Влияние петель на g-квадруплексные днк: геометрия, молекулярная динамика и взаимодействие с катионами

На правах рукописи

РЕШЕТНИКОВ Роман Владимирович ВЛИЯНИЕ ПЕТЕЛЬ НА G-КВАДРУПЛЕКСНЫЕ ДНК:

ГЕОМЕТРИЯ, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С КАТИОНАМИ 03.01.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва 2011

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: д.х.н., профессор Копылов Алексей Михайлович к.х.н., стар.преп. Головин Андрей Викторович

Официальные оппоненты: д.ф.м.н., профессор Шайтан Константин Вольдемарович д.ф.м.н., Крупянский Юрий Фёдорович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН

Защита состоится «_» мая 2011 года в «_» на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 по биофизике при Московском государственном университете им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, строение 12, Биологический факультет, новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «_» апреля 2011 года Учёный секретарь диссертационного совета Д.501.001. доктор биологических наук Страховская Марина Глебовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность гуанин-богатых олигонуклеотидов самоорганизовываться в структуры, построенные из G-квартетов, состоящих из четырёх копланарных гуанинов и связанных Хугстиновскими водородными связями, известна уже почти 50 лет. Гуанин-богатые сегменты, имеющие функциональную роль in vivo, были найдены в биологически важных регионах генома: теломерах и участках переключения синтеза иммуноглобулинов;

промоторные области, образующие квадруплексы, были локализованы для ряда онкогенов и генов, ассоциированных с раком. Квадруплексы нуклеиновых кислот (G-ДНК/РНК) являются также перспективными терапевтическими агентами: многие РНК- и ДНК-аптамеры, отобранные к специфичным мишеням с помощью селекции in vitro, образуют квадруплексные структуры. Таким образом, как сама структура, так и конформационная устойчивость квадруплексных ДНК являются важными предметами изучения для современной фундаментальной и прикладной науки.

Образование и конформационная устойчивость G-квадруплексов зависят от ряда факторов: стэкинг-взаимодействий оснований, водородных связей, электростатических взаимодействий и гидратной оболочки. Помимо этих стандартных для дуплексной ДНК стабилизирующих факторов, у квадруплексов существуют специфические: координация О6 карбонилов гуанина катионами и петли, участвующие в образовании мономерных и димерных G-квадруплексных структур.

Ранее было показано, что длина и первичная структура петель оказывают существенное влияние на эффективность образования и стабильность квадруплекса, однако, до полного понимания правил формирования пространственной структуры квадруплексных структур ещё очень далеко. Необходимо учитывать влияние петель на геометрию G-ДНК/РНК при рациональном дизайне самих G-квадруплексных структур, либо взаимодействующих с ними агентов.

Для второго специфического фактора стабилизации - взаимодействий между квадруплексами и координирующими катионами, с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) было показано, что положение катиона в структуре квадруплекса зависит от размера и заряда иона. К примеру, Na+ способен занимать два положения: в плоскости квартета и между двумя G-квартетами. Такие ионы, как K + и NH4+, обладая большим, чем у Na+, атомным радиусом, не способны находиться в плоскости квартета;

как правило, для структур, разрешённых с помощью РСА, ионы калия располагаются между квартетами, координируя восемь атомов кислорода O6.

Известные данные о влиянии петель и катионов на стабильность квадруплексов предоставляют недостаточно информации об атомных механизмах стабилизации квадруплекса, что затрудняет рациональное улучшение квадруплексных структур. Так, для представителя нового класса ингибиторов тромбообразования, ДНК-аптамера к тромбину (15-ТВА) — 15-звенного олигонуклеотида, структура которого состоит из двух G-квартетов и трех петель латерального типа (Рис. 1), неоднократно предпринимали попытки оптимизировать функциональные характеристики путём модификации петель.

Любые изменения первичной структуры аптамера приводили к ухудшению функциональных показателей. Более того, оставался открытым вопрос о количестве и локализации стабилизирующих катионов в структуре 15-ТВА. Сведения о пространственной структуре аптамера и его комплекса с тромбином содержали иные противоречивые данные, касающиеся геометрии петель, полярности полинуклеотидной цепи и взаимной ориентации белка и аптамера в комплексе.

Цель работы. Целью настоящей работы является решение задачи определения атомных механизмов стабилизации квадруплексной конформации15-ТВА и подобных ему G квадруплексных структур, состоящих из небольшого (2-3) числа G-квартетов. Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Выбор корректной модели взаимодействия 15-ТВА с тромбином 2) Разрешение неопределённости геометрии петель структуры аптамера 3) Разрешение неопределённости количества и положения стабилизирующих катионов в структуре 15-ТВА 4) Систематизация структурных данных по G-квадруплексам с известной структурой Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

Систематизированы данные о влиянии типа петель на геометрию квадруплексных структур. Предложен новый параметр для исследования и классификации G-ДНК.

Разрешены неопределённости, связанные со структурой и свойствами 15-ТВА:

устойчивая конформация, стехиометрия комплекса со стабилизирующим катионом, стехиометрия комплекса с тромбином;

определена структурная функция каждого нуклеотида аптамера. Детально описан процесс комплексообразования между стабилизирующим катионом и квадруплексом. Охарактеризован последний этап механизма самосборки структуры 15-ТВА и роль катиона в этом процессе. Для корректного моделирования молекулярной динамики (МД) исследуемых структур на архитектуру GROMACS были портированы новейшие данные о двугранных углах сахаро-фосфатного остова дезоксирибонуклеиновых кислот, описываемые силовым полем parmbsc0. Общая продолжительность траекторий моделирования МД, выполненного в рамках настоящей работы, составляет десятки микросекунд, что является максимальным значением из документированных результатов для G-ДНК.

На основе полученных данных были сконструированы принципиально новые структуры на основе 15-ТВА с улучшенными характеристиками сборки пространственной структуры, аффинностью к тромбину и физиологическими параметрами. Поданы заявки на защиту предложенных в работе методов стабилизации квадруплексных структур российским и международным патентами РСТ 2010/000750 и 2009146170/10(065916).

Разработанные антикоагуляционные препараты аптамеров в настоящее время проходят предклинические испытания в ООО «Апто-Фарм».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: XIV, XV и XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008 и 2011, соответственно), I Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech 2008» (Москва, 2008), III Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 2010), конференция королевского химического общества (Манчестер, Великобритания, 2009), 34й конгресс FEBS (Прага, Чешская Республика, 2009), The EMBO Meeting (Барселона, Испания, 2010), 3й международный семинар по нанонаукам и нанотехнологиям (Гавана, Куба, 2010), 2я международная конференция по поиску лекарств и терапии (Дубаи, ОАЕ, 2010) Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликовано 13 работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах, включённых в список ВАК, и 10 тезисов конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылки. Работа изложена на 143 страницах, содержит 25 рисунков и 7 таблиц.

ВВЕДЕНИЕ Обсуждена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Проанализирована литература по функциональной значимости, структурным характеристикам и факторам стабилизации G-квадруплексных структур нуклеиновых кислот. Проведён обзор синтетических конструкций на основе G-ДНК: аптамеров, наночастиц, сенсоров. Рассмотрены структура и свойства тромбинового аптамера 15 ТВА. Особое внимание уделено расчётно-теоретическим методам изучения нуклеиновых кислот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Портирование силового поля parmbsc0 на архитектуру GROMACS. Новый тип атомов, соответствующий атому С5', параметры соответствующих связей, углов и торсионных углов и были добавлены к записям нуклеиновых кислот силового поля AMBER-99SB. Проверку правильности портирования проводили сравнением профилей потенциальной энергии соответствующего торсионного угла. В качестве образца строили профиль энергии торсионного угла по уравнению Vp Etors(ijkl)= Z (1+cos(n-)), где Vp соответствует половине величины потенциального барьера, Z — общее число торсионных углов относительно соответствующей связи, к которым применим потенциал, n — количество барьеров потенциальной энергии при вращении вокруг связии — фаза. Эти значения брали из работы Perez et al, Biophys. J., 2007, посвященной разработке силового поля parmbsc0.

С этим потенциалом сравнивали потенциал, полученный при вращении динуклеотида 5'-GG-3' вокруг соответствующего торсионного угла от -180 до + градусов с шагом 1 градус;

для каждой конформации определяли значение потенциальной энергии. Процедура состояла в минимизации энергии в портированном силовом поле, брали первое значение энергии двугранных углов.

Рисунок 1. Схематическое изображение двух моделей структуры 15-ТВА. Слева: ЯМР модель (PDB ID 148d). Справа: РСА-модель (PDB ID 1hut) в составе комплекса. Серыми прямоугольниками показаны гетероциклические основания, входящие в состав G квартетов, и основания TGT-петли (T7, G8, T9), образующие с ними стэкинг взаимодействия. Оранжевым пунктиром показаны взаимодействия T4-T13 между ТТ петлями ЯМР-модели. Две оси симметрии квадруплекса образуются двумя симметричными широкими бороздками (синий) и двумя узкими (красный).

Сравнение ЯМР- и РСА-моделей 15-ТВА Стартовые конформации 15-ТВА брали из записей Protein Data Bank (PDB), ID 1hut (для РСА-модели) и 148d (для ЯМР-модели). Структуру беспетлевого четырёхтяжевого квадруплекса, состоящего из двух G-квартетов, получали из ЯМР-модели удалением остатков петель. Изучали МД ЯМР-и РСА-моделей с модифицированными конформациями TGT-петли: модели «TG(-T)», «T(-GT)» и «TG(+T)» были получены изменением координат остатков, заключенных в скобки, с целью разрушения (-) или образования (+) стэкинг-взаимодействий азотистых оснований этих остатков с верхним G-квартетом. Эти модели получали из начальных конформаций вращением G8 и T вокруг торсионных углов, и в программе PyMol 1.1. Затем к моделям применяли процедуру минимизации энергии по алгоритму Бройдена-Флетчера-Голдфарба-Шанно (BFGS) для оптимизации геометрии.

Для моделирования МД комплексов 15-ТВА с тромбином остатки Asp, Glu и His были протонированы в соответствии с работой Ahmed et al, Acta Crystallogr. D Biol.

Crystallogr., 2007. Модели комплексов тромбина с аптамером со стехиометрией 2:1 были получены из начальных моделей путем воспроизведения соседних ячеек по кристаллической решетке в программе PyMol 1.1. Среди всех соседей молекула тромбина, взаимодействующая с аптамером из исходного комплекса своим экзосайтом II, считалась второй молекулой комплекса.

Для моделирования МД и анализа траекторий был использован пакет программ GROMACS 4, с параметрами силового поля parmbsc0. Моделирование МД в явно заданном растворителе проводили при температуре 300К с константой времени 0, пикосекунды под контролем термостата перемасштабирования скорости (velocity rescaling termostat), постоянном давлении под контролем алгоритма Берендсена с константой времени 5 пикосекунд и применением метода Particle-Mesh Ewald (PME) для учета электростатических взаимодействий. Было проведено 16 модельных экспериментов с длиной траектории 600-900 наносекунд (шаг интеграции фемтосекунды) для каждой из моделей. Негативные заряды систем были скомпенсированы добавлением катионов натрия путём замещения молекул воды в случайных позициях, с минимальным расстоянием между ионами, равным 6.

Стабилизацию моделей ДНК осуществляли помещением катиона калия в геометрический центр G-квадруплекса, определяемый как среднее арифметическое от координат атомов О6 гуанинов квадруплекса.

Влияние типа петель на геометрию квадруплекса. Список структур, содержащих квадруплексы, был составлен на основе списка PDB и содержал 75 структур. Все структуры были разделены на 8 групп согласно топологии пространственной организации квадруплекса (число олигодезоксирибонуклеотидных цепей и тип петель, представленных в структуре). На основе языка Perl и модулей Vector::Real и Statistics::Descriptive была разработана программа, которая определяет наличие квартетов в структуре, их расположение и измеряет геометрические параметры. Для определения углов поворота квадруплекса измеряли угол между двумя векторами. Первый вектор соединял атомы C1' двух соседних нуклеотидов в квартете, второй вектор соединял атомы C1' в соответствующих нуклеотидах в соседнем квартете.

Взаимодействие квадруплекса из двух G-квартетов с катионами. Стартовые конформации 15-ТВА брали из PDB, ID 1c35 для комплексов с К+ и 1rde для комплекса с Ва2+. Было сконструировано 5 систем. Верхнюю позицию катиона (системы 1, 4) определяли как среднее арифметическое от координат К+, располагающихся над верхним G-квартетом (остатки G1, G6, G10, G15) в структуре 1с35. Центральную позицию (система 2) определяли как среднее арифметическое от координат атомов О6 гуанинов квадруплекса. Нижнюю позицию катиона (системы 3, 4) определяли как среднее арифметическое от координат К+, располагающихся под нижним G-квартетом (остатки G2, G5, G11, G14) в структуре 1с35. Системы 1-4 были смоделированы с катионами калия, система 2 была также смоделирована с катионом бария. Молекулярно механическую часть описывали с помощью параметров силового поля parmbsc0.

Квантово-механическая часть системы была описана в терминах теории функционала плотности с использованием псевдопотенциалов и базиса плоских волн (PW-DFT), с применением спин-поляризованного формализма и функционала PW91. Взаимодействия между валентными электронами и ионным остовом описывали сверхмягкими псевдопотенциалами Вандербильта. Квантово-механическая часть состояла из азотистых оснований 15-ТВА (за исключением Т7, не принимающего участия во взаимодействиях с катионом) и катионов калия или бария. Разбиение систем на квантово-механическую и молекулярно-механическую части осуществляли по N-гликозидной связи с введением атомов водорода для насыщения разорванных связей. В конечном итоге квантово механическая система состояла из 178 атомов (179 в случае системы 4). Взаимодействия Ван-дер-Ваальса, плохо описываемые теорией функционала плотности, корректировали аналитическим потенциалом Гримми. Каждая из моделируемых систем была наполнена водой модели tip4p, заряд компенсировали добавлением ионов натрия. Вода и ионы натрия были уравновешены вокруг комплекса ДНК:К+ (Ва2+) проведением МД в течение 100 пикосекунд с закреплением позиций комплекса.

Подготовленные системы были подвержены комбинированному квантово механическому и молекулярно-механическому моделированию (КM/MM) с помощью пакета программ GROMACS/CPMD с траекторией длиной 1,5 пикосекунд, с шагом 0, фемтосекунды (~5 а.е.) и электронной массой 500 под контролем термостата Ноза Хувера при температуре 310К. Базис плоских волн, описывающий поведение валентных электронов, был ограничен пределом 30 Ry. Использовали кубическую квантово механическую подъячейку с длиной стороны 40 Ry, что составляло в итоге примерно 90000 плоских волн на волновую функцию.

Изотермическая калориметрия (ИК) Связывание аптамеров d(GGTTGGTGTGGTTGG) и d(GGTTGGTCTGGTTGG) с катионами калия и бария изучали с помощью прибора MicroCal iTC 200 (MicroCal, USA) при 25°С в буфере Трис, pH 6,8 в присутствии 140 мМ LiCl. 2 мкл аликвоты раствора BaCl2 или KСl вводили в ячейку объёмом 0,2 мл, содержащую раствор ДНК.

Концентрацию аптамера в калориметрической ячейке изменяли от 50 до 250 мкМ, концентрация хлорида калия и хлорида бария в шприце варьировали от 1 до 10 мМ.

Теплоту разбавления определяли инъекциями хлорида калия и хлорида бария в буферный раствор, не содержащий аптамера, полученные значения вычитали из теплоты реакции для получения эффективной теплоты связывания. Итоговые кривые анализировали с помощью программного обеспечения MicroCal Origin. Кажущиеся константы ассоциации (Ка), стехиометрию связывания (N) и энтальпию определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа данных ИКТ. Изменение энтропии (S) определяли из стандартного термодинамического уравнения G = –RTlnK a = H – TS.

Измерения ИК для каждого аптамера проводили до достижения трёхкратного повторения термодинамических результатов эксперимента.

Моделирование молекулярной динамики Проводили три серии моделирования. Во-первых, исследовали взаимодействие между 15-ТВА (PDB ID 148d) и катионами (К+ или Na+), для чего сконструировали систем, три - с К+ и 5 - с Na+. Во всех системах в стартовые структуры 15-ТВА не помещали никаких ионов.

Во второй серии исследовали модель структуры 15-ТВА, лишенную TGT-петли.

Сконструировали 11 систем, различающихся стартовыми координатами катионов натрия в растворителе. В 10 из систем в стартовые структуры олигонуклеотида не помещали никаких ионов, в одной - в геометрический центр квадруплекса помещали катион натрия.

В третьей серии исследовали модель структуры 15-ТВА, лишенную TT-петель.

Сконструировали системы, аналогичные описанным для второй серии.

Для первой серии проводили моделирование МД с длинами траекторий 300 нс с параметрами, описанными для экспериментов по сравнению ЯМР и РСА моделей аптамера. Для второй и третьей серии длины индивидуальных траекторий составляли нс.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнение ЯМР- и РСА-моделей 15-ТВА Существует две модели пространственной структуры тромбинового аптамера 15 ТВА. Обе они показывают, что укладка олигонуклеотида представляет собой G квадруплекс, состоящий из двух G-квартетов, соединённых тремя петлями латерального типа. Модели согласуются друг с другом по структуре квадруплекса, однако рознятся по ориентации петель и по направлению хода дезоксирибонуклеотидной цепи. В ЯМР модели две ТТ-петли перекрывают узкие бороздки с одного конца квадруплекса;

с другого конца TGT-петля перекрывает широкую бороздку (Рис. 1). В РСА-модели, наоборот, ТТ-петли перекрывают широкие бороздки, и TGT-петля — узкую.

Существуют также противоречия между моделями о том, какие нуклеотиды взаимодействуют с тромбином: ЯМР-модель связывает тромбин ТТ-петлями, в то время как в РСА-модели комплекса аптамер и белок взаимодействуют по TGT-петле олигонуклеотида (Рис. 2). Экспериментальные подходы не дают однозначного ответа на вопрос, какая модель взаимодействий верна. Введение мутаций в ТТ-петли ухудшает связывание тромбина аптамером. В то же время, модификации TGT-петли также отрицательно влияют на функциональную активность 15-ТВА.

Рисунок 2. Две модели комплекса тромбина с 15-ТВА. Слева: РСА-модель комплекса (PDB ID 1hut), справа: ЯМР-модель (PDB ID 1hao). В РСА-модели взаимодействие между аптамером и тромбином происходит по TGT-петле олигонуклеотида, в ЯМР модели — по ТТ-петлям Сравнительное моделирование МД двух моделей структуры аптамера и определение структурной функции каждого нуклеотида 15-ТВА способны устранить указанные противоречия. В представленной работе исследовали конформационную устойчивость моделей и их производных в силовом поле parmbsc0, с длинами индивидуальных траекторий 600-900 нс. По результатам моделирования проводили структурное аннотирование нуклеотидов 15-ТВА.

По результатам сравнительного моделирования МД 15-ТВА G-квадруплекс РСА модели оказался неустойчивым, в то время как ЯМР-модель сохранила конформацию, идентичную стартовой структуре из PDB, с сохранением водородных связей и стэкинг взаимодействий между основаниями. Это означает, что РСА-структура, возможно, содержит ошибки, которые были определены с помощью МД.

Причины устойчивости ЯМР-модели по сравнению с РСА-моделью определяли сравнительным моделированием производных 15-ТВА с модифицированными конформациями TGT-петли (Табл. 1).

Таблица 1. Выборочные модельные эксперименты для определения факторов стабильности 15-ТВА система что оценивали результат четырёхтяжевой G- влияние петель на квадруплекс с катионом К+ устойчивость Устойчивая конформация на в центре (идентичен в конформации протяжении всех 700 нс МД обеих моделях) квадруплекса важность катиона для Потеря структуры а четырёхтяжевой G устойчивости квадруплекса в течение первой квадруплекс без катиона квадруплекса нс МД влияние различных существенной разницы между ЯМР-модель с Na+ вместо параметров катионов на Na+- и К+-стабилизированными К+ в центре квадруплекса геометрию и динамику моделями модели не обнаружено модель устойчива в течение важность катиона для ЯМР-модель без катиона нс, после чего был захвачен устойчивости модели катион из раствора ЯМР-модель с будет ли ЯМР-модель отсутствием стэкинг- устойчивой, имея только Потеря структуры квадруплекса взаимодействий между Т9 G8 в стэкинге с G и верхним G-квартетом квартетом модель стабильна в течение Будет ли РСА-модель РСА-модель со стэкинг- нс, после чего была потеряна устойчивой, имея и G8, и взаимодействием между структура квадруплекса из-за Т9 в стэкинге с G Т9 и верхним G-квартетом стэкинг-взаимодействий между квартетом Т4 и Т Рисунок 3. Сверху: схематичное изображение угла поворота, в вершинах квадратов, отображающих G-квартеты (тёмные прямоугольники — гетероциклические основания гуанинов), находятся атомы C1'. Снизу: динамика изменения угла поворота между квартетами. Следили за углом поворота для разных бороздок, что отображено на схемах для каждого графика. Данные были сглажены с помощью сплайн-интерполяции.

Серым показан угол поворота между квартетами для структуры четырёхтяжевого беспетлевого квадруплекса;

чёрным: для 15-ТВА в свободном состоянии;

коричневым — для 15-ТВА в составе комплекса с тромбином. Голубые линии обозначают максимальное и минимальное значение углов закрутки для 12 структур ЯМР-модели (PDB ID 148d) Из Табл. 1 видно, что основным фактором, определяющим стабильность ЯМР модели 15-ТВА, является образование дополнительных по сравнению с РСА-моделью стэкинг-взаимодействий между гетероциклическим основанием Т9 и верхним квартетом G-квадруплекса.

РСА-модель аптамера брали из записи PDB, содержащей аптамер в комплексе с тромбином, взаимодействие с белком могло повлиять на результаты моделирования:

неустойчивая конформация РСА-модели могла стабилизироваться взаимодействиями с тромбином. В связи с этим проводили сравнительное моделирование МД комплексов, основанных на ЯМР- и РСА-моделях аптамера, с тромбином. РСА-модель аптамера не способна поддерживать G-квадруплексную структуру и в комплексе с белком, что указывает на некорректность исходной модели, в то время как ЯМР-модель комплекса после 600 нс моделирования МД идентична стартовой структуре.

Происхождение дестабилизации в структуре 15-ТВА. ЯМР-модель характеризуется стабильными траекториями МД, в отличие от РСА-конформации аптамера. Причиной этого являются внутримолекулярные силы, разрушающие РСА-модель. Что же является причиной этих сил и в чём они выражаются? Для ответа на этот вопрос рассматривали динамику изменения угла закручивания квадруплекса, т.е. угла поворота между двумя соседними квартетами, которому соответствует угол между двумя векторами, проходящими через атомы C1' двух соседних гуанинов (Рис. 3).

Сравнивали углы закручивания квадруплексов и флуктуацию их значений в модельных экспериментах МД ЯМР-модели 15-ТВА в свободном состоянии и в комплексе с тромбином, и четырехтяжевого беспетлевого двухквартетного квадруплекса, полученного из 15-ТВА удалением нуклеотидов петель.

Для всех четырёх бороздок значения углов поворота для структуры 15-ТВА (Рис. 3, A-D, чёрная линия) существенно меньше, чем для ее квадруплекса, лишённого петель (Рис. 3, A-D, серая линия), что свидетельствует о том, что петли ограничивают диапазон изменений структуры. Поведение 15-ТВА в комплексе с тромбином (Рис. 3, A-D, коричневая линия) отличается и от аптамера в свободном состоянии, и от беспетлевого квадруплекса;

если для узких бороздок (Рис. 3, А и С) углы закрутки ближе к структуре 15-ТВА в свободном состоянии, то для широких бороздок (Рис. 3, B и D) эти значения характерны уже для беспетлевых структур. Это объясняется тем, что широкие бороздки топологически связаны с петлей большей длины, чем узкие (3 нуклеотида TGT против двух TT), не столь сильно ограничивающей геометрию квадруплекса. Тромбин, являющийся молекулярным шапероном для сборки 15-ТВА, способен компенсировать негативное влияние TGT-петли на структуру квадруплекса. Петли аптамера оказывают влияние на геометрию квадруплекса, ограничивая его структурную подвижность.

Основным источником дестабилизации в структуре 15-ТВА являются ТТ петли.Полученные в работе результаты коррелируют с ЯМР-моделью аптамера в свободном состоянии и в комплексе с белком. Основная роль TGT-петли заключается в стабилизации квадруплекса аптамера до момента захвата катиона и связывания с тромбином;

ТТ-петли, являясь основным источником внутримолекулярных дестабилизирующих сил в структуре аптамера, ответственны за специфическое взаимодействие с тромбином.

Влияние типа петель на геометрию квадруплекса Согласно результатам моделирования МД, петли латерального типа влияют на структуру квадруплекса, ограничивая его угол закрутки областью 10...19, в то время как для беспетлевого квадруплекса характерны величины 17...25 (см. Рис. 3). Для выяснения влияния петель двух других типов на геометрию квадруплекса проводили исследование 75 структур G-квадруплексов из банка данных PDB.

В качестве характеристик квадруплексов было выбрано два структурных параметра.

Первый — угол поворота квадруплекса. В качестве второго выбран оригинальный параметр, который характеризует искажение структуры квартета (Рис. 4). Два этих параметра позволяют описать конформационный полиморфизм структуры квадруплексной ДНК.

Четырёхтяжевой межмолекулярный параллельный квадруплекс (структуры «без петель» на Рис. 4) имеет самую простую топологию G-квадруплекса, геометрия которого зависит лишь от количества входящих в его состав G-квартетов. Эта переменная определяет границы, в которых могут существовать такие структуры: угол поворота меняется от 19° до 36°, что согласуется с результатами моделирования МД (Рис. 3).

Латеральные петли деформируют квадруплексы. Если для беспетлевых квадруплексов минимальные углы поворота равны 19°, то для структур с латеральными петлями угол меняется в пределах 15°±5°.

Рисунок 4. Влияние типа петель на геометрию квадруплекса. Слева: величины углов поворота квадруплексов в зависимости от типа петель. Внизу: схематические изображения различных топологий квадруплексных структур, слева направо: структура с латеральными петлями, структура с петлями диагонального типа, беспетлевой параллельный квадруплекс, квадруплекс с пропеллерными петлями. Справа: схематичное отображение измеряемого параметра отклонения от планарности G-квартетов:

расстояние между центрами масс двух квадратов, образованных атомами О6 и N9.

В структурах типа «корзина» (мономолекулярный квадруплекс, соединенный с одной стороны двумя латеральными петлями, с другой — петлёй диагонального типа) хорошо видно соотношение сил, создаваемых латеральными и диагональными петлями.

Прилегающая к диагональной петле часть квадруплекса имеет углы поворота 36°±4°. Это выходит за рамки интервала для беспетлевых параллельных квадруплексов, но диагональная петля может фиксировать и такую структуру Необходимо отметить, что такие значения углов поворота нехарактерны для структур с петлями только диагонального типа. В таких структурах геометрия квадруплексов ограничена значениями углов 19°±4° (Рис. 4), что ближе к значениям для беспетлевых квадруплексов. Следовательно, латеральные петли сильнее влияют на структуру квадруплекса, чем петли диагонального типа.

Пропеллерные петли наиболее строго определяют геометрию квадруплекса. Как в мономолекулярных, так и в бимолекулярных квадруплексах с петлями пропеллерного типа значения углов поворота находятся в пределах 31°±3° (Рис. 4). Наличие в таких структурах латеральных петель слабо сказывается на закручивании прилежащих к пропеллерным петлям частей квадруплексов (28°±4°), что находится в пределах значений для беспетлевых квадруплексов (от 19° до 34°). Видимо, такие углы закручивания соответствуют оптимальной геометрии G-квартета, поскольку G-квартеты структур с петлями пропеллерного типа характеризуются высокой планарностью, в отличие от квадруплексов с диагональными петлями.

Взаимодействие катионов с квадруплексами Одним из важнейших факторов, стабилизирующих структуру G-квадруплексов, является взаимодействие с координирующим катионом. В настоящей работе показали, что ЯМР-модель 15-ТВА способна существовать в водном растворе без разрушения квадруплекса до тех пор, пока не захватит стабилизирующий катион (см. Табл. 1).

Однако, стехиометрия комплекса аптамера с катионом, а также его локализация в структуре 15-ТВА неизвестна.

Согласно Marathias and Bolton, Nucleic Acids Res., 2000, 15-ТВА взаимодействует с двумя катионами калия, сайты связывания располагаются над квадруплексом и под ним (Рис. 5, положения «а» и «с»). Trajkovski et al, Org. Biomol. Chem., 2009, показали, что 15 ТВА взаимодействует с одним ионом NH4+, причём катион располагается в центре квадруплекса (Рис. 5, положение «b»). Более того, было показано, что ДНК-аптамер к ВИЧ-интегразе, имеющий идентичную15-ТВА топологию, взаимодействует с тремя ионами калия.

Рисунок 5. Схематическое изображение структуры 15-ТВА. Фиолетовый: TGT-петля;

голубой: G квадруплекс;

бежевый: TT-петли. Буквами a, b, c и оранжевыми кругами обозначены возможные положения катионов В данной работе гипотезы о положения катиона в структуре 15-ТВА проверяли методами КM/MM и ИК. Результаты КM/MM оценки устойчивости положения К + в трёх катион-связывающих сайтах показывают, что наличие 2 катионов калия в структуре аптамера маловероятно, поскольку один из катионов вытесняется в раствор. Наиболее предпочтительно расположение катиона калия в центре квадруплекса, когда он связан координационными взаимодействиями с атомами О6 гуанинов (Рис. 6).

Рисунок 6. Поведение ионов в разных типах комплексов с 15-ТВА в QM/MM экспериментах. Слева: расстояние между катионом и геометрическим центром квадруплекса. Граница квадруплекса обозначена фиолетовой прерывистой линией;

если расстояние находится в пределах между 0 и границей, то катион располагается в центральном сайте связывания. Справа: схематическое изображение траекторий катионов. Цвета катионов соответствуют цветам линий на графике слева.

В прямом эксперименте по изотермической калориметрии, показано, что стехиометрия комплекса близка к 1:1 (Табл. 2). Более того, по результатам конкурентного связывания Ва2+ и К+ с 15-ТВА оказалось, что катионы занимают один и тот же сайт:

титрование комплекса катиона бария с аптамером катионом калия показало полное отсутствие связывания К+.

Комплексообразование 15-ТВА с катионами исследовали методом МД и его результаты полностью согласуются с данными КM/MM и ИК. В молекуле 15-ТВА существует три потенциальных катион-связывающих сайта (Рис. 5, положения «а», «b» и «с»). Однако, два из них, верхний и нижний, функционируют как временные ионные ловушки, из которых катион поступает в центральный сайт. Предполагаемый механизм захвата катиона приведен на Рис. 7. Когда в структуре 15-ТВА нет катиона, электростатическое отталкивание между некомпенсированными частичными зарядами карбонильных кислородов О6 гуанинов квартета расталкивает азотистые основания, увеличивая площадь полости между ними. Атом N3 гуанина G8 из верхней петли, располагающегося прямо над полостью, также имеет частичный отрицательный заряд, что вынуждает азотистое основание G8 отодвинуться в плоскости, параллельной квадруплексу, в сторону от полости.

Образовавшийся «просвет» между нуклеотидами T9 и G8 позволяет катиону проникнуть в верхний сайт связывания. Затем электростатическое притяжение между катионом и карбонильными кислородами затягивает катион в центральный сайт. Заряд катиона компенсирует негативные частичные заряды кислородов, что приводит к уменьшению расстояния между гуанинами в квартете и перемещению основания G ближе к Т9. В итоге «ворота», направляющие катион внутрь квадруплекса, закрываются, запирая ион внутри.

Рисунок 7. Механизм «захвата» катиона квадруплексом через верхний сайт связывания В модельных экспериментах катионы предпочтительно связывались с верхним сайтом. В настоящей работе показано, что это связано со стерическими затруднениями нижнего сайта связывания из-за взаимодействий между петлями. Для того, чтобы оценить влияние петель на взаимодействия с катионом, проводили моделирование МД олигонуклеотидов, представляющих собой 15-ТВА, лишенный тех или иных петель.

Показали, что наличие петель не является обязательным для связывания катиона, но они играют важную роль в регулировании процесса связывания иона.

Согласно результатам МД, TGT-петля имеет как минимум три независимых функции. Во-первых, она предотвращает разрушение структуры 15-ТВА до момента захвата стабилизирующего катиона. Во-вторых, петля затрудняет первичное связывание катиона, стерически затрудняя его путь в центр квадруплекса: 15-ТВА, лишённый TGT петли и не имеющий связанного катиона, быстрее захватывает ион из раствора, но в то же время гораздо менее устойчив: в случае, если такая структура не образовывала комплекс с катионом до шестой нс траектории МД, она неизбежно разрушалась (время жизни квадруплексной структуры 15-ТВА без стабилизирующего катиона способно составлять сотни нс). И в-третьих, в молекулах, захвативших катион, петля помогает удерживать его внутри.

Рисунок 8. Обмен катионом между 15-ТВА, лишённым нижних петель, и раствором.

Пришедший из раствора катион выделен чёрным цветом В моделировании МД впервые показан полный спонтанный обмен катионом между раствором и квадруплексом. Это имело место в одном из экспериментов со структурой 15-ТВА, лишённой ТТ-петель (Рис. 8). Вытеснение ранее связанного катиона произошло через нижнюю часть структуры, что было вызвано связыванием катиона из раствора с верхним сайтом (через TGT-петлю). Пришедший катион занял позицию в центре квадруплекса сразу после того, как изначально связанный катион покинул эту область.

Это означает, что, возможно, большинство процессов обмена катиона проходят без дестабилизации G-ДНК, даже в случае квадруплексов, состоящих только лишь из двух квартетов.Электростатическое отталкивание между двумя катионами не позволяет образоваться комплексу 1:2 между аптамером и катионами, для этого необходимо наличие более стабильной ионной ловушки, такой, как петли аптамера к ВИЧ-интегразе (где стэкинг-взаимодействия нуклеотидов с прилежащим G-квартетом дополняются неканоническими T-G взаимодействиями между азотистыми основаниями петель) или еще один квартет.

Уменьшение площади стэкинг-взаимодействий нуклеотидов TGT петли с верхним квартетом приведёт к уменьшению константы связывания катиона калия с квадруплексом. Это предположение было подтверждено с помощью ИКТ 15-ТВА и модифицированного 15-ТВА с заменой G8 на С (15-ТСТ) с ионами калия и бария (Табл.

2).

Таблица 2. Термодинамические параметры связывания тромбина с катионами* Ka, M- Аптамер Ион стехиометрия 125 мкM 15-TBA 750 мкM KCl 4 1. 125 мкM 15-TBA 750 мкM BaCl2 4 1, 125 мкM 15-TCT 750 мкM KCl Не детектируется 250 мкM 15-TCT 833 мкM KCl 4 0. 250 мкM 15-TCT 833 мкM BaCl2 4 1, 2. *буфер: 140 мM LiCl, 20 мM Tрис-HCl, pH = 6, 15-ТСТ демонстрирует слабое связывание с ионами калия, в то время как сродство к барию мало изменилось по сравнению с 15-TGT. По-видимому, уменьшение поверхности стэкинг-взаимодействий верхней петли с квадруплексом приводит к облегчению проникновения катиона в центральный сайт связывания;

для К + (экспериментальное координационное число 5-6) это означает также, что и выход из квадруплекса менее затруднен, чем в случае 15-TGT, что приводит к постоянному обмену ионами между аптамером и раствором. В случае с Ва2+, согласно КM/MM расчётам, его координационное число в квадруплексе - 8, что позволяет ему взаимодействовать со всеми карбонильными кислородами G-ДНК, образуя прочный комплекс.

Результаты МД также способствуют ответу на вопрос, что первично — сборка квадруплексной структуры с последующим «захватом» стабилизирующего катиона, или образование квадруплекса вокруг иона в растворе. Согласно модельным экспериментам, квадруплекс без стабилизирующего катиона способен сохранять структуру в течение нескольких сотен наносекунд, что является достаточным временем для «захвата» катиона из раствора. Более того в ряде модельных экспериментов наблюдали следующее: если начиналась существенная деформация квадруплекса, то попадание катиона в центр молекулы приводило к быстрому (времена порядка 1 нс) восстановлению квадруплекса.

Ранее было показано, что 15-ТВА образует внутримолекулярные квадруплексные структуры при низких температурах в растворах, не содержащих катионов, способных стабилизировать такие структуры. Это может означать, что олигонуклеотиды находятся в постоянном процессе сборки-разборки в водном растворе при комнатной температуре, и добавление ионов калия лишь сдвигает конформационное равновесие в сторону собранной формы. Таким образом, катион стабилизирует преформированную структуру квадруплекса, направляя ее дальнейшую сборку, но не является инициатором сборки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В диссертационной работе проанализирована структура 15-членного антитробинового ДНК-аптамера (15-ТВА, мономолекулярного антипараллельного G квадруплекса) с использованием метода моделирования МД в силовом поле parmbc0, оптимизированном для нуклеиновых кислот, в диапазоне от 0,1 до 1 мкс. Результаты моделирования доказаны с помощью гибридного КМ/ММ-подхода и изотермической калориметрии. Применение КМ/ММ-подхода, помимо учёта эффекта поляризации электронных облаков, позволило оценить реалистичное время (~2 пс) диффузии К + в центр квадруплекса. Проведен статистический анализ геометрии квадруплекса известных на текущий момент структур G-ДНК.

Показано, что основным фактором, влияющим на геометрию структуры G-ДНК, являются характеристики петель, соединяющих квартеты квадруплекса. В зависимости от длины, типа и расположения, петли квадруплексных структур могут оказывать как деструктивное, так и стабилизирующее воздействие на квадруплекс.

Вклад петель в структурообразование и устойчивость квадруплекса может быть опосредованным, через оказание влияния на комплексообразование между квадруплексом и катионом — ключевое событие для поддержания устойчивости структуры G-ДНК. В работе показано, что катионы, не являясь инициаторами сборки квадруплекса, стабилизируют уже собранные G-ДНК, либо взаимодействуют с пре собранными квадруплексами, обеспечивая их дальнейшую сборку. Процесс комплексообразования затруднён в случае наличия в структуре олигонуклеотида петель, препятствующих захвату катиона из раствора, но благодаря петлям связанный катион удерживается внутри структуры.

Для повышения устойчивости 15-ТВА необходимо оптимизировать его структуру.

Это нельзя делать за счёт ТТ-петель, поскольку сравнительным моделированием МД комплексов тромбина с аптамером показано, что ТТ-петли взаимодействуют с тромбином. Можно изменять тип стабилизирующего катиона и стэкинг-взаимодействия TGT-петли с верхним G-квартетом квадруплекса. С помощью моделирования МД 15 ТВА, имеющего различную конформацию TGT-петли показано, что для устойчивости молекулы необходимо наличие не менее двух нуклеотидов в стэкинге с верхним квартетом.

ВЫВОДЫ 1. Согласно моделированию молекулярной динамикой (МД) структура 15-членного ДНК аптамера 15TBA и его комплекса с тромбином корректно описывается только ЯМР моделью, но не РСА-моделью 2. Методом моделирования МД описано три потенциальных участка связывания катионов с аптамером. Изотермической калориметрией (ИКТ) и гибридным методом КМ/ММ показана эквимольная стехиометрия комплекса с К +;

ион расположен в центре квадруплекса 3. Нуклеотиды трех петель квадруплекса образуют стэкинг-взаимодействия с верхним и нижним квартетами. Согласно моделированию МД площадь перекрывания оснований определяет конформационную устойчивость 15ТВА;

а также удержание катиона внутри квадруплекса, что коррелирует с данными ИКТ 4. При взаимодействии катиона с аптамером моделирование МД выявляет противоположную функцию петель квадруплекса: они стерически затрудняют комплексообразование, но этот же фактор препятствует диссоциации уже образованного комплекса 5. Согласно моделированию МД катион связывается только частично развернутым или полностью сформированным квадруплексом 6. 75 разрешенных структур квадруплексных ДНК из банка PDB рассортированы на групп согласно типу петель и количеству олигодезоксирибонуклеотидных цепей.

Геометрия квадруплекса зависит от типа петель: латеральные петли наиболее сильно искажают G-ДНК;

структуры с пропеллерными петлями характеризуются оптимальной геометрией квадруплекса.

Список работ по теме диссертации Reshetnikov R.V., Golovin A.V., Spiridonova V.A., Kopylov A.M., Sponer J. Structural Dynamics of Thrombin-Binding DNA Aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG) Quadruplex DNA Studied by Large-Scale Explicit Solvent Simulations. Journal of Chemical Theory and Computation, 2010, V.6, P. 3003- Решетников Р.В., Копылов А.М., Головин А. В. Классификация G-квадруплексных ДНК по углу вращения квадруплекса и планарности G-квартетов. Acta Naturae, 2010, Том 2, № 4(7), с. 80- Решетников Р.В., Головин А.В., Копылов А.М. Сравнение моделей 15-звенного ДНК аптамера к тромбину с помощью симуляции молекулярной динамики. Биохимия (Москва), 2010, Том 75, вып. 8, с. 1124- Решетников Р.В., Головин А.В., Копылов А.М. Рациональный дизайн антитромботического агента нового поколения. 2011, ХVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», г. Москва Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov T., Yuminova A., Spiridonova V., Arutyunyan A. Structural Studying of Two-module Thrombin Binding DNA Aptamers. 2010, 2nd International Conference on Drug Discovery & Therapy, Dubai, UAE Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Sponer, J. Large scale molecular dynamics simulations bring in-depth insights into thrombin DNA aptamer structure and function. 2010, EMBO, Barcelona, Spain Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov T., Spiridonova V., Arutyunyan A., Yuminova A.

Modular constractions of thrombin binding dna aptamer as molecular recognition nanoelement.

2010, 3rd International Seminar on Nanosciencies and Nanotechnologies, Habana, Cuba Решетников Р.В., Головин А.В., Копылов А.М. Рациональный дизайн антитромботического агента нового поколения. 2010, III Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech», г. Москва Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov T., Yuminova A., Spiridonova V., Arutyunyan A. Structural Studying of Conformational Interplay within Two-module Thrombin Binding DNA Aptamers. 2009, FEBS, Prague, Chech Republic Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Rassokhina O., Zavyalova E., Turchaninov T., Yuminova A., Spiridonova V., Arutyunyan A. Structural studying of G-quadruplex based thrombin binding DNA aptamers. 2009, Royal Chemical Society, Manchester, Great Britain Решетников Р.В., Головин А.В, Спиридонова В.А, Копылов А.М. Модульное конструирование аптамеров методами суперкомпьютерных вычислений. 2008, Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech», г. Москва Решетников Р.В., Головин А.В., Спиридонова В.А., Копылов А.М. ДНК-аптамеры к тромбину. 2008, ХV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», г.

Москва Решетников, Р.В., Головин А.В., Спиридонова В.А., Копылов А.М. Изучение структурного поведения аптамеров к тромбину методом молекулярной динамики. 2007, ХIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», г. Москва