Динамика ионного канала никотинового ацетилхолинового рецептора
На правах рукописи
Ли Аньбан МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА ИОННОГО КАНАЛА НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Специальность 03.00.02 -биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва – 2006
Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович
Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Крупянский Юрий Фёдорович (ИХФ им. Н.Н. Семёнова РАН) доктор химических наук, профессор Вржещ Пётр Владимирович (МБЦ МГУ им. М. В. Ломоносова)
Ведущая организация: Российский университет дружбы народов
Защита диссертации состоится " " 2006 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория “Новая”.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Автореферат разослан " " 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Т. Е. Кренделева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Ионные каналы представляют собой интегральные белки, находящиеся в липидном бислое мембраны и опосредующие транспорт ионов через мембрану. Вопросы их функционирования составляют ключевую проблему в биофизике мембранных процессов и имеют важное прикладное значение для современной биомедицины. Лиганд-зависимые ионные каналы (например, никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nicotinic acetylcholine receptors, nAChR), серотониновый рецептор (5-гидрокситриптамин, 5-НТ), глициновый рецептор, рецепторы -аминомасляной кислоты GABAA и GABAC), состоят в основном из пяти субъединиц и играют ключевую роль в передаче сигнала в нервной системе и нервно-мышечных соединениях..
Лиганд-зависимые ионные каналы функционально представляют собой интегральные белки канальной структуры, встроенные в липидную биомембрану и образующие пору. Они могут находиться в двух состояниях:
закрытом и открытом, и могут переходить из закрытого состояния в открытое состояние при присоединении молекул лигандов. Лиганд-зависимые каналы обладают свойствами селективной проводимости ионов и гейтингом – процессом активации проводимости (открывания) канала в ответ на соединение с лигандами. Экспериментально установлено, что процесс открывания лиганд-зависимых ионных каналов определяется конформационными изменениями каналов после связывания с лигандами.
nAChR мышечного типа наиболее подробно исследован, и трёхмерная структура трансмембранного домена рецептора, выделенного из электрического органа электрического ската Torpedo была определена в закрытом состоянии с разрешением 9, 4,6 и 4, а в открытом состоянии с разрешением 9.
Полученные трехмерные структуры дают возможность для более детального изучения взаимосвязи структуры и функции лиганд-зависимых ионных каналов с помощь методов компьютерного моделирования. Множество исследований (Сэнсом, Ру, Санкарарамакришнан) вычислительными методами уже проведены с использованием модели канала nAChR, в том числе некоторые исследования с использованием модели, основанной на определенной трёхмерной структуре. В то же время, пока еще нет исследований, проведенных методом управляемой молекулярной динамики, который можно использовать для изучения неравновесных процессов, например, процесса миграции ионов сквозь пору канала и процесса открытия ионного канала. В настоящее время актуальным является изучение процессов ионного транспорта и конформационных изменений, происходящих при функционировании канала nAChR методом управляемой молекулярной динамики.
-1 Целью работы является построение динамической модели функционирования канальной части ацетилхолинового рецептора на основе данных по трёхмерной структуре трансмембранного домена.
Постановка задачи.
Для достижения этих целей необходимо было поставить и решить следующие основные задачи:
Построить модель пентамерной структуры поры nAChR для исследования методом молекулярной динамики;
Провести изучение динамики заряженных и незаряженных частиц внутри канала методом управляемой молекулярной динамики и установить возможные области ворот канала;
Изучить влияние действия внешних сил и электростатических сил на прохождение частиц и конформацию канала;
Изучить влияние заряженных остатков на движение ионов;
Изучить возможный механизм открытия канала nAChR.
Научная новизна исследования В настоящей работе впервые методами управляемой молекулярной динамики определено положение ворот канала nAChR и проведена оценка энергического барьера для ворот канала, исследовано влияние заряженных остатков на поддержание стабильности канала и прохождение ионов через канал.
Также впервые использована новая методика для изучения механизма открытия канала, суть которой состоит в приложении внешних моментов сил к внеклеточным концам -М2 спиралей. Полученные результаты расчётов подтверждают гипотезу механизма открытия канала и позволяет понять детали процесса открытия канала, которые трудно выяснить экспериментально.
Теоретическое и практическое значение работы.
Данная работа посвящена изучению связи между структурой и функциями биомакромолекул, которая является одним из ключевых вопросов молекулярной биофизики. Изучение процесса прохождения ионов сквозь канал, определение положения ворот канала и механизма открытия канала могут быть полезны для выяснения детального механизма функционирования ацетилхолинового рецептора, а также других лиганд-зависимых рецепторов (глициновых рецепторов, рецепторов 5-HT, и рецепторов GABAA и GABAC). Выяснение детального механизма функционирования ацетилхолинового рецептора также может быть полезно при разработке новых лекарственных препаратов.
Достоверность результатов диссертации обеспечивается использованием универсальных законов и уравнений классической и квантовой механики и проведением тестовых расчётов систем, сравниваемых с экспериментальными -2 данными.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции «Ломоносов 2005» (Москва, 2005 г.), 3-ем съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005 г.), Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005 г.), Международной конференции «Ломоносов 2006» (Москва, 2006 г.). Доклады о результатах работы были представлены на семинарах кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ и 2 находятся в печати.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа ( страниц) состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (158 ссылки), иллюстрирована рисунками и содержит 3 таблицы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Функциональные и структурные особенности никотинового ацетилхолинового рецептора Эта глава посвящена обзору литературы по структуре и функциям, никотинового ацетилхолинового рецептора.
Мышечный nAChR наиболее подробно исследован. Он располагается в постсинаптических мембранах скелетных мышечных волокон позвоночных, в синапсах электрического органа электрического ската и обеспечивает быструю нейропередачу в синапсах никотиновых AChR. nAChR представляет собой 290-кДа гликопротеин, образованный 5 субъединицами (,,,, ). Он может быть подразделён на три домена: N-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен и относительно небольшой внутриклеточный домен.
Внеклеточный домен формируется из структурных внеклеточных частей всех пяти субъединиц, в этом домене находятся два сайта связывания лиганда.
Каждая цепь субъединицы пересекает мембрану четыре раза. Четыре -спиральных сегмента (M1, M2, M3, M4) всех пяти субъединиц формируют трансмембранный домен. Трёхмерная структура трансмембранного домена рецептора была определена в закрытом состоянии с разрешением 9, 4,6 и 4 и в Рис. 1. Структура трансмем бранного домена nAChR. Вид открытом состоянии с разрешением 9. Пять с внеклеточной стороны.
вторых -спиралей трансмембранного домена -3 (M2) формируют полость канала и играют роль как катион селективного фильтра, так и ворот канала. Другие сегменты (M1, M3, M4) формируют внешний цилиндр, отделяя спирали М2 от мембраны (рис. 1).
nAChR переходит из закрытого состояния в открытое при присоединении двух молекул лиганда. Сравнение структуры nAChR в закрытом и открытом состояниях показывает следующее. Ацетилхолин выбрасывается из пресинаптической мембраны в синаптическую щель и взаимодействует с сайтами рецептора постсинаптической мембраны, при этом внутренние -листы внеклеточного домена -субъединицы (A и D) поворачиваются [14].
Спирали M2 трансмембранного домена поворачиваются вокруг центральной оси канала по часовой стрелке на несколько градусов, что приводит к формированию открытого состояния канала. Хотя эти изменения в структуре канала известны, но детальный механизм процесса открытия канала до сих пор неясен.
Глава 2. Метод молекулярной динамики В этой главе представлен литературный обзор по методу молекулярной динамики и применению метода к изучению динамики биологических объектов.
Раскрыт смысли основных понятий: силовое поле, термостат, численное интегрирование, периодические граничные условия. Описаны особенности применения равновесной молекулярной динамики и неравновесной (или управляемой) молекулярной динамики (Steered Molecular Dynamics, SMD). В данной работе использован метод управляемой молекулярной динамики.
Глава 3. Молекулярная динамика канала nAChR и прохождения ионов сквозь канал nAChR Эта глава посвящена построению модели поры канала nAChR, описанию метода расчетов, и анализа результатов и изучению динамики функционирования ионного канала nAChR.
Построение модели поры канала nAChR Молекулярная структура поры канала nAChR в закрытом состоянии была взята из базы данных белковых структур (PDB ID: 1OED). Для построения модели были вырезаны пять трансмембранных сегментов M2, непосредственно участвующих в процессе переноса ионов. Использовалось полноатомное приближение. Для предотвращения концевых эффектов на C' концы цепей были добавлены остатки NME, на N' концы - остатки ACE. Таким образом, каждая из конечных цепей состояла из 34 остатков (рис. 2). Стабилизация канала осуществлялась с помощью углеводородного кольца из 105 остатков СН2.
-4 Рис. 2. Последовательность остатков М2-цепей в модели канала. Приведена нумерация остатков в цепях рецептора. Верхние числа соответствуют номерам остатков в цепи (принятым в PDB). Нижние числа приведены в соответствии с другой распространённой системой нумерации остатков в этом рецепторе (например, 9' соответствует остатку -LEU251). Жирным шрифтом указаны остатки LEU (15'), которые близки к добавленному стабилизирующему углеводородному кольцу.
Добавленные группы ACE и NME не указаны.
Были проведены исследования прохождения ионов и комплексов сквозь канал при различных условиях. Все расчёты были проведены с помощью программного комплекса ПУМА-Б с использованием метода управляемой молекулярной динамики, включающем в себя стандартный протокол молекулярной динамики, дополненный введением сил, действующих на ионы и комплексы (табл. 1).
Таблица 1 Протокол молекулярной динамики Параметр Значение Потенциальное поле AMBER Длина траектории при T=300 К до 2 нс Термостат столкновительный Масса виртуальных частиц в m=18 а.е.м столкновительном термостате v=55пс- Частота столкновений виртуальных частиц с атомами рассчитываемой системы Температура термостата 300К Температура релаксации в начальный период 300К расчёта Режим фиксации атомов включён Диэлектрическая проницаемость среды () варьировалась Радиус обрезания кулоновских Rel = взаимодействий Интервал обрезания для взаимодействий Rvdw = 15- Ван-дер-Ваальса 200200200 Кубическая периодическая ячейка Алгоритм численного интегрирования Верле -5 Метод определения начальных скоростей Генератор случайных чисел по атомов распределению Максвелла Шаг интегрирования 1 фс (0,1 фс в релаксации) Шаг записи в траекторный файл 0,1 пс Шаг записи файла контрольной точки 0,1 пс Сила, действующая на атом или комплекс Варьировалась Для того чтобы препятствовать отделению стабилизирующего углеводородного кольца и схлопыванию канала, глубина ям для леннард-джонсовского (ЛД) взаимодействия между крайним атомом углерода в остатках 15' (-LEU257) и соответствующим атомом кольца была увеличена до 5ккал/моль. Чтобы препятствовать чрезмерному сближению цепей в процессе расчёта, атомы углерода остатков ACE и NME фиксировались.
Пробная частица помещалась в центре верхней (близкой к внеклеточной) области канала. Таким образом, система имела следующий вид:
Рис. 3. Модель молекулы канала ацетилхолинового рецептора, включающей трансмембранных сегментов M2. Сферой обозначена пробная частица (ион Na+).
Показано также добавленное кольцо, содержащее 105 сегментов CH2. а: вид сверху с внеклеточной стороны. б: вид сбоку. Приведённая справа шкала отображает масштаб изображённой структуры. Высота канала примерно 45.
Использовались следующие пробные частицы: 1) незаряженные комплексы Na(H2O)6 и Cl(H2O)6, с ван-дер-ваальсовыми параметрами, эквивалентными иону натрия и атому хлора, формально гидратированных шестью молекулами воды (ван-дер-ваальсовый радиус 3,63 и 3,71, соответственно);
2) заряженные комплексы Na+(H2O)6 и Cl-(H2O)6, с ван-дер-ваальсовыми параметрами, эквивалентными ионам натрия и хлора, гидратированных шестью -6 молекулами воды (ван-дер-ваальсовый радиус 3,63 и 4,73, соответственно).
В процессе релаксации дополнительные силы к частицам не прикладывались. После релаксации к пробной частице прикладывалась внешняя сила F вдоль нормали к мембране (координата z) с внеклеточной во внутриклеточную сторону.
Движение частиц в канале под действием внешней силы Проведен ряд вычисленных экспериментов, в которых к частицам прикладывались различные внешние силы.
Кинетика прохождения незаряженной пробной частицы сквозь пору канала представлена на рис. 4. Под действием внешней силы F=1ккал/(моль) незаряженные комплексы Na(H2O)6 и Cl(H2O)6 застревают в канале, в области с координатой z86.
а б Рис. 4. Миграция незаряженных комплексов Na(H2O)6 и Cl(H2O)6 сквозь пору канала ацетилхолинового рецептора. Знак «-» обозначает направление сил вдоль нормали к мембране (координата z) с внеклеточной стороны во внутриклеточную сторону.
Рассмотрение структуры канала показывает, что в этой области находятся остатки 13' – A-VAL255, B-VAL261, C-Val269, D-VAL255 и E-ILE264, которые образуют незаряженное кольцо, формирующее ван-дер-ваальсовские ворота канала. Прохождение пробной частицы оказывается невозможным из-за стерических препятствий, так как диаметр гидратированных иона натрия и хлора превышает диаметр канала в этой области координат (~6 при z86 ).
Увеличение внешней силы до 2ккал/(моль) приводит к пробою области ворот, хотя наблюдается заметное торможение пробной частицы в области z86 на время около 20 пс. Дальнейшее увеличение внешней силы приводит к уменьшению времени прохождения частицы через канал и полному исчезновению торможения частицы в области z86 при F=5ккал/(моль).
Торможение частиц в канале происходит вследствие наличия локальных энергетических минимумов (ловушек), отделенных от соседних состояний барьером, создаваемым воротами канала. Данные по кинетике прохождения -7 изучаемого комплекса области ворот показывают, что крутизна энергического барьера ворот составляет около 2ккал/(моль·). С другой стороны, это означает, что энергетический профиль ворот канала весьма чувствителен к внешним воздействиям и ворота могут быть открыты под действием относительно небольшой силы, приложенной, в частности, к верхним остаткам М2 спиралей -субъединицы (cм. главу 4).
Положительно заряженный комплекс Na+(H2O)6 притягивается к отрицательно заряженным остаткам ASP или GLU, находящим в положении 20’ и 24’, что препятствует прохождению иона при значениях внешней силы до 10ккал/(моль) (рис. 5а). Однако при силе больше 11ккал/(моль), он успешно проходят через канал. При прохождении частицы наблюдается торможение в области z86 на время порядка 10 пс. Дальнейшее увеличение внешней силы (до значений 18-20ккал/(моль)) приводит к существенному уменьшению времени прохождения частицы через канал (менее 20пс) и полному исчезновению торможения частицы в области z86.
Отрицательно заряженный комплекс Cl-(H2O)6 не двигается вдоль оси канала, а выходит поперек канала, пока приложенная внешняя сила не достигнет величин более 5ккал/(моль) (на рис. не показано). Комплекс Cl-(H2O)6 начинает проходить через канал, но затем притягивается к остатку A-LYS242 (0’) (внешняя сила F= 5ккал/(моль). Когда внешняя сила больше 6ккал/(моль), связь между комплексом Cl-(H2O)6 и остатком A-LYS разрушается, и комплекс проходит сквозь канал (рис. 5б).
а б Рис. 5. Миграция заряженных комплексов Na+(H2O)6 и Cl-(H2O)6 сквозь пору канала ацетилхолинового рецептора.
Приведенные выше данные показывают, что в закрытом состоянии торможение ионов в канале происходит за счёт двух составляющих:
стерических препятствий и электростатических взаимодействий иона с заряженными боковыми группами. Стерические препятствия формируют энергический барьер ван-дер-ваальсовских ворот с крутизной не более -8 2ккал/(моль·). Функция зарядовой селективности канала выполняется за счет электростатических сил притяжения и отталкивания между ионами и отрицательно заряженными остатками ASP и GLU, находящимися в верхней области канала (20' и 24'). Барьеры, сформированные за счет электростатических взаимодействий с заряженными боковыми группами аминокислотных остатков имеют в закрытом состоянии канала существенно большую крутизну - около 8-9ккал/(моль).
Влияние диэлектрической проницаемость среды на динамику прохождения комплекса.
Так как динамика прохождения ионов через канал наиболее чувствительна к электростатическим взаимодействиям, проводилась серия численных экспериментов при разных значениях диэлектрической проницаемости.
Характерно, что увеличение диэлектрической проницаемости (и ослабление вклада электростатических взаимодействий) приводит к увеличению проницаемости канала. Кинетика прохождения заряженной частицы Na+(H2O) сквозь пору канала при различных представлена на рис. 6. Крутизна энергетического барьера, вызванного вкладом электростатических взаимодействий, уменьшается в ряду 11, 5, 3, 2 и 3 ккал/(моль·) при увеличении значений диэлектрической проницаемости соответственно = 1, 2, 3, 4 и 5. На рис.6 видно заметное уменьшение критического значения силы для преодоления ворот канала при переходе от =1 к =2, связанное с ослаблением электростатических взаимодействий между катионом и отрицательно заряженными остатками. На рис. 7 показана кинетика прохождения Na+(H2O) сквозь пору nAChR под действием внешней силы F=5ккал/(моль·) при разных значениях. Видно заметное уменьшение времени прохождения комплекса при переходе от =2 к =3. Дальнейшее увеличение диэлектрической проницаемости среды приводит к сильному ослаблению (=3, 4) и полному исчезновению (=5) вклада электростатических взаимодействий в кинетику прохождения катиона через канал. Весьма показательно, что расчёты, проведенные для аниона хлора в канале глицинового рецептора, дают сходные результаты для влияния значений диэлектрической проницаемости среды на проницаемость канала.
-9 Рис. 6. Динамика прохождения комплекса Na+(H2O)6 сквозь пору nAChR под действием внешней силы F=5ккал/(моль·) при разных значениях диэлектрической проницаемости.
Отметим, что степень ионизации отрицательно заряженных остатков, расположенных при входе в канал, зависит от рН среды и может влиять на работу канала. Если отрицательно заряженные остатки, расположенные в начальной области канала не полностью ионизированы, то результаты моделирования с ослабленным кулоновским взаимодействием более соответствуют реальной ситуации. Т.е. сила, необходима для преодоления электростатических взаимодействии между заряженными боковыми группами с заряженным комплексом Na+(H2O)6, может составлять менее 8-9ккал/(моль).
Изменение эффективного радиуса канала было определено с помощью программного пакета HOLE. На рис. 7 приведен радиус канала в разные моменты времени при разных значениях. Согласно этим данным радиус внеклеточного входа в канал составляет около 6. Радиус средней части канала равен приблизительно 3. Канал наиболее узок в области с координатой z82, которая соответствует воротам канала. В этой области находятся остатки 13', которые образуют незаряженное кольцо, которое, по-видимому, и формирует ван-дер-ваальсовские ворота канала.
а б - 10 в г Рис. 7. Проекция эффективного радиуса канала nAChR на ось в моментах времени =1пс, =200пс, =400пс и =600пс при значении диэлектрической проницаемости =1 (а), =2 (б), =3 (в) и =4 (г).
Как видно из рисунков, при значении диэлектрической проницаемости = радиус канала немного уменьшается в верхней области (с координатой z=85-100) и нижней области (с координатой z 60-75), но радиус канала в средней области изменяется относительно мало. В других случаях с при увеличении значения радиус канала флуктуирует с большей амплитудой. Так, радиус канала в области с координатой z6070 может становиться менее 1.
Рассмотрение структуры канала в разные моменты времени показывает, что при увеличении значения боковые цепи остатков, выстилающих внутреннюю поверхность поры канала, самостоятельно выдвигаются к центру поры канала, что и вызывает уменьшение радиуса канала. Можно полагать, что кулоновское отталкивание играет существенную роль в стабилизации конформации канала.
Динамика множественного прохождения Na+(H2O)6 сквозь канал.
Для выяснения взаимного влияния ионов при прохождении через канал ацетилхолинового рецептора проводились следующие вычислительные эксперименты. Во внеклеточную область канала nAChR помещались одновременно шесть заряженных комплексов Na+(H2O)6, к которым прикладывались одинаковые внешние силы F, направленные с внеклеточной стороны во внутриклеточную сторону. Как и в случае единичного иона при внешней силе менее 5ккал/(моль·), ни один комплекс Na+(H2O)6 не проходит сквозь канал nAChR. Наблюдается притяжение к отрицательно заряженным остаткам ASP и GLU (всех шести катионов при значениях силы до 2ккал/(моль·), четырёх катионов – при 4ккал/(моль·)). Однако при внешней силе 5ккал/(моль·) один из ионов проходит через канал (рис. 8а). При большем значении силы число ионов, прошедших через канал возрастает (2 при 7ккал/(моль·) – рис. 8б, 3 при 9ккал/(моль·) и 4 при 11ккал/(моль·)).
- 11 а б + Рис. 8. Динамика движения комплексов Na (H2O)6 в поре канала nAChR под действием внешней силе F=5ккал/(моль·) (а) и F=7ккал/(моль·) (б).
Сравнение кинетики миграции ионов (рис. 8 и рис. 5) показывает, что кулоновский энергический барьер при прохождении положительно заряженных частиц уменьшается при одновременном присутствии нескольких положительно заряженных частиц в канале. Это обусловлено экранированием отрицательно заряженных остатков и сглаживанием энергетического профиля для иона в канале.
Глава 4. Механизм открытия канала nAChR Механизм открытия канала nAChR до сих пор не вполне ясен. Открытым остается вопрос о том, как вращения -листов внеклеточного домена -субъединиц передаются на трансмембранные -спирали M2, и каким образом поворот -спиралей вызывает открытие поры канала. Предполагается наличие в -субъединицах между изгибами 1/2 (которые располагаются между -листами 1 и 2 и находятся прямо над C’ концом спиралей М2) внеклеточного домена и концами спиралей М2 трансмембранного домена структуры типа “разъема” (pin-socket) – внеклеточный концевой остаток -VAL46 (-VAL44 в AChBP) внеклеточных изгибов 1/2 входит в карман, образованный -SER269-PRO272 (остатки между М2 и М3) в трансмембранном домене. Таким образом, поворот внеклеточных -листов передается на трансмембранные -М2 сегменты и вызывает вращение всех М спиралей кооперативно, что и приводит к открытию канала.
Хотя такой механизм теоретически возможен, до сих пор нет его экспериментальных подтверждений. Чтобы изучить механизм открытия канала, в данной работе произведен ряд расчетов, моделирующих возможные взаимодействия между изгибами 1/2 и внеклеточными концами -М спиралей (и возможные процессы открытия канала nAChR). Использована такая - 12 же модель канала nAChR и такие же параметры расчетов, как и в главе 3. Как и в проведённых расчетах в главе 3, вначале частица помещалась в центр верхней (близкой к внеклеточной) области канала. Кулоновские эффекты в данной работе не рассматривались, а изменение просвета канала отслеживалось по прохождению незаряженного комплекса радиуса 3,63А сквозь пору канала.
После релаксации (1пс) к частице прикладывалась внешняя сила F=1ккал/(моль·) вдоль оси нормали мембраны, под действия которой комплекс не проходит через канал в закрытом состоянии (см. рис. 4а).
Для моделирования возможных воздействий внутренних изгибов 1/ внеклеточного домена -субъединиц на верхние остатки -M2 спиралей были добавлены следующие типы внешних сил (после релаксации):
К атомам CT остатков -SER269 и -ALA270 (цепей A и D), которые находятся на верхнем (внеклеточным) конце -M2 спиралей, прикладывались силы, вдоль нормали канала к мембране (координата z) с внутриклеточной стороны во внеклеточную сторону (выдвигающими спирали наверх) (рис. 9а). Ниже обозначены «I».
К атомам CT остатков -SER269 и -ALA270 (цепей A и D), прикладывались вращающие моменты сил (F=1ккал/(моль)), поворачивающие -М2 спирали вокруг оси канала, направленные по часовой стрелке и против часовой стрелки (рис. 9б, на котором показаны только моменты сил, направленные по часовой стрелке).
Ниже обозначены «II» и «III».
К атомам CT остатков -THR267, -SER268, -SER269 и -ALA (цепей A и D), прикладывались вращающие моменты сил (F=1ккал/(моль)), поворачивающие -спирали против часовой стрелки относительно оси («закручивание» спирали) и по часовой стрелке относительно оси («вывинчивание» спирали) (рис. 9в, на котором показаны только моменты сил, направленных против часовой стрелки относительно оси.). Ниже обозначены «IV» и «V».
- 13 Рис. 9. Схема приложенных внешних сил при моделировании канала nAChR на модели.
Стрелками показано направление приложенных сил.
В контрольном эксперименте, в котором к незаряженному комплексу прикладывалась внешняя сила F=1ккал/(моль·), а к атомами спиралей не прикладывались силы, прохождение комплекса оказывалось невозможным из-за стерических препятствий (рис. 4а, а также кривая «0» на рис. 10). Аналогичная ситуация возникала и в численных экспериментах под действием моментов сил, приложенных к спиральным участкам и направленных по часовой стрелке вокруг оси канала («III»), а также вокруг осей -М2 спиралей («V»). В этих случаях комплекс застревает в канале, в области с координатой z (результаты не показаны).
В других трёх расчётах («I», «II» и «IV») комплекс вначале тормозился в области z86, но через некоторое время продолжал движение сквозь пору.
Далее частица ненадолго задерживалась в области z75, и после этого успешно проходила через канал (за суммарное время 340, 480 и 480пс в расчётах «I», «II» и «IV», соответственно). Кинетика прохождения незаряженного комплекса сквозь пору канала представлена на рис. 10.
- 14 Рис. 10. а: молекулярная структура канала в момент времени =200пс после приложения внешней действия. Пробная частица показана шариком. Остатки 13' изображены с боковыми цепями. б: Кинетика перемещения незаряженного комплекса (3,63А) в канале nAChR под действием F=1ккал/(моль•). 0 – в контрольном расчёте, к спиралям не прикладывалось никаких внешних сил;
значение «I», «II» и «IV» – см.
объяснения в тексте.
Радиус канала в момент времени t=400пс приведен на рис. 11а. Как видно, радиус канала в расчёте с моментом сил, приложенным против часовой стрелки относительно оси -М2 спиралей («IV») отличается от других случаев: радиус в области с координатой z=8285 заметно больше, чем в других случаях.
Усредняемое изменение радиуса канала в области значений z=8285, что соответствует воротам канала, приведено на рис. 11б. Изменения радиуса канала при разных стартах в начальные 200пс качественно похожи. Радиус ворот канала в численных экспериментах с моментом сил, направленным против часовой стрелки относительно оси («IV»), составляет около 2,75 (от 2,2 до 2,8). Радиус ворот канала в контрольном расчёте («0») монотонно уменьшался (менее 1,5 после т=600пс). В других двух расчётах («I» и «II») после т=400пс, радиус ворот канала составлял 1,52,6, – Хотя в момент прохождения иона радиус ворот канала в этих двух расчётах составлял более 2,8 (рис. 10). По-видимому, значение 2,8 для радиуса ворот канала – критическое для прохождения комплекса через канал. Можно предположить, что большие частицы могут проходить через канал только в случае, в котором прикладывались моменты сил, поворачивающие -спирали против часовой стрелки относительно оси («IV»), и не могут проходить в двух других случаях («I» и «II») б а Рис. 11. а: Проекция эффективного радиуса канала nAChR на ось в моменты времени =400пс. б: Изменение радиуса канала в области значений z=8285. Обозначения «0», «I», «II», «IV» – как на рис. 10.
- 15 Отметим, что радиусы ворот канала, даваемые программой HOLE – 2,7-2,8 – оказываются заниженными по сравнению с радиусом проникающей сферы в МД эксперименте (3,63). Это обусловлено двумя факторами.
Программа HOLE использует тяжелоатомное силовое поле AMBER84 (в МД экспериментах мы используем полноатомное силовое поле AMBER99). Второй фактор связан с динамическими эффектами деформации поры канала (т.е.
частица расталкивает окружающие атомы в поре канала).
Изменение конформации в области ворот канала в моменты времени т=600пс и т=1пс показаны на рис. 12. В расчёте с моментом сил, направленным против часовой стрелки относительно оси («IV»), главные цепи A, B, C и D поворачиваются по часовой стрелке вокруг центральной оси канала и выдвигаются чуть наружу. Главная цепь E поворачивается против часовой стрелки и отклоняется к центру канала. Все спирали двигаются кооперативно, таким образом, ворота канала открываются. Результат хорошо коррелирует с наблюдаемой в эксперименте изменением конформации канала при переходе в открытое состояние.
Динамика канала в других расчётах («III» и «V» не показаны, «0», «I» и «II» показаны на рис. 12) существенно отличается. Спирали выдвигались по-разному, радиус канала значительно уменьшался, симметричность расположения цепей в области ворот нарушалась, и конформация канала изменялась на менее благоприятную для прохождения иона.
Рис. 12. Конформация ворот канала в расчётах. Верхний ряд: сравнение конформаций остатков 12’, 13’ и 14’ в моменты времени т=1пс (боковые цепи остатков показаны серыми тонкими линиями) и т=600пс (боковые цепи остатков показаны черными толстыми линиями) в расчётах «0», «I», «II» и «IV». Нижний ряд: остатки 12’, - 16 13’ и 14’ в моменты времени т=600пс в расчётах «0», «I», «II» и «IV», показаны ван-дер-ваальсовыми шариками. Обозначения «0», «I», «II» и «IV» – так же на рис. 10.
Таким образом, только в случае, когда к верхним (внеклеточная сторона) остаткам -М2 спиралей прикладывают моменты сил, направленные против часовой стрелки относительно оси, остатки 13’, которые формируют ворота канала, и их соседние остатки – 12’ и 14’ – двигаются кооперативно и вызывают открытие канала. Это подтверждает гипотезу о механизме открытия канала за счет передачи вращательного момента на верхние остатки -M2 (субъединиц A и D) в результате конформационных изменений внеклеточного домена после связывания лиганда. Конформационные изменения -М2 спиралей в процессе открытия канала передаются только за счёт вращательного движения петли 1/2 внеклеточного домена относительно оси, направленного против часовой стрелки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе были поставлены задачи построения модели переноса частиц в поре лиганд-зависимого ионного канала – никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR), изучения свойств ворот канала и возможного механизма открытия канала nAChR при прохождении частиц в поре канала. На основе проведенных численных экспериментов определено нахождение ворот канал, оценен энергический барьер ворот и подтверждена гипотеза об открытии канала за счёт поворота М2 спиралей субъединиц.
На основе экспериментально определенной трёхмерной структуры трансмембранного домена nAChR построена упрощенная модель поры канала, состоящая из пяти -спиральных М2 участков, которые непосредственно формируют пору канала и взаимодействуют с проходящими ионами. Для стабилизации канала на пентамерную структуру было одето углеводородное кольцо, состоящее из 105 остатков СН2.
Показано, что остатки 13' – A-VAL255, B-VAL261, C-VAL269, D-VAL255 и E-ILE264, находящиеся в области с координатой z82, по-видимому, формируют ван-дер-ваальсовые ворота канала. Катион Na+(H2O)6 притягивается к отрицательно заряженным остаткам ASP и GLU. Барьеры, сформированные за счет электростатических взаимодействий с заряженными боковыми группами аминокислотных остатков, имеют в закрытом состоянии канала существенно большую крутизну - около 8-9ккал/(моль). Редукция электростатических взаимодействий облегчает прохождение катиона, хотя и уменьшает конформационную стабильность канала.
В работе также впервые использована новая методика для изучения - 17 механизма открытия канала, в которой внешние моменты сил прикладываются на внеклеточные концы -М2 спиралей, что приводит в конечном итоге к открытию канала. Анализ изменений радиуса канала и конформации ворот канала показывает, что ворота канала nAChR открываются только под действием момента сил приложенного на внеклеточные концы -М2 спиралей и направленного против часовой стрелки относительно оси. Это показывает каким образом изгибы 1/2 могут действовать на -М2 спирали и демонстрирует детальный механизм процесса открытия канала. Наши данные подтверждают гипотезу о механизме открытия канала за счет передачи вращательного момента на верхние остатки -M2 (субъединиц A и D) в результате конформационных изменений внеклеточного домена после связывания лиганда. Рецепторы, входящие в семейство лиганд-зависимых ионных каналов, возможно, работают по одинаковому механизму.
На основании вышеизложенных результатов можно сделать следующие выводы.
ВЫВОДЫ 1. Остатки 13' – A-VAL255, B-VAL261, C-VAL269, D-VAL255 и E-ILE264, находящиеся в области с координатой z82 в канале nAChR, образуют незаряженное кольцо, которое и формирует главные ван-дер-ваальсовые ворота канала.
2. Крутизна ван-дер-ваальсовского энергического барьера, создаваемого остатками 13’, составляет меньше 2ккал/(моль·). Больший энергический барьер создают отрицательно заряженные остатки GLU и ASP, которые располагаются в верхней области канала и играют роль электростатического фильтра, отбирающего положительно заряженные ионы.
3. Стабильная конформация канала поддерживается кулоновским отталкиванием между отрицательно заряженными остатками.
4. При одновременном присутствии нескольких положительно заряженных ионов в канале, электростатический барьер для прохода ионов уменьшается.
Например, для комплекса Na+(H2O)6, с 11ккал/(моль·) до 5ккал/(моль·).
5. Ворота канала открываются при действии момента сил, направленного против часовой стрелки относительно оси (сила прикладывалась к верхним остаткам M2). Это подтверждает гипотезу о механизме открытия канала за счет передачи вращательного момента на верхние остатки -M2 (субъединиц A и D) в результате конформационных изменений внеклеточного домена после связывания лиганда. Рецепторы, входящие в семейство лиганд-зависимых ионных каналов, возможно, работают по одинаковому механизму.
- 18 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ли Аньбан – Динамика прохождения ионов и гидратированных комплексов сквозь мембрану гетеромерного ацетилхолинового рецептора, состоящего из ТМ2 фрагментов // Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2005».
М.:МГУ. -2005. –Т. 2. – С. 23.
2. Шайтан К.В., Терешкина К.Б., Турлей Е.В., Левцова О.В., Ли А., Голик Д.Н.
– методы управляемой динамики для молекулярного дизайна сложных мембранных структур // Материалы третьего съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Макс Пресс, Москва, 2005. – С. 3. Ли А-Б., Терёшкина К.Б., Шайтан К.В. – Механизм открытия канала ацетилхолинового рецептора // Сборник тезисов международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», Москва, 2005. – С. 4. Ли Аньбан – Моделирование открытия канала никотинового ацетилхолинового рецептора // Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2006».
М.:МГУ. -2006. – Т. IV. – С. 56.
5. Шайтан К.В., Турлей Е.В., Голик Д.Н., Терешкина К.Б., Левцова О.В.,Федик И.В., Шайтан А.К., Ли А., Кирпичников М.П.. – Динамический молекулярный дизайн био- и наноструктур // Российский химический журнал. – 2006.2. – Т. L. – С. 53- - 19