Морфофункциональная характеристика эпителиев при воздействии пептидного морфогена гидры
На правах рукописи
КУЛАЕВА Виолетта Валерьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭПИТЕЛИЕВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПЕПТИДНОГО МОРФОГЕНА ГИДРЫ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2007
Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.
акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Быков Владимир Лазаревич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Пигаревский Петр Валерьевич доктор медицинских наук, профессор Мельникова Валентина Филипповна Ведущее учреждение – ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита диссертации состоится «_»2007 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 208. 087. 01 при ГОУ ВПО «Санкт Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (194100, Санкт-Петербург, Литовская ул., д. 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: (194100, Санкт – Петербург, Кантемировская ул., д. 16.)
Автореферат разослан «»_2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Н.Р. Карелина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Эндогенные регуляторные олигопептиды участвуют в различных проявлениях морфогенеза, влияя на течение жизненно важных процессов в организме человека и животных [Ашмарин И.П., Обухова Н.Ф., 1986, 1994;
Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1996;
Тимошин С.С., 2001;
Brain S.D., Cox H.M., 2006;
Varela N. et al., 2007;
Tabata T., Takei Y., 2004]. Одним из активно изучаемых веществ этой группы является древний в филогенетическом отношении ундекапептид, первоначально выделенный из организма пресновод ного кишечнополостного животного гидры (Hydra attenuata, современное назва ние – Hydra vulgaris) и поэтому названный пептидным морфогеном гидры – ПМГ [Schaller H.С., 1973;
Schaller H.С. et al., 1984]. Строение молекулы ПМГ де тально изучено, она и ряд аналогов синтезированы в лабораторных условиях [Рубина А.Ю., 1992;
Birr C., et al., 1981, Bodenmuller H. et al., 1987;
Sakura N. et al., 1987;
Schaller H.C., Bodenmuller H., 1981].
ПМГ обнаружен в тканях представителей различных классов, включая бес позвоночных, позвоночных животных [Балобанова Э.Ф., Крещенко Н.Д., 1988;
Милосердов Ю.В., 1988;
Тирас Х.П., 1988, Fuentes E.J. et al., 1993] и человека [Вараксин А.А. и др., 1987;
Трясучева И.Г. и др., 1990;
Bodenmuller H. et al., 1980;
Sakura H. et al., 1991;
Schaller H.C. et al., 1988]. Выделены и охарактеризо ваны рецепторы ПМГ в тканях животных и человека [Christians S. et al., 1993;
Hampe W. et al. 1999, 2000;
Jacobsen L. et al., 1996;
Kanaki T. et al., 1998;
Neubauer K.H. et al., 1990]. ПМГ отнесен к нейропептидам, покольку он влияет рост и дифференцировку нейронов [Чимитдоржиев Ж.Ж., 2001;
Kajiwara S., Sato T., 1986;
Niemann S., Schaller H.C., 1996;
Quach T.T. et al., 1992], а его содержание наиболее высоко в клетках и органах нервной системы как в норме, так и при патологических состояниях, включая опухоли [Вараксин А.А. и др., 1987;
Трясучева И.Г. и др., 1990;
Ekman R. et al., 1990;
.Schaller H.C. et al., 1988;
Schawaller M. et al., 1988;
Winnikes M. et al., 1992].
В экспериментальных исследованиях установлено влияние ПМГ на органы и клетки сердечно-сосудистой, эндокринной, дыхательной, пищеварительной, репродуктивной систем и кожи [Виноградов В.А. и др., 1987;
Ганьчева Е.А. и др., 1997;
Казимирский А.Н., 1985;
Кривошеев О.Г. и др., 1985;
Лебедько О.А., Тимошин С.С., 1994, Лебедько О.А. и др, 1997, 2000;
Мурзина Н.Б. и др., 1991;
Сазонова Е.Н. и др. 1997;
Слепушкин, и др., 1989;
Спевак С.Е. и др., 1988;
Тимошин С.С. и др., 1997, 1998;
Федосеев В.А и др., 1993;
Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1990, 1991, 1997].
Между тем, основная часть морфологических исследований посвящена авторадиографическому изучению влияния ПМГ на активность пролиферации клеток. В этих исследованиях дается лишь общая усредненная оценка изучаемого процесса и не описываются его особенности в различных участках тканей и органов. Влияние ПМГ на структурные и метаболические характеристики тканей остается мало изученным.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить структурно-функциональные изменения эпителия различных органов (роговица, язык, пищевод, щитовидная железа) при воздействии пептидного морфогена гидры.
ЗАДАЧИ, определяющие достижение поставленной цели:
1. Гистологическая и морфометрическая оценка влияния пептидного мор фогена гидры на структуру эпителиальных тканей различных органов: рогови цы, языка, пищевода, щитовидной железы;
2. Характеристика метаболических изменений, вызываемых пептидным морфогеном гидры, в эпителиях указанных органов при использовании гисто химических методов выявления ферментов с количественной цитофотометриче ской оценкой;
3. Изучение изменений пролиферативной активности эпителиев при воздействии пептидного морфогена гидры с использованием метода авторадио графии НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В проведенной работе при изучении эпителиев различных органов подтверждено ранее установленное стимулирую щее влияние ПМГ на пролиферацию эпителиальных клеток. Выявлены не опи санные особенности митогенного эффекта ПМГ на эпителиоциты, расположен ные в различных топографических зонах в пределах единого эпителиального пласта в одном органе (периферия и центральные участки в роговице, дорсаль ная и вентральная поверхности языка, эпителий нитевидных сосочков и между сосочками на дорсальной поверхности языка).
Получены новые данные о влиянии ПМГ на архитектонику эпителиального пласта и соотношение толщины слоев в эпителиях различных органов, неодина ково выраженные в конкретных топографических зонах. При количественном анализе гистоэнзимологических характеристик эпителиев выявлено ранее не описанное стимулирующее влияние ПМГ на метаболическую активность по кровных и железистых эпителиев, неодинаково выраженное в отдельных топо графических зонах органов и слоях многослойных эпителиев. Впервые установ лено, что под влиянием ПМГ существенно усиливается гетероморфия и гистоэн зимологическая неоднородность эпителиев.
Впервые изучено влияние пептидного морфогена гидры на морфофункцио нальные характеристики эндокринного органа – щитовидной железы. Получены новые данные о его стимулирующем действии на функционально ведущую ткань железы – эпителий, которые свидетельствуют о повышении функциональ ной активности органа.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования представляют теоретический научный интерес, так как они расширяют существенные представления о влиянии на структуру и функции эпителиальных тканей млекопитающих особого класса биологически активных регуляторных молекул – пептидных морфогенов, в частности, одного из наиболее древних в филогенетическом отношении пептидов – ПМГ. Полу ченные данные указывают на сложную организацию изученных эпителиальных тканей, которая проявляется неодинаковой чувствительностью к воздействию ПМГ топографически различных участков эпителия, расположенных даже в пределах единого пласта в одном органе. Практическое значение полученных данных заключается в возможности разработки фармакологических препаратов на основе пептидного морфогена гидры (или его аналогов) для использования с целью стимуляции регенерации эпителиальных тканей, заживления ран и лече ния хронических заболеваний.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. В покровных многослойных эпителиях роговицы, языка и пищевода при воздействии ПМГ наблюдается увеличении толщины эпителиального пласта: в роговице отмечено ее нарастание от периферии к центру, в языке – на дорсаль ной поверхности в области между сосочками и на вентральной поверхности, в пищеводе – значимое увеличение толщины всего эпителиального пласта.
2. В железистом эпителии щитовидной железы введение ПМГ вызывало увеличение относительного содержания эпителия при снижении относительного содержания коллоида. Показатель степени фолликулярной организации щито видной железы не изменился, а показатель активности – увеличился.
3. В эпителиях роговицы, языка, пищевода и щитовидной железы при воз действии ПМГ выявлено увеличение всех показателей, характеризующих про лиферативную активность – митотического индекса, индекса меченых ядер и интенсивности метки, выраженность которого зависит от топографических осо бенностей эпителия.
4. В эпителиях роговицы, языка, пищевода и щитовидной железы ПМГ вызывает усиление метаболической активности, неодинаково выраженное в от дельных слоях и топографических зонах эпителиального пласта.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и об суждены на: II създе физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995);
Всероссийской научной конференции с международным участием, по священной 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистоло гии человека БелГУ (Белгород, 2006);
5-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2006);
научной конференции ученых-мор фологов Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2006);
международной научной конференции «Актуальные проблемы морфологии», посвященной 85-летию БГМУ (Минск, 2006);
II международном эмбриологическом симпозиуме «Югра – Эмбрио-2006» (Ханты-Мансийск, 2006);
8-м конгрессе международной ассо циации морфологов (Орел, 2006);
конференции, посвященной 70-летию Твер ской Государственной медицинской академии и 100-летию со дня рождения проф. И.С. Кудрина (Тверь, 2006);
научно-практической конференции «Совре менные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию со дня рождения проф. Л.И. Фалина (Москва, 2007).
ПУБЛИКАЦИИ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАК ТИКУ. Материалы диссертации изложены в 11 научных работах, в том числе в публикациях в центральном журнале. Основные положения диссертационного исследования включены в учебную программу кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии и патологической анатомии ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П.
Павлова», кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «СПбГПМА».
ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 140 стра ницах (текст) и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы.
Список литературы содержит 345 источников, из них – 255 зарубежных. В работе 60 рисунков (35 микрофотографий, 25 графиков).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты поставлены на 94 нелинейных взрослых мышах-самцах (питомник «Рапполово») с массой тела 20-25 г и 35 нелинейных взрослых крысах-самках (питомник Дальневосточного государственного медицинского университета) с массой тела 100-120 г. Животным экспериментальных групп ПМГ вводили внутрибрюшинно 5-кратно с интервалом 24 ч из расчета 100 мкг на 1 кг массы тела [Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1991]. Препарат синтезирован в Лаборато рии синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии Российского Кардиологического научно-производственного комплекса Росздрава (Москва) и любезно предоставлен для проведения экспериментов руководителем лаборато рии к.х.н. Ж.Д. Беспаловой. Животным контрольных групп с той же кратностью вводили стерильный изотонический раствор натрия хлорида. Животных умер щвляли декапитацией под лгким эфирным наркозом через 24 ч после очередной инъекции ПМГ. Содержание животных, проведение экспериментов и выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с приказом Минздрава СССР №755 от 1997г, а также правилами, утвержднными этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Для авторадиографического исследования крысам за 1 ч до забоя однократно внутрибрюшинно вводили 3Н-тимидин с удельной активностью 84 Ки/моль в дозе 0,6 мкКи/г. Животным на поверхность роговицы дополнительно наносили 5 мкКи 3Н-тимидина трижды в течение часа с интервалом в 20 мин [Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1991].
Гистологическое исследование роговицы, языка, пищевода, щитовидной железы проводили на серийных срезах, визуально оценивая общее состояние ор ганов с учетом конкретных топографических зон: толщину эпителиального пла ста, соотношение его слоев, тинкториальные характеристики, форму и взаимное расположение эпителиоцитов, их ядерно-цитоплазматическое соотношение, со стояние ядерного аппарата, выраженность гетероморфии.
Морфометрическое исследование многослойных плоских эпителиев рого вицы, языка и пищевода включало определение общей толщины эпителиального пласта и толщины отдельных его слоев [Автандилов Г.Г., 1990] с помощью ли нейного окулярного микрометра при увеличении 630. На поперечных срезах щитовидной железы проводили стереологическую оценку относительных объе мов, занимаемых в органе эпителием (Е), в том числе его фолликулярным (Еf), интерфолликулярным (Ei) компонентами и коллоидом (С). На основании этих результатов определяли соотношения Еf/Ei и Е/С – показатели фолликулярной организации и активности щитовидной железы, соответственно. Измерения вы полняли стереологическим методом точечного счета с тест-сеткой окулярного микрометра с 25 точками;
в ходе исследования учитывали данные, полученные при регистрации 1000 точек. [Быков В.Л., 1979]. Митотическую активность эпителиоцитов исследовали на тотальном препарате роговицы, а также на поперечных срезах роговицы, языка, пищевода и долей щитовидной железы.
Оценивали митотический индекс, просматривая в среднем не менее 3000 клеток у каждой мыши на 5 срезах.
Гистохимическое исследование. На криостатных срезах материала, замо роженного в жидком азоте, толщиной 10 мкм выявляли ряд ферментов, характе ризующих метаболическую активность эпителиоцитов изучаемых органов:
НАДН-диафоразу, сукцинат- (СДГ) и лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Активность ферментов оценивали цитоплазме клеток эпителия на спектроцитофотометре плаг-методом при увеличении 280, площади зонда 0,785 мкм2 и длине волны 545 нм, выражая результаты в относительных единицах оптической плотности (D) [Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977;
Быков В.Л., 1979]. Для многослойных эпителиев измерения проводили, учитывая по 100 клеток в базальном и шипова том слоях на каждом из 5 срезов. Замеры D в щитовидной железе проводили в 100 тироцитах, исследуя по два тироцита в каждом фолликуле, расположенных друг против друга.
Авторадиографическое исследование* проводили на парафиновых срезах толщиной 6-7 мкм. Для этого срезы тканей роговицы и языка депарафинировали и покрывали фотоэмульсией НИИХИМФОТО, после экспозиции препараты об рабатывали проявителем D-19, фиксировали 33% раствором тиосульфата на трия, промывали водой и окрашивали гематоксилином Лилли-Майера. Подсчи тывали индекс меченых ядер (ИМЯ), который определяли как соотношение ме ченых ядер, над которыми было не менее 5 зерен серебра, к общему количеству ядер [Епифанова О.И. и др., 1977]. Определение ИМЯ проводили на основании просмотра не менее 3000 клеток у каждого животного. Интенсивность метки, (ИМ) отражающую скорость синтеза ДНК, оценивали путем подсчета зерен се ребра над 25 мечеными ядрами. Подсчет производили в генеративных зонах ис следуемых тканей [Хомичук А.Ю., 1995] при увеличении 630.
Статистическая обработка количественных данных ** проводена с использованием программного пакета Statistica for Windows V6.0. Для каждого показателя определяли среднее значение и ошибку средней арифметической;
различия величин показателей оценивали с помощью критерия Стьюдента, считая их значимыми при Р0,05.
Авторадиографические исследования выполнены на базе центральной научно * исследовательской лаборатории Дальневосточного государственного медицинского университета (г. Хабаровск) под руководством заведующего ЦНИЛ – профессора С.С.
Тимошина. Приношу свою искреннюю благодарность руководителю и сотрудникам лаборатории за помощь в осуществлении исследований.
Гистоэнзимологические и цитофотометрические исследования, а также статистиче ** скую обработку количественных данных выполняли на базе Отдела патологии НИЦ СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Приносим свою искреннюю благодарность руково дителю Отдела проф. В.В. Томсону и ведущему инженеру А.Г. Красникову.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменение структурно-функциональных показателей эпителия рогови цы при воздействии пептидного морфогена гидры. Гистологическое строение многослойного плоского неороговевающего эпителия роговицы исследованных животных, а также данные о ее толщине у животных контрольной группы полностью соответствуют приведенным в литературе [Collinson J.M. et al., 2004;
Gipson I.K., Sugrue I.P., 1994]. Средняя толщина эпителия роговицы мышей составляет 30,2 ± 0,09 мкм, она выше в центральных участках роговицы (33,1 ± 0,17 мкм) по сравнению с периферическими (25,4 ± 0,23 мкм).
При введении ПМГ происходило выявляемое визуально и подтвержденное морфометрическим исследованием увеличение толщины эпителиального пласта (в среднем на 40%), преимущественно за счет 2-кратного утолщения шиповатого слоя (с 15,1 ± 0,07 до 30,3 ± 0,12 мкм), что указывает на увеличение пула диффе ренцирующихся клеток. В центральных участках роговицы нарастание толщины эпителия было более выраженным (в 1,6 раза), чем в периферических (в 1,2 раза), тем самым, введение ПМГ вызывало усиление имеющейся в норме зональной гетероморфии ткани. Гетероморфия является характерным призаком архитекто ники роговицы, закономерности которой описываются так называемой «X–Y–Z гипотезой» [Thoft R.A., 1983], и, вероятно, служит отражением расположения ге неративных зон эпителия в наиболее периферических участках и центростреми тельного перемещения клеток, которое сочетается с их вертикальной миграцией [Димент А.В., Лебедева Г.С., 1973;
Cotsarelis G. et al., 1989;
Haddad A., 2000].
Нарастание толщины пласта эпителия связано с усилением митотической ак тивности в ответ на введение ПМГ, которое зарегистрировано нами как на гисто логических срезах и тотальных препаратах при проведении подсчета митозов, так и методом авторадиографии. МИ значимо увеличивался в среднем с 10,1 ± 0,08 до 13 ± 0,19‰. При этом в центральных участках роговицы он возрастал менее резко (в 1,2 раза с 9,5 ± 0,09 до 11,4 ± 0,15‰), чем периферических (в 1,5 раза с 10,2± 0,22 до 15,3± 0,07‰). ИМЯ в роговице крысы после введения ПМГ значимо уве личивался в 1,3 раза с (9,7 ± 0,27 до 12,9 ± 0,65‰), ИМ также значимо увеличива лась в 1,3 раза (с 13,8 ± 0,11до 17,6 ± 0,18).
Полученные нами данные согласуются со сведениями об общем стиму лирующем влиянии ПМГ на процессы пролиферации в эпителии роговицы [Тимо шин С.С. и др.1997;
Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1990;
1991]. Вместе с тем, на ми впервые отмечены топографические различия, связанные с зональностью ро говицы. Поскольку описанный эффект наблюдался нами и другими авторами в ро говице мышей и крыс, очевидно, что он не является видоспецифичным.
При гистохимическом исследовании все изученные ферменты (НАДН-диа фораза, СДГ, ЛДГ) выявлены в клетках эпителия роговицы у животных как кон трольной, так и экспериментальной группы. Они определяются во всех слоях эпи телия, однако визуально не удавалось отметить каких-либо различий в активности ферментов ни между базальным и шиповатым слоями, ни в отдельных топогра фических зонах (центр – периферия роговицы).
При воздействии ПМГ цитофотометрическая оценка гистохимических ре акций выявила нарастание средней активности НАДН-диафоразы (в 1,3 раза) и СДГ (в 1,6 раза) в цитоплазме клеток, что свидетельствует о стимулирующем влиянии ПМГ на окислительно-восстановительные процессы в эпителии рогови цы. Активность ЛДГ не менялась. Ранее отмечено, что высокая активность СДГ и других дегидрогеназ характеризуют нормальный метаболизм этой ткани, а ее снижение служит показателем повреждения [Cejkova J. et al., 1992;
Salla S. et al., 1995;
Feng Y. et al., 2004]. Поскольку ЛДГ рассматривается как маркер дифферен цировки эпителия роговицы [Hernandez-Quintero M. et al., 2002], можно предпо ложить, что отсутствие изменений ее активности при введении ПМГ обусловлено высоким уровнем его дифференцировки или значением устойчивой активность ЛДГ в поддержании тканевого гомеостаза.
При введении ПМГ выявлены ранее отсутствовавшие различия активности ферментов в отдельных топографических зонах с ее нарастанием от центра к пе риферии роговицы. Так, активность НАДН-диафоразы у мышей контрольной группы значимо не различается в центральной и периферической зонах, а после введения ПМГ эти различия становились значимыми и достигали 1,5 раза Анало гичным образом, различия активности СДГ достигают 1,6 раза. Указанные разли чия не выявлены для ЛДГ.
Дифференциальная оценка эффекта ПМГ с учетом различных слоев эпите лия показала, что его действие значимо для активности НАДН-диафоразы в ба зальном слое, СДГ – в базальном и шиповатом слоях. Влияние ПМГ на актив ность ЛДГ во всех слоях эпителия по отношению к таковой в контрольной группе не выявлено. Между тем, количественная оценка гистохимических реакций обна ружила также различия активности всех исследованных ферментов между слоями эпителия (базальным и шиповатым), которые отсутствовали в контрольной груп пе. После введения ПМГ соотношение активности ферментов в базальном и ши поватом слоях составило 1,6, 1,4 и 2,0 для НАДН-диафоразы, СДГ и ЛДГ соответ ственно.
В целом, на основании полученных данных можно заключить, что ПМГ вы зывал усиление метаболической активности в эпителии роговицы, которое было выраженным примерно в равной степени для СДГ и НАДН-диафоразы и прак тически не проявлялось в отношении ЛДГ. Этот эффект может являться частич но следствием нарастания митотической активности, что согласуется с нашими данными о ее максимальной выраженности в периферических отделах роговицы – участке с наиболее активной пролиферацией клеток. Однако выявление эф фекта ПМГ в шиповатом слое указывает на его способность активировать мета болизм дифференцированных клеток. Характерным следствием воздействия ПМГ явилось возрастание гистоэнзимологической неоднородности с появлени ем различий в активности ферментов между зонами и слоями внутри пласта.
Изменение структурно-функциональных показателей эпителия языка при воздействии пептидного морфогена гидры. Эпителий языка у исследован ных животных имеет типичную структуру, характерную для этой ткани у мышей и крыс [Мамонтов С.Г., 1968;
Рыбаков В.П., 1984;
Hill M.W., 1988;
Loe H. et al., 1972;
Maier H. et al., 1994;
Schroeder H.E., 1981, 1987]. Он обладает структурными различиями на различных поверхностях. На вентральной поверхности он много слойный плоский ороговевающий со сравнительно тонким роговым слоем, под ним располагается собственная пластинка слизистой оболочки со слабо выра женным папиллярным слоем. На дорсальной поверхности языка в средней части органа эпителий имеет различное строение в области нитевидных сосочков и расположенных между ними интерпапиллярных зон. Нитевидные сосочки языка имеют вид асимметричных заостренных пирамидных структур и образованы первичными и вторичными выпячиваниями собственной пластинки [Kobayashi K. et al., 2001, 2004], покрытыми многослойным плоским ороговевающим эпите лием;
его роговой слой распределен неравномерно по поверхности сосочков, преобладая на их выпуклой стороне. Показатели толщины эпителиального пласта у мышей контрольной группы (41,2 ± 0,23;
42,0 0,17 и 57,1 ± 0,31 мкм на дор сальной поверхности в области сосочков, между ними и на вентральной поверх ности соответственно) примерно совпадают с описанными в литературе [Hill M.W., 1988;
Hill M.W. et al., 1981].В целом, полное (хотя и неодинаково выра женное) ороговение эпителия языка во всех его участках отражает особенности питания грызунов и является дополнительным защитным приспособлением, пре пятствующим повреждению этой ткани грубой пищей [Быков В.Л., 1996,1997;
Schroeder H.E.,1981;
Dale B.A. et al., 1990].
После введения ПМГ структура эпителия языка на обеих поверхностях, в це лом, не менялась по сравнению с таковой в контрольной группе. Однако, как по казало визуальное исследование, подтвержденное данными морфометрии, тол щина эпителия увеличивалась (преимущественно за счет шиповатого слоя) на вентральной поверхности языка (в 1,8 раза), на дорсальной – между сосочками (в 1,4 раза). В области сосочков значимых изменений этого показателя не отмечено.
Нарастание толщины эпителия в языке рассматривают как приспособитель ный механизм, который в сочетании с повышенной скоростью обновления эпи телия усиливает его барьерные свойства и препятствует проникновению в эпите лий микробов, их продуктов, а также аллергенов, мутагенов и канцерогенов [Быков В.Л., 1996, 1997;
Cameron I.L., 1966;
Dale B.A. et al., 1990;
Goldberg M., 1993;
Hill M.W., 1988;
Hill M.W. et al., 1981;
Schroeder H.E., 1981;
Ten Cate A.R., 1994]. Напротив, истончение эпителия рассматривается как неблагоприятный признак, вследствие которого эпителий и подлежащие ткани подвергаются уси ленному воздействию повреждающих веществ, в частности, канцерогенов [Maier H. et al., 1994].
Утолщение эпителия при введении ПМГ является прямым следствием нара стания пролиферативной активности его клеток. У мышей контрольной группы митотическая активность эпителия на дорсальной поверхности языка (3,2 ± 0, и 2,9 ± 0,38‰ – в области сосочков и между ними соответственно) и на его вен тральной поверхности (3,0 ± 0,18‰), по нашим данным, значимо не различается и лежит в пределах величин, описанных в литературе [Мамонтов С.Г., 1968;
Ра дивоз М.И. и др., 1991, Рыбаков В.П., 1984;
Тимошин С.С., Жданова Т.Ф., 1987;
Cameron I.L., 1966;
Hill M.W., 1988;
Hill M.W. et al., 1981].
После введения ПМГ нарастание митотической активности было особенно выраженным на вентральной поверхности языка, где этот показатель увеличился в 1,7 раза по сравнению с таковым в контроле, менее существенное увеличение отмечено на дорсальной поверхности между сосочками (в 1,5 раза), тогда как в области сосочков статистически значимые изменения активности пролиферации отсутствовали. Полученные данные полностью согласуются с результатами авто радиографического анализа: у крыс после введения ПМГ значимо в 1,3 раза воз росло количество ДНК-синтезирующих клеток в эпителии (увеличение ИМЯ с 9,04 ± 0,55‰ до 11,8 ± 0,42‰) на вентральной поверхности языка (дорсальная не исследовалась). При этом ИМ увеличился в 1,2 раза (с 16,4 ± 0,37 до 19,7 ± 0,98).
Полученные нами данные о стимулирующем влиянии ПМГ на пролифера тивную активность эпителия языка согласуются с результатами других исследо вателей [Лебедько О.А., Тимошин С.С., 1994;
Лебедько О.А. и др, 1997;
Сазонова Е.Н. и др. 1997;
Хомичук А.Ю., С.С. Тимошин, 1990], которые, однако, изучали эту ткань без учета ее топографических особенностей в органе. Между тем, эпи телий различных топографических зон языка существенно различается не только своим строением, выраженностью гетероморфии, но и клеточной кинетикой, а также биоритмическими характеристиками [Kellett M. et al., 1989;
Potten C.S. et al., 2002]. В этой связи интересно, что, по нашим данным, до введения ПМГ ми тотическая активность клеток в базальном слое эпителия языка значимо не раз личалась во всех трех изученных локализациях, однако после введения ПМГ она увеличивалась неравномерно, в результате чего через 1 сутки после заключи тельной инъекции она оказывалась более высокой на вентральной поверхности, чем на дорсальной. Таким образом, под влиянием ПМГ заметно усиливалась ге тероморфия эпителия языка.
Данные количественного гистохимического анализа подтверждают выводы о стимулирующем влиянии ПМГ на эпителий языка, поскольку они свидетельст вуют о повышении активности всех изученных ферментов. Последнее выражено неодинаково в зависимости от топографических зон языка: оно более выражено на вентральной поверхности (в 1,9–2,4 раза для разных ферментов), а на дорсаль ной поверхности отмечено лишь в участках эпителия между сосочками языка (в 1,5–1,8 раза). В области сосочков изменения отсутствовали.
Воздействие ПМГ приводило не только к общему повышению метаболичес кой активности ткани, но и к появлению ранее отсутствовавших топографичес ких гистоэнзимологических различий: активность НАДН-диафоразы и ЛДГ в эпителии, расположенном на вентральной поверхности языка, стала значимо превышать таковую на дорсальной (в 1,7 и 1,8 и раза соответственно). Вызванное введением ПМГ повышение активности ферментов не может быть отражением лишь усиленной пролиферации, так оно происходило не только в базальном, но и в шиповатом слое, содержащем преимущественно дифференцирующиеся клетки.
Изменение структурно-функциональных показателей эпителия пище вода при воздействии пептидного морфогена гидры. Многослойный плоский ороговевающий эпителий пищевода мышей контрольной группы имеет типич ное строение, характерное для грызунов, в частности, для исследованного вида.
Ороговение этого эпителия определяются свойственным данному виду характе ром питания [Бажанов А.Н., 1978;
Быков В.Л., Исеева Е.А., 2006;
Исеева Е.А., Быков В.Л., 2006;
Leblond C.P et al., 1964;
Oliveira J.A. et al., 1990;
Schonnagel B., 2005]. Граница между эпителием и подлежащей собственной пластинкой слизи стой оболочки сравнительно ровная, соединительнотканные сосочки, вдающи еся в эпителий, выражены слабо, поэтому существенные колебания толщины эпителия в различных участках отсутствуют. По данным морфометрическогo ис следования, толщины эпителиального пласта у животных контрольной группы составляет 58,1 ± 1,13 мкм, а его базального, шиповатого и рогового слоев – 4, ± 0,07, 36,3 ± 0,21 и 15,5 ± 0,33 мкм соответственно. Эти величины лежат в пределах, которые описаны у взрослых мышей [Быков В.Л., Исеева Е.А., 2006;
Исеева Е.А., Быков В.Л., 2006;
Schonnagel B., 2005].
У животных, получавших ПМГ, структура эпителия, в целом, не изменя лась, однако толщина эпителиального пласта значимо увеличилась в 1,4 раза, шиповатого слоя – в 1,7 раза, базального – в 1,3 раза по сравнению с аналогич ными показателями в контроле. Толщина зернистого и рогового слоев после введения ПМГ значимо не изменялась. Описанные изменения типичны для ре акции пищевода и других многослойных эпителиев на факторы, которые вызы вают усиленный рост этой ткани [Black D.D et al., 1990;
Bove M., et al., 2005;
Far rell C.L et al., 1999;
Geboes K., Desmet V., 1978;
Juhl C.O. et al., 1995;
Oliveira J.A.
et al., 1990;
Seefeld U. et al., 1977]. Разрастание эпителия пищевода в условиях повреждения с увеличением толщины служит одной из его главных защитных реакций [Быков В.Л., Исеева Е.А., 2006;
Livstone E.M. et al., 1977]. Увеличение толщины эпителия с (преимущественным за счет шиповатого слоя) после воздействия ПМГ указывают на стимуляцию пролиферации эпителия и уве личение популяции дифференцирующихся клеток.
Эти результаты согласуются с обнаруженным нами увеличением митотиче ской активности в эпителии в 1,4 раза (с 16,5 ± 0,46 ‰ в контрольной группе до 23,1 ± 0,27 ‰). Величины показателей митотической активности, а также дан ные о преимущественной локализации пролиферирующих клеток в базальном слое эпителия пищевода мышей согласуются с данными литературы [Исеева Е.А., Быков В.Л., 2006;
Рыбаков В.П., Романов Ю.А., 1989;
Duan H. et al., 1993].
При проведении гистохимического исследования у животных контрольной группы НАДН-диафораза, СДГ, ЛДГ выявлены во всех слоях эпителия, кроме рогового, что согласуется с данными, представленными в литературе [Исеева Е.А., Быков В.Л.. 2006;
DeLahunta A., 1965]. Введение ПМГ не меняло характера распределения продуктов гистохимических реакций в клетках эпителия пищево да, однако вызывало нарастание активности НАДН-диафоразы и СДГ в базаль ном (в 1,6 и 1,4 раза) и шиповатом слоях (в 1,3 и 1,5 раза) и ЛДГ – в шиповатом слое (в 1,4 раза).
Характерной особенностью метаболической реакции эпителиоцитов на ПМГ служит появление различий в активности ферментов между слоями эпите лия, которые отсутствовали в контрольной группе. Так, после введения ПМГ появились значимые различия в активности НАД-Н-диафоразы и ЛДГ между ба зальным и шиповатым слоями (при соотношениях 1,3 и 1,36).
Увеличение активности изученных ферментов в эпителии пищевода после введения ПМГ, вероятно, частично обусловлено нарастанием пролиферативной активности, что согласуется с повышением активности гистохимических реак ций в базальном слое, где сосредоточен основной пул пролиферирующих кле ток. Вместе с тем, ПМГ вызывает нарастание активности исследованных фер ментов и в шиповатом слое – зоне дифференцирующихся клеток. Таким обра зом, в целом, стимулирующее влияние ПМГ на эпителий пищевода проявляется усилением его пролиферации и метаболической активацией при неравномерной реакции отдельных его слоев и усилении структурной и функциональной неодн ородности ткани.
Изменения структурно-функциональных показателей эпителия щито видной железы при воздействии пептидного морфогена гидры. Щитовидная железа мышей контрольной группы имеет типичное фолликулярное строение и состоит из функционально ведущего эпителиального компонента – продуцента тиреоидных гормонов, представленного фолликулярным и интерфолликуляным эпителием, коллоида (тиреоглобулина), который является секреторным продук том тиреоидного эпителия, и стромой, содержащей сосуды и нервы [Быков В.Л., 1979, 2001]. При использованной стандартной гистологической окраске еще один функционально важный компонент щитовидной железы – С- (парафолли кулярные) клетки, продуцирующие кальцитонин, – не выявляется, однако в свя зи с незначительным объемом, который они занимают в железе [Petko M. et al., 1976;
Conde E. et al., 1991], их включение в состав объема тиреоидного эпителия не может существенно повлиять на точность измерений.
По данным стереологического анализа, у животных контрольной группы средние относительные объемы (волюметрические фракции), занимаемые в же лезе фолликулярным и интерфолликулярным эпителием, а также коллоидом со ставляют 25,9 ± 1,12, 13,5 ± 0,97 и 32,0± 1,08% соответственно. Соотношения фолликулярного и интерфолликулярного эпителия (показатель степени органи зации эпителия в фолликулы) и эпителия (всего) и коллоида (показатель актив ности щитовидной железы) составляют соответственно 1,9 ± 0,05 и 1,2 ± 0,13.
Указанные выше показатели находятся в пределах величин, описанных в лите ратуре [Быков В.Л. 1976, 1979, 2001;
Юкина Г.Ю., Быков В.Л., 2004;
Delverdier M. et al., 2001;
Malendowicz L.K., Woznicki G., 1986].
Введение ПМГ, в целом, не приводило к резким изменениям в фоллику лярной организации и структурно-функциональной зональности долей щито видной железы. Между тем, по данным морфометрического анализа, ПМГ вы зывал почти 2-кратное увеличение относительного объема тиреоидного эпите лия при одновременном снижении волюметрической фракции коллоида в 1, раза. Эти сдвиги указывают на усиление процессов резорбции тиреоидного кол лоида, т.е. на повышение функциональной активности щитовидной железы в це лом, поскольку активация резорбции коррелирует с повышенной секрецией ти реоидных гормонов [Быков В.Л., 1979;
Хмельницкий О.К., 1993]. Соотношение волюметрических фракций тиреоидного эпителия и коллоида после введения ПМГ увеличивалось в 2,7 раза, а фолликулярного и интерфолликулярного эпителия – значимо не менялось.
Активация тиреоидного эпителия под влиянием ПМГ, выявленная в про веденном исследовании, сочеталась с выраженной статистически значимой ми тогенной реакцией (МИ нарастал в 1,6 раза с 0,81± 0,07 до 1,32 ± 0,15 ‰). Полу ченные в нашем исследовании данные об уровне митотической активности в эпителии щитовидной железы лежат в пределах величин, приведенных в рабо тах различных авторов. [Павлов А.В. 1992;
Павлов А.В., Антипанова Е.М., 1988;
Романов Ю.А., Степанова Л.И., 1974;
Bybee A., Tuffery A.R., 1989;
Conde E. et al., 1992;
Kimura T. et al., 2001]. Нарастание пролиферативной активности тиро цитов обычно сочетается с усилением функциональной активности щитовидной железы, что отмечено и в проведенном нами исследовании.
Гистохимическое исследование выявило высокую активность НАДН-диа форазы, СДГ, ЛДГ в цитоплазме тироцитов, что согласуется с результатами ра нее выполненных работ [Быков В.Л., 1976;
Клечиков В.З., Плинер Л.И., 1974;
Юкина Г.Ю., Быков В.Л., 2001;
Arvy L., 1971;
Lindsay S., Jenks P.R., 1961].
Характер распределения продуктов реакций в тироцитах не менялся под влиянием ПМГ, однако уже при визуальной оценке отмечалось нарастание ак тивности изученных ферментов. Описанный эффект подтвержден результатами цитофотометрического анализа, которое выявило статистически значимое уве личение интенсивности гистохимических реакций, максимально выраженное для НАДН-диафоразы (в 1,7 раза), умеренно – для ЛДГ (в 1,5 раза) и минималь но – для СДГ (в 1,3 раза). Нарастание активности исследованных ферментов указывает на стимулирующее влияние ПМГ на метаболизм и функцию тиреоид ного эпителия [Быков В.Л.,1976;
Клечиков В.З., Плинер Л.И., 1974;
Юкина Г.Ю., Быков В.Л., 2001;
Arvy L., 1971;
Lindsay S., Jenks P.R., 1961].
Таким образом, в целом полученные морфометрические и гистохимичес кие данные свидетельствуют об активации тиреоидного эпителия и железы под действием ПМГ. Эти выводы согласуются со сведениями об усиленной секре ции тиреоидных гормонов у животных, получавших ПМГ [Мурзина Н.Б. и др., 1991], а также о том, что введение ПМГ нивелирует угнетающее влияние стрес са на уровни тиреотропного и тиреоидных гормонов [Тимошин С.С. и др., 1997].
Морфофункциональных исследований влияния ПМГ на тиреоидный эпителий или щитовидную железу в целом ранее не проводили. Описанное действие ПМГ может объясняться как его прямым влиянием на тироциты, так и влиянием, опо средованным через гипофиз, о чем говорит зарегистрированное ранее воздейст вие ПМГ на уровни ТТГ.
ПМГ, вероятно, является одним из элементов сложной регуляторной сис темы нейропептидов, которая контролирует различные функции клеток щито видной железы – пролиферацию, дифференцировку, функциональную актив ность, опухолевый рост [Costamagna M.E. et al., 2002;
Lenziardi M. et al., 1995;
Paez Pereda M. et al., 2000;
Raspe E. et al., 1991;
Tseng Y.C. et al., 1993;
Tsuzaki S., Moses A.C., 1990]. При анализе влияния ПМГ и других нейропептидов на ак тивность тиреоидного эпителия следует учитывать, что гормоны щитовидной железы, в свою очередь, воздействуют на синтез некоторых нейропептидов [Fullerton M.J. et al., 1990], а также оказывают существенное регуляторное влия ние на разнообразные функции организма: созревание и дифференцировку кле ток и тканей, секрецию факторов роста, гормонов и цитокинов, активность ме таболизма и др. [Harvey C.B., Williams G.R., 2002;
Hulbert A.J., 2000].
ВЫВОДЫ 1. По данным гистологического, морфометрического, количественного ги стохимического и авторадиографического исследования, пептидный морфоген гидры оказывает стимулирующее воздействие на покровные (роговица, язык, пищевод) и железистый (щитовидная железа) эпителии, усиливая их пролифера тивную и метаболическую активность, увеличивая толщину эпителиальных пла стов и изменяя их цитоархитектонику. Указанные реакции неодинаково выра жены в различных эпителиях, а также их отдельных слоях и топографических зонах. Под влиянием пептидного морфогена гидры существенно усиливается гетероморфия и гистоэнзимологическая неоднородность эпителиев.
2. В многослойном плоском неороговевающем эпителии роговицы при воздействии пептидного морфогена гидры происходит увеличение толщины эпителиального пласта (преимущественно за счет шиповатого слоя), которое бо лее выражено в центральной зоне роговицы. Отмечено усиление ДНК-синтези рующей и митотической активности эпителиоцитов, более значительное в пери ферической зоне роговицы. Пептидный морфоген индуцирует повышение актив ности НАДН-диафоразы (в базальном слое эпителия) и СДГ (в базальном и ши поватом слоях), которая нарастает от центра к периферии роговицы, не оказывая влияния на активность ЛДГ. Следствием воздействия морфогена явилось воз растание гистоэнзимологической неоднородности с появлением различий в ак тивности ферментов между зонами и слоями внутри пласта.
3. Многослойный плоский ороговевающий эпителий языка после введения пептидного морфогена гидры утолщается (преимущественно за счет шиповато го слоя) – максимально на вентральной поверхности, а также на дорсальной по верхности между нитевидными сосочками языка в отсутствие значимой реак циии в области нитевидных сосочков. После введения морфогена нарастает ДНК-синтезирующая и митотическая активность эпителиоцитов;
последняя на иболее высока на вентральной поверхности языка, менее выражена в эпителии между сосочками и не меняется в области сосочков. Активность СДГ, ЛДГ и НАДН-диафоразы более резко нарастает в эпителии вентральной поверхности языка и на дорсальной поверхности между сосочками языка;
в области сосоч-ков изменения активности ЛДГ и СДГ менее выражены, а НАДН-диафоразы – от сутствуют. Под влиянием пептидного морфогена возникают различия в актив ности НАДН-диафоразы и ЛДГ в эпителии, расположенном на вентральной и дорсальной поверхностях языка.
4. Многослойный плоский ороговевающий эпителий пищевода под дейст вием пептидного морфогена гидры утолщается (преимущественно за счет ши поватого слоя), что сочетается с увеличением его митотической активности.
Морфоген вызывает также повышение активности исследованных ферментов:
НАДН-диафоразы и СДГ – в базальном и шиповатом слоях, а ЛДГ – в шипо ватом слое. При этом под влиянием морфогена появляются различия в актив ности ферментов между базальным и шиповатым слоями эпителия, которые от сутствовали в контрольной группе.
5. В щитовидной железе введение пептидного морфогена гидры вызывает значительное увеличение относительного объема (волюметрической фракции) тиреоидного эпителия при одновременном снижении относительного объема его секреторного продукта – интрафолликулярного коллоида, что приводит к резко му увеличению их соотношения, которое служит показателем активности щито видной железы. Соотношение волюметрических фракций фолликулярного и ин терфолликулярного эпителия (показатель степени фолликулярной организации железы) значимо не менялось. Морфоген вызывает также значимое нарастание пролиферативной активности тироцитов и увеличение активности ферментов НАДН-диафоразы, СДГ и ЛДГ в их цитоплазме.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Выявленное стимулирующее влияние пептидного морфогена гидры на пролиферативную и метаболическую активность эпителиев может лежать в ос нове разработки средств для стимуляции регенерации эпителиев после их по вреждения. Напротив, блокирование действия пептидного морфогена гидры с помощью его антагонистов может препятствовать избыточное разрастание эпи телия, например, при гиперпластических процессах и опухолевом росте. Сведе ния о влиянии пептидного морфогена гидры на морфофункциональное состоя ние эпителия различных органов целесообразно использовать в учебном процесс на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии и патологической физиологии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Кулаева В.В., Лебедько О.А., Рубина А.Ю. и др. Влияние пептидного морфогена гидры на поддержание структурного гомеостаза в норме и при стрессе // Тезисы II съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. – Новосибирск: Изд-во НГМИ, 1995. – С. 242.
2. Быков В.Л., Кулаева В.В. Гистохимическая характеристика эпителия ро говицы при введении пептидного морфогена гидры // Бабухинские чтения в Ор ле. Материалы 5 Всероссийской конференции. – М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды», 2006. – С. 67-68.
3. Быков В.Л., Кулаева В.В. Влияние пептидного морфогена гидры на структурно-метаболические характеристики в эпителиальной ткани роговицы // Материалы II Международного эмбриологического симпозиума «Югра-Эмбрио – 2006». Научный вестник Ханты-Мансийского Государственного медицинского института. 2006. – №2. – С. 27 – 28.
4. Кулаева В.В., Быков В.Л. Топографические особенности изменения эпи телия языка после введения пептидного морфогена гидры: морфометрическая характеристика // Морфология. – 2006. – Т. 129, вып. 4. – С.72.
5. Кулаева В.В., Быков В.Л. Реакция эпителия на пептидный морфоген гидры: гистологический и количественный гистоэнзимологический анализ // В кн.: Современные проблемы морфологии – СПб: Изд-во СПб., отд. ВНОАГЭ. – 2006. – вып. 1. – C. 58 – 59.
6. Кулаева В.В., Быков В.Л. Гистоэнзимологическая характеристика эпи телия роговицы при воздействии пептидного морфогена гидры // В кн.: Акту альные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии. – Белгород: Изд-во БелГУ. – 2006. – C. 95.
7. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфометрическая и гистохимическая оценка изменений эпителия пищевода при воздействии пептидного морфогена гидры // В. кн. Актуальные проблемы морфологии. – Минск: Изд-во БГМУ. – 2006. – С.
89 – 90.
8. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфометрическая и гистохимическая харак теристика эпителия языка при введении пептидного морфогена гидры // Морфо логия. – 2006. – Т. 129, вып.5. – С. 56.
9. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфометрическое и гистохимическое ис следование эпителия роговицы при введении пептидного морфогена гидры // В.
кн.: Актуальные вопросы современной морфологии и физиологии. – СПб: Изд во ДЕАН. – 2007. – С. 255 – 256.
10. Кулаева В.В., Быков В.Л. Количественный анализ структурных и мета болических изменений эпителия языка при введении пептидного морфогена гидры // Морфология. – 2007. – Т. 131, вып. 3. – C. 78.
11. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфофункциональная характеристика эпи телия языка при введении пептидного морфогена гидры // Морфология. – 2007. – Т. 131, вып. 3. – С. 41 – 44.