Оксигенные фототрофные микроорганизмы, ассоциированные с гидроидом dynamena pumila
На правах рукописи
Кравцова Татьяна Робертовна ОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ГИДРОИДОМ DYNAMENA PUMILA Специальность 03. 02. 10. – гидробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2013
Работа выполнена на кафедрах биоинженерии и гидробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Ильяш Людмила Васильевна (Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова) доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Кокшарова Ольга Алексеевна (Научно-исследовательский институт физико химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова)
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Симаков Юрий Георгиевич (Московский государственный университет технологий и управления) доктор биологических наук, старший научный сотрудник Куликов Алексей Михайлович (Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН)
Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)
Защита диссертации состоится «28» ноября 2013 г. в 11часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.55 при Московском государственном совете имени М.В.Ломоносова, по адресу: 119234 Москва, Ленинские горы, 1, 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, аудитория 389.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «» октября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Карташева Н.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Эпибиоз – это ассоциация, состоящая из организма хозяина (базибионта) и живущих на нем организмов (эпибионтов). Эпибиоз широко распространен в водных экосистемах, при этом в качестве базибионта выступают водная растительность, простейшие и многоклеточные животные, в том числе гидроидные полипы (Di Camillo et al., 2005, 2008;
Romagnoli et al., 2007;
Martnez Garca et al., 2011;
Burke et al., 2011). Обязательным компонентом всех эпибионтных сообществ, обитающих в фотической зоне, являются оксигенные фототрофные микроорганизмы (ОФМ): цианобактерии и одноклеточные водоросли. Исследования эпибионтных ОФМ актуальны с точки зрения оценки видового разнообразия, биотических взаимоотношений между компонентами и продуктивности водных экосистем.
Проведенные ранее исследования эпибионтных ОФМ, ассоциированных с гидроидным полипом Dynamena pumila, обитающим в Белом море, выявили присутствие разнообразных цианобактерий и эукариотных водорослей, которые, за исключением диатомовых водорослей, не были идентифицированы (Лобакова и др., 2008;
Gorelova et al., 2013). Идентификация многих ОФМ представляет значительную трудность, и для уточнения их систематического положения с успехом используются молекулярно-генетические методы (Ernst et al., 2003;
Taylor et al., 2007;
Perkerson et al., 2011 и др.). Именно на основе их применения выявлено, что значительная часть видов ОФМ в природных водных экосистемах еще не идентифицирована, отсутствуют сведения об их ареалах и функциональной роли в экосистемах (Follows et al., 2007).
В предыдущих исследованиях показано, что среди ОФМ, ассоциированных с D. pumila, по численности преобладают цианобактерии и диатомовые водоросли (Горелова и др., 2009;
Gorelova et al., 2013), тогда как оценки их биомассы, а также сведения о динамике биомассы в течение летнего периода до настоящего времени отсутствовали.
Цель работы - оценка численности и биомассы оксигенных фототрофных микроорганизмов, ассоциированных с гидроидным полипом Dynamena pumila и определение таксономического положения ОФМ, выделенных из ассоциации с гидроидом.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
- Оценить численность и биомассу диатомовых водорослей и цианобактерий основных компонентов эпибионтного сообщества беломорского гидроида Dynamena pumila в июне и августе.
- Получить изоляты ОФМ, из ассоциаций с гидроидом D. pumila.
- Охарактеризовать морфологию, ультраструктуру и состав пигментов ОФМ, изолированных из ассоциаций с гидроидом D. pumila микроорганизмов.
- Провести молекулярно-генетическое типирование и филогенетический анализ ОФМ, изолированных из ассоциации с гидроидом D. pumila.
Научная новизна. Выявлена выраженная сезонная и пространственная изменчивость биомассы эпибионтных диатомей и цианобактерий на молодых междоузлиях беломорского гидроида Dynamena pumila. Показано достоверное различие в трендах величины биомассы диатомовых водорослей и цианобактерий в летний период. Впервые в ассоциации ОФМ с гидроидом D. pumila идентифицированы цианобактерии Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp.
Установлено, что ближайшие родственники этих ОФМ обитают как в морских, так и пресных водоемах разных широт. Цианобактерии Leptolyngbya sp. 2Dp86E и Nostoc sp. 10Dp66E являются новыми видами для биоты Белого моря. В ассоциации с Nostoc sp. впервые выявлена гетеротрофная бактерия рода Gemmatimonas.
Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представления о видовом разнообразии и обилии ОФМ, ассоциированных с беспозвоночными животными, обитающими в Белом море. Результаты могут быть использованы при оценке продукционного потенциала Белого моря, а также при решении таких фундаментальных задач гидробиологии и экологии, как выявление механизмов формирования видовой структуры и поддержания видового разнообразия эпибионтных сообществ. Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp., Desmodesmus sp. ведутся как лабораторные культуры, которые могут быть использованы в биотехнологических проектах в качестве продуцентов биологически активных соединений. Результаты могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по гидробиологии.
Апробация работы и публикации. Диссертационная работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании кафедр гидробиологии и биоинженерии, на заседании международного биотехнологического центра МГУ имени М.В.Ломоносова. Результаты работы доложены и обсуждены на международной научной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера» (Апатиты, 2009), на международной научно-практической конференции «Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах» (Киров, 2010), на 2-ой и 3-ей Московских международных конференциях «Молекулярная филогения» (Москва, 2010, 2012), на 4-ой международной Европейской конференции микробиологов FEMS (Женева, 2011), на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), на 4-ой международной конференции «Актуальные проблемы современной альгологии» (Киев, 2012), на международной конференции «Физиология и биотехнология микроводорослей» (Москва, 2012).
По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературных источников, включающего 361 наименований.
Глава 1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Освещены вопросы, касающиеся закономерностей формирования эпибионтных сообществ. Рассмотрены состав эпибионтных ОФМ и их пространственно-временная изменчивость на разных группах организмов базибионтах. Дана общая характеристика колониального гидроида Dynamena pumila и состава ассоциированных с ним ОФМ. В Белом море D.pumila распространен в сублиторали, обитает в основном на фукусах, встречается также на камнях, аскофиллумах и ламинариях. Высота колоний редко превышает 7 см. Тело гидроида представляет собой разветвленную двухслойную трубу, часть которой - столоны гидроризы прикреплены к субстрату. Вдоль столон гидроризы примерно через каждые 2,5 мм образуются вертикально поднимающиеся побеги, которые также ветвятся. Ствол побега состоит из междоузлий длиной 2-3 мм, отделенных друг от друга сужением ствола. Гидранты располагаются на стволе побега друг против друга, лишены ножки и приплюснуты к стволу, имеют внешний скелет – гидротеку (Марфенин, 1993). Удлинение колонии происходит моноподиальным способом с терминально расположенными зонами роста. При средней температуре воды 12-18С новое терминальное междоузлие может развиваться за 24-72 ч (Косевич, Федосов, 2008;
Gorelova et al., 2013).
Также обсуждены современные молекулярно-генетические методы и их применение для исследований ОФМ, обитающих в водных экосистемах.
Глава 2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Образцы колоний гидроида D. pumila отбирали в верхнем горизонте сублиторали Ругозерской губы Кандалакшского залива Белого моря в районе Беломорской биологической станции МГУ имени Н.А. Перцова в июне и августе 2006 г. и 2007 г. С апикальной части колоний 3-5 гидроидов срезали первые 4– междоузлий. В лаборатории с помощью светового микроскопа Leica DM2500 делали фотографии поверхности гидроида, включая фронтальную сторону междоузлия, зону слияния ствола и гидротеки. В июне было сделано 30 фотографий, в августе – 16. По фотографиям на участках определенной площади, выбранных случайным образом, подсчитывали количество эпибионтных ОФМ. Количество клеток (N) пересчитывали на 1 мм2 поверхности гидроида. Объемы клеток определяли методом геометрического подобия (Hillebrand et al., 1999). Величину биомассы в единицах углерода (B) рассчитывали по аллометрическим уравнениям (Menden-Deuer, Lessard, 2000). Площадь поверхности колонии гидроида рассчитывали по средним линейным размерам междоузлия (Марфенин, 1993) методом геометрического подобия, принимая, что высота побега составляет 20-25 междоузлий с учетом бокового ветвления 30-300% в зависимости от возраста колонии (Марфенин, 1993).
Достоверность различий средних значений N и B оценивали по критерию Манна Уитни с использованием программы PAST (PAleontological STatistics) Version 2. (http://folk.uio.no/ohammer/past/).
В работе использованы накопительные культуры ОФМ, выделенные из ассоциаций с D. pumila сотрудниками каф. биоинженерии биологического факультета МГУ. Выделение моновидовых изолятов цианобактерий и эукариотных водорослей из накопительных культур проведено с участием автора. Изоляты культивировали на жидкой и твёрдой (1.5% агара) минеральной среде BG-11 и её безазотном аналоге BG-110 (Stanier et al., 1971).
Спектры поглощения клеточных суспензий в видимом и ближнем ИК диапазоне снимали на спектрофотометре снабженном Hitachi 150-20, интегрирующей сферой. Компенсацию на вклад светорассеяния осуществляли, как описано в работе (Merzlyak, Razi Naqvi, 2000).
Выделение хромосомной ДНК из цианобактерий проводили согласно методике (Koksharova et al., 1998). Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей генов 16S pPHK-23S pPHK проводили по методике (Papaefthimiou et al., 2008). В качестве праймеров применяли опубликованные нуклеотидные последовательности (Nbel et all., 1997;
Taton et all., 2003) и праймеры, дизайн которых был осуществлен в настоящей работе. Нуклеотидные последовательности nifH гена амплифицировали с помощью праймеров (Ben-Porath, Zehr, 1994). Для амплификации фрагментов нуклеотидных последовательностей 18S pPHK в качестве праймеров применяли нуклеотидные последовательности (Katana et al, 2001). Все праймеры синтезировали в компании «Синтол» (Россия).
Амплификацию проводили в амплификаторе ТЕРЦИК (НПФ «ДНК-Технология», Россия).
Ампликоны клонировали в векторе pJET 1.2/blunt с помощью набора для клонирования ПЦР фрагментов CloneJetTM PCR Cloning Kit # K1231 фирмы Fermentas (EU). Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в ЦКП «Геном».
Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программ и BLAST BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer) с использованием нуклеотидных баз данных секвенированных геномов микроорганизмов. Нуклеотидные последовательности изучаемых ОФМ сравнивали с последовательностями, представленными в генном банке (GenBank) с помощью программы BLAST с отбором их по степени сходства, обеспечивающей достаточное разнообразие видов.
Последовательности отобранных видов выравнивали посредством программы MEGA 5.1 (http://www.megasoftware.net/) с использованием алгоритма ClustalW v.1.6. Для филогенетических построений использовали метод кластеризации - метод ближайшего соседа (Neighbor-Joining) с предварительным выбором оптимальной эволюционной модели нуклеотидных замен (MEGA 5.1). Статистическую надежность топологий получаемых деревьев оценивали с помощью бутстреп анализа в 1000 повторностях (MEGA 5.1).
Глава 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Пространственно-временная динамика ОФМ, ассоциированных с колониальным гидроидом Dynamena pumila. В летний период на первых пяти междоузлиях беломорских гидроидов D. pumila присутствуют одноклеточные и трихомные цианобактерии, диатомовые и зеленые водоросли.
Диатомовые водоросли. В июне встречались только «прикрепленные» формы Cocconeis scutellum, C. costata и Licmophora sp. В августе видовое богатство диатомей увеличилось до 20 таксонов. В июне средние значения численности (N) и биомассы (В) диатомей составили 2,09±1,85 тыс. кл./мм2 и 0,130 ±0,115 мкг С/мм2), соответственно. В августе значения N и B были достоверно (р0,02) ниже, чем в июне, средние значения составили 1,45 ±2,74 тыс. кл./мм2 и 0,091 ±0,170 мкг С/мм2.
По биомассе в июне и в августе доминировал C. scutellum.
Цианобактерии. Как в июне, так и в августе, отмечены трихомные формы, по морфологическим признакам принадлежащие к и субсекциям, и III IV одноклеточные формы. В июне N цианобактерий менялась от 0,53 до 292,50 тыс.
кл./мм2 в зависимости от локализации на побегах гидроида. Наибольшая N отмечалась в местах слияния гидротеки со стволом гидроида. В июне средние значения N и B составили 27,02±60,86 тыс. кл./мм2 и 0,54±1,23 мкг С/мм2, соответственно. В августе N и В были высоко достоверно (р 0,01) больше, чем в июне, средние значения составили 100,73±124,00 тыс. кл./мм2 и 2,03±2,44 мкг С/мм2, соответственно.
В июне величины биомассы диатомей и цианобактерий достоверно не различались (р=0,72), тогда как в августе биомасса цианобактерий была высоко достоверно (р 0,01) больше биомассы диатомей.
Сравнительный анализ полученных результатов с опубликованными данными показал следующее. Состав эпибионтных диатомей в целом согласуется с ранее опубликованными данными (Лобакова и др., 2008;
Горелова и др., 2009). Такие диатомеи, как Cocconeis costata, Ceratoneis closterium, Nitzcshia cf. sigma, Navicula spp., Fragilaria sp. на D. pumila отмечены впервые. Некоторые диатомеи, выявленные на гидроиде ранее, в исследованных нами образцах отсутствовали.
Вариабельность состава может быть обусловлена как сезонной динамикой, так и зависимостью от локальных гидрологических условий, в которых обитают колонии гидроида. Доминирование среди диатомей водоросли Cocconeis scutellum, которая является «приросшей» формой, свидетельствует о начальном этапе развития эпибионтного сообщества. Это согласуется с возрастом исследованных междоузлий – максимум 2 недели. В зрелых эпибионтных сообществах преобладают диатомеи, прикрепляющиеся к субстрату слизистым тяжом. Видовое богатство эпибионтных диатомей на молодых междоузлиях D. pumila меньше такового в зрелых эпибионтных сообществах на беломорских макрофитах (Бондарчук, 1970;
Георгиев, 2010) и на средиземноморском гидроиде Eudendrium racemosum (Romagnoli et al., 2007), тогда как величины численности и биомассы диатомей оказались сопоставимыми. Численность и биомасса эпибионтных цианобактерий на гидроиде D. pumila были больше, чем аналогичные оценки для E. racemosum (Romagnoli et al., 2007). Сезонная динамика обилия эпибионтных диатомей и цианобактерий на D.
pumila сходна с таковой на E. racemosum. Выявленная пространственная изменчивость обилия эпибионтных диатомей и цианобактерий может быть обусловлена разным возрастом междоузлий, наличием благоприятных для колонизации зон на теле гидробионта, а также микромасштабной неоднородностью гидрологических условий.
3.2. Идентификация оксигенных фототрофных микроорганизмов, ассоциированных с колониальным гидроидом Dynamena рumila. Из ассоциаций с D. рumila было выделено четыре изолята ОФМ, которые идентифицированы по совокупности морфологических, ультраструктурных характеристик, составу пигментов и филогенетическому анализу (табл. 1).
3.2.1. Цианобактерия Synechococcus sp. 1Dp66E-1. Морфология, ультраструктура и пигментный состав. Одноклеточная цианобактерия, клетки не имеют слизистых чехлов. Деление происходит перетяжкой поперечно в одной плоскости. Бинарное деление приводит к образованию двух дочерних клеток как одинаковой, так и разной длины. Форма клеток – палочки, длина 1,5-2,0 мкм, диаметр 0,6-0,8 мкм.
Рельеф поверхности клеток складчатый. В протопласте находятся по 2- периферически расположенных тилакоида, в центре нуклеотид, карбоксисомы.
Резервные полимеры представлены гранулами поли--гидроксибутирата, цианофициновые гранулы отсутствуют (Koksharova et al., 2013).
Молекулярно-генетическое типирование и филогенетический анализ. Определен фрагмент ДНК размером 2277 пар нуклеотидов (п.н.), содержащий большую часть гена 16S pPHK, внутренний транскрибируемый спейсер 16S-23S pPHK и часть гена 23S pPHK. Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с общей коллекцией последовательностей ДНК в GenBank показало, что Synechococcus sp.
1Dp66E-1 не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом.
Полная нуклеотидная последовательность была депонирована в генный банк (GenBank) как Synechococcus sp. 1Dp66E-1 (HM064496.1) (Кокшарова и др., 2010;
Kravzova et al., 2012;
Koksharova et al., 2013).
Таблица 1. Таксономическое положение типированных изолятов.
Изолят Номенклатура бактерий Ботаническая ОФМ номенклатура (Castenholz, 2001) (www.algaebase.org) 1Dp66Е-1 Субсекция I Фила Cyanobacteria Synechococcus sp.
Класс Cyanophyceae 1Dp66Е- (Chroococcales) Порядок Synechococcales Семейство Synechococcaceae Род Synechococcus Субсекция III Фила Cyanobacteria 2Dp86E Leptolyngbya sp.
Класс Cyanophyceae (Oscillatoriales) 2Dp86E Порядок Pseudanabaenales Семейство Pseudanabaenaceae Род Leptolyngbya Субсекция IV (Nostocales) Фила Cyanobacteria 10Dp66E Nostoc sp. 10Dp66E Класс Cyanophyceae Порядок Nostocales Семейство Nostocaceae Род Nostoc Тип Chlorophyta 3Dp86E-1 Desmodesmus sp.
Класс Chlorophyceae _ 3Dp86E- Порядок Sphaeropleales Семейство Scenedesmaceae Род Desmodesmus Филогенетический анализ показал, что Synechococcus sp. 1Dp66E-1 образует кладу, сформированную штаммами Synechococcus spp. и Cyanobium spp. Клада поддерживается референтным штаммом Synechococcus sp. PCC 7009 и объединяет несколько кластеров. Ближайшие родственники беломорского Synechococcus sp.
1Dp66E-1 - планктонные формы, обитающие в разных географических зонах, в пресных и солоноватоводных экосистемах (табл. 2).
Таблица 2. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей генного кластера 16S-23S рРНК Synechococcus sp. 1Dp66E-1 с гомологичными последовательностями из GenBank.
Ближайший Номер клона Идентич- Происхождение штамма или Score родственник из или штамма ность, клона, литературный источник Генного Банка в Генном % банке Озеро Балатон (46050`N;
17044`E), Synechococcus AF330246.1 3422 sp. BGS171 (Ernst et al., 2003).
Synechococcus AF317072.1 3388 sp. BO Боденское озеро (47039`N;
9019`E), Synechococcus AF317078.1 3377 (Ernst et al., 2003).
sp. BO Synechococcus AF317077.1 3341 sp. BO Водохранилище, Саксония, Cyanobium sp. GU935365.1 3296 Европа, (не опубл.).
Sai Озеро, Калифорния, США.
Synechococcus AM709628.1 3431 Референтный штамм, (не опубл.).
sp. PCC Cyanobium sp. AB610888.1 3465 Suigetsu-CR Меромиктическое озеро Суйгецу Cyanobium sp. AB610887.1 3465 (350 35'N;
1350 52'E), отделившееся Suigetsu-CR от Японского моря, Cyanobium sp. AB610890.1 3465 (Ohki et al., 2009).
Suigetsu-CG Cyanobium sp. AB610892.1 3469 Suigetsu-CG Балтийское море, Synechococcus AF330254.1 3321 sp. BS20 (Ernst et al., 2003).
3.2.2. Цианобактерия Leptolyngbya sp. 2Dp86E. Морфология, ультраструктура и пигментный состав. Однорядные неветвящиеся трихомы сильно изогнуты или переплетены между собой, окружены слоистыми чехлами. Клетки цилиндрические или бочковидные, длина 1,5-2,5 мкм, диаметр 1,0-1,5 мкм, делятся бинарно в одной плоскости. Дифференцированные клетки отсутствуют. В центре клетки расположен компактный нуклеоид, рибосомы и карбоксисомы, по периферии вдоль продольной клеточной стенки располагаются тилакоиды (Koksharova et al., 2013).
Молекулярно-генетическое типирование и филогенетический анализ. Определена нуклеотидная последовательность рибосомального кластера п.н.), ( содержащего большую часть гена 16S pPHK, внутренний транскрибируемый спейсер 16S-23S pPHK и часть гена 23S pPHK. Последовательность Leptolyngbya sp.
2Dp86E депонирована в GenBank как Oscillatoriales cyanobacterium 2Dp86E (GU265558.1). Эта цианобактерия не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом (Кокшарова и др., 2009;
Лобакова и др., 2010;
Горелова и др., 2012б;
Кравцова и др., 2012;
Koksharova et al., 2010, 2013;
Kravzova et al., 2012).
Филогенетический анализ выявил общую кладу для последовательностей Leptolyngbya sp. 2Dp86E и цианобактерий родов Leptolyngbya, Nodosolinea, Phormidium, а также других представителей порядков Pseudanabaenales и Oscillatoriales. Ближайшие родственники Leptolyngbya sp. 2Dp86E обитают как в наземных, так и водных экосистемах, они отмечены в планктоне и бентосе пресных и морских водоемов (табл. 3).
3.2.3. Цианобактерия Nostoc sp.10Dp66Е. Морфология, ультраструктура и пигментный состав. Трихомы этой цианобактерии окружены мощными слизистыми чехлами, клетки округлой формы 2,5-3,5 мкм в диаметре. Между вегетативными клетками располагаются гетероцисты и акинеты. Трихомы объединены колониальной слизью. Тилакоиды располагаются неупорядоченно, присутствуют цианофициновые гранулы (Горелова и др., 2012б;
Koksharova et al., 2013).
Молекулярное генетическое типирование и филогенетический анализ. Определен фрагмент ДНК размером 1902 п.н., содержащий большую часть гена 16S pPHK, внутренний транскрибируемый спейсер 16S-23S pPHK и часть гена 23S pPHK.
Последовательность Nostoc sp.10Dp66Е депонирована в GenBank (JQ259187.1). Она не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом (Горелова и др., 2012б;
Кравцова и др., 2012;
Kravzova et al., 2012;
Koksharova et al., 2013).
Филогенетический анализ выявил, что Nostoc sp. 10Dp66Е образует отдельную ветвь и проявляет наибольшее сходство с Nostoc commune NC1, Nostoc commune NC5, Calothrix spp. (табл. 4). Сравнение морфологических признаков Nostoc sp. 10Dp66E с диагнозами Nostoc commune (Komrek, Anagnotidis, 1989) и по результатам сравнения вставок и потерь парных и одиночных нуклеотидов, Nostoc sp. 10Dp66E и Nostoc commune NC1 (ЕU586149.1) являются разными видами (идентичность 94%).
Ближайшие родственники Nostoc sp. 10Dp66E обитают в наземных экосистемах.
Таблица 3. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей генного кластера 16S-23S рРНК Leptolyngbya sp. 2Dp86E с гомологичными последовательностями из GenBank.
Ближайший Номер Score Идентич- Происхождение штамма или родственник из клона или ность, клона, литературный источник Генного Банка штамма в % Генном банке Монтаукский национальный парк, Leptolyngbya AB039012.1 2035 Нью-Йорк, США, PCC (Ishida et. al., 2001).
Донные отложения устьев рек Leptolyngbya sp. HM217044.1 2013 Португалии, (Lopes et. al., 2012).
LEGE Leptolyngbya sp. AJ639893.1 2082 0BB24S Озера Бубано, Басин, Имола, Leptolyngbya sp. AJ639894.1 2033 север Италии, 0BB32S (Castiglioni et. al., 2004).
Leptolyngbya sp. AJ639895.1 2046 0BB19S Морской штамм, коллекция Phormidium sp. EU624415.1 2013 культур Ю. Карстен (Университет SAG 61. Росток, Германия), (Siegesmund et.
al., 2008).
Коллекция культур Ю. Карстен Pseudanabaenaceae EF654067.1 2771 (Университет Росток, Германия), cyanobacterium DPG1-KK5 (Siegesmund et.al. 2008).
д.о.
Oscillatoria AB003168.1 1956 neglecta IAM M-82 (Ishida et al., 1997).
Планктон, Южно-Китайское Nodosolinea EF122600.1 1954 море, (Perkerson et. al., 2011).
nodulosa UTEX Прибрежная зона озера Розплуце, Leptolyngbya N. EU528669.2 2475 Польша, bijugata str.
(Casamatta, Johansen, не опубл.).
Kovacik1986/5aa Почвы пустыни, Leptolyngbya sp. EU528667.2 2152 (Casamatta, Johansen, не опубл.).
SEV4-5-c Почвы пустыни Форт Ирвин Nodosolinea sp. HM018678.1 2596 Мойове, Калифорния, США, FI2-2HA (Perkerson et al., 2011).
Примечание: д.о. - данные отсутствуют В ассоциации с Nostoc sp. 10Dp66E в результате молекулярно-генетического типирования выявлена некультивируемая гетеротрофная бактерия Gemmatimonas (JX437625) (925 п.н.). Эта бактерия является представителем новой бактериальной ХХIV филы «Gemmatimonadetes». Идентифицированная бактерия имеет наибольшее сходство с Gemmatimonas aurantiaca T-27т (Takasaki еt al., 2012).
Таблица 4. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей генного кластера 16S-23S рРНК последовательности Nostoc sp. 10Dp66E с гомологичными последовательностями из GenBank.
Номер Ближайший клона или Идентичность, Происхождение штамма или родственник из штамма в Score клона, литературный источник % Генного банка Генном банке д.о.
Nostoc commune EU586726.1 2693 (Johansen et al., не опубл.).
NC д.о.
Nostoc commune EU586728.1 2666 (Johansen et al., не опубл.).
NC5 clone Луговые почвы, вблизи Врбенских Nostoc commune прудов, Ческе-Будеевице, Чехия, EU784149.1 2681 NC (Rehakova et al., 2007, не опубл).
Стены пещеры Гавайи, (Vaccarino, Calothrix sp.
JN385289.1 2634 HA4356-MV2 Johansen, 2011).
Стены пещеры, Гавайи, (Vaccarino, Calothrix sp.
JN385288.1 2232 HA4356-MV2 Johansen, 2011).
Примечание: д.о. - данные отсутствуют Зелёная водоросль Морфология, 3.2.4. Desmodesmus sp. 3Dp86E-1.
ультраструктура и пигментный состав. Одноклеточная водоросль, клетки округлой формы 4,5-9 мкм в диаметре, без жгутиков. Размножение осуществляется автоспорами (по 8 и более в одном спорангии). Клеточная стенка состоит из спорополленинового и полисахаридного слоев. На внешнем слое клеточной стенки располагаются структуры в виде трубочек и бородавок. Хлоропласт имеет лопастную форму, окружен оболочкой из двух мембран, содержит пиреноид.
Запасные продукты представлены липидными глобулами, крахмальными зёрнами и гранулами, подобными полифосфатным или фенольным (Горелова и др., 2012а;
Лобакова и др., 2012). Состав пигментов соответствует таковому представителей Chlorophyta.
Молекулярно-генетическое типирование изолята проведено сотрудниками кафедры биоинженерии. Филогенетический анализ проведен автором. Получен фрагмент ядерной ДНК (всего 500 п.н.), содержащий внутренний транскрибируемый межгенный спейсер ITSI-5,8-ITS2. Последовательность Desmodesmus sp. 3Dp86E- депонирована в GenBank (JQ313132.1) и не имеет полного сходства ни с одним ранее исследованным организмом.
При анализе последовательности Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 выявлено, что водоросль кластеризуется со значениями бутстрэп-поддержки не ниже 50% с представителями рода В кластере объединились Desmodesmus (табл. 5).
Desmodesmus spp., различающие по биотопическим характеристикам (планктонные и эпибионтные формы) и по отношению к солености (обитают как в пресных, так и морских водах).
Таблица 5. Результаты анализа BLAST, полученные с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей, содержащих внутренние транскрибируемые спейсеры ITS-1-5,8-ITS-2 ядерной ДНК микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, с гомологичными последовательностями из GenBank.
Ближайший Номер родственник из клона Идентичность, Происхождение штамма или Score Генного Банка штамма в клона, литературный источник % Генном банке Планктон морских прибрежных Desmodesmus sp. JX046421.1 897 вод, юго-восток побережья FG Аргентины, (Do Nascimento et al., Desmodesmus sp. JX046420.1 897 2012).
M1- Ассоциация с гидроидом Coryne Desmodesmus sp. JQ313131.1 886 lovenii, Белое море, (не опубл.).
2CL66E Ассоциация с трохофорной Desmodesmus sp. JQ313134.1 886 личинкой полихеты Phyllodoce 1Pm66B maculate, Белое море, (не опубл.).
Ассоциация с губкой Desmodesmus sp JQ313133.1 883 Halichondria panacea, Белое 1Hp86E- море, (не опубл.).
Desmodesmus DQ417558.1 655 bicellularis isolate Пруд Итаского Национального NDem 9/21 T-17d парка, Миннесота (не опубл.).
Desmodesmus DQ417562.1 655 komarekii isolate Tow 10/11 T-16W Озеро Мери, Итаский Desmodesmus DQ417525.1 767 Национальный парк, Миннесота, multivariabilis var.
(не опубл.).
turskensis isolate Mary 8/18 T-1W Анализ характера замен нуклеотидов в высоко консервативном фрагменте внутреннего транскрибируемого межгенного спейсера (ITSI) ядерной ДНК даёт основания отнести водоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, Desmodesmus sp. 1Pm66B, 2Сl66E и выделенные из Desmodesmus sp. Desmodesmus sp. 1Hp86E-2, беспозвоночных животных Белого моря, к близкородственным видам одной монофилетической группы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе было оценено обилие эпибионтных диатомей и цианобактерий на первых пяти (молодых) междоузлиях гидроида D. pumila. На междоузлиях большего возраста, начиная с шестого, присутствует уже многослойная пленка обрастаний с гораздо более высокой численностью эпибионтных ОФМ (Gorelova et al., 2013). Количественные данные по обилию эпибионтных ОФМ на междоузлиях D. pumila большего возраста отсутствуют. Мы рассчитали биомассу эпибионтных ОФМ на поверхности одной колонии гидроида D. pumila с учетом средней биомассы ОФМ на молодых побегах и площади поверхности колонии D. pumila, понимая, что эти оценки являются заниженными.
Тем не менее, полученные ориентировочные оценки дают возможность сравнить величины биомассы эпибионтных ОФМ и биомассы бентосных водорослей. Даже заниженные оценки биомассы эпибионтных ОФМ на одной колонии гидроида оказались сопоставимыми с биомассой микрофитобентоса под 1 см2 (Удалов и др., 2004). А если учесть, что на 1 см2 субстрата может в среднем обитать 4 колонии гидроида D. pumila (Марфенин, 1993), то биомасса эпибионтных ОФМ окажется даже больше таковой микрофитобентоса.
Исходя из биомассы эпибионтных ОФМ и рассчитанной максимальной удельной скорости роста разных размерных классов ОФМ, мы оценили максимальную величину первичной продукции эпибионтных ОФМ. Согласно расчетам, эпибионтные ОФМ на гидроиде D. pumila могут вносить существенный вклад в процессы первичного продуцирования в прибрежной зоне.
Из ассоциации с гидроидом D. pumila было выделено четыре изолята ОФМ, которые успешно поддерживаются в лабораторных культурах. Эти ОФМ идентифицированы как цианобактерии Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp.
и зеленая водоросль Desmodesmus sp. Генотипы всех четырех ОФМ оказались уникальными. Филогенетический анализ типированных Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. показал, что их ближайшие родственники обитают в разных биотопах как морских, так и пресных водоемов разных широт на нескольких материках. Мы полагаем, что сезонная вариабельность абиотических условий в Белом море, в частности, широкие диапазоны варьирования температуры, освещенности, солености, концентрации биогенных элементов способствует отбору генотипов, которые обеспечивают адаптацию к широкому набору условий. По-видимому, этим обусловлено близкое родство беломорских Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. с пресноводными формами.
Вследствие способности адаптироваться к широкому диапазону условий, многие арктические ОФМ могут быть выведены в культуры. Помимо культур, типированных как Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp., из ассоциаций с другими беломорскими беспозвоночными животными было выделено несколько десятков культур цианобактерий и 19 культур эукариотных одноклеточных водорослей, не имеющих жестких панцирей (Лобакова и др., 2012;
Горелова и др., 2012а), которые успешно ведутся в музее культур кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ. Полученные культуры беломорских Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. в перспективе могут быть использованы в практических целях для получения биотехнологически ценных соединений.
Для Белого моря показано наличие пикоцианобактерий в планктоне, оценены их численность и биомасса, однако идентификация до вида не проводилась (Ильяш, 1998;
Белевич, Ильяш, 2012). Согласно литературным данным, в полярных водах планктонные пикоцианобактерии представлены почти исключительно родом Synechococcus (Vincent, 2000). Это дало основание предполагать, что виды рода Synechococcus присутствуют и в планктоне Белого моря (Белевич, Ильяш, 2012).
Результаты наших исследований доказывают присутствие Synechococcus sp. в биоте Белого моря. Учитывая связь между планктонным и эпибионтными сообществами (Wahl, 1989, 2009), можно ожидать присутствие Synechococcus sp. 1Dp66E-1 и в планктоне Белого моря.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что в Белом море в ассоциациях с гидроидами Dynamena pumila, Coryne lovenii, губкой Halichondria panicea и трохофорными личинками полихеты Phyllodoce maculate обитают близкородственные виды представители одной Desmodesmus, монофилетической группы. Это может свидетельствовать о специфичности представителей рода Desmodesmus в выборе базибионта.
В биоте Белого моря ранее было идентифицировано несколько видов цианобактерий рода Leptolyngbya и Nostoc (Белякова, 1996;
Уланова, 2003;
Давыдов, 2006). Сравнение нуклеотидных последовательностей, депонированных в Генном банке, и морфологических признаков с диагнозами ранее идентифицированных видов этих родов, показало, что Leptolyngbya sp. 2Dp86E и Nostoc sp. 10Dp66E являются новыми видами для биоты Белого моря. Идентификация новых видов расширяет современные представления о биоразнообразии оксигенных фототрофных организмов Белого моря и Арктики в целом.
ВЫВОДЫ 1. Впервые количественно оценена биомасса диатомовых водорослей и цианобактерий в эпибионтном сообществе на молодых междоузлиях беломорского гидроида Dynamena pumila в летний период. Биомасса эпибионтных диатомей и цианобактерий на отдельных участках междоузлий варьирует в значительной степени.
2. Обилию эпибионтных диатомовых водорослей и цианобактерий присуща выраженная сезонная изменчивость. Биомасса диатомей снижалась от июня к августу, тогда как биомасса цианобактерий возрастала. В июне величины биомассы диатомовых водорослей и цианобактерий достоверно не различались, тогда как в августе биомасса цианобактерий была больше биомассы диатомей.
3. Впервые в ассоциации с гидроидом Dynamena pumila идентифицированы цианобактерии Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp. и гетеротрофная бактерия Gemmatimonas sp. (ассоциирована с Nostoc sp.). Подтверждено присутствие в ассоциации зеленой водоросли Desmodesmus sp.
4. Филогенетический анализ типированных Synechococcus sp., Leptolyngbya sp., Nostoc sp. и Desmodesmus sp. показал, что их ближайшие родственники обитают в разных биотопах как морских, так и пресных водоемов разных широт на нескольких материках.
5. Зеленая водоросль Desmodesmus sp., ассоциированная с гидроидом Dynamena pumila, формирует одну монофилетическую группу с представителями рода Desmodesmus, ассоциированными с другими беспозвоночными животными Белого моря.
6. Цианобактерии Leptolyngbya sp. 2Dp86E и Nostoc sp. 10Dp66E являются новыми видами для биоты Белого моря.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Горелова О.А., Баулина О.И., Соловченко А.Е., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р, Чивкунова О.Б., Кокшарова О.А., Лобакова Е.С. Зелёные микроводоросли, изолированные из ассоциации с беспозвоночными Белого моря // Микробиология.
2012а. Т. 81. № 4. С.505-507.
2. Кравцова Т.Р., Лазебная И.В., Лазебный О.Е., Волкова Е.Ю., Федоренко Т.А., Горелова О.А., Баулина О.И., Лобакова Е.С., Васетенков А.Е., Кокшарова О.А.
Молекулярная филогения зелёной микроводоросли, изолированной из Halichondria panicea (P., 1766) Белого моря // Физиология растений. 2013. Т. 60. № 4. С. 569-573.
3. Koksharova O.A., Kravzova T.R., Lazebnaya I.V., Gorelova O.A., Baulina O.I., Lazebny O.E., Fedorenko T.A., Lobakova E.S. Molecular identification, ultrastructural and phylogenetic study of cyanobacteria from association with the White sea hydroid Dynamena Pumila (L., 1758) // BioMed Research International. 2013. V. 2013. ( pages). http://dx.doi.org/10.1155/2013/ Материалы конференций и тезисы:
Лобакова Е.С., Кокшарова О.А., Федоренко Т.А., Баулина О.И., 1.
Кравцова Т.Р., Омарова Е.О., Горелова О.А. Азотфиксирующие цианобактерии в симбиозе с беломорским гидроидным полипом Dynamena pumila (L.,1758) // Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях Крайнего Севера. Тезисы докладов Международной научной конференции. 7-11 июня 2009 года, г. Апатиты, Россия. Апатиты: ООО «КаэМ», 2009. С. 193-195.
Кокшарова О.А., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р., Омарова Е.О., 2.
Горелова О.А., Лобакова Е.С. Идентификация цианобактерий, изолированных из гидроидного полипа Dynamena pumila (L.,1758) // Бюллетень МОИП. Отд.
биологический. 2009. Т. 114. Вып. 2. Прилож. 1. С. 137-139.
3. Кокшарова О.А., Горелова О.А., Кравцова Т.Р., Федоренко Т.А., Лазебная И.В., Баулина О.И., Лобакова Е.С. Цианобактерии – симбионты гидроидного полипа Dynamena pumila (L.,1758) // Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах. Материалы Международной конференции к 100-летию со дня рождения проф. Э. А. Штины. 11-15 октября 2010 года, г. Киров, Россия. Киров: Вятская ГСХА, 2010. С. 167-171.
4. Koksharova O.A., Kravzova T.R., Fedorenko T.A., Omarova E.O., Gorelova O.A., Baulina O.I., Lobakova E.S. Associations between the White Sea invertebrates and oxygen-evolving phototrophic microorganisms: a phylogenetic study // Molecular Phylogenetics. Materials 2nd Moscow international conference. May 18-21, 2010, Moscow, Russia. M.: Torus Press, 2010. P. 118.
5. Лобакова Е.С., Кравцова Т.Р., Федоренко Т.А., Косевич И.А., Баулина О.И., Кокшарова О.А., Горелова О.А. Нитчатая цианобактерия – симбионт гидроидных полипов // Автотрофные микроорганизмы. Материалы Всероссийского симпозиума к 80-летию биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова, 85-летию со дня рождения акад. Е.Н. Кондратьевой. 23-26 декабря 2010 года, г. Москва, Россия. М.:
Макс Пресс, 2010. С. 65.
6. Лобакова Е.С., Баулина О.И., Соловченко А.Е., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р., Горелова О.А. Микроводоросли, ассоциированные с беспозвоночными животными Белого моря // Биологически активные вещества микроорганизмов.
Прошлое, настоящее, будущее. Материалы Всероссийского симпозиума к 90-летию заслуженного проф. Московского ун-та Н.С. Егорова. 27-29 января 2011года, г.
Москва, Россия. М.: Макс Пресс, 2011. С. 77.
7. Gorelova O., Koksharova O., Kravzova T., Lazebnaya I., Baulina O., Fedorenko T., Kosevich I., Lobakova E. Cyanobacteria associated with the White sea hydroid // Proceedings of the 4th Congress of European Microbiologists. FEMS. June 26-30, 2011, Geneva, Switzerland. 2011. P. 2408.
8. Лобакова Е.С., Баулина О.И., Федоренко Т.А., Кравцова Т.Р., Кокшарова О.А., Горелова О.А. Микроводоросли, ассоциированные с беспозвоночными Белого моря:
выделение и ультраструктура // Актуальные проблемы современной альгологии.
Тезисы докладов IV Международной конференции. 23-25 мая 2012 года, г. Киев, Украина. Киев: Институт ботаники им. Н.Г. Холодного НАН, 2012. С. 170-171.
9. Горелова О.А, Кравцова Т.Р., Кокшарова О.А., Лазебная И.В., Баулина О.И., Федоренко Т.А., Лобакова Е.С. Морфологическое и молекулярное типирование цианобактерий, ассоциированных с колониальным гидроидом Dynamena pumila // Актуальные проблемы современной альгологии. Тезисы докладов IV Международной конференции. 23-25 мая 2012 года, г. Киев, Украина. Киев:
Институт ботаники им. Н.Г. Холодного НАН, 2012б. С. 81-82.
10. Кравцова Т.Р, Горелова О.А., Кокшарова О.А., Баулина О.И., Федоренко Т.А., Ильяш Л.В., Лобакова Е.С. Фототрофные микроорганизмы, изолированные из беломорских ассоциаций с колониальным гидроидом Dynamena pumila (L., 1758) // Физиология и биотехнология микроводорослей. Тезисы докладов Международной конференции к 80-летию со дня рождения В.Е. Семененко. 16-19 октября 2012 года, г. Москва, Россия. М.: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 2012. С. 81.
11. Kravzova T.R., Lazebnaya I.V., Fedorenko T.A., Gorelova O.A., Lobakova E.S., Koksharova O.A. Phylogenetic study of new cyanobacteria associated with the White Sea invertebrates // Molecular Phylogenetics. Materials 3rd Moscow international conference.
July 31 - August 4, 2012, Moscow, Russia. M.: Torus Press, 2012. P. 143.
Автор приносит глубокую и искреннюю благодарность научным руководителям проф. Л.В. Ильяш и д.б.н. О.А. Кокшаровой за постоянную помощь в работе и поддержку. Автор выражает особую благодарность проф. Е.С. Лобаковой, д.б.н.
О.А. Гореловой и д.б.н. О.И. Баулиной за совместную экспериментальную работу, неоценимую помощь при проведении лабораторных исследований и обсуждение полученных результатов. Автор благодарен своим друзьям и коллегам к.б.н. Т.А.
Федоренко, к.б.н. О.Б. Чивкуновой, к.б.н. И.В. Лазебной, А.А. Поповой и всем сотрудникам кафедры биоинженерии за помощь в работе, внимание и теплую дружескую атмосферу, сложившуюся в коллективе. Автор признателен проф. Н.Н.
Марфенину за высококвалифицированные консультации.