Изучение процесса аморфной агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики: действие детергентов

На правах рукописи

ПАНЮКОВ ЮЛИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА АМОРФНОЙ АГРЕГАЦИИ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ:

ДЕЙСТВИЕ ДЕТЕРГЕНТОВ 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе физических методов измерений НИИ физико-химической биологии им. А. Н.

Белозерского Московского государственного университета им. М. В.

Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Е. Н. Добров, кандидат физико-математических наук, В. А. Драчев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н. Б. Гусев доктор химических наук, профессор А. В. Ефимов

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита состоится «_» 2006 г. в _ на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Долгое время процессы аморфной агрегации белков изучались в основном в контексте проблем пищевой промышленности. Однако с развитием биотехнологии и увеличением доли лекарственных препаратов на белковой основе в фармацевтике, процессы аморфной агрегации стали создавать серьёзные технические и экономические проблемы и в этих отраслях хозяйства [18]. Это привело к увеличению числа работ, посвящённых исследованию процессов аморфной агрегации белков, а выражаясь точнее, работ посвященных поиску путей предотвращения аморфной агрегации. Работами ряда лабораторий было показано, что детергенты могут не только ингибировать агрегацию белков, но и разрушать аморфные агрегаты и вызывать ренатурацию белков [15, 20-22].

Несколько лет назад, когда выяснилось, что причиной ряда важных заболеваний человека (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) являются именно аморфные агрегаты – предшественники зрелых амилоидов [7, 9], изучение процессов агрегации белков и влияния на эти процессы детергентов стало особенно актуальным.

Белок оболочки (БО)2 вируса табачной мозаики (ВТМ) характеризуется ярко выраженной склонностью к образованию упорядоченных агрегатов (т.н.

«полимеров») (рис. 1) [8]. Формирование «полимеров» БО ВТМ происходит за счёт сильных специфических межсубъединичных взаимодействий разных типов [16].

Кроме того, этот белок является удобной моделью и для изучения неупорядоченной (аморфной) агрегации. Процесс термоиндуцированной (52 °C) аморфной агрегации БО ВТМ хорошо воспроизводим и может легко регулироваться путём изменения условий среды [3, 17].

Согласно данным рентгено-структурного анализа [16] субъединица БО ВТМ состоит из классического пучка из четырех -спиралей, расположенного в вирусной частице вблизи оси вириона и менее упорядоченной части, расположенной ближе к Нам представляется удобным использование старого термина «детергент», поскольку термин «сурфактант» в русском языке используется мало, а сокращением ПАВ во многих случаях пользоваться не удобно.

Список сокращений: БО – белок оболочки, ВТМ – вирус табачной мозаики, ДЛС – динамическое лазерное светорассеяние, ДСН – додецилсульфат натрия, ФБ – фосфатный буфер, рН 8,0, ЦТАБ – цетилтриметиламмонийбромид, A320 – кажущееся поглощение при длине волны 320 нм, обусловленное светорассеянием (оптическая плотность), Vin – начальная скорость прироста А320 в ходе агрегации.

поверхности вириона, на расстояниях более 65 от его оси (рис. 2). «Внешняя» часть молекулы содержит значительное число гидрофобных остатков, образующих так называемый «гидрофобный гребень» вблизи поверхности вириона. В составе гидрофобного гребня располагаются и все имеющиеся в молекуле БО ВТМ остатки тирозина (2, 70, 72, 139) и триптофана (17, 52, 152) [16].

Термоиндуцированная аморфная агрегация БО ВТМ вызывается нарушением баланса между электростатическим отталкиванием молекул белка и их взаимным притяжением, определяемым мужсубъединичными взаимодействиями.

Агрегация инициируется за счёт аберрантных взаимодействий частично разупорядоченных участков гидрофобного гребня молекул белка [3, 17].

Ранее нами было показано, что при внесении до начала агрегации анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) в низких концентрациях (15 молекул детергента на одну молекулу белка) полностью ингибирует термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ [4]. Поэтому мы решили исследовать действие детергентов двух других групп на БО ВТМ. В качестве таковых нами был выбран катионный детергент цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) и неионный детергент Тритон Х-100.

додецилсульфат натрия цетилтриметиламмонийбромид Тритон Х- Целью данной работы было исследование возможных структурных и кинетических механизмов агрегации и дезагрегации БО ВТМ под действием детергентов разных групп. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать действие анионного детергента ДСН, катионного детергента ЦТАБ и неионного детергента Тритон Х-100 на БО ВТМ при комнатной температуре.

2. Исследовать влияние ДСН, ЦТАБ и Тритон Х-100 на термоиндуцированную (52 °С) аморфную агрегацию БО ВТМ.

3. Изучить процесс индуцированной нагреванием и детергентами аморфной агрегации БО ВТМ методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).

Научная новизна и практическая значимость работы.

Исследовано действие детергентов трёх разных групп на БО ВТМ при разных условиях среды. Выяснено, что в зависимости от своей природы и условий среды исследованные детергенты могут по-разному влиять на БО ВТМ, причём даже действие одного детергента может меняться на прямо противоположное при изменении его концентрации или температуры.

Обнаружено, что анионный детергент ДСН в концентрациях от 250 мкМ предотвращает термоиндуцированную аморфную агрегацию БО ВТМ, не защищая молекулу белка от термоиндуцированного разупорядочения гидрофобного гребня. В более высоких концентрациях (от 460 мкМ) ДСН вызывает денатурацию этого участка молекулы БО ВТМ при комнатной температуре (25 °С), но этого оказывается не достаточно для индукции агрегации.

Катионный детергент ЦТАБ, известный как «искусственный шаперон» [20, 21], в высоких концентрациях (от 400 мкМ) вызывает реверсию термоиндуцированной агрегации БО ВТМ. Оказалось, однако, что в чрезвычайно низких концентрациях (от 17 мкМ) этот детергент оказывает противоположное действие – не только не ингибирует термоиндуцированную агрегацию, но, напротив, эффективно индуцирует агрегацию БО ВТМ при 25 °С в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,0-8,0. Результатом такой агрегации является образование детергент-белковых комплексов, в составе которых на одну молекулу белка приходится четыре молекулы детергента. Предположительно, аморфной агрегации под действием ЦТАБ при 25 °С подвергаются нативные молекулы БО ВТМ. Добавление ДСН в ходе агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, вызывает реверсию агрегации вследствие образования смешанных мицелл из двух детергентов. Использование детергента, несущего противоположный заряд, для удаления «искусственного шаперона» с белка, по видимому, может представляться в некоторых случаях более удобным вариантом, чем общепринятое использование циклодекстринов [20, 21].

Концентрации ЦТАБ ниже индуцирующих агрегацию при комнатной температуре (около 0,00005 %) способны защищать БО ВТМ от агрегации при длительном хранении при комнатной температуре. Вероятно, ЦТАБ может защитить и другие белки от подобной неприятности.

Обнаружено также, что другой «искусственный шаперон» – неионный детергент Тритон Х-100, подобно ЦТАБ, в высоких концентрациях (около 5 мМ) предотвращает аморфную агрегацию БО ВТМ при 52 °С. Однако в концентрациях более низких (от 460 мкМ) Тритон Х-100 сам вызывает аморфную агрегацию молекул БО ВТМ при 30 °С, которая может быть реверсирована добавлением ДСН. Эффект индукции агрегации БО ВТМ при помощи Тритон Х-100 сильно зависит от температуры, что может объясняться необходимостью частичной денатурацией молекул белка для инициирования процесса агрегации.

Таким образом, звание «искусственных шаперонов» [20, 21] детергенты оправдывают отнюдь не всегда. Более того, влияние конкретного детергента на отдельно взятый белок невозможно предсказать, а можно выяснить лишь экспериментальным путём.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на ХI и ХII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2004, 2005), на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2006). Работа была апробирована на совместном заседании Учёного Совета Факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М. В. Ломоносова МГУ и Отдела физических методов измерений НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского МГУ и на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 11 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 175 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы.

Работа содержит 2 таблицы и 48 рисунков. Список литературы включает литературных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение ВТМ и его БО. В работе использовали препараты дикого (U1) штамма ВТМ. Вирус выращивали на растениях Nicotiana tabacum var. Samsun и выделяли стандартным методом [1]. Выделение БО из вирионов ВТМ проводили ацетатным методом [12].

УФ-спектроскопия. УФ-спектры БО ВТМ, детергентов и их смесей измеряли на двулучевых спектрофотометрах «Shimadzu UV-1601» (Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Япония) или «SPECORD UV-VIS» (Carl Zeiss Jena, Германия) в области 190-350 нм. Для определения концентрации ВТМ и использованных в работе белков использовали коэффициенты поглощения: A 0.1% = 2,30 для ВТМ, A 0.1% = 1,30 для БО ВТМ (Dobrov et al., 1977), A 0.1% = 2,63 для лизоцима, 280 A 0.1% = 0,83 для миоглобина и A 0.1% = 0,65 для БСА. В случае светорассеивающих 280 препаратов спектры истинного поглощения рассчитывали с помощью метода экстраполяции [2, 11].

Турбидиметрия. Измерения кинетики прироста оптической плотности (кажущегося поглощения – A320) проводили на спектрофотометрах «SLM-Aminco DW-2000» (Aminco, США) или «SPECORD UV-VIS» в термостатированных кюветах.

Флуоресцентная спектроскопия. Измерения спектров флуоресценции БО ВТМ проводили на спектрофлуориметре «Hitachi MPF-4» (Hitachi Inc., Япония) в термостатированных кюветах. Для измерения спектров эмиссии в области 300-400 нм использовали УФ-свет с длинной волны 280 нм.

Спектроскопия кругового дихроизма. Спектры КД препаратов вирусов и белков в областях 198-250 и 250-350 нм измеряли на модифицированном дихрографе «Jobin-Ivon Mark V» (Франция). Для области 250-350 нм величины КД выражали в молярных коэффициентах дихроического поглощения, а для области 198-250 нм – в величинах молярной эллиптичности.

Аналитическое ультрацентрифугирование проводили на ультрацентрифуге «Beckman E» (Beckman, США), оборудованной сканером и мультиплексной оптикой при длине волны 275 нм, при +4 °С и скоростях вращения от 1000 до 40000 об/мин. Расчет коэффициента седиментации производили обычным методом [1].

Динамическое лазерное светорассеяние. Измерения проводили на установке Photocor Complex (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 nm, 10 mW) в качестве источника света.

Температура образцов поддерживалась при помощи PID temperature controller в пределах 0,1 °C. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени. Обработку автокорреляционных функций и расчёт величин D и Rh осуществляли при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль) [6, 13].

Дифференциальная сканирующая калориметрия. Калориметрические измерения проводили в дифференциальном адиабатическом сканирующем калориметре «ДАСМ-4» (Биоприбор, Россия). Эксперименты проводили при постоянном избыточном давлении 2 атм. Скорость нагрева составляла 1 град/мин.

Обратимость тепловых переходов проверяли путём повторного прогрева образцов.

Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) детергентов. Для определения ККМ ЦТАБ и Тритон Х-100 использовали методику спектрофотометрического определения ККМ, предложенную в работе Salette Reis и соавт. [19].

Для определения стехиометрии связывания ЦТАБ с БО ВТМ в препараты белка (11,5-23 мкМ) добавляли различные концентрации ЦТАБ (5,75- мкМ). Образцы инкубировали в течение 48 часов при 25 °С, затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 20 мин при +4 °С в центрифуге «Beckman J2-21» (Beckman, США). Концентрацию БО ВТМ в супернатанте вычисляли из величины А280, а процент осевшего в ходе центрифугирования белка – из разницы между исходной концентрацией белка и концентрацией белка в супернатанте.

Для определения количества ЦТАБ, оставшегося в супернатанте в случае высоких молярных соотношений [ЦТАБ]:[БО], в супернатант добавляли вторую порцию БО ВТМ (до конечной концентрации 28,8 мкМ). Образцы вновь инкубировали в течении 48 часов, центрифугировали и процент БО ВТМ осевшего в ходе второго центрифугирования рассчитывали, как описано выше.

При использовании инструментальных методов сбор данных, их анализ и все необходимые расчёты выполняли с помощью специального программного обеспечения, которым оборудованы приборы. Последующую обработку данных осуществляли при помощи программы Origin 7.5 (MicroCal Software, Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ранее нами было показано, что анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) в низких концентрациях (примерно 15 молекул детергента на одну молекулу белка) эффективно ингибирует термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ [4]. В ходе наших экспериментов выяснилось, что катионный детергент ЦТАБ в концентрациях от 2 мкМ не только не ингибирует термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ, но заметно ускоряет этот процесс.

Действие ЦТАБ на БО ВТМ при комнатной температуре. Оказалось, что ЦТАБ в низких концентрациях (от 17 мкМ) индуцирует аморфную агрегацию БО ВТМ даже при комнатной температуре причём в 10 мМ нейтральном фосфатном буфере (ФБ) (при такой низкой молярности ФБ термоиндуцированной агрегации не наблюдается).

Обнаруженный феномен индукции агрегации низкими концентрациями ЦТАБ представляется весьма удивительным. Как правило, детергенты используются для предотвращения агрегации и разрушения агрегатов [15, 20-22]. В нашем случае мкМ ЦТАБ оказывается достаточно для индукции агрегации при комнатной Рис. 2. Структура [16] и аминокислотная последовательность [24] молекулы БО ВТМ.

Выделены аминокислотные остатки тирозина Рис. 1. Фазовая диаграмма агрегационных (темно-серые) и триптофана (светло-серые). Ось форм БО ВТМ [8]. вириона проходит вертикально слева.

температуре.

В использовавшихся нами условиях ЦТАБ не вызывал агрегации других исследованных белков – яичного лизоцима, миоглобина из сердца лошади и бычьего сывороточного альбумина.

0.4 Начальная скорость прироста Vin, опт.ед./мин оптической плотности (Vin) в ходе 0. аморфной агрегации, индуцированной 0. ЦТАБ при 25 °С сильно зависела от 0. концентрации детергента (рис. 3). При 0. 0 100 200 300 400 агрегации различных концентраций БО cЦТАБ, мкМ ВТМ Vin увеличивалась с повышением Рис. 3. Зависимость начальной скорости [ЦТАБ]:[БО] до 10:1, при дальнейшем прироста А320 от концентрации ЦТАБ в ходе агрегации БО ВТМ, индуцируемой увеличении [ЦТАБ]:[БО] начинала падать, ЦТАБ при 25 °С в 10 мМ ФБ.

и при молярном соотношении с белком Концентрации БО ВТМ: 5,75 (1), 11,5 (2), 17,25 мкМ (3).

выше 25:1 ЦТАБ уже не индуцировал аморфную агрегацию БО ВТМ при 25 °С.

2 Как известно, главная (и, log (Vin*10 ) возможно, единственная) функция БО ВТМ заключается в формировании целого ряда упорядоченных белковых агрегатов (в т.ч.

вирионов) [8]. Поэтому не исключено, что -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0. обнаруженный нами индуцирующий log [ФБ] агрегацию эффект ЦТАБ будет проявляться Рис. 4. Зависимость начальной скорости прироста А320 от концентрации ФБ в ходе и в отношении ряда других белков, для агрегации 11,5 мкМ БО ВТМ, индуцируемой 34,3 мкМ ЦТАБ которых характерно образование длинных ([ЦТАБ]:[БО] = 3:1) при 25 °С (1), упорядоченных агрегатов (актина, агрегации, индуцируемой 460 мкМ Тритон Х-100 ([Тритон]:[БО] = 40:1) при 30 °С (2). тубулина). Поскольку известные (3) – для сравнения зависимость для амилоидогенные белки и пептиды (амилоид термоиндуцированной (52 °С) агрегации [3].

, -синуклеин, прионный белок и др.) также проявляют способность формировать и длинные упорядоченные, и аморфные агрегаты, не исключено, что их аморфная агрегация также может быть индуцирована при физиологических условиях низкими концентрациями ЦТАБ.

Vin в ходе термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ характеризуется весьма необычной зависимостью от ионной силы среды (рис. 4, кривая 3) [3], однако, Vin в ходе аморфной агрегации БО ВТМ, индуцированной микромолярными концентрациями ЦТАБ, мало зависела от ионной силы среды (рис.

4, кривая 1), что говорит о различиях в механизмах между двумя видами агрегации.

Для определения величины ККМ ЦТАБ в условиях наших экспериментов мы воспользовались методикой спектрофотометрического определения ККМ [19].

Исходя из полученных данных можно заключить, что в условиях наших экспериментов молекулы ЦТАБ от добавленного сразу % связавшегося белка самоассоциируются в мицеллы начиная с (а) концентраций 250-300 мкМ. Таким образом, аморфная агрегация БО ВТМ при комнатной температуре индуцируется 2 свободными молекулами ЦТАБ, а не мицеллами детергента. К сожалению, нам 0 2 4 6 8 не удалось измерить ККМ ЦТАБ в от второго добавления присутствии белка потому, что спектр БО % связавшегося белка (б) ВТМ имеет мощный максимум поглощения в используемой для определения ККМ области.

3 Из данных, представленных на рис. 5 (а), видно, что в случае трёх 0 2 4 6 8 [ЦТАБ] : [БО] исследованных нами концентраций БО ВТМ процент агрегированного белка Рис. 5. Определение стехиометрии линейно зависит от молярного соотношения комплексов ЦТАБ с БО ВТМ, формирующихся в ходе агрегации при [ЦТАБ]:[БО], но не от абсолютных °С в 10 мМ ФБ. Концентрации БО ВТМ:

11,5 (1), 17,15 (2) и 23 мкМ (3). концентраций компонентов. Весь, имеющийся в системе белок, осаждается при 15000 g при молярном соотношении [ЦТАБ]:[БО] равном примерно 4:1.

Для ответа на вопрос, остаётся ли ЦТАБ в супернатанте после центрифугирования при молярных соотношениях [ЦТАБ]:[БО] выше 4:1, в супернатанты после первого центрифугирования добавлялась вторая порция белка и после повторной инкубации препараты вновь центрифугировались. Три линии, соответствующие разным исходным 1. концентрациям белка на рис. 5 (б), 1.2 пересекают ось абсцисс при значениях A320, опт. ед.

0.9 [ЦТАБ]:[БО] между 4 и 5. Таким образом, 0.6 весь избыточный ЦТАБ остаётся в системе свободным, готовым связать новую порцию 0. БО ВТМ, что свидетельствует о 0. 0 10 20 кооперативности взаимодействий t, мин детергента с белком.

Рис. 6. Реверсия аморфной агрегации 11, По нашим данным, спектры мкМ БО ВТМ, индуцированной 103, мкМ ЦТАБ ([ЦТАБ]:[БО] = 9:1) при 25 °С собственной флуоресценции нативного БО (1) и индуцированной 460 мкМ ([Тритон]:[БО] = 40:1) при 30 °С (2). ДСН ВТМ (5,75 мкМ) и белка в присутствии добавлялся в соотношениях:

низких концентраций ЦТАБ (5,75-17, [ДСН]:[ЦТАБ] = 3:1, [ДСН]:[Тритон] = 1: (10 мМ ФБ). мкМ), зафиксированные через 5 минут после начала агрегации, практически не отличаются. Это свидетельствует о том, A, опт. ед.

4 что, ЦТАБ, индуцируя аморфную агрегацию белка, не нарушает его третичную структуру, по крайней мере, на 0 начальных стадиях агрегации.

190 220 250 280 310, нм В последние годы, особенно после Рис. 7. Истинные УФ-спектры работ лаборатории Gellman, ЦТАБ стал поглощения 5,75 мкМ БО ВТМ в 10 мМ широко известен, как «искусственный ФБ при 25 °С в отсутствии ЦТАБ (1), после инкубации (75 мин) с [ЦТАБ]:[БО] шаперон», предотвращающий агрегацию = 3:1 (2), через 2 часа после реверсии агрегации при помощи [ДСН]:[ЦТАБ] = денатурированных молекул белков после 3:1;

ресуспендированный осадок (4) и разбавления из высоких концентраций супернатант (5) после центрифугирования 15000 g. мочевины или гуанидин хлорида [20-21]. В экспериментах, проведённых лабораторией Gellman, использовались концентрации ЦТАБ около 0,6 мМ [20]. Мы обнаружили, что гораздо более низкие концентрации ЦТАБ индуцируют агрегацию нативных молекул БО ВТМ при комнатной температуре, а более высокие концентрации детергента, использованные в работах Gellman, агрегацию при комнатной температуре действительно не вызывают.

Добавление анионного детергента ДСН в ходе аморфной агрегации БО ВТМ, индуцируемой катионным детергентом ЦТАБ, вызывает реверсию агрегации.

Как видно из рис. 6 (кривая 1), добавление [ДСН]:[ЦТАБ] = 3:1 приводит к падению величины А320, что свидетельствует о реверсии процесса агрегации. Опытами с добавлением других концентрации ДСН показано, что именно молярное град*см *дмоль- (а) соотношение детергентов равное 3: является оптимальным для реверсии ЦТАБ-индуцированной агрегации БО - [], ВТМ с помощью ДСН.

- 240 260 280 300 320 Однако падение величины А, нм происходит при этом не до нулевого, град*см2*дмоль- (б) значения. Наличие в системе остаточной оптической плотности свидетельствует о - присутствии светорассеивающих частиц.

- 1 Для определения их природы нами был []* - поставлен следующий эксперимент. БО 200 210 220 230 240 ВТМ подвергался инкубации в, нм присутствии ЦТАБ при 25 °С, затем в Рис. 8. Спектры КД в «ближнем» (а) и «дальнем» (б) УФ-свете исходного (1) и систему добавляли ДСН, что вызвало освобождённого из агрегатов (2) БО ВТМ в 10 мМ ФБ при 25 °С. Агрегация была реверсию агрегации. Препарат индуцирована добавлением ЦТАБ до центрифугировали и измеряли УФ молярного соотношения [ЦТАБ]:[БО] = 3:1 и через 10 мин реверсирована спектры супернатанта и добавлением ДСН до молярного ресуспендированного осадка.

соотношения [ДСН]:[ЦТАБ] = 3:1.

Как видно из спектров, представленных на рис. 7, в осадке (кривая 5) отсутствует белок. Спектр осадка имеет максимум только в коротковолновой области, на 193,4 нм, а, следовательно, является спектром детергента (или смеси детергентов). Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что остаточная оптическая плотность в системе после реверсии ЦТАБ-индуцированной агрегации при помощи ДСН обусловлена исключительно детергентами, но не белком.

Возможность разрушить агрегаты при помощи ДСН позволила изучить структуру молекул БО ВТМ, вышедших из агрегатов, методом КД-спектросопии.

Спектры нативного БО ВТМ и спектры БО ВТМ, освобожденного из агрегатов, представленные на рис. 8, и в «ближнем» и в «дальнем» УФ-свете практически не отличаются. Следовательно, после освобождения из состава агрегатов молекулы БО ВТМ находятся в нативном состоянии с исходной вторичной и третичной структурой.

Известно, что молекула БО ВТМ содержит 16 отрицательно заряженных и 13 положительно заряженных групп [24]. Таким образом, электростатическое связывание четырех молекул ЦТАБ с субъединицей БО ВТМ должно приводить субъединицу белка в близкое к электронейтральному состояние. Поэтому наиболее вероятным механизмом ЦТАБ-индуцированной агрегации БО ВТМ является нейтрализация отрицательных зарядов субъединиц белка путём связывания положительно заряженных «головок» молекул детергента и формирование дополнительных гидрофобных участков на поверхностях субъединиц белка за счёт «хвостов» молекул детергента. Связывание молекул ЦТАБ с субъединицами БО ВТМ приводит одновременно к уменьшению электростатического отталкивания между молекулами белка и к повышению общей гидрофобности поверхности субъединиц белка. Совокупное действие этих двух факторов приводит к тому, что молекулы БО ВТМ слипаются за счёт гидрофобных межсубъединичных взаимодействий образовавшихся за счёт присоединения детергента, а также за счёт уже имеющихся гидрофобных участков на поверхности субъединиц белка.

Большинство отрицательно заряженных аминокислотных остатков локализовано на поверхности субъединицы БО ВТМ и не участвует в формировании пар зарядов внутри молекулы [16]. Четыре карбоксильных группы (E50, D77, E95 и E106) в составе вириона формируют знаменитые «каспаровские» карбоксил карбоксилатные пары. В свободном белке эти группы существуют в свободном состоянии и, таким образом, могут быть первыми кандидатами для связывания ЦТАБ.

Ослабление эффекта индукции агрегации при молярных соотношениях [ЦТАБ]:[БО] выше 10:1 мы объясняем следующей схемой. Присутствие в системе дополнительного количества молекул ЦТАБ приводит к гидрофобным взаимодействиям «хвостов» «избыточных» молекул детергента с гидрофобными сайтами белка, а также к гидрофобным взаимодействиям между «избыточными» молекулами ЦТАБ и молекулами ЦТАБ, электростатически связанными с субъединицами БО ВТМ. Результатом таких взаимодействий является образование «шубы» положительных зарядов на поверхности субъединиц белка, состоящей из «головок» детергента и собственных положительных зарядов аминокислотной последовательности белка. Формирование такой «шубы» усиливает электростатическое отталкивание между субъединицами БО ВТМ и препятствует агрегации.

На основании полученных данных мы предполагаем, что реверсия ЦТАБ индуцированной агрегации БО ВТМ под действием ДСН обусловлена формированием смешанных мицелл, в состав которых входят оба детергента.

Гидрофобные и электростатические взаимодействия между молекулами ДСН и ЦТАБ, по-видимому, оказываются сильнее взаимодействий ЦТАБ с отрицательно заряженными сайтами на поверхности субъединиц БО ВТМ. По крайней мере, часть образующихся смешанных мицелл должна иметь крупный размер, чтобы обуславливать заметное светорассеяние и оседать при 15000 g. Наличие как положительных, так и отрицательных зарядов на поверхности смешанных мицелл по всей вероятности и обуславливает их способность к формированию ассоциатов.

Обнаруженный нами факт того, что ЦТАБ-индуцированная агрегация БО ВТМ происходит, по-видимому, без потери молекулами белка их нативной структуры ещё раз демонстрирует «шаперонные» свойства ЦТАБ в системе, сильно отличающейся от систем, описанных в работах Gellman [20-21].

Использование для удаления детергента с белка пары, состоящей из катионного и анионного детергентов, может в некоторых случаях быть более удобным, чем использование 4,8 мМ циклодекстрина, применяемого лабораторией Gellman [20] (необходимые концентрации противоположно заряженного детергента существенно ниже концентраций плохо растворимых циклодекстринов).

Мы обнаружили также, что ЦТАБ может индуцировать при 25 °С (10 мМ ФБ) агрегацию даже цельных вирионов ВТМ. Такая агрегация не сопровождается разрушением вирионов и также реверсируется добавлением ДСН.

Кроме того, оказалось, что добавление концентраций ЦТАБ ниже индуцирующих агрегацию (1,44-2,9 мкМ) препятствует агрегации БО ВТМ, вызванной длительным (несколько суток) хранением при комнатной температуре.

Увеличение оптической плотности препаратов белков в ходе длительной инкубации при комнатной температуре обычно связано с денатурацией и последующей агрегацией и/или с бактериальным проростом. Оказалось, что даже 2 чрезвычайно низкие концентрации ЦТАБ I, отсчёт/сек (0,00005 %) способны защищать БО ВТМ (а, возможно, и другие белки) от подобных неприятностей.

Методом ДЛС нами был 0 10 20 30 40 (а) проведён сравнительный анализ кинетики t, мин 1500 термоиндуцированной агрегации БО ВТМ и агрегации, индуцированной ЦТАБ при Rh, нм 25 °С. ДЛС – мощный и продуктивный метод исследования, давно уже успешно использующийся для решения самых разнообразных задач биохимии, биофизики и молекулярной биологии. Как 0 10 20 30 40 (б) t, мин видно из рис. 9 (б) (кривые 1), в случае Рис. 9. Зависимость интенсивности термоиндуцированной агрегации БО ВТМ лазерного светорассеяния (а) и гидродинамического радиуса (б) от в начальный момент измерений в системе времени в ходе термоиндуцированной обнаруживаются агрегаты с агрегации 5,75 мкМ БО ВТМ (50 мМ ФБ) – кривые 1 и в ходе агрегации 11,5 мкМ гидродинамическим радиусом (Rh) около БО ВТМ, индуцированной 34,3 мкМ ЦТАБ при 25 °С (10 мМ ФБ) – кривые 2. 20 нм, которые мы назвали стартовыми Линии на рис. (б) проведены в агрегатами. Как оказалось, Rh стартовых соответствии с уравнением. В случае термоиндуцированной агрегации df = 1,80, агрегатов не зависит от концентрации для агрегации, индуцированной ЦТАБ, df белка. В ходе прогрева при небольших = 1,74.

временах в системе обнаруживается только один тип агрегатов, мы их назвали базовые агрегаты. Через несколько минут после начала агрегации зависимость Rh(t) для базовых агрегатов подчиняется степенному закону: Rh = Rh [1 + K1 (t t * )]1/d, где t* – * f время начала выполнения уравнения, Rh соответствует Rh при t = t*, K1 – константа, df * – фрактальная размерность. В случае термоиндуцированной агрегации df = 1,80.

Подчинение зависимости Rh(t) степенному закону и значение df в пределах 1,70-1, свидетельствуют о том, что формирование базовых агрегатов происходит в режиме, при котором скорость агрегации лимитируется диффузией частиц, и каждое столкновение частиц приводит к слипанию [14].

В случае термоиндуцированной агрегации в момент достижения интенсивностью лазерного светорассеяния постоянной предельной величины распределение агрегатов по размерам становится бимодальным. В системе появляется второй тип агрегатов – суперагрегаты. В этот момент размер базовых агрегатов перестаёт увеличиваться и останавливается на величине 135 нм. Предельный размер базовых агрегатов не зависит от концентрации БО ВТМ.

Мы полагаем, что суперагрегаты формируются за счёт слипания базовых агрегатов, т.к. только подобным образом можно объяснить переходы между частицами при постоянстве интенсивности светорассеяния.

В отличие от термоиндуцированной агрегации, в ходе агрегации, индуцированной ЦТАБ, рост размеров агрегатов во времени происходит монотонно (рис. 9 (б), кривые 2). Полидисперсности в системе не обнаруживается. Увеличение размеров агрегатов начинается с величины примерно 100 нм, характеризующей размер стартовых агрегатов, который не зависит от концентраций компонентов системы. Рост размеров агрегатов во времени следует степенному закону при временах выше 13 мин, и величина df при этом составляет 1,74, т.е. с t = 13 мин агрегация, индуцированная ЦТАБ, выходит на режим, при котором скорость агрегации лимитируется скоростью диффузии частиц.

Таким образом, методом ДЛС в ходе термоиндуцированной (52 °С) аморфной агрегации БО ВТМ зафиксировано разделение популяции агрегатов на два типа: базовые агрегаты и суперагрегаты. В случае агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, такого феномена не обнаружено.

Действие ДСН на БО при комнатной температуре. Оказалось, что анионный детергент ДСН в молярном соотношении с белком 40:1 и выше вызывает разупорядочение гидрофобного гребня молекулы БО ВТМ (по данным флуоресцентной спектроскопии) при комнатной температуре. Причём этот эффект не зависит от ионной силы среды. Как оказалось, такого разупорядочения под действием ДСН, однако, не достаточно для индукции агрегации БО ВТМ при комнатной температуре.

Действие Тритон Х-100 на БО ВТМ при комнатной температуре. В самые последние годы наблюдается стремительное увеличение числа белков и пептидов, используемых в медицинской практике. В связи с этим одной из важнейших задач фармакологии 1. 3 становится защита этих пептидов и белков от денатурации, агрегации, протеолиза, 1. A320, опт. ед.

адсорбции прочих проблем в ходе их 0. 2 изготовления и, особенно, хранения.

0.4 Известно, что одним из наиболее 1 эффективных средств такой защиты 0. 0 5 10 15 20 25 являются детергенты, и чаще всего – t, мин неионные [5, 10, 18, 23]. Поэтому мы Рис. 10. Регистрируемая по приросту А индукция аморфной агрегации 11,5 мкМ БО решили изучить действие неионного ВТМ (100 мМ ФБ) в присутствии 0,46 мМ детергента Тритон Х-100 на БО ВТМ.

Тритон Х-100 при 25 (1), 30 (2), и 35 °С (3).

Как оказалось, и Тритон Х-100 индуцирует агрегацию БО ВТМ при температурах, близких к комнатной. Однако концентрации Тритон Х-100, необходимые для индукции агрегации оказываются на порядок выше концентраций ЦТАБ, необходимых для индукции агрегации при 25 °С.

Как видно из рис. 10, при 25 °С в присутствии 460 мкМ Тритон Х- прирост А320 в системе, содержащей БО ВТМ, ещё невелик. Однако при увеличении температуры в этих условиях на каждые 5 °С скорость прироста оптической плотности резко увеличивается. Обнаруженный характер температурной зависимости индукции агрегации и наличие лаг-периода на кривых увеличения оптической плотности БО ВТМ по всей вероятности должен свидетельствовать об участии денатурационных изменений в процессе аморфной агрегации БО ВТМ, индуцированной Тритон Х-100. Напомним, что ни в случае термоиндуцированной агрегации, ни в случае агрегации, индуцируемой ЦТАБ при 25 °С, лаг-период не обнаруживается.

В пользу предположения о денатурационных изменениях в молекулах БО ВТМ в ходе аморфной агрегации, индуцированной Тритон Х-100, говорит и обнаруженное нами снижение температуры плавления 11,5 мкМ БО ВТМ в присутствии 460 мкМ Тритон Х-100 по данным ДСК с 41 до 37 °С.

По нашим данным, молекулы Тритон Х-100 самоассоциируются в мицеллы при концентрациях около 500 мкМ. Таким образом, концентрации Тритон Х-100, индуцирующие аморфную агрегацию БО ВТМ, находятся в районе ККМ детергента.

Как видно из рис. 4 (кривая 2), зависимости начальной скорости прироста А320 от молярности ФБ для агрегации БО ВТМ, индуцированной Тритон Х-100 при °С, весьма сходна с таковой для термоиндуцированной агрегации, но резко отличается от той, которая наблюдается в случае агрегации, индуцированной ЦТАБ при 25 °С.

Мы полагаем, что мицеллы Тритон Х-100 взаимодействуют с молекулами белка и вызывают их частичную денатурацию. Вероятно, эта денатурация происходит в области гидрофобного гребня, т.к. именно данный участок субъединицы БО является наименее стабильным [3, 17]. Сидящие на мицеллах частично денатурированные молекулы БО ВТМ взаимодействуют с другими свободными или связанными с мицеллами субъединицами белка с формированием крупных агрегатов, состоящих из молекул белка и мицелл Тритон Х-100.

Оказалось, что аморфная агрегации БО ВТМ, индуцированная Тритон Х 100, может быть обращена добавлением [ДСН]:[Тритон Х-100] = 1:5 (рис. 6, кривая 2). Опытами с добавлением различных концентрации ДСН было показано, что именно данное молярное соотношение детергентов является оптимальным для реверсии Тритон-индуцированной агрегации БО ВТМ.

Нам представляется наиболее вероятным, что реверсия Тритон индуцированной агрегации БО ВТМ, как и реверсия ЦТАБ-индуцированной агрегации, может быть обусловлена превращением мицелл Тритон Х-100 в смешанные мицеллы Тритон + ДСН. Причём, как видно, для такого превращения оказывается достаточным присутствия одной молекулы ДСН на 5 молекул Тритон Х 100.

В пользу идеи о реверсии Тритон-индуцированной агрегации БО ВТМ под действием ДСН за счёт образования смешанных мицелл говорит факт наличия остаточной оптической плотности в системе после реверсии агрегации. Эта остаточная оптическая плотность, по нашему мнению, как и в случае реверсии ЦТАБ индуцированной агрегации, обусловлена крупными светорассеивающими ассоциатами смешанных мицелл, в состав которых входят два детергента.

Действие ЦТАБ, ДСН и Тритон Х-100 на термоиндуцированную аморфную агрегацию БО ВТМ. Как видно из рис. 11 (кривая 2), при добавлении ДСН в ходе агрегации БО ВТМ при 52 °С, происходит понижение величины А320.

Величина А320 падает почти до нуля при абсолютной концентрации детергента равной примерно 250 мкМ.

При добавлении ЦТАБ в ходе термоиндуцированной агрегации БО ВТМ, величина А320 приближается к нулю значению при концентрациях ЦТАБ выше мкМ (рис. 11, кривая 1). Опытами с 1.8 другими концентрациями белка и 1.5 2 детергентов показано, что максимальный A320, опт. ед.

1. эффект достигается именно при данных 0. концентрациях ДСН и ЦТАБ. Таким 0. образом, и ДСН, и ЦТАБ способны 0. вызывать реверсию 0. 0 5 10 15 20 термоиндуцированной аморфной t, мин агрегации БО ВТМ.

Рис. 11. Реверсия термоиндуцированной ( °С) аморфной агрегации 11,5 мкМ БО ВТМ Мы предполагаем следующий (50 мМ ФБ) под действием 400 мкМ ЦТАБ механизм реверсии (1), 250 мкМ ДСН (2) и 5 мМ Тритон Х- (3). термоиндуцированной агрегации БО ВТМ под действием ДСН или ЦТАБ. Молекулы детергента связываются «хвостами» с гидрофобными гребнями субъединиц БО, уже частично вовлеченными в аберрантные межсубъединичные взаимодействия, ведущие к формированию агрегатов. Взаимодействие хвостов детергентов с БО ВТМ приводит к скоплению зарядов «головок» молекул детергента, связанных с участками гидрофобных гребней разных субъединиц БО. Электростатическое отталкивание одноимённых зарядов ведёт к разрыву межсубъединичных связей и, как следствие, к разрушению белковых агрегатов.

Как видно из рис. 11 (кривая 3), Тритон Х-100 вызывает реверсию термоиндуцированной агрегации БО ВТМ в концентрациях от 5 мМ. Реверсия и ингибирование термоиндуцированной агрегации БО в этом случае являются, по нашему мнению, следствием полного покрытия субъединиц белка мицеллами детергента и, как следствие, защитой от взаимодействий с другими субъединицами.

Таким образом, катионный детергент ЦТАБ и неионнный детергент Тритон Х-100 индуцируют аморфную агрегацию БО ВТМ при температурах, близких к комнатной. Причём необходимые для индукции агрегации концентрации Тритон Х 100 оказываются примерно в 20 раз выше, чем необходимые концентрации ЦТАБ.

Анионный детергент ДСН предотвращает и реверсирует термоиндуцированную ( °С) аморфную агрегацию БО ВТМ, однако, ни при каких из исследованных нами условий не индуцирует аморфную агрегацию БО.

На основании всех полученных данных можно заключить, что агрегационные характеристики БО ВТМ (и, возможно, других белков) могут быть изменены в любую сторону действием различных детергентов. Однако подбор детергентов и условий их действия, вероятно, представляет собой отдельную задачу для каждого белка.

ВЫВОДЫ 1. Обнаружено, что свободные молекулы катионного детергента ЦТАБ в концентрациях от 17 мкМ индуцируют аморфную агрегацию молекул БО ВТМ при комнатной температуре (25 °С) в нейтральном ФБ, результатом чего является формирование детергент-белковых комплексов с соотношением [ЦТАБ]:[БО] равном всего 4:1. Предположительно агрегации подвергаются нативные молекулы БО ВТМ.

2. Методом динамического лазерного светорассеяния в ходе термоиндуцированной (52 °С) аморфной агрегации БО ВТМ зафиксировано разделение популяции агрегатов на два типа: базовые агрегаты и суперагрегаты. В случае агрегации БО ВТМ, индуцированной ЦТАБ, такого явления не обнаружено.

3. Мицеллы неионного детергента Тритон Х-100 (концентрации детергента от мкМ) индуцируют аморфную агрегацию БО ВТМ при 30 °С. Индукция агрегации, по-видимому, происходит после частичной денатурации молекул белка.

4. Анионный детергент ДСН ни при каких из исследованных нами условий не индуцирует аморфную агрегацию БО ВТМ.

5. Все три исследованных нами детергента оказывают реверсирующее действие на термоиндуцированную (52 °С) аморфную агрегацию БО ВТМ: ДСН в концентрациях выше 250 мкМ, ЦТАБ в концентрациях выше 400 мкМ, Тритон Х-100 в концентрациях от 5 мМ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Панюков Ю. В., Рафикова Э. Р. «Ингибирование аморфной агрегации белков низкими концентрациями додецилсульфата натрия». Тезисы докладов ХI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Секция биология. Москва, 12-15 апреля 2004, с. 123.

2. Рафикова Э. Р., Панюков Ю. В., Арутюнян А. М., Ягужинский Л. С., Драчёв В.

А., Добров Е. Н. «Низкие концентрации Ds-Na ингибируют аморфную агрегацию белка оболочки вируса табачной мозаики и влияют на стабильность белка». Биохимия, 2004, том 69, вып. 12, с. 1683-1690.

3. Курганов Б. И., Чеботарёва Н. А., Панюков Ю. В., Добров Е. Н., Федуркина Н.

В., Мицкевич Л. Г. «Кинетика агрегации белков». III съезд биофизиков России.

Воронеж, 24-29 июня 2004. Тезисы докладов, том I, с. 60.

4. Панюков Ю. В., Немых М. А. «Обратимая аморфная агрегация вируса табачной мозаики и его белка оболочки при комнатной температуре индуцируемая цетилтриметиламмонийбромидом». XVII зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».

Москва, 7-10 февраля 2005. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 46.

5. Панюков Ю. В., Немых М. А. «Влияние ионных детергентов на аморфную агрегацию белка оболочки вируса табачной мозаики». Материалы ХII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва, 12-15 апреля 2005, том II, с. 31.

6. Панюков Ю. В., Немых М. А., Добров Е. Н. «Возможные механизмы индуцированной детергентами аморфной агрегации белков». II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005.

Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 100.

7. Панюков Ю. В., Рафикова Э. Р., Добров Е. Н. «Неупорядоченная агрегация белка оболочки вируса табачной мозаики, при комнатной температуре индуцируемая цетилтриметиламмонийбромидом». Доклады академии наук, 2005, том 402, вып. 6, с. 835-837.

8. Панюков Ю. В., Добров Е. Н., Курганов Б. И. «Изучение тепловой агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики методом динамического лазерного светорассеяния». Международный симпозиум «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, 12-16 сентября 2005. Материалы симпозиума, с. 95-98.

9. Yuliy V. Panyukov, Maria A. Nemykh, Elvira R. Rafikova, Boris I. Kurganov, Lev S. Yaguzhinsky, Alexander M. Arutyunyan, Vladimir A. Drachev, and Evgeny N.

Dobrov «Low cetyltrimethylammonium bromide concentrations induce reversible amorphous aggregation of tobacco mosaic virus and its coat protein at room temperature». The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2006, volume 38, issue 4, pp. 533-543.

10. Markossian, K. A., Kurganov, B. I., Levitsky, D. I., Khanova, H. A., Chebotareva, N.

A., Samoilov, A. M., Eronina, T. B., Fedurkina, N. V., Mitskevich, A. M., Merem'yanin, A. V., Kleymenov, S. Y., Makeeva, V. F., Muronetz, V. I., Naletova, I.

N., Shalova, I. N., Asryants, R. A., Schmalhausen, E. V., Saso, L., Panyukov, Y. V., Dobrov, E. N., Yudin, I. K., Timofeeva, A. C., Muranov, K. O., and Ostrovsky, M.

A. «Mechanism of the chaperone-like activity» (pp. 89-171) in Protein Folding: New Reseach. Nova Science Publishers, Inc., 2006.

11. Панюков, Ю. В., Козловский, В. С. «Агрегирующее и дезагрегирующее действие детергентов на белок оболочки вируса табачной мозаики». 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука ХХI века».

Пущино, 17-21 апреля 2006. Сборник тезисов, с. 87.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Практикум по общей вирусологии (2002). Издательство МГУ.

2. Ксенофонтов А. Л. и др. (2005). Мол. биол., 40, 172-179.

3. Орлов В. Н. И др. (2001). Биохимия, 66, 195-204.

4. Рафикова Э. Р. и др.(2004). Биохимия, 69, 1683-1690.

5. Arakawa T. & Kita Y. (2000). J. Pharm. Sci., 89, 646-651.

6. Baussay K. et al. (2004). Int. J. Biol. Macromol., 34, 21-28.

7. Bucciantini M. et al. (2002). Nature, 416, 507-511.

8. Butler P.J.G. (1984). J. Gen. Virol., 65, 253-279.

9. Chiti F. et al. (2002). Nat. Struct. Biol., 9, 137-143.

10. Chou D. K. et al. (2005). J. Pharm. Sci., 94, 1368-1381.

11. Dobrov E. N. et al. (1977). Biochim. Biophys. Acta, 475, 623-637.

12. Fraenkel-Conrat H. (1957). Virology, 4, 1-4.

13. Goldin A. A. (1991). Opt. Spectrosk., 71, 485-489.

14. Lin M. Y. et al. (1989). Proc. Royal Soc. A., 423, 71-87.

15. McMeekin T. L. et al. (1949). J. Biol. Chem., 71, 3606-3609.

16. Namba K. et al. (1989). J. Mol. Biol., 208, 307-325.

17. Rafikova E. R. et al. (2003). Int. J. Biochem. Cell Biol., 35, 1452-1460.

18. Randoph T. W. & Jones L. S. (2002). Pharm. Biotechnol., 13, 159-175.

19. Reis S. et al. (2004). Anal. Biochem., 334, 117-126.

20. Rozema D. & Gellman H. S. (1996). J. Biol. Chem., 271, 3478–3487.

21. Rozema D. & Gellman H. S. (1996). Biochemistry, 35, 15760-15771.

22. Tandon S. & Horowitz P. (1986). J. Biol. Chem., 261, 15615-15681.

23. Webb S. D. et al. (2003). J. Pharm. Sci., 92, 715-729.

24. Wittmann-Liebold B. & Wittmann H.G. (1967). Mol. Gen. Genet., 100, 5818-5822.