Микробная деградация полисахаридов в почвах при различных температурах
На правах рукописи
Власенко Анна Николаевна МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ В ПОЧВАХ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ Специальность 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Д.Г. Звягинцев доктор биологических наук
Официальные оппоненты:
Л.П. Терехова кандидат биологических наук И.К. Кравченко Российский государственный аграрный
Ведущая организация:
университет МСХА имени К.А.
Тимирязева
Защита диссертации состоится 31 мая 2011 г в 14 ч 00 мин в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, строение 12, факультет почвоведения.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 28 апреля 2011г.
Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, строение 12, факультет почвоведения, Ученый совет.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г. М. Зенова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Такие биополимеры как хитин и пектин являются распространенными полисахаридами в природе и постоянно присутствуют в почве (De Boer W., 2004). Хитин представляет собой азотсодержащий полимер N-ацетил-D-глюкозамина, выступает неотъемлемым компонентом клеточных стенок микромицетов, экзоскелета беспозвоночных животных. Пектин – безазотистый полисахарид, состоящий из остатков D-галактуроновой кислоты, является структурным компонентом клеточных стенок высших растений, придающий прочность растительным тканям. Оба биополимера представляют собой существенный источник углерода и азота для почвенных микроорганизмов, а их минерализация имеет важное значение для биогеохимических циклов этих элементов в биосфере (Gooday, 1990;
Kang et al., 2005).
Жизнедеятельность гидролитических микробных сообществ в существенной степени определяет уровень плодородия почв, включая снабжение растений доступными питательными ресурсами, формирование почвенной структуры и способность к подавлению нежелательных фитопатогенных популяций (Downing & Thomson, 2000;
Kobayashi et al., 2002).
Масштабы микробной деструкции биополимеров (на примере полисахаридов) отличаются в биогеоценозах разных биоклиматических зон, однако в научной литературе информация о структуре и особенностях формирования микробных гидролитических комплексов под воздействием экологических факторов (в частности, температуры) практически отсутствует. С одной стороны, важна роль психрофильных и психротрофных микроорганизмов в процессах деструкции биополимеров, особенно в зонах холодного и умеренного климата.
С другой стороны, известная приуроченность максимальной активности большинства хитинолитических и пектинолитических ферментов микроорганизмов к температуре 40-55оС (Kashyap, 2001;
Dahia, 2006) делает интересным вопрос о деструкции полисахаридов почвенным микробным комплексом при повышенных температурах, с целью оценки потенциальной гидролитической активности микробного сообщества почв и поиска продуцентов гидролитических ферментов.
Целью диссертационной работы явилось исследование особенностей комплекса микроорганизмов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина) в почвах при различных температурах (5, 27, 50оС).
В задачи исследования входило:
1. Сравнительное исследование динамики эмиссии диоксида углерода из образцов почв с добавлением субстрата (хитина и пектина) и без него, инкубируемых при разных температурах.
2. Изучение динамики численности и биомассы эукариотных и прокариотных микроорганизмов, развивающихся в исследуемых микрокосмах при различных температурах в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением полисахаридов.
3. Оценка разнообразия и численности отдельных филогенетических групп прокариотных микроорганизмов гидролитиков в почвах при различных температурах.
4. Детекция хитиназного гена при различных температурах в исследуемых почвах и чистых культурах хитинолитиков.
5. Выявление наиболее активной группы микроорганизмов, участвующих в разложении хитина и пектина в почве при разных температурах.
Выделение доминантов гидролитичеких сообществ почв, определение их видового разнообразия и активности разложения ими полисахаридов.
Научная новизна. Впервые в экспериментах с микрокосмами проведена оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур.
Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) при гидролизе полисахаридов микробным сообществом вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов – мицелиальных и одноклеточных прокариот. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.
Впервые с использованием метода FISH (флюоресцентная гибридизация in situ) оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активного бактериального гидролитического (хитинолитического и пектинолитического) комплекса в гумусовых горизонтах серой лесной, глее-слабоподзолистой, бурой пустынно-степной почв и чернозема в зависимости от температуры. Установлено, что при всех исследуемых температурах среди возможных агентов деструкции полисахаридов их разложение осуществляется представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. При понижении температуры в почвенном гидролитическом бактериальном комплексе особенно возрастает численность метаболически активных форм Firmicutes и Betaproteobacteria. С ростом температуры на порядок увеличивается биомасса мицелиальных представителей группы Actinobacteria, а также возрастает роль Gammaproteobacteria.
С помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического сообщества (дыхания).
Практическая значимость. Выделены штаммы микроорганизмов, обладающие высокой хитинолитической активностью при различных температурах, последовательности гена 16S рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа. Полученные штаммы могут быть использованы в биотехнологии для создания биопрепаратов при борьбе с фитопатогенами.
Результаты проведенного исследования имеют важное практическое значение при разработке биотехнологического процесса получения хитинолитических и пектинолитических ферментов.
Проведенная оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур, и анализ их компонентного состава могут быть полезны в разработке и применении хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика), а также для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов.
Знание закономерностей микробного разложения биополимеров даст возможность управлять микробными популяциями и раскрыть экологическую роль микроорганизмов в углеродных и азотных циклах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на ХIII и XIV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007 и Ломоносов-2006, на XIV Докучаевских молодежных чтениях - 2011 в Санкт-Петебургском государственном университете, на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ и в Институте почвоведения и оценки земель университета Хохенхайм (Штутгарт, Германия).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 статьи, трое тезисов докладов.
Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы и заключение. Материалы диссертации изложены на …. страницах машинописного текста, содержат …. рисунков, ….таблиц. Список литературы включает … источников, из них …. зарубежные.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность своим научным руководителям д.б.н., проф. Д.Г. Звягинцеву и к.б.н. Н.А.
Манучаровой за постоянную помощь и поддержку, повседневное внимание к работе, ценные советы и консультации. Автор особенно благодарен д.б.н. П.А.
Кожевину за помощь в проведении многомерной математической статистики и математического планирования эксперимента, И.К. Кравченко и А.К.
Кизиловой за помощь в постановке ДГГЭ и ценные практические советы.
Автор искренне благодарит А.Л. Степанова, Г.М. Зенову, Т.Г. Добровольскую, Т.П. Турову за ценные рекомендации и помощь в работе, а также весь коллектив кафедры биологии почв МГУ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования Объектами исследования явились образцы верхних гумусовых горизонтов почв разных биоклиматических зон: глее-слабоподзолистой, серой лесной почв и чернозема типичного, отобранные в Тюменской (Надым), Тульской (Щекинский район) и Воронежской (Таловский район) областях, соответственно, и текстурного уплотненного горизонта бурой пустынностепной почвы из Монголии (Южный Гоби, Булган сомон). Основные характеристики исследуемых почв представлены в таблице 1.
Таблица 1. Основные характеристики исследуемых почв.
Глубина рH Почва отбора проб, Сорг, % Сгк/Сфк водн.
см 2-10 0,8 0,5 4, Глее-слабоподзолистая Серая лесная типичная бескарбонатная глубокая 8-20 1,8 0,9 5, на покровном суглинке Чернозем типичный глубококарбонатный 5-30 3,1 2,14 6, тяжелосуглинистый Бурая пустынностепная 2-10 0,64 0,5 8, песчаная При определении структуры гидролитического микробного комплекса в исследуемых почвах при различных температурах использовали метод почвенных микрокосмов с инициацией микробной сукцессии увлажнением и внесением очищенного хитина («ICN Biomedicals», Германия) и пектина («Sigma», Германия) в количестве 0,6% от массы почвы. Инкубацию почвенных микрокосмов осуществляли при 5, 27 и 50оС.
Изучение активности эмиссии диоксида углерода из почв при внесении полисахаридов и без них оценивали газохроматографическим методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).
Определение численности бактерий, длины мицелия актиномицетов и грибов проводили с помощью люминесцентно-микроскопического метода.
Препараты для подсчета бактерий и мицелия актиномицетов окрашивали акридиновым оранжевым, для учета мицелия грибов – калькофлюором белым.
Биомассу определяли расчетным методом (Кожевин, 1989;
Полянская и др., 1995).
Выделение из почв микроорганизмов, разрушающих полисахариды, проводили методом посева на плотные питательные среды. Детекцию микроорганизмов осуществляли по филогенетическим и культурально морфологическим признакам.
Оценку интенсивности потребления хитина чистыми культурами микроорганизмов проводили, измеряя эмиссию диоксида углерода этими культурами и одновременно их биомассу по накоплению белка методом Бредфорда (Bradford, 1976).
Интенсивность образования хитиназы разными группами микроорганизмов осуществляли спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата хитиназура – коммерческого препарата окрашенного хитина (Gomes Ramizes et al., 2004), также с применением 4-метилумбеллиферон меченого N-ацетил-D-глюкозоаминида дигидрата (Pritsch et al., 2004).
С использованием метода флюоресцентной гибридизации in situ (метод FISH) (Amann, 2000) выявляли специфику бактериального, метаболически активного сообщества, разрушающего полисахариды. В настоящей работе был применен спектр зондов, специфичных для представителей доменов Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп Bacteria. Использование метода FISH позволило учесть живые, метаболически активные клетки в почвенных образцах с полисахаридами и без них. Окраска препаратов красителем акридиновым оранжевым дала возможность оценить общую численность клеток микроорганизмов в образцах, включая покоящиеся формы.
Для выделения ДНК из чистых культур микроорганизмов применяли Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США). Суммарную ДНК из почв экстрагировали с помощью PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя.
ПЦР. Фрагмент гена 16S rRNA амплифицировали с использованием универсальных праймеров 341F+GC и 907R (Muyzer et al., 1993). Фрагмент хитиназного гена chiA обнаруживали с помощью «вложенного» ПЦР („nested“ PCR) согласно протоколу (Williamson et al., 2000).
Полученные ПЦР-фрагменты разделяли с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) на оборудовании DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, США) в Институте микробиологии РАН согласно протоколу (Кравченко и др., 2010) с использованием денатурирующего градиента (формамид, мочевина) 50-65% под напряжением 40 В в течение 16 ч для 16S rRNA (и 35-60% при 200V в течение 6 ч для chiA) при постоянной температуре 60о С. Результаты электрофореза регистрировали с помощью системы гель-документирования BioDoc Analyzer II (Biometra, Германия) после окрашивания этидий бромидом. Характерные видимые полосы были элюированы, полученные растворы очищены и использованы для определения нуклеотидных последовательностей.
Секвенирование генов 16S rРНК и chiA проводили в Центре «Биоиженерия» РАН с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США).
Филогенетический анализ. Для предварительного анализа полученных нуклеотидных последоватеотностей генов 16S rРНК и chiA использовали программу BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), а их множественное выравнивание - с использованием программы CLUSTAL W 1.75. Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма “neighbor-joining” (NJ) в программе MEGA 4 (Tamura, 2007). Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы STATISTICA-6 и Statgraphics Plus.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Динамика эмиссии диоксида углерода из почв с внесением полисахаридов при различных температурах Исследование активности дыхания в почвенных микрокосмах с внесением хитина и пектина показало, что эмиссия СО2 в этих вариантах превышала контроль в среднем в 2-6 раз во всех исследуемых почвах. Скорость продукции СО2 в вариантах с субстратом различалась с изменением температуры инкубации. При минимальной температуре (5оС) пик активности наблюдался к концу 3-й недели эксперимента, при 27оС – к концу первой недели, а при 50оС – уже на первые сутки опыта. При этом, контрольные варианты на изменение температуры не реагировали (рис. 1). Такие результаты указывают на высокую активность микробных сообществ, деградирующих полисахариды.
Wilks lambda=,04019, F(54, 674,21)=24,232, p=0, Vertical bars denote 0,95 confidence intervals мкг С-СО 2 / г п. сут Контроль Хитин Пектин 0 1 4 8 14 22 30 0 1 4 8 14 22 30 0 1 4 8 14 22 сутки А. Б. В.
Рис. 1. Динамика эмиссии диоксида углерода (мкг С-СО2/ г почвы сут) из микрокосмов буро-пустынностепной почвы, инкубируемых при различных температурах: А – 5оС, Б – 27оС, В – 50оС.
2. Оптимизация условий разложения хитина с помощью математического планирования эксперимента Эмиссия диоксида углерода также была использована в качестве функционального показателя микробного хитинолитического сообщества для эксперимента на основе математического планирования определения условий, обеспечивающих оптимальные значения факторов для микробного разложение хитина в почвах. Эксперимент был спланирован по схеме центрального композиционного плана «22+звезда». В результате была получена поверхность отклика функционального показателя (эмиссии диоксида углерода) в зависимости от температуры с течением времени с четко выявляемой вершиной. Установлено, что оптимальные значения факторов различались для исследуемых типов почв. На контурных графиках (рис. 2) видно, что для чернозема максимальное дыхание обнаруживается примерно на 20-е сутки при температуре 25оС, для пустынно-степной почвы – на 10-е сутки при температуре 30оС.
А. Б.
Рис. 2. Оптимальные значения факторов на контурном графике в экспериментах с внесением хитина в А – бурую пустынностепную почву и Б – чернозем типичный.
Таким образом, с помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического сообщества (дыхания).
3. Динамика биомассы хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов почв, развивающихся при различных температурах Эксперименты по определению динамики численности и биомассы разных групп микроорганизмов в ходе микробной сукцессии в образцах почв, инкубируемых при разных температурах, в целом подтвердили полученные Wilks lambda=,04873, F(30, 311,81)=18,701, p=0, Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 0, А.
0, мг/ г почвы 0, 0, 0, Контроль Хитин 0, Пектин 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 Wilks lambda=,07445, F(30, 311,81)=14,790, p=0, Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 0, Б.
0, 0, мг/ г почвы 0, 0, 0, Контроль 0, Хитин Пектин 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 Wilks lambda=,01800, F(30, 311,81)=30,457, p=0, Vertical bars denote 0,95 confidence intervals В.
мг/г почвы Контроль Хитин Пектин 0 0 1 4 8 15 30 1 4 8 15 30 1 4 8 15 сутки о о о 27 С 5С 50 С Рис. 3. Динамика биомассы микроорганизмов (мг / г почвы) при различных температурах в ходе хитино- и пектолитической сукцессии в черноземе типичном:
А – бактерии, Б – актиномицеты, В – грибы.
нами закономерности активности дыхания для всех почв (рис. 3).
Установленная зависимость коррелировала также с полученными результатами по определению активности хитиназы in situ с использованием 4 метилумбеллиферон-меченого N-ацетил-B-D-глюкозоаминид дигидрата. Так, максимальная активность хитиназы в увлажненном черноземе in situ даже без внесения хитина при 27оС приходилась на 8-е сутки эксперимента и составляла 610 нмоль / г ч, что в шесть раз превышало активность хитиназы в этой же почве, инкубируемой при 5оС.
Рассмотрение отношений биомассы отдельных групп микроорганизмов в образцах с добавлением субстрата к биомассе микроорганизмов в контрольном образце (рис. 4) показало, что вне зависимости от субстрата и типа почвы грибы имеют тенденцию разлагать полисахариды более активно при низких температурах. Чего нельзя сказать о прокариотном комплексе, который в большей степени приурочен к типу почвы. Как бактериальный, так и актиномицетный гидролитические комплексы глееподзолистой почвы особенно Б.
А. К6 К х п х п х п х п х п х п грибы бактерии акт-ты грибы бактерии акт-ты В.
Т, оС:
5 27 K х п х п х п грибы бактерии акт-ты Рис. 4. Максимальные значения отношений биомассы основных групп микроорганизмов в почвах с добавлением хитина (х) и пектина (п) к биомассе тех же групп в контрольных образцах (К) в ходе эксперимента при различных температурах инкубации чернозема (А), глее-слабоподзолистой (Б) и пустынно-степной (В) почв.
активны при низких температурах. В бурой пустынно-степной почве вклад прокариот в разложение полисахаридов максимален при 50оС. При этом активность актиномицетов при повышенных температурах особенно велика в бурой пустынно-степной почве и черноземе с хитином. Данные особенности, по всей вероятности, обуславливаются структурой природного микробного комплекса, приспособленного к климатическим условиям формирования исследованных почв.
4. Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почве С помощью методов многомерной математической статистики был проведен анализ структурных (биомасса грибов, бактерий и актиномицетов) и функционального (эмиссия диоксида углерода) показателей при деструкции полисахаридов в почвах. Пошаговая множественная регрессия для выявления связи между функциональным и структурными показателями определила существенную роль вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов в функционировании почвенного микробного сообщества – мицелиальных и одноклеточных бактерий, особенно актиномицетов.
Полученная регрессионная модель на основе двух переменных имеет высокую статистическую значимость (объясняет до 90% дисперсии функционального показателя). Зависимость описывается следующими уравнениями для исследуемых почв:
Resp = 52,87*B + 89,27*A – пустынно-степной почва Resp = 37,77*B + 555,49*A – серая лесная почва где, Resp – эмиссия СО2 (мкг С-CO2/г·ч), А – биомасса актиномицетов (мг/г), В – биомасса бактерий (мг/г).
Таким образом, установлена высокая активность при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов микробного сообщества – мицелиальных и одноклеточных прокариот, которые, как показано, вносят существенный вклад в контролирование дыхания микробного сообщества на широком спектре условий (температура, поступление органического вещества, сукцессионное время). При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.
5. Молекулярно-биологический анализ компонентного состава гидролитического бактериального сообщества почв, развивающегося при различных температурах 5.1. Исследование прокариотного хитинолитического и пектинолитического сообщества почв с помощью флюоресцентной гибридизации in situ Оценку метаболически активных клеток прокариот в микробном гидролитическом комплексе рассматриваемых почв проводили с помощью метода in situ-гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH) на сроки эксперимента с максимальной микробной биомассой, измеренной с помощью люминесцентной микроскопии, и наибольшей активности дыхания для определенных температур инкубации.
Проведенные исследования показали, что в целом суммарная доля идентифицируемых клеток, обнаруженных гибридизацией с универсальными зондами на представителей доменов Bacteria и Archaea, составила в образцах исследуемых почв от 26% для чернозема до 90% для глее-слабоподзолистой и бурой пустынностепной почв от общего числа клеток, определенных окрашиванием акридином оранжевым. Особенно низким процент идентификации оказался для образцов чернозема инкубируемых при 5оС, где основная масса бактерий была представлена очень мелкими размерами клеток.
Эти данные позволяют предположить, что значительная доля прокариотных организмов чернозема находится в форме покоящихся или метаболически неактивных клеток.
В почвах с хитином и пектином по сравнению с контролем отмечалось возрастание (в 1,5-3 раза) численности метаболически активных представителей доменов как Bacteria, так и Archaea при всех исследуемых температурах (рис. 5). В образцах разных типов почв с добавлением субстратов при разных температурах она составила 4-20,5*108 (для Bacteria) и 9-29*107 (для Archaea) клеток в грамме почвы. Представляет интерес высокая доля архей в гидролитическом микробном 0 10 20 30 40 50 60 70 80 10 кл./г п.
А.
контроль хитин пектин контроль хитин пектин контроль хитин Bacteria пектин Arhaea 0 3 6 9 12 Б. 10 кл./г п.
контроль Неидентифицированные клоны (акридин оранж.) хитин контроль хитин пектин 15 108 кл./г п.
0 3 6 9 В.
контроль хитин контроль хитин Т, оС Рис. 5. Численность метаболически активных представителей доменов Bacteria и Аrchaea в микробном комплексе почв при различных температурах: А – чернозем, Б – глее-подзолистая почва, В – пустнынно-степная почва.
комплексе пустынно-степной и глее-слабоподзолистой почв, как при высоких, так и при низких температурах, особенно в образцах с хитином. В ряде работ говорится об их участии в минерализации азотсодержащего органического вещества в почвах (Leininger et al., 2006;
Timonen & Bomberg, 2009;
Stopnisek et al., 2010).
Наибольшее влияние температуры на метаболическую активность домена Bacteria обнаруживалось для гидролитических комплексов глееподзолистой и пустнынно-степной почв, где численность активных клеток возрастала с понижением или увеличением температуры, соответственно. Тогда как в хитинолитическом и пектинолитическом комплексах чернозема общая численность метаболически активных форм Bacteria не существенно колебалась c изменением температуры. Данные особенности, по всей видимости, объясняются высокой буферной способностью гидролитических микробных систем чернозема, а также достаточно высоким содержанием органического вещества в этой почве.
Анализ компонентного соcтава клеток внутри домена Bacteria в образцах чернозема типичного выявил дифференциацию групп бактерий при изменении температуры инкубирования (рис 6). Было показано, что представители филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes реагировали значительным увеличением численности метаболически активных форм на внесение хитина и пектина во все исследованные почвы вне зависимости от А. 3, 10 кл./г п.
2, 1, 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 3, Б.
2, 10 кл./г п.
1, 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 В. 3, 10 кл./г п.
2, контроль 1, хитин пектин 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 6. Численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria (1 – Actinobacteria, 2 – Firmicutes, 3 – Alphaproteobacteria, 4 – Betaproteobacteria, 5 – Gammaproteobacteria, 6 – Deltaproteobacteria, 7 – Cytophaga/Bacteroidetes, 8 – Chitinophaga, 9 – Verrucomicrobia) в черноземе с добавлением полисахаридов и без них при различных температурах инкубации: А – 5оС, Б – 27оС, В – 50оС.
температуры. Что позволяет говорить об их активном участии в разложении полисахаридов при широком диапазоне температур. Эти группы организмов наиболее часто упоминаются в числе основных агентов деструкции органического вещества в природных экосистемах (Pourcher et. al., 2001;
Звягинцев, Зенова, 2001).
При понижении температуры до 5оС в гидролитическом микробном комплексе почв наблюдалось возрастание численности группы Firmicutes и Betaproteobacteria, и сокращение грамположительных бактерий с высоким содержанием Г+Ц пар в ДНК, относящихся к филогенетической группе Actinobacteria по сравнению с их численностью в этих почвах при 50оС, где Actinobacteria заметно возрастала в опытных вариантах и составляла до 35% среди идентифицированных одноклеточных единиц внутри домена Bacteria в гидролитическом комплексе почв. При этом особого внимания заслуживает рост мицелиальных форм актинобактерий, биомасса которых в пустынностепной почве и черноземе с добавлением хитина увеличивалась почти на порядок.
Кроме того, в вариантах с полисахаридами при 50оС (в некоторых почвах и при 27оС) численность метаболически активных клеток Gammaproteobacteria была выше, чем в контрольных образцах. Роль этой группы бактерий в разложении хитина отмечается в некоторых исследованиях (Cottrell et al., 2000;
Das et al., 2010).
Увеличение численности Verrucomicrobia в вариантах с пектином указывает на их возможное участие в процессах деструкции. На данный момент среди описанных и узаконенных представителей Verrucomicrobia выявлены бактерии, способные к росту на целлюлозе, пектине, крахмале (Chin et al., 2001;
Sangwan et al., 2004).
5.2. ДГГЭ-анализ амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК микробных сообществ из почв, обогащенных субстратом и без него Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) суммарного амплификата фрагментов гена 16S рРНК был применен с целью оценки сложности микробных гидролитических сообществ почв и различий в структурах их доминантных составляющих. Для анализа использовалась суммарная ДНК, выделенная из микрокосмов чернозема и бурой пустынно степной почв, инкубируемых при различных температурах с внесением полисахаридов и без них, на сроки, аналогичные методу FISH.
На полученных профилях ДГГЭ интенсивность и количество дискретных полос в образцах с добавлением пектина и хитина была выше по сравнению с контрольными для обоих почв. Филогенетическое дерево, представленное на рисунке 7, объединяет результаты ДГГЭ-анализа амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК почвенных сообществ. Сиквенс-анализ некоторых характерных ДГГЭ полос выявил в образцах почв с хитином, инкубируемых при 5оС, присутствие сиквенсных типов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteriacea (Jantinobacterium, Massilia) группы Betaproteobacteria (рис. 7, кластер а). Большинство проанализированных при 27оС последовательностей относилось к филлуму Bacteroidetes (кластер с).
Характерные полосы, выделенные при 50оС, принадлежали представителям семейства Xantomonodaceaе гаммапротеобактерий, среди которых наиболее близкими оказались бактерии рода Lysobacter (кластер b).
Таким образом, комбинирование двух молекулярно-биологических методов (FISH и DGGE) дало возможность информативно оценить различия в структурах доминантных составляющих гидролитических сообществ почв, формирующихся при различных температурах. Кроме того, среди сиквенсных типов, полученных методом ДГГЭ, были представители, выделяемые нами на плотные питательные среды.
6. Детекция хитиназного гена chiA в почвах с хитином и без него при различных температурах С помощью метода «вложенного» ПЦР-анализа (nested PCR) с использованием специфических праймеров и последующим разделением полученных продуктов ПЦР с помощью денатурирующего градиентного гель электрофореза было проведено исследование хитиназного гена группы А (chiA) 18 семейства гликозилгидролаз в почвенном микробном сообществе in situ и чистых культурах микроорганизмов, выделенных из исследуемых почв при различных температурах инкубации. Среди известных хитиназ эта группа а b c Рис. 7. Дендрограмма, основанная на результатах DGGE-анализа амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК почвенных сообществ.
Опытные варианты обозначены кружочками. Дерево построено с помощью алгоритма neighbour-joing, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» - анализа альтернативных деревьев. Буквенные обозначения выделенных кластеров см. в тексте.
обладает высоко консервативными участками, позволяющими их специфическую детекцию среди широкого филогенетического разнообразия микроорганизмов и обнаруживается у 70-80% микробов-хитинолитиков (Williamson et al., 2000).
ДГГЭ анализ амплифицированных фрагментов хитиназного гена показал возрастающую сложность микробных сообществ в почве с добавлением хитина на всех температурах. Результаты секвенирования выдавали отношение полученных последовательностей к хитиназному гену некультивируемых организмов и таким филогенетическим группам, как Actinobacteria ( и Firmicutes. Однако среди близкородственных организмов, выявленных ДГГЭ хитиназного гена, не обнаруживались доминанты, выделенные нами на плотные среды с хитином. Здесь нельзя говорить об абсолютной корреляции между филогенией функционального хитиназного гена и филогенией 16S РНК.
Что также отмечается в работах других авторов (Xiao et al., 2005;
Yasir et al., 2009) и позволяет предполагать горизонтальный перенос хитиназных генов внутри микробного сообщества, как большинства генов биодеградации, сосредоточенных в плазмидной ДНК.
7. Выделение и идентификация доминантов хитинолитического сообщества почв, развивающегося при различных температурах, и определение их хитинолитической активности Исследование комплекса хитинолитических микроорганизмов в глее слабоподзолистой и бурой пустынностепной почвах c использованием метода посева на плотные питательные среды с добавлением хитина, как единственного источника углерода и азота, выявило разных доминантов в зависимости от температуры культивирования. Идентификация выделенных штаммов производилась по культурально-морфологическим и\или филогенетическим признакам. В целом, полученные посевы отличались явным преобладанием (от 55% до 80-90% от общего числа выделенных организмов) какого-то одного вида хитинолитика внутри групп микроорганизмов для отдельных типов почв и температур (особенно это было характерно для крайних температур – 5 и 50оС).
при 27оС среди Так, в глее-слабоподзолистой почве доминантами выделяющихся на среде с хитином микроорганизмов были представители родов Аrthrobacter, Sreptomyces (St. flavogriseus), Aspergillus (A. caespitosus).
При 5оС основными хитинолитиками в этой почве оказались Bacillus sp., Pseudomonas sp., Streptomyces globosus, Penicillum frequentans. В бурой пустынностепной почве 27оС среди мицелильных прокариот преобладали St.
pluricolorescens и St. lavendulacolor, среди немицелиальных бактерий – аэробные грамположительные палочки рода Bacillus, среди грибов – Trichoderma (T. viride). Streptomyces roseolilacinus оказался единственным представителем среди актиномицетов пустынно-степной почвы, выделенных на среде с хитином при 50оС. Доминирующий штамм бактерии в хитинолитическом комплексе бурой пустынностепной почвы при 50оС, был идентифицирован, на основании последовательности 16S рРНК как представитель недавно открытого рода Silanimonas – S. lenta, относящийся к семейству Xanthomonadaceae гамма-протеобактерий.
С целью определения интенсивности разрушения хитина выделенными чистыми культурами микроорганизмов была измерена удельная активность их дыхания (В), под которой понимали отношение разности между эмиссией диоксида углерода (мкг С-СО2/мл среды) определенным штаммом при росте его на среде с хитином и без него к разности накопленной биомассы (мкг) этим штаммом на тех же средах (рис. 7, левая панель). Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК некоторых активных штаммов хитинолитиков были депонированы в генбанк EMBL-EBI. Присвоенные им номера доступа указаны в скобках далее по тексту.
При температуре инкубирования 5оС удельная активность дыхания штаммами Streptomyces sp. strain 5GP1-1 (FR821066), Pseudomonas sp.
(FR832618) и Penicillum frequentans была сравнима между собой и достигала максимума к 14-м суткам опыта (рис 7А, левая панель). Однако при 27оС наибольшая хитинолитическая активность обнаруживалась у штамма актиномицета Streptomyces flavogriseus strain 10 (FR832623), причем на порядок превышала таковую у грибного штамма Trichoderma viride и бактериального 1 С 0, lgB А.
0, 0, 0, 0, 0,01 1 3 6 14 сутки Pseudomonas sp.
0, сутки St. sp. strain 5GP1- 0 1 7 14 P. frequentans St. sp. strain 5GP1- Pseudomonas sp.
P. frequentans lgB С 0, Б.
0, 0, 0, 0, 0,01 1 3 6 сутки T. viride 0, Bacillus sp.
21 сутки 1 3 7 T. viride St. flavogriseus strain Bacillus sp.
St. flavogriseus strain lgB С 0, В.
0, 0, 0, 0, 0, 1 3 6 14 сутки S. lenta 0, St. roseolilacinus 21сутки 0 1 3 7 S. lenta St. roseolilacinus Рис. 7. Динамика удельной активности дыхания (В) (левая панель) и удельной активности образования хитиназы (С) (правая панель) чистыми культурами хитинолитических микроорганизмов при А – 5, Б – 27 и В – 50оС.
штамма Bacillus sp. (FR832620). При 50оС участие мицелиальных (Streptomyces roseolilacinus (FR749827) и одноклеточных (Silanimonas lentа) бактерий в трансформации хитина становится схожим по показателю удельной активности дыхания.
Рассмотрение удельной активности образования хитиназы (С [ед.
хитиназы/мл среды]) в культуральной жидкости исследуемых микроорганизмов, измеренной с помощью chitin-azure (рис. 7, правая панель), показывает, что при 5оС она была максимальной для грибных штаммов, при 27оС - у актиномицетов и на порядок превышала таковую у грибов и бактерий.
При 50оС продукция хитиназы была одинаковой для обоих прокариотных штаммов Streptomyces roseolilacinus и Silanimonas lenta. В литературе имеются сведения, указывающие на способность образования хитиназы у многих представителей гаммапротеобактерий (Das et al., 2010), однако для рода Silanimonas, принадлежащего к этой группе, хитинолитическая активность определена впервые.
Таким образом, интенсивное накопление биомассы, высокая эмиссия диоксида углерода микроорганизмами, растущими на среде с хитином, а так же образование в среде экзофермента хитиназы показывает на потребление хитина в качестве источника углерода и азота в среде всеми исследуемыми микроорганизмами, однако наиболее активными деструкторами хитина из рассматриваемых штаммов можно считать мицелиальные прокариоты – актиномицеты.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что деградация полисахаридов наиболее активно протекает в пустынно-степной зоне – при высоких температурах, в почвах средних и северных климатических зон – при более низких температурах. В почвах при высоких температурах основными деструкторами полисахаридов являются прокариоты, при низких температурах возрастает роль грибов.
2. С помощью математического планирования впервые показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя почвенного микробного гидролитического сообщества (дыхания).
3. Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов микробного сообщества – мицелиальных и одноклеточных прокариот.
При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.
4. Показано, что изменение температуры существенно влияет на общую численность метаболически активных одноклеточных прокариот в гидролитическом комплексе глее-слабоподзолистой и пустынно-степной почв и практически не изменяет её в черноземе, но выявляет различия в структурах доминантных составляющих бактериальных гидролитических сообществ всех исследованных почв.
5. При всех исследуемых температурах разложение полисахаридов осуществляется филогенетическими группами Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Понижение температуры значительно увеличивает численность метаболически активных клеток Firmicutes и Betaroteobacteria в гидролитическом комплексе почв и сокращает её у группы Actinobacteria. При высоких температурах на фоне явного доминирования группы Actinobacteria, биомасса мицелиальных форм которой возрастает почти на порядок в образцах с хитином, в некоторых почвах выделяются также Gammaproteobacteria.
6. Детектирован хитиназный ген группы А (chiA) в почве и чистых культурах микроорганизмов, отвечающий за процесс гидролиза хитина при различных температурах.
7. Выделены бактериальные штаммы, обладающие высокой хитинолитической активностью при различных температурах, определенные последовательности гена 16S рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа.
Основные положения диссертации изложены в следующих работах:
1. Власенко А.Н. Микробная трансформация хитина в почвах при различных температурах. «XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007» М. 2006. Изд-во Макс Пресс. с. 24-25.
2. Манучарова Н.А, Власенко А.Н., Степанов А.Л. Температура как аутэкологический фактор формирования хитинолитического микробного комплекса в почвах. Известия РАН. Сер. Биол. 2007. № 2. с. 205-211.
3. Власенко А.Н. Влияние температуры на формирование почвенного микробного хитинолитического комплекса. «XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007» М. 2007. Изд-во Макс Пресс. с. 13-14.
4. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Белова Э.В., Зенова Г.М., Добровольская Т. Г., Степанов А. Л. Методические аспекты определения использования хитина почвенными микроорганизмами. Известия РАН.
Сер. Биол. 2008. №5. с. 635-640.
5. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Турова Т.П., Пантелеева А.Н., Степанов А.Л., Зенова Г.М. Термофильный хитинолитический микробный комплекс бурой пустынно-степной почвы. Микробиология.
2008. Т. 77. №5. с. 683–688.
6. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Менько Е.В., Звягинцев Д.Г.
Специфика хитинолитического микробного комплекса в почвах, инкубируемых при различных температурах. Микробиология. 2011. Т.
80. №2. с. 219-229.
7. Рапопорт А.М., Власенко А.Н., Манучарова Н.А. Гидролитические микробные сообщества и их роль в наземных экосистемах. "Материалы всероссийской научной конференции XIV Молодежные Докучаевские чтения - 2011", СПб: СПбГУ, 2011, с. 359-360.