Растворение белковых агрегатов с помощью полиэлектролитов
На правах рукописи
СЕМЕНЮК Павел Игоревич РАСТВОРЕНИЕ БЕЛКОВЫХ АГРЕГАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ 03.01.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва, 2013
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич
Официальные оппоненты: Левицкий Дмитрий Иванович доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им.
А.Н. Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией Лозинский Владимир Иосифович доктор химических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н.
Несмеянова Российской академии наук, заведующий лабораторией
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук
Защита диссертации состоится « » декабря 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.
Автореферат разослан « » 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Одной из важных задач современной биохимии и биотехнологии является разработка подходов к подавлению белковой агрегации, а также поиск путей разрушения уже сформировавшихся белковых агрегатов различных типов. Необходимость перевода белка в растворимую ренатурированную форму из агрегатов приобрела особое значение в последнее время, поскольку многие рекомбинантные белки, продуцируемые в бактериальных клетках, образуют нерастворимые тельца включения (Carri and Villaverde, 2002).
Не меньший интерес представляют подходы к растворению амилоидных агрегатов, образующихся в нервных тканях при нейродегенеративных заболеваниях (Ashe and Aguzzi, 2013;
Kalia et al., 2013;
Kazantsev and Kolchinsky, 2008).
Существующие методы разрушения телец включения и подавления их образования недостаточно эффективны и требуют индивидуального подхода к каждому белку (Burgess, 2009;
Singh and Panda, 2005). Так, введение в последовательность белка точечных мутаций, приводит к некоторому увеличению доли растворимой формы, но не решает проблему в целом (Ventura, 2005). Еще одним перспективным подходом для решения обоих типов задач считалось использование шаперонов (Swietnicki, 2006;
Ben-Zvi and Goloubinoff, 2001). Однако существование большого числа разных шаперонов, обладающих различным, а иногда и противоположно направленным действием, и сложность одновременной экспрессии в клетках шаперонов и целевых белков не позволили разработать эффективные подходы для растворения телец включения.
Следует также отметить, что изучение белок-полиэлектролитных взаимодействий становится в последнее время все более актуальным. Это обусловлено большим потенциалом полиэлектролитных комплексов для решения целого ряда задач, таких как создание функциональных нанокомплексов и иммобилизация белков. Одним из возможных приложений может стать как раз борьба с белковой агрегацией (Shalova et al., 2005;
Stogov et al., 2010).
Цель работы. Установление механизма растворения белковых агрегатов с помощью полиэлектролитов.
Были поставлены следующие задачи:
исследование механизмов взаимодействия полианионов со свободными белками и факторов, влияющих на этот процесс;
сравнение особенностей взаимодействия с белками полианионов, содержащих различные заряженные группы, а также их влияния на тепловую агрегацию связанного белка;
тестирование ряда синтетических полиэлектролитов на способность к растворению различных типов белковых агрегатов – аморфных и амилоидных телец включения, а также агрегатов, образованных в результате термоиндуцированной денатурации;
Научная новизна. Все полученные в работе результаты являются принципиально новыми либо расширяют уже имеющиеся представления.
Так, впервые показано, что полифосфаты менее прочно связываются с белком, чем полисульфоанионы, и вследствие этого не оказывают, в отличие от полисульфоанионов, денатурирующего воздействия на его структуру. Тем не менее, они способны практически полностью подавлять белковую агрегацию, хотя и менее эффективно, чем сульфосодержащие полианионы.
Детально исследован механизм взаимодействия полианионов с белком. Обнаружено, в частности, что связывание полисульфоанионов происходит в два этапа. При небольших величинах молярного соотношения полианион/белок не наблюдается значительных изменений в структуре белка, но при большом избытке полисульфоанионов начинается дополнительное взаимодействие, приводящее к денатурации связанного белка.
Впервые показана возможность растворения белковых агрегатов различных типов (как аморфных, так и амилоидных телец включения и агрегатов, образующихся в результате тепловой денатурации) синтетическими полисульфоанионами. Изучено влияние степени полимеризации полианиона и его гидрофильности на эффективность растворения агрегатов. Предложен возможный механизм исследуемого процесса. Предложенный способ позволил значительно снизить амилоидные свойства агрегатов овечьего приона, а в случае агрегатов, образованных в результате термоиндуцированной агрегации, удалось добиться не только растворения, но и значительного восстановления активности белка.
Научно-практическая значимость работы. Разрабатываемый в работе подход к борьбе с агрегацией может быть применен как в биохимии, так и в биотехнологии. Отдельно стоит отметить возможность применения предложенного подхода для растворения уже сформированных агрегатов, поскольку по сей день не существует универсального метода решения этой проблемы. Кроме того, полученные результаты могут быть в перспективе использованы в медицине, в частности, для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, связанных с образованием телец включения в нервных тканях. Наконец, выявленные закономерности взаимодействия полиэлектролитов с белками, помимо прикладного значения (к примеру, для создания белок-полиэлектролитных нанокомплексов), имеют чисто научное значение, в частности, для понимания механизмов функционирования клетки и ее систем регуляции.
Апробация работы проведена на совместном заседании лаборатории молекулярной организации биологических структур, лаборатории ферментных систем, лаборатории инженерной энзимологии, лаборатории молекулярной инженерии и лаборатории молекулярной генетики Института биохимии им. А.Н. Баха РАН 3 октября 2013 года. Кроме того, результаты работы были представлены на следующих конференциях: The EMBO Meeting (Амстердам, Нидерланды, 2013), Biocatalysis- (Москва, 2013), 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress (Севилья, Испания, 2012) и X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2011).
Результаты работы отмечены стипендией Президента Российской Федерации молодым ученым, осуществляющим перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской экономики (2013 – 2015), стипендиями МГУ имени М.В.Ломоносова молодым преподавателям и научным сотрудникам, добившимся значительных результатов в преподавательской и научной деятельности (2012, 2011) и премией им. А.Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В.
Ломоносова (2012).
Публикации. По материалам работы опубликовано 7 печатных работ, включая 2 статьи в рецензируемых научных журналах и 5 тезисов докладов на международных конференциях.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 106 страниц машинописного текста, в том числе 27 рисунков. Список литературы включает источников.
Список используемых в тексте сокращений, не являющихся общепринятыми: GFP – зеленый флуоресцентный белок, PrP – прионный белок, ГАФД – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ДС – полисульфат декстрана, ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия, – динамическое ДСР светорассеивание, ИТК – изотермическая титрационная калориметрия, КД – круговой дихроизм, ПВС – поли(винилсульфат), ПСС – поли(стиролсульфонат), индекс около аббревиатуры полимера означает количество заряженных групп в цепи, ПФ – полифосфат, ТВ – тельца включения.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы В данном разделе рассмотрены особенности межполиэлектролитных взаимодействий и способов их регуляции, а также основные области практического применения полиэлектролитов и их комплексов с белками в биохимии, медицине и биотехнологии.
Материалы и методы В качестве модельного белка в первой части исследования, касающейся взаимодействия полиэлектролитов с нативным белком, использовали глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу ГАФД, выделенную из скелетных мышц кролика по методу Скоупса (Scopes and Stoter, 1982).
Для второй части исследования были выбраны тельца включения GFP и овечьего прионного белка VRQ, а также аморфные агрегаты ГАФД, полученные в результате нагревания фермента до 60°С и последующей агрегации. Экспрессию ТВ GFP и прионного белка проводили в культуре E.coli BL21 (DE3), трансформированной плазмидой pET-19b и pET-22b(+) (Novagen), соответственно. Синтез белков индуцировали добавлением IPTG и проводили в течение ночи, затем клетки отделяли центрифугированием. После лизиса ТВ отмывали, последовательно осаждая нерастворимую фазу и ресуспендируя ее в 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0. Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) и спектрофотометрически, растворяя ТВ гидрохлоридом гуанидиния. Чистоту препаратов используемых белков проверяли с помощью электрофореза по Лэммли (Laemmli, 1970).
Структурные формулы и степени полимеризации (n) использованных в работе полиэлектролитов приведены на Рис. 1.
Концентрации полиэлектролитов выражали в молярных концентрациях заряженных групп.
Рис. 1. Структурные формулы использованных полиэлектролитов.
Взаимодействие полианионов с нативной формой ГАФД исследовали с помощью изотермической титрационной калориметрии (ИТК, использовался прибор VP-ITC, Mictocal). Кажущиеся значения констант связывания определяли из молярного отношения количества заряженных групп полианиона к белку, при котором половина белка связана с полианионом. Кроме того, с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК, калориметр ДАСМ-4, Биоприбор) была проанализирована возможность образования комплексов при различных концентрациях соли. Изучение влияния различных полианионов на структуру ГАФД проводили с помощью ДСК, измерения спектров КД в ближнем ультрафиолете (Chiroscan, Applied Photophysics) и измерения ферментативной активности ГАФД. Помимо этого, измеряли размер комплексов с помощью ДСР с использованием установки ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments).
Для изучения влияния полиэлектролитов на тепловую агрегацию ГАФД вносили аликвоту белка в прогретый до 60°С раствор полиэлектролита и фиксировали прирост оптической плотности раствора при 320 нм после инкубации в течение 5 минут. Полученные значения делили на аналогичную величину для свободного белка с той же концентрацией. Использовался спектрофотометр DW-2000 (SLM Aminco Instruments).
За динамикой растворения агрегатов следили с помощью ДСР, титруя суспензию агрегатов титровали полианионом и измеряя размер частиц. На основе полученных данных определяли концентрацию полианиона, необходимую для растворения агрегатов. Для дальнейшего анализа растворимые комплексы отделялись центрифугированием.
Наличие белка в растворимой фазе проверяли отдельно с помощью электрофореза и вестерн-блота.
Наличие амилоидных свойств и их изменение в результате растворения ТВ овечьего приона оценивали с помощью окрашивания тиофлавином Т и Конго красным.
Результаты и их обсуждение В первой части работы были исследованы особенности взаимодействия ГАФД с полианионами, содержащими различные заряженные группы, и их влияние на структуру белка. Для этих целей были выбраны гидрофильные анионы ПФ и как гидрофильные (ДС), так и гидрофобные (ПСС) полисульфоанионы близкой степени полимеризации.
С помощью титрационной калориметрии было показано, полианионы обоих типов активно связываются с ГАФД, однако тепловой эффект связывания белка с ПСС значительно выше по сравнению с ПФ и ДС (Рис. 2). Значения кажущихся констант ассоциации, определенные на основе первой части изотермы связывания (слева от стрелки на Рис. 2), составили 60,3 ± 5,2 мМ-1 для ПСС77, 49,0 ± 4,0 мМ-1 для ДС95 и 21,1 ± 4, мМ-1 для ПФ155, то есть оба полисульфоаниона (обладающий наибольшим сродством к белку ПСС и гидрофильный ДС) связываются с ГАФД сильнее, чем ПФ. Важное различие результатов титрования заключается в выраженном двухстадийном выделении тепла при взаимодействии ГАФД с гидрофобным ПСС (Рис. 2, справа от стрелки).
Рис. 2. Результаты изотермического калориметрического титрования раствора ГАФД полианионами.
А. Исходные данные титрования фермента полианионом ПСС77.
Б. Зависимости теплового эффекта каждой инъекции от достигнутого молярного соотношения полианиона к белку: ПСС77 (кривая 1, квадраты), ДС95 (кривая 2, ромбы) и ПФ (кривая 3, круги). Исходные концентрации ГАФД в ячейке и полианионов в шприце составляли 0,6 мг/мл (4,2 мкМ) и 1,4 мМ соответственно. 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,5.
Далее было изучено влияние полианионов на структуру и свойства связанного белка. Было показано, что, в отличие от прочно связанных с белком цепей ПСС, более чем в 20 раз снижающих ферментативную активность ГАФД, цепи ПФ на нее практически не влияют (данные не представлены). Учитывая, что гидрофильный ДС также не ингибирует активность ГАФД (Stogov et al., 2010), можно предположить, что денатурирующий эффект ПСС определяется, прежде всего, его гидрофобной природой. Кроме того, при взаимодействии ПСС с ГАФД образовывались комплексы с гидродинамическим диаметром 24 – 28 нм, в то время как добавление ПФ не приводило к изменению размера частиц (данные не представлены). Подобное многократное увеличение размера частиц связано, по-видимому, с денатурацией белка и последующим образованием комплексов, содержащих несколько молекул белка.
Выявленные различия между воздействием анионов ПФ и ПСС на ГАФД были подтверждены с помощью ДСК (Рис. 3). Было показано, что эффект, оказываемый ПФ на структуру белка (Рис. 3, A), значительно ниже, чем эффект ПСС, которые при тех же условиях практически полностью денатурирует белок (Рис. 3, Б). Промежуточная картина наблюдалась для ДС: с одной стороны, он не вызывает денатурацию ГАФД до нагрева (Stogov et al., 2010) из-за отсутствия гидрофобных участков, с другой – в присутствии ДС температура максимума пика плавления снижается примерно на 10°С сильнее, чем в присутствии ПФ (Рис. 3, Б). По-видимому, эта разница объясняется обнаруженной нами высокой прочностью связывания полисульфоанионов с белком.
Электростатическая природа взаимодействия была подтверждена калориметрическим исследованием водно-солевых растворов ГАФД и полианионов. Для удобства сравнения были подобраны условия, при которых термограммы плавления всех комплексов практически совпадали. Оказалось, что уже при добавлении 100 мМ NaCl разница между термограммами плавления ГАФД и смеси ГАФД с ПФ пропадала, в то время как отличия термограмм плавления смесей ГАФД с ПСС и ДС от Рис. 3. Термограммы плавления ГАФД в свободном виде (кривая 1) и в присутствии ПФ (А), ПСС и ДС (Б): ГАФД + ПФ18 (А, кривая 2), ГАФД + ПФ155 (А, кривая 3), ГАФД + ПСС20 (Б, кривая 2), ГАФД + ПСС77 (Б, кривая 3), ГАФД + ДС32 (Б, кривая 4), ГАФД + ДС95 (Б, кривая 5). Термодинамические параметры денатурации приведены на правой панели. 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,5;
концентрация ГАФД и заряженных групп полианионов 1 мг/мл (7 мкМ) и 0,5 мМ, соответственно.
контроля все еще оставались значительными (Рис. 4). Другими словами, достигнутая ионная сила раствора достаточна, чтобы полностью подавить образование комплекса ГАФД-ПФ, в то время как связывание ПСС и ДС с белком остается заметным и прекращается только в присутствии 200 мМ NaCl.
Таким образом, прочность взаимодействия полисульфоанионов с ГАФД значительно выше, чем анионов ПФ. Тем не менее, обнаружено, что анионы ПФ способны полностью подавлять тепловую агрегацию ГАФД, хотя необходимая для этого концентрация ПФ на порядок выше, Рис. 4. Кривые ДСК свободнй ГАФД (1) и смесей ГАФД с ГАФД с ПСС77 (2), ПФ (3) и ДС95 (4) в отсутствии NaCl (A) и в присутствии 100 мМ (Б) и 200 мМ (В) NaCl.
Термодинамические параметры денатурации соответствующих образцов показаны на правой панели. Концентрация ГАФД 1 мг/мл (7 мкМ), полимеров – 0,5 мМ. 10 мМ ФБ, pH 6,4.
Рис. 5. Зависимость тепловой агрегации ГАФД от концентрации заряженных групп полианиона: ПСС77 (1), ПСС20 (2), ПФ155 (3) и ПФ18 (4).
Концентрация ГАФД составляла 0,1 мг/мл. 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,5, 60°C.
чем ПСС (Рис. 5). Интересно, что чем выше степень полимеризации полианиона, тем более эффективно он подавляет агрегацию. Этот эффект, обнаруженный ранее для ПСС (Shalova et al., 2005), связан, по-видимому, с образованием экспонированных в раствор петель и хвостов полиэлектролита, обеспечивающих растворимость образующихся комплексов. Образование подобных петель короткими полианионами затруднено, вследствие чего понижается и степень подавления агрегации.
Для выявления факторов, вызывающих денатурацию связанного с полианионом белка, был более подробно исследован механизм взаимодействия полисульфоанионов с нативной формой ГАФД.
Оказалось, что при смещении pH среды на единицу в кислую область обнаруженное ранее дополнительное связывание после прекращения первого процесса (кривая 1, справа от стрелки на Рис. 2, Б) становится более выраженным. Более того, при увеличении длины цепи полианиона молярное соотношение, при котором начинается вторая стадия взаимодействия, растет, а связывание высокомолекулярных фракций ПСС с белком и вовсе происходит в одну стадию (Рис. 6). Важно отметить, что наличие второй стадии при связывании коррелирует с выраженностью денатурирующего эффекта по отношению к связанному белку. Согласно данным кругового дихроизма, третичная структура ГАФД остается интактной до начала второй стадии тепловыделения и разрушается в процессе второй стадии.
Кроме того, поведение комплексов ГАФД с ПСС было изучено с помощью ДСР. Оказалось, что при титровании белка короткими цепями полианиона размер комплекса поначалу меняется слабо, а затем (по видимому, вследствие денатурации белка) происходит агрегация. В случае же высокомолекулярных фракций ПСС комплексообразование приводит к формированию крупных частиц, размер которых постепенно уменьшается с ростом концентрации цепей полианиона (из-за уменьшения количества белка в каждом комплексе). Интересно, что подобное «растворение» крупного комплекса наблюдалось и при титровании короткими цепями Рис. 6. Результаты калориметрического титрования раствора ГАФД раствором ПСС с различной степенью полимеризации: 8 (А), 20 (Б), 77 (В), (Г) и 1700 (Д). Приведены зависимости теплового эффекта каждой инъекции от достигнутого молярного соотношения.
Концентрация ГАФД в ячейке 0,6 мг/мл (4,2 мкМ), ПСС в шприце 1,4 мМ. 10 мМ фосфатный буфер, pH 6,4.
ПСС, но при значительно более высокой концентрации полианиона.
Поскольку полианионы способны полностью подавлять агрегацию белков, было интересно проверить, возможен ли обратный процесс – растворение уже сформировавшихся агрегатов. В качестве модельных объектов исследования были выбраны обладающие амилоидными свойствами ТВ овечьего прионного белка (PrP), аморфные ТВ белка GFP, а также агрегаты, образующиеся в процессе тепловой денатурации олигомерного фермента ГАФД. Было исследовано влияние на все три типа агрегатов сульфосодержащих полианионов, различающихся как по прочности связывания с белком, так и по гидрофобности и степени полимеризации.
Было показано, что высокополимерные фракции ПСС способны достаточно эффективно растворять наиболее прочные амилоидные агрегаты приона. Так, добавление даже сравнительно небольших порций ПСС1700 приводило к появлению небольших (около 30 нм) растворимых комплексов, которые затем были отделены центрифугированием от остатков агрегатов. Их белковая природа была отдельно подтверждена с помощью денатурирующего фореза и иммунноблоттинга. При этом, согласно спектрофотометрическим оценкам, в растворимую форму удалось перевести почти 40% прионного белка.
Использование ПСС с более низкой степенью полимеризации и, тем более, менее активно взаимодействующего с белком декстрансульфата (даже высокомолекулярного), не позволяет достигнуть растворения агрегатов.
Важно отметить, что при добавлении ПСС тельца включения приона теряют свои амилоидные свойства. Об этом говорит практически двукратное уменьшение интенсивности флуоресценции при окрашивании тиофлавином Т (Рис. 7, А), а так же сдвиг пика поглощения при окрашивании красителем Конго красным с 539 нм в случае интактных ТВ до 521 нм после добавления полианиона (Рис. 7, Б). Кроме того, были предприняты попытки выделить в индивидуальном виде прионный белок, находящиеся в комплексе с полианионом, с помощью поликатиона.
Однако, хотя принципиальная возможность вытеснения белка из комплекса с полиэлектролитом при добавлении полимера противоположного знака была ранее продемонстрирована в ряде работ (Ivinova et al., 2003;
Shalova et al., 2005), перевести в раствор прионный белок после добавления поликатиона поли(N-этил-винилпиридиния) нам не удалось. Вероятно, прочность связывания ПСС с прионом достаточно велика, и добавление поликатиона приводит к образованию тройного комплекса белок-ПСС-поликатион. Формирование крупных конгломератов после добавления поликатиона было подтверждено с помощью конфокальной микроскопии с использованием тиофлавина Т для визуализации амилоидных структур (данные не представлены).
Необходимо отметить, что образующиеся в результате комплексы окрашивались тиофлавином Т значительно слабее, чем исходные ТВ.
Рис. 7. A: Спектры флуоресценции тиофлавина Т в присутствии нативной формы PrP (1) и интактной (2) и обработанной ПСС (3) суспензии ТВ. Б: Спектры поглощения Конго Красного в свободном виде (1) и в присутствии интактной (2) и обработанной ПСС (3) суспензии ТВ приона.
Далее было изучено влияние различных полисульфоанионов на ТВ зеленого флуоресцентного белка (GFP). Оказалось, что к появлению небольших растворимых комплексов приводит добавление не только высокополимерного ПСС, но и более коротких образцов ПСС, а также ДС с молекулярной массой 100 и 1000 кДа и ПВС. Поэтому аморфные ТВ GFP были использованы в качестве модели для детального исследования процесса растворения агрегатов и факторов, определяющих эффективность растворения.
С помощью метода ДСР проведен поэтапный анализ состояния системы при постепенном увеличении концентрации полианионов, в частности, ПВС (Рис. 8). Хотя введение первых порций полианиона вызывало даже небольшое укрупнение частиц агрегатов (Рис. 8, Б), последующее титрование приводило к появлению (Рис. 8, В) и последующему накоплению относительно небольших частиц, размер которых постепенно уменьшался с 20 нм до 14 нм (Рис. 8, Д), что существенно превышает размер свободного полианиона (9 нм).
Характерно, что при этом в растворе сохранялись большие агрегаты порядка 800 нм, которые сосуществовали с вновь образующимися малыми частицами. По мере добавления полианиона объемная доля фракции больших частиц понижалась и практически исчезала, что подтверждает растворение телец включения под действием связывающегося полианиона.
Кроме того, оказалось, что эффективность растворения агрегатов зависит от степени полимеризации полианиона – чем длиннее заряженная цепь, тем меньше концентрация полианиона, при которой появляются растворимые комплексы. Такая закономерность наблюдалась как для ПСС, так и для ДС, но эффективность растворения агрегатов анионами ПСС была выше, чем ДС (Рис. 9). Объясняться это различие может, во первых, показанным ранее более высоким сродством ПСС к белку и, во вторых, его гидрофобностью, так как гидрофобные взаимодействия играют ключевую роль в стабилизации аморфных агрегатов.
Аморфные агрегаты, образующиеся в результате тепловой денатурации ГАФД, удалось растворить не только ПСС, который оказался наиболее эффективным, но и декстран-сульфатом. Более того, после Рис. 8. Гидродинамический диаметр интактной (А) суспензии ТВ GFP и ее смесей с ПВС (Б – Д) при разных концентрациях ПВС. На нижней панели (Е) показано распределение размера чистого ПВС. 50 мМ фосфатный буфер, pH 7,5.
инкубации в течение часа происходило значительное восстановление ферментативной активности ГАФД (Рис. 10).
Таким образом, агрегаты всех типов могут быть растворены с помощью полисульфоанионов. Наиболее прочные из них, амилоидные тельца включения, удалось разрушить только с помощью наиболее «жесткого» полисульфаоаниона, ПСС, в то время как аморфные агрегаты растворялись и более мягкими полианионами, не оказывающими денатурирующий эффект на нативный белок (в частности, декстрансульфатом).
Рис. 9. Зависимость концентрации ПСС (1) и ДС (2), необходимой для растворения ТВ GFP, от их степени полимеризации.
Рис. 10. Общая ферментативная активность нативной и агрегированной формы ГАФД, а также комплексов, образованных после растворения агрегатов с помощью ДС. Концентрация ГАФД 0,1 мг/мл, ДС 2 мМ.
Полученные данные позволили предложить механизм растворения агрегатов, включающий стадии сорбции полиэлектролита на поверхность агрегатов с их «разрыхлением» и последующим переходом белка в раствор в виде растворимого белок-полиэлектролитного комплекса (Рис.
11). Согласно предложенной модели, налипание заряженных цепей полианиона на поверхность агрегата приводит к разрыхлению его верхнего слоя, что отражается в увеличении размера частиц, обнаруженного с помощью ДСР (Рис. 8, Б). С ростом концентрации полианиона остается все меньше нескомпенсированных зарядов, расположенных на поверхности ТВ, и при достижении некоторой критической концентрации происходит разрушение агрегата (Рис. 8, В).
Отсутствие плавного перехода между пиками (Рис. 8, Б и Г) свидетельствует об отрыве наночастиц растворимого комплекса от остова белкового агрегата, а не последовательной диссоциации агрегата на все уменьшающиеся по размерам фрагменты – в противном случае присутствовало бы большое количество частиц промежуточного размера.
Двукратное превышение размеров растворимых комплексов (Рис. 8, В) по отношению к гидродинамическому диаметру полианиона указывает на плотное заполнение цепей белком в момент возникновения растворимых комплексов. При увеличении же концентрации полианиона происходит, по-видимому, расселение белка по вновь вводимым заряженным цепям, сопровождающееся постепенным уменьшением размеров в процессе титрования.
Важно отметить, что растворение агрегатов энергетически выгодно как с точки зрения энтальпии (за счет образования ионных связей между белком и полианионом), так и с точки зрения энтропии (за счет непосредственно растворения – увеличения количества частиц – и за счет высвобождения низкомолекулярных ионов, взаимодействовавших ранее с полиэлектролитом). Растворимость же полученных комплексов обеспечивается, по-видимому, наличием экспонированных в раствор заряженных петель полианиона. В этой связи можно ожидать, что эффективность растворения ТВ зависит, в том числе, от таких факторов, как прочность взаимодействия полиэлектролита с белком, его гидрофобность и степень полимеризации. Влияние всех перечисленных факторов и было показано в данной работе.
Рис. 11. Модель растворения белковых агрегатов полиэлектролитами Предложенный способ растворения агрегатов может быть использован, прежде всего, в биотехнологии, в частности, для извлечения белка из ТВ, так как требует малых по сравнению с часто используемыми для этих целей хаотропными агентами концентраций полиэлектролита. В связи с этим необходимо отметить, что для белок-полиэлектролитных комплексов характерно явление так называемого молекулярного узнавания (Kabanov et al., 1980), заключающееся в специфичном взаимодействии полиэлектролитов с конкретным белком. Этот эффект позволял выделять определенный белок из исходной смеси (McDonald et al., 2009;
Xu et al., 2011). Таким образом, возможно одновременное растворение ТВ, содержащих требуемый рекомбинантный белок, и его очистка от прочих компонент. Более того, поскольку полиэлектролиты часто применяются для иммобилизации белков, полученные белок полиэлектролитные комплексы могут быть немедленно использованы для дальнейшей утилизации, в том числе, для создания белок-содержащих наночастиц.
Не менее интересны полученные результаты и с точки зрения подавления амилоидной агрегации и, в частности, лечения нейродегенеративных заболеваний. Действительно, полученные после растворения амилоидных ТВ комплексы не подвержены агрегации, в отличие от продуктов разрушения агрегатов, полученных другим путем.
При этом амилоидные свойства в результате растворения значительно снижались. Вероятно, это связано отчасти с сильным денатурирующим действием ПСС. Другими словами, предложенный способ может позволить не только разрушить уже сформированные амилоидные агрегаты, но и снизить (или даже полностью подавить) их инфекционность. Более того, полученные комплексы впоследствии могут быть выделены в отдельную (уже неинфекционную) фазу с помощью поликатиона, поскольку считается, что наибольшую опасность представляют собой небольшие амилоидные агрегаты.
ВЫВОДЫ 1. Полифосфаты способны полностью подавлять агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, практически не влияя на ее ферментативную активность.
2. Полисульфоанионы связываются с глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназой прочнее, чем полифосфаты, по данным изотермической титрационной калориметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии.
3. Эффективность подавления агрегации глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы возрастает при увеличении степени полимеризации полианионов обоих типов и прочности их связывания с белком.
4. Зависимость величины теплового эффекта взаимодействия белка с полисульфоанионами от концентрации полианиона имеет двухфазную природу. Согласно предложенной модели, первой фазе соответствует связывание полианиона с поверхностными заряженными группами фермента, а второй – дополнительное связывание полианиона, сопровождающееся проникновением его цепей внутрь белковой глобулы и приводящее к денатурации белка.
5. Полисульфоанионы способны эффективно растворять как аморфные и амилоидные тельца включения, так и белковые агрегаты, образованные в результате тепловой денатурации. Эффективность растворения агрегатов и телец включения возрастает при увеличении степени полимеризации и гидрофобности полианионов.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:
1. Semenyuk P.I., Muronetz V.I., Haertl T., Izumrudov V.A. Effect of poly(phosphate) anions on glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase structure and thermal aggregation: comparison with influence of poly(sulfoanions). // Biochimica et Biophysica Acta – General subjects 2013, 1830 (10), 4800 – 4805.
2. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Asryants R.A., Semenyuk P.I., Makeeva V.F., Kurganov B.I. Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin on thermal inactivation, denaturation and aggregation of glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscle. // International Journal of Biological Macromolecules 2010, 46 (5), 487 – 492.
Тезисы докладов конференций:
3. Semenyuk P., Izumrudov V., Muronetz V. Two-stage interaction of polyanions with protein: comparing of the effect of poly(phosphate) and various poly(sulfate/sulfonate). // The EMBO Meeting, 21 – 24 сентября 2013, Амстердам, Нидерланды.
4. Semenyuk P., Muronetz V., Izumrudov V. Control of structure and catalytic activity of GAPDH by anionic polymers of different nature.
// Biocatalysis-2013, 2 – 5 июля 2013, Москва.
5. Semenyuk P.I., Izumrudov V.A., Muronetz V.I. Solubilization of protein inclusion bodies by polyelectrolytes. // 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress, 4 – 9 сентября 2012, Севилья, Испания. // FEBS Journal 2012, (SI 1), 424.
6. Семенюк П.И., Изумрудов В.А., Муронец В.И. Растворение белковых телец включения полиэлектролитами. // X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова, 14 – 17 ноября 2011, Москва.
7. Семенюк Растворение белковых телец включения П.И.
полисульфоанионами. // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010», 12 – 15 апреля 2010, г. Москва, секция «Биоинженерия и биоинформатика», подсекция «Физико химическая биология»