространение СРБ в наземных гидротермах и их деятельность в микробном сообществе.
Исследованные источники характеризуются высоким содержанием сульфатов, лабильного органического вещества, а также низкими значе ниями ОВП, что является благоприятным для развития СРБ. На конечных этапах деструкции органического вещества в гидротермах Забайкалья сульфатредукторы являются основными деструкторами органического вещества в микробных сообществах гидротерм, в том числе и в бессуль фидных. Образованный сероводород создает особые экологические усло вия для функционирования бактерий круговорота серы – аноксигенных фототрофных и хемотрофных серных и тионовых бактерий.
Анализ генов 16S рРНК из пробы источника Алла, полученных мето дом пиросеквенирования, позволил обнаружить последовательности, род ственные генам 16S рРНК сульфатредуцирующих бактерий рода Thermo desulfovibrio. В популяции микробного сообщества гидротерм, микроорга низмы, осуществляющие диссимиляционное восстановление сульфатов, могут составлять более 1/3 микробного сообщества, что показывает суще ственную роль этой группы прокариот в функционировании микробного сообщества. Сульфатредуцирующие бактерии, могут участвовать в вос становительной фазе цикла серы в щелочных условиях термальных ис точников в диапазоне рН от 8,4 до 9,9 и температуре от 24 до 70С.
Сульфидогенное микробное сообщество играет важную геохимиче скую роль, участвуя в процессе окисления органических веществ в ана эробных условиях и синтезе углекислоты и сероводорода. В результате деятельности в гидротермальных системах сульфатредукторы участвуют в формировании геохимических барьеров, на которых создаются градиенты по концентрациям, растворимости компонентов, рН. Образование геохи мических барьеров в микробном мате ведет к осаждению ряда минералов, таких как кальциты и пириты.
ВЫВОДЫ 1. Сульфатредуцирующие бактерии широко распространены в дон ных осадках и микробных матах гидротерм Западного Забайкалья. Макси мальная численность термофильных СРБ достигает 108 кл/см3, мезофиль ных – 104 кл/см3.
2. В сероводородных и бессульфидных гидротермах Западного За байкалья создаются условия для активной деятельности сульфатредуци рующих бактерий, которые играют важную роль в анаэробном окислении ОВ. Скорость сульфатредукции при температуре 57-70°С составляет 0,012 15,340 мгSдм-3сут-1. При этом максимальные скорости выявлены в мик робных матах.
3. Получены десять активных накопительных культур алкалотермо фильных СРБ, способных к росту при рН 8,5-10 и температуре 40-70°С, и шесть актиалкаломезофильных СРБ, способных росту при рН 8,5-10 и температуре 27-55°С.
4. Анализ микробного сообщества гидротермы Алла методом пиро секвенирования показал присутствие организмов, родственных Thermode sulfovibrio. По полученным результатам пиросеквенирования сульфатре дуцирующие бактерии составляют третью часть от микробного сообщест ва.
5. Геохимическая роль сульфатредуцирующих бактерий в микроб ных матах и донных осадках гидротерм связана с их участием в минерали зации органического вещества с образованием углекислоты и сероводоро да, участием в синтезе сульфидных и карбонатных минералов, а также в создании лечебных свойств воды и илов.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Статьи, опубликованные в рецензируемых изданиях 1. Бархутова Д.Д., Данилова Э.В., Тудупов А.В., Дармаева Б.В. Гид рохимические показатели гидротермы Горячинск // Вестник Бурятского государственного университета. 2008. Вып. 3. С. 14-17.
2. Данилова Э.В., Дагурова О.П., Гаранкина В.П., Тудупов А.В., Ульзетуева А.Д. Гидрохимическая и микробиологическая характеристика некоторых источников Тункинской долины // Вестник Бурятского госу дарственного университета. 2008. Вып. 3. С. 52-54.
3. Тудупов А.В., Потапова З.М., Дашиева Э.П., Бабасанова О.Б. Гид рохимические показатели щелочных гидротерм Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2008. Вып. 3. С. 42-44.
4. Потапова З.М., Тудупов А.В., Цыренова Д.Д., Бархутова Д.Д.
Влияние температуры на содержание хлорофилла «а» в термальных ис точниках Уро и Горячинск // Вестник Бурятского государственного уни верситета. 2009. Вып. 3. Серия «Химия, Физика». С. 27-31.
5. Тудупов А.В., Дамбаев В.Б., Бархутова Д.Д. Изотопный состав уг лерода микробных матов щелочных гидротермах Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2009. Вып. 3. Серия «Химия, Физика». С. 33-35.
6. Тудупов А.В., Калашников А.М., Бархутова Д.Д. Распространение сульфатвосстанавливающих бактерий в щелочных гидротермах Прибайка лья // Вестник Бурятского государственного университета. 2009. Вып. 4.
серия «Биология, География». С. 102-105.
7. Калашников А.М., Тудупов А.В., Зайцева С.В., Бархутова Д.Д., Намсараев Б.Б. Разнообразие сульфатредуцирующих бактерий в щелочных гидротермах Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного уни верситета. 2010. Вып. 4. Серия «Биология, География». С.93-96.
8. Бархутова Д.Д., Тудупов А.В., Намсараев Б.Б. Содержание основ ных неорганических соединений серы в минеральных источниках Бурятии и Монголии // Вестник Бурятского государственного университета. 2011.
Вып. 3. Сеия «Химия, Физика». С.74-80.
9. Тудупов А.В., Бархутова Д.Д., Намсараев З.Б., Намсараев Б.Б. Бак териальный синтез сероводорода в азотных гидротермах Прибайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. 2011. Вып. 3. Серия «Химия, Физика». С.129-134.
Тезисы 10. Калашников А.М., Тудупов А.В. Сульфатредуцирующие бактерии термального источника Горячинск (Бурятия) // Материалы Всероссийской конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий».
Абакан: Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова, 2008. С.128-129.
11. Тудупов А.В., Бархутова Д.Д. Распространение сульфатредуци рующих бактерий в щелочных гидротермах Прибайкалья // Материалы IV Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва: ООО «МАКС Пресс», 2008. С. 46 47.
12. Бархутова Д.Д., Тудупов А.В., Данилова Э.В. Процессы сульфат редукции в холодных сероводородных минеральных источниках Байкаль ской рифтовой зоны // Материалы V Международной конференции по криопедологии «Разнообразие мерзлотных и сезонно-промерзающих почв и их роль в экосистемах». Москва: Институт географии РАН, 2009. С. 109 110.
13. Тудупов А.В. Распространение и экофизиологические характери стики сульфатредуцирующих бактерий в бессульфидных гидротермах Уро и Гарга (Прибайкалье) // Материалы Международной конференции «Эко логия и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных ме стообитаний». Улан-Удэ: изд-во Бурятского государственного университе та, 2011. С. 167-168.
14. Бархутова Д.Д., Тудупов А.В. Роль сульфатредуцирующих бакте рий в биогеохимических процессах гидротерм // Материалы конференции и симпозиума, посвященных 30-летию ИПРЭК СО РАН «Эволюция био геохимических систем (факторы, процессы, закономерности) и проблемы природопользования;
Геоэкологические, экономические и социальные проблемы природопользования». Чита: Забайкальский государственный гуманитарно-педагогический университет, 2011. С. 67-69.