Иммунобиохимическая характеристика крови птицы при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза
на правах рукописи
ОРЕХОВ ДМИТРИЙ АНДРЕЕВИЧ ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРОВИ ПТИЦЫ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА Специальности: 16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007 2
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедре биологической химии ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины” Научные руководители:
доктор биологических наук Сухинин Александр Александрович доктор ветеринарных наук, профессор Конопатов Юрий Васильевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович доктор ветеринарных наук, профессор Калишин Николай Михайлович Ведущая организация ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства».
.
Защита диссертации состоится «22» февраля 2008 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО “Санкт Петербургская государственная академия ветеринарной медицины” по адресу:
196084, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО “Санкт Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”.
Автореферат разослан «»2008 года и размещн на сайте http://spbgavm.ru «»2008 г.
Учный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Белова Л.М.
1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Колибактериоз птиц – инфекционная болезнь всех видов и возрастов птиц, которую в большинстве случаев можно охарактеризовать, как септицемию. Возбудителем является патогенная Escherichia coli (Кэлнек Б.У., 2003).
Болезни, вызываемые энтеробактериями, являются одной из ключевых проблем промышленного птицеводства. Концентрация огромного числа особей в одном помещении приводит к стрессовым состояниям, что усиливает вирулентность условно-патогенной микрофлоры, и, как следствие, развитие инфекционного процесса (Бочкарв В.Н., 1992;
Виноходов В.О., 2000;
Соколова Л.Н. и др., 2005;
Кузьмин В.А. и др., 2006;
Джавадов Э.Д., 2006;
Борисенкова А.Н., 2007).
В комплексе мер борьбы с инфекционными болезнями, включающими соблюдение ветеринарно-санитарных правил, условий содержания и кормления, вакцинопрофилактика занимает ведущее место (Соколов В.Д., 1989;
Садовников Н.В., 1995;
Бурдейный В.В., 1998;
Бакулин В.А., 2006). Для профилактики колибактериоза в настоящее время применяются вакцины: инактивированная вакцина против колибактериоза птиц, вакцина инактивированная сорбированная против колибактериоза птиц, ассоциированная инактивированная сорбированная вакцина против колибактериоза и пастереллеза птиц (Романов Е.А., 2005). Имеется много сообщений об успешном приготовлении и применении инактивированных вакцин против колибактериоза птиц из серотипов О78:К80 и О2:К1 (Arp L. H., 1987;
Lynne A.M. et al., 2006;
Виноходов В.О., 2000).
В технологии изготовления инактивированных вакцин одно из главных мест отводится блокированию инфекционной активности микроорганизмов. С этой целью наиболее широко применяется формалин. Однако, одним из возможных подходов к решению вопроса инактивации возбудителя может быть использование азиридинов, а именно аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) (Бородина О.В., 2005;
Ширяев Ф.А., 2005;
Русалеев В.С., 2005).
При изготовлении инактивированной вакцины против колибактериоза в качестве адъюванта применяют гидроокись алюминия, которая наряду с положительными показателями имеет и ряд недостатков. В тоже время многочисленные исследования показали целесообразность использования в качестве адъюванта липосом, так как вакцины на их основе обладают более выраженной безвредностью, антигенной и иммуногенной активностью (Шанская А.И. и др.,1997;
Сухинин А.А., 2003;
Придыбайло Н.Д. и др., 2006).
Цель исследований - разработка инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур и изучение иммунобиохимических характеристик крови при е применении.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-разработать режим инактивации E. coli, используя аминоэтилэтиленимин;
-изготовить экспериментальные образцы инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур;
-сравнить биологические характеристики инактивированной липосомальной вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза кур;
-определить иммунизирующую дозу, напряжнность и продолжительность иммунитета после применения вакцины на цыплятах;
-определить влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур на иммунобиохимические показатели сыворотки крови кур.
Научная новизна работы. В результате проведнных исследований нами впервые определены оптимальные параметры и режим инактивации E. coli аминоэтилэтиленимином.
Впервые разработана экспериментальная инактивированная липосомальная вакцина против колибактериоза птиц с использованием штамма E. coli № (О78), полученного из ФГУ “ВГНКИ”. Показано, что данная вакцина безвредна, обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью. Установлено, что после вакцинации липосомальной вакциной содержание общего белка, гамма– глобулинов, а также титр специфических антител в сыворотке крови цыплят увеличивались в динамике и были достоверно выше, чем при иммунизации гидроокись алюминиевой формолвакциной. Получено положительное решение формальной экспертизы по заявке на патент РФ № 016893 от 11.07.2007 (приоритет от 25.04.2007).
Практическая значимость работы.
Разработана эффективная экспериментальная инактивированная липосомальная вакцина против колибактериоза на основе штамма E. coli № (О78).
На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур.
Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсу “Ветеринарная микробиология и иммунология” и курсу “Биологическая химия” в ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”.
Апробация работы. Основные материалы исследований диссертационной работы доложены и обсуждены на:
Всероссийской научно-практической конференции ”Ветеринарная медицина – теория, практика и обучение” (Санкт-Петербург, 2006, 2007);
Научно-практической конференции ”Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы” (Санкт-Петербург, 2007);
Международном научно-практическом конгрессе ”Актуальные проблемы ветеринарной медицины” (Санкт-Петербург, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Способ инактивации E. coli аминоэтилэтиленимином.
2. Использование липосом при конструировании вакцины против колибактериоза кур.
Влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза на 3.
иммунобиохимические характеристики крови цыплят.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Список использованных литературных источников включает 224 наименования, в том числе 100 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 рисунками и таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Экспериментальна часть работы была выполнена в течение 2004 – 2007 гг. на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедре биологической химии ФГОУ ВПО “Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины”.
Штамм микроорганизма. В работе использовали штамм Escherichia coli №389 (серовар О-78), полученный из ФГУ “ВГНКИ” (г Москва).
Подопытные животные. В экспериментальных исследованиях были использованы 28-сут. цыплята кросса “Радонит”. Определена безвредность, антигенная и иммуногенная активность инактивированной липосомальной вакцины, проанализирована динамика изменений содержания общего белка и белковых фракций в сыворотке крови птицы после вакцинаций.
Вирулентность культуры E. coli определяли путм постановки биопробы на белых мышах в соответствии с методическими указаниями Минсельхоза России (2000).
Питательные среды, краски. При проведении исследований применяли общепринятые питательные среды и краски. Для культивирования кишечной палочки использовали МПА, МПБ.
Проведение инактивации. Для отработки режима инактивации возбудителя E. coli аминоэтилэтиленимин вносили в бактериальную суспензию, исходя из концентрации бактерий в определнном объме, а также процентного содержания основного активного вещества в водном растворе инактиванта.
Характеризуя кинетические закономерности гибели микроорганизмов, производили расчт постоянной (константы) скорости инактивации (k) по формуле экспоненты (Мейнелл Д., Мейнелл Э., 1967):
Xi e kt г де X K- константа скорости инактивации (ч-1);
T- время инактивации (ч);
X0 – исходная концентрация живых микробных клеток (Ig КОЕ/см3);
Xi – остаточное количество живых микробных клеток (Ig КОЕ/см3);
отсюда:
X k 2,3 / t Xi С учтом показателя k производили расчт времени инактивации микробной суспензии (t) до определнного уровня остаточного вирулентного материала по формуле (Мейнелл Д., Мейнелл Э., 1967):
2,3 lg( x пр / x0 ), где t= k K- константа скорости инактивации (ч-1);
T- время инактивации (ч-1);
X0 – исходная концентрация живых микробных клеток (Ig КОЕ/см3);
Xпр – прогнозируемая концентрация живых микробных клеток после инактивации (Ig КОЕ/см3);
Определение концентрации микробных клеток. Количество КОЕ в бактериальных суспензиях определяли визуально по стандарту (эталону) мутности, в соответствии с инструкцией по применению, и путм высева на плотные питательные среды.
О вирулентности штамма кишечной палочки для мышей и кур судили по LD50 и выражали в КОЕ/мл. Белых мышей заражали подкожно, а кур внутрибрюшинно в объме 0,5 см3 десятикратными разведениями (10-1-10-9) суточных бульонных культур кишечной палочки в забуферном физиологическом растворе.
Световую микроскопию бактериальных клеток проводили под окуляром микроскопа марки МБИ-15 "Биолам" при увеличении х700 раз в мазках, фиксированных на предметном стекле и окрашенных различными методами.
Электронно-микроскопическое исследование нативных и инактивированных бактерий проводили методом позитивного окрашивания уранилацетатом. Препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100C (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 100 кв.
Методы бактериологических исследований.
С целью выделения микроорганизмов рода Escherichia, после заражения вакцинированных и не вакцинированных птиц, проводили морфологические, культуральные, иммунобиохимические, серологические исследования культур E.
coli в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» (2000).
Методы получения и контроля лабораторных серий инактивированной вакцины.
Опытные серии жидкой формы моновалентной инактивированной липосомальной вакцины были приготовлены из антигенов клеток E. coli штамма №389 (О78), инактивированных формальдегидом, или 2% раствором аминоэтилэтиленимина, в течение 24 часов при температуре 37 оС и соединенных с адъювантом – липосомами или гелем гидроокиси алюминия. Липосомы смешивали в различных сочетаниях с инактивированными бактериальными антигенами (1:5, 1:10, 1:20).
Сыворотку крови получали от всех цыплят подопытной (n = 10) и контрольной групп (n = 10).
Контроль качества липосом. Контроль качества стерильности липосомальных суспензий осуществляли в соответствии с ГОСТ 28085- “Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности”.
Стабильность вакцины определяли по характеру изменений иммуногенной активности вакцинных препаратов при хранении в различных режимах: при температуре 37оС в течение 30 суток и при 2 - 4оС в течение 6 и 12 месяцев.
Определение стерильности готовой вакцины и полноты инактивации бактериальных суспензий проводили в соответствии с ГОСТ 28085- “Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности”.
При проверке на бактериальное загрязнение проводили посев на среды: Эндо, МПА, МПБ, МППБ, а при исследовании на грибную контаминацию - на среду Сабуро. О стерильности судили по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах.
Испытуемые образцы вакцины проверяли на контаминацию микоплазмами путем высева в пробирки со средой Эдварда (жидкая, полужидкая и плотная). Об отсутствии роста микоплазм в среде судили по сохранению цвета среды.
Определение безвредности. Безвредность вакцины определяли по ОСТ 9380 076-00008064-96 “Препараты ветеринарные. Методы определения безвредности.
Основные положения”. Сущность метода заключается в выявлении реактогенного действия вакцины на привитых цыплятах по клиническому состоянию и сохранности подопытной птицы.
Антигенную активность вакцины оценивали методом серологических исследований сыворотки крови иммунизированных птиц. Напряженность иммунитета оценивали с помощью реакции агглютинации (РА). С этой целью через определенные интервалы времени от иммунизированных птиц брали кровь, получали сыворотку и исследовали на содержание антител.
Иммуногенные свойства инактивированных вакцин изучали в лабораторных опытах на белых мышах и цыплятах. Животных иммунизировали однократно.
Через 21 сутки после вакцинации всех иммунизированных и контрольных (не вакцинированных) животных заражали E. coli штамм №389 (О78). Об уровне специфической защиты судили по отсутствию у привитых птиц клинических признаков, характерных для колибактериоза.
Влияние вакцинации на биохимические показатели сыворотки крови изучали в лабораторных опытах на цыплятах. Вакцину вводили птице внутримышечно, однократно. Для выявления иммунобиохимических реакций организма у птиц брали кровь до кормления, непосредственно перед иммунизацией, а затем через 5, 10, 15 и 25 дней после вакцинации.
В сыворотке крови вакцинированных цыплят определяли концентрацию общего белка биуретовым методом, соотношение белковых фракций нефелометрическим методом по Оллу и Маккорду.
Статистическую обработку полученных результатов проводили методом математической статистики, предложенным Ашмариным И.П. (2000) и с помощью программ Microsoft Excel 97 и Statistika/W v.5.773, SPSS v.7.58.
Цифровой материал диссертации обработан по критерию Стьюдента для проверки достоверности различий. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при Р 0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Инактивация клеток Escherichia coli В качестве исходного материала использовали суспензию клеток E. coli штамм №389 (О78) с концентрацией 2 1010 КОЕ/см3. Инактивацию осуществляли при температуре 370С в режиме постоянного перемешивания. Концентрацию микробных клеток определяли при помощи стандарта мутности ГИСК им. Л.А.
Тарасевича.
Для инактивации клеток E. coli использовали аминоэтилэтиленимин с конечной концентрацией 2% по активному веществу. Данные фиксировали через каждый час путм титрования отбираемых проб с чашек Петри со средой Эндо.
Кинетическая кривая, построенная на основании данных эксперимента, наглядно демонстрирует процесс инактивации E. coli.
Концентрация бактериальных 10 клеток, lg КОЕ/см -2 1 2 3 4 -4 - - Время, час 1 - Escherichia coli, штамм №389 (О78);
2 - принятый предел инактивации, равный 1*10-4 КОЕ/см Рис.1. Жизнеспособность клеток E. coli при воздействии 2% АЭЭИ.
Прямолинейная форма е указывает на экспоненциальный характер гибели бактерий.
Константу скорости инактивации (k) определяли по формуле экспоненты (Д.
Мейлелл, Э. Мейлелл, 1967).
Таким образом, константа скорости инактивации составила -2,95 час-1.
Необходимо отметить, что величина эмпирического коэффициента является справедливой только для 2% концентрации аминоэтилэтиленимина. С изменением концентрации E. coli №389 (O78) в суспензии, равно как и инактиванта изменятся как продолжительность, так и константа скорости инактивации.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что при изготовлении инактивированного антигена E. coli №389 (О78) инактивацию микробных клеток целесообразно проводить 2% аминоэтилэтиленимином в течение 5-6 часов при температуре 37°С.
2.2.2. Влияние аминоэтилэтиленимина и формалина на морфологию бактерий E. coli Морфологические свойства интактных и инактивированных бактерий исследовали с помощью световой и электронной микроскопии. Сравнительный анализ методом световой микроскопии, окрашенных по Граму препаратов нативных и инактивированных аминоэтилэтиленимин культур E. сoli №389 (О78), выявил различия в форме и размерах бактериальных клеток. В мазках, приготовленных из инактивированных клеток, наряду с характерными для данного вида возбудителя палочками, отмечали структуры округлой формы более бледной окраски, которые, по всей вероятности, представляли собой пустые «клеточные тени», оставшиеся после разрушения клеток.
Результаты сравнительного электронно-микроскопического анализа морфологических свойств клеток E. coli №389 (О78) до и после инактивации формалином и аминоэтилэтиленимином представлены на рисунках 2, 3, соответственно.
Установлено, что морфологические свойства клеток E. coli №389 (О78) в контрольных препаратах соответствуют норме (рис.2), о чем свидетельствует характерная форма и размеры клеток, а также наличие поверхностных структур:
часть клеток снабжена пилями и жгутиками. Клетки не имели деструктивных изменений и большая часть популяции (около 97% клеток) находилась в физиологически активном состоянии.
Рис.2. Морфологически интактные клетки E. сoli №389 (О78).
Увеличение 20000.
Рис.3. Инактивированные формалином Рис.4. Инактивированные клетки E. coli №389 (О78). аминоэтилэтиленимином Контроль - увеличение 20000. клетки E. coli №389 (О78).
Увеличение 20000.
На электронограмме (рис.3) видны деструктивные изменения формы клеток, происходящие в результате сжатия белково-рибосомального компонента цитоплазмы и его преобразования в электронно-плотные включения. Деструкция бактерий сопровождалась уменьшением размеров и повышенной агрегацией клеток.
Морфологические свойства клеток E. coli №389 (О78), инактивированных аминоэтилэтиленимином, свидетельствуют о потери ими физиологической активности и переходе в электронно-плотное состояние. У большинства бактериальных клеток наблюдаются деструктивные изменения, что проявляется, в основном, в отслоении наружной и цитоплазматической мембран (рис.4).
Таким образом, посредством электронной микроскопии были выявлены различия в форме, размерах и ультраструктуре клеток E. coli №389 (О78), до и после воздействия инактиванта.
2.2.3. Изготовление моновалентной инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птиц Получаемый вакцинный препарат представляет собой суспензию, содержащую инактивированный аминоэтилэтиленимином антиген бактерии E. coli штамм №389 (О78), адсорбированный на липосомальных везикулах. Вместо штамма E. coli №389 (О78) может быть использован и другой патогенный штамм E.
сoli, вызывающий колибактериоз птиц.
Вакцину готовили по следующей методике: 0.45 л суспензии клеток E. coli штамм №389 (О78) с концентрацией 2 1010 КОЕ/см3 смешивали при температуре 370С в режиме постоянного перемешивания с 50 мл 20% раствора аминоэтилэтиленимина в течение 20 мин. Полученный препарат содержал антиген и не содержал жизнеспособных клеток бактерий. 20 мл препарата, содержащего антиген, смешали с 2.0 г суммарных фосфолипидов растительного лецитина, 0.5 г бутилоксианизола и 0.5 г лактозы. Смесь гомогенизировали в течение 10 минут при скорости вращения 700 g и температуре смеси 22 - 240 С, после чего использовали для вакцинации.
Препарат вводили внутримышечно в грудную или бедренную мышцу птицы в дозе 0,5 мл на 1 голову.
Вакцину проверяли на безвредность, антигенную и иммуногенную активность. Напряженность поствакцинального иммунитета определяли через 7, 28, 45, 60, 90 суток после прививки в реакции агглютинации.
2.2.4. Результаты сравнительной оценки инактивированной липосомальной вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза птицы Установили, что липосомальная вакцина против колибактериоза птицы была безвредна и не вызывала патологоанатомических изменений в органах и тканях при введении 10-кратной дозы. Она обладала выраженной антигенной активностью и индуцировала в организме иммунизированной птицы образование специфических антител. Динамика формирования иммунитета представлена в таблице 1.
Таблица Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных цыплят (титры антител в log2, M m).
Дни исследований после иммунизации №№ 7 28 45 60 группы 6,1 0.2 9,5 0,3 9,9 0,2** 9,8 0,2** 9,8 0,1 ** 5,4 0,5 7,7 0,5 7,4 0.5 6,8 0, 7,2 0, 0,5 0,1 0,7 0, Н/О Н/О Н/О ** По сравнению с контролем вакцины.
Примечание. Н/О – не обнаружено.
Группа 1 – цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной.
Группа 2 – цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной.
Группа 3 – контроль.
Обе вакцины были антигенно-активными и формировали напряженный иммунитет у подопытной птицы в течение всего периода наблюдения.
В сравнительном аспекте было изучено проявление местных тканевых реакций на внутримышечное введение вакцин (таблица 2, 3). Контроль клинического состояния птицы в ходе эксперимента не выявил существенных отклонений общего и местного характера. Не обнаружено отклонений в е поведении при введении 10-кратной дозы препарата.
Таблица Оценка места введения вакцин против колибактериоза через 10 суток после инъекции ( n = 10 ).
Видимые изменения в местах введения вакцин, % Степень Следы №№ поражения вакцины Гранулмы Отчность группы легкая Н/О Н/О средняя Н/О 60 Примечание:
группа 1 – цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной;
группа 2 – цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной;
Н/О – не обнаружено Таблица Оценка места введения вакцин против колибактериоза через 90 суток после инъекции ( n = 10 ).
Видимые изменения в местах введения вакцин,% Степень Без видимых Незначит.
№№ поражения изменений кол-во. Фибрин группы вакцины легкая Н/О Н/О Н/О средняя Н/О 40 Примечание:
группа 1 – цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной;
группа 2 – цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной;
Н/О – не обнаружено После вакцинации в течение первых 5 суток проводили убой птиц и визуально оценивали место инъекции. Установлено, что при использовании липосом местные реакции тканей были минимальными. Нами установлено отсутствие воспаления и инкапсулированных остатков вакцины, лгкое побледнение тканей на площади 0, см в диаметре.
В случае использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта регистрировали: отчность, побледнение окружающих тканей, гиперемию в зоне воспалительной реакции до 2 см в диаметре вокруг места инъекции, отмечали присутствие остатков инкапсулированной вакцины.
Поствакцинальной реакции не наблюдали. Все птицы были клинически здоровы.
Коэффициент иммунологической эффективности инактивированной липосомальной вакцины при внутримышечном способе вакцинации цыплят, в лабораторных условиях спустя 28 дней после иммунизации составлял 100%. При применении ГОА формолвакцины коэффициент иммунологической эффективности был – 95%.
От всех павших после заражения патогенными штаммами птиц была выделена исходная культура кишечной палочки.
2.2.5. Влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы на иммунобиохимические показатели сыворотки крови цыплят подопытной и контрольной групп Исследования иммунобиохимических показателей сыворотки крови цыплят показали, что под влиянием липосомальной вакцины концентрация общего белка в сыворотке крови цыплят возросла на 4,31% по сравнению с контролем, под влиянием ГОА формолвакцины в тот же период этот показатель был выше контроля на 10,45% (Р0,05).
В контрольной группе цыплят с возрастом отмечена тенденция снижения концентрации гамма – глобулинов сыворотки крови, тогда как в сыворотке крови вакцинированных цыплят установлено достоверное увеличение концентрации этой фракции общего белка, начиная с 5-го дня после вакцинации. Так, концентрация гамма – глобулинов сыворотки крови цыплят, вакцинированных ГОА формолвакциной, на 25 день составила 10,08 ± 0,93 г/л, против 6,96 ± 0,64 г/л – в контроле (Р0,05). Концентрация гамма – глобулинов сыворотки крови цыплят, вакцинированных инактивированной липосомальной вакциной, оказалась максимальным в этот возрастной период – 12,23 ± 1,20 г/л (Р0,05). Таким образом, под влиянием вакцин происходило перераспределение фракций общего белка в сторону увеличения синтеза гамма – глобулинов (рис. 5).
содержание гамма - глобулинов в сыворотке крови цыплят, г/л Липосомальная вакцина ГОА формолвакцина 6 Контроль 0 5 10 15 20 25 дни исследований после иммунизации Рис. 5. Содержание гамма – глобулинов в сыворотке крови цыплят.
3. ВЫВОДЫ Разработан метод инактивации штамма №389 (О78), 1. E. coli обеспечивающий гибель бактерий при сохранении их антигенных и иммуногенных свойств. Изучено в сравнительном аспекте влияние аминоэтилэтиленимина и формалина на морфологию клеток штамма E. coli №389 (О78).
Установлено, что инактивация клеток штамма coli №389 (О78) 2. E.
аминоэтилэтиленимином происходит прямолинейно, т.е. с постоянной скоростью.
Разработан метод изготовления инактивированной липосомальной 3.
вакцины против колибактериоза кур. Определена иммунизирующая доза, напряжнность и продолжительность иммунитета после применения вакцины на цыплятах.
При использовании вакцины с адъювантом на основе липосом местная 4.
реакция тканей при иммунизации цыплят была минимальной, не наблюдались воспаление и инкапсулированные остатки препарата.
Опытные образцы вакцин были антигенно-активными в течение всего 5.
периода наблюдения, иммунная реакция проявлялась на 7 день после вакцинации и достигала максимальных значений к 45 дню с момента иммунизации, стабильно удерживаясь в течение 3-х месяцев (срок наблюдения). Однако, инактивированная липосомальная вакцина обладала более выраженной антигенной активностью, индуцировала образование высокого уровня специфических антител, по сравнению с ГОА формолвакциной (P 0.01).
Определена иммунобиохимическая характеристика крови цыплят при 6.
применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза. Установлено, что в ответ на введение вакцин (липосомальной и ГОА формолвакцины) происходит нарастание общего белка (P 0,05), которое в основном достигалось за счт увеличения фракции гамма–глобулинов. При этом содержание гамма–глобулинов, а также титр специфических антител в сыворотке крови птиц вакцинированных инактивированной липосомальной вакциной были достоверно выше, чем при иммунизации ГОА формолвакциной (Р 0,05).
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Разработаны технические условия на инактивированную липосомальную 1.
вакцину против колибактериоза птицы, а также наставление по е применению.
Инактивированную липосомальную вакцину предлагается использовать 2.
для профилактики колибактериоза птиц в условиях птицехозяйств.
Результаты исследований по изучению иммунобиохимической 3.
характеристики крови птицы при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии, и кафедре биохимии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», а также в ветеринарной практике.
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Орехов Д.А. Применение формалина, теотропина и 1.
аминоэтилэтиленимина для инактивации возбудителя колибактериоза // Мат. 60-й науч. конф. молодых учных и студентов СПбГАВМ. – СПб, Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2006. – С. 84-85.
Орехов Д.А., Конопатов Ю.В., Сухинин А.А. Применение липосом при 2.
конструировании инактивированной вакцины против колибактериоза птицы // Ветеринарная медицина теория, практика и обучение: Мат. науч. практич. конф. – Спб., Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2006. – С. 22-24.
Орехов Д.А. Изготовление и лабораторные испытания инактивированной 3.
липосомальной вакцины против колибактериоза птиц // Ветеринарная медицина теория, практика и обучение: Мат. Втор. Всероссийской науч. практич. конф. – Спб., Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2007. – С. 52-55.
Орехов Д.А. Инактивация Escherichia coli аминоэтилэтиленимином // 4.
Мат. 61- й науч. конф. молодых учных и студентов СПбГАВМ. – СПб., Изд-во ФГОУ ВПО “СПбГАВМ”, 2007. – С. 64-66.
Орехов Д.А. Вакцинный препарат против колибактериоза птиц: Тезисы 5.
докл. научно-практич. конгресса ”Актуальные проблемы ветеринарной медицины”. - СПб. - 2007. - С. 164-166.
Орехов Д.А., Конопатов Ю.В., Сухинин А.А. Инактивированная 6.
липосомальная вакцина и гидроокись алюминиевая формолвакцина против колибактериоза птиц // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - №4. – С. 77-79.
Орехов Д.А., Конопатов Ю.В., Сухинин А.А., Рыбальченко О.В.
7.
Использование аминоэтилэтиленимина при конструировании липосомальной вакцины против колибактериоза птиц // Ветеринарная патология. - 2007. - №2. - С. 66-69.
Конопатов Ю.В., Сухинин А.А., Пилаева Н.В., Орехов Д.А.
8.
Иммунобиохимическая характеристика крови птиц при применении липосомальной вакцины против колибактериоза // Ветеринарная практика.
– 2007. - №2(37).- С. 22-26.
Сухинин А.А., Конопатов Ю.В., Орехов Д.А. Инактивированная 9.
липосомальная вакцина против колибактериоза птиц // Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы: Мат. науч. – практич. конф., посвящнной памяти академика Россельхозакадемии Р.Н. Коровина. – СПб.: ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии. ВВМ. – 2007. - С. 235-240.