Влияние структуры 5'-конца рнк на образование вирусных рибонуклеопротеидов с участием белка оболочки потексвирусов in vitro
На правах рукописи
ПЕТРОВА Екатерина Кирилловна ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ 5'-КОНЦА РНК НА ОБРАЗОВАНИЕ ВИРУСНЫХ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ С УЧАСТИЕМ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ПОТЕКСВИРУСОВ IN VITRO 03.02.02 - Вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Карпова Ольга Вячеславовна
Официальные оппоненты:
Равин Николай Викторович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» РАН, заведующий лабораторией систем молекулярного клонирования, заместитель директора по научной работе.
Гмыль Анатолий Петрович, кандидат биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» РАМН, заведующий лабораторией биохимии
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН г. Москва.
Защита состоится 21 ноября 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д.501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, ауд. _.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).
Автореферат разослан « » октября 2013 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук: Крашенинников И.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Исследование молекулярных механизмов распространения вирусной инфекции в растении является одним из основных вопросов современной молекулярной фитовирусологии. У большинства РНК-содержащих вирусов растений транспортной формой, перемещающейся из клетки в клетку, является вирион и/или вирусный рибонуклеопротеид (вРНП). Ключевым этапом сборки вирусной частицы или вРНП является селективное взаимодействие геномной РНК с белком оболочки (БО). Однако специфический сигнал упаковки (участок инициации сборки) до сих пор не охарактеризован для большинства вирусов растений. В связи с этим изучение сборки вирионов и вРНП и поиск сигналов упаковки вирусных геномов является актуальным и важным для понимания механизмов взаимодействия вирусных БО и РНК и процессов образования вирусной частицы. Исследование механизмов образования вирусных частиц служит основой для понимания природы фитовирусов, принципов их взаимодействия с зараженной клеткой, а также для разработки методов безвирусного растениеводства.
На данный момент особенности формирования вирионов у фитовирусов изучены недостаточно, причем большинство существующих работ посвящены икосаэдрическим вирусам растений (Rao, 2006). Основные исследования, связанные с изучением сборки вирусов растений со спиральной структурой, были опубликованы около 30 лет назад.
Наиболее подробно процесс образования вирусных частиц и сигналы сборки были исследованы для вируса табачной мозаики (ВТМ) (Zimmern, 1977;
Butler, 1984). В последнее время процессы формирования вирусных частиц спиральных фитовирусов изучаются в основном в свете транспортных функций (Cruz et al., 1996;
Taliansky et al., 2003;
Ozeki et al., 2009) или белок-белковых взаимодействий (Alzhanova et al., 2007;
Anindya and Savithri, 2003). Объект нашего исследования – Х вирус картофеля (ХВК) – гибкий нитевидный вирус со спиральным типом симметрии, типичный представитель рода Potexvirus семейства Alfaflexiviridae. В 1996 году Kim и Hemenway предположили, что 5'-район РНК ХВК участвует в координации образования вирусной частицы, транспорте и репликации. До сих пор участок инициации сборки ХВК полностью не охарактеризован, хотя в ряде работ было подтверждено, что для ХВК он находится на 5'-конце молекулы РНК (Kwon et al., 2005;
Lough et al., 2006;
Karpova et al., 2006). Ранее было показано, что БО ХВК способен in vitro образовывать вРНП не только с РНК ХВК, но и с гетерологичными нуклеиновыми кислотами (Новиков и др., 1972), однако структура и свойства этих вРНП не были изучены.
Цели и задачи исследования Целью данной работы было изучение особенностей структуры и свойств вРНП, образующихся при инкубации БО ХВК с гетерологичными геномными РНК вирусов, относящихся к различным таксономическим группам, фрагментом геномной РНК и 5' концевыми транскриптами потексвирусов in vitro, а также поиск сигнала или необходимого структурного элемента, влияющего на упаковку вирусного генетического материала в вРНП при инкубации с БО ХВК.
Для достижения поставленных целей решались следующие основные задачи:
1. Исследование структуры и трансляционных свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК in vitro.
2. Изучение структуры и свойств вРНП, полученных при инкубации БО ХВК с компонентами генома вируса мозаики костра (ВМК) и функционально активным фрагментом геномной РНК 3 ВМК.
3. Изучение возможности формирования вРНП при инкубации БО ХВК с 5'-концевыми некэпированными и кэпированными транскриптами потексвирусов различной длины.
4. Исследование возможности образования вРНП при инкубации БО ХВК с некэпированными и кэпированными транскриптами потексвирусов с делецией ~100 нт с 5'-конца молекулы РНК (предполагаемого участка инициации сборки).
5. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с декэпированными 5'-концевыми транскриптами ХВК.
Научная новизна и практическая ценность работы В работе впервые изучены и охарактеризованы структура и свойства вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гетерологичными геномными РНК вирусов растений и животных. С использованием ряда физико-химических методов показано, что образующиеся вРНП морфологически и по трансляционным свойствам идентичны гомологичным вРНП (РНК ХВК – БО ХВК) и нативным вирионам ХВК. Обнаружено, что инициация сборки гетерологичных вРНП (чужеродная РНК – БО ХВК) in vitro так же, как и гомологичных, начинается с 5'-конца молекулы РНК и не зависит от специфической нуклеотидной последовательности. Впервые показано, что 5'-концевые некэпированные транскрипты РНК потексвирусов не образуют вРНП при инкубации с БО ХВК in vitro. При этом инкубация БО ХВК с кэпированными транскриптами потексвирусов приводит к формированию вРНП, идентичных по структуре и свойствам гомологичным вРНП и нативным вирионам ХВК, в том числе и при инкубации БО ХВК с кэпированными транскриптами с делецией первых 96 нт с 5'-конца молекулы РНК (предполагаемого участка инициации сборки). Впервые продемонстрировано, что кэп-структура сама по себе не является сигналом, необходимым для взаимодействия РНК с БО ХВК при формировании вРНП, так как ее удаление после предварительного кэпирования РНК в дальнейшем не препятствует образованию вРНП, а добавление in trans к некэпированным транскриптам не приводит к сборке.
Таким образом, впервые показано, что важным условием сборки вРНП in vitro является предварительное кэпирование нуклеиновой кислоты, при котором кэп-структура, вероятно, влияет на 5'-конец молекулы РНК, создавая конформационный сигнал упаковки и способствуя эффективному взаимодействию РНК и БО ХВК.
Полученные результаты вносят определенный вклад в изучение процессов образования вирионов и вРНП и носят фундаментальный характер. Поскольку вирионы и/или вРНП являются транспортными формами и играют роль при распространении вирусной инфекции по растению, исследование сигнала упаковки и механизмов образования вирусных частиц необходимо для разработки новых методов безвирусного растениеводства.
Также создание искусственных вРНП, содержащих БО вирусов растений и генетический материал различной природы, может стать основой при создании новых биотехнологий для медицины и сельского хозяйства.
Апробация работы Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на семинарах кафедры вирусологии и на международных конференциях: на ХVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва, 2010);
на 14-й и 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011 гг.);
на V и VI Международных конференциях «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2011, 2012);
на 2-й Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и Наномедицина» (Московская область, 2011);
на Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2012);
на 37-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (FEBS), объединенным с 22-м конгрессом Международного объединения биохимиков и молекулярных биологов (IUBMB) под общим названием «From Single Molecules to Systems Biology» (Испания, 2012).
Личный вклад автора Основные результаты получены при непосредственном участии автора в планировании и проведении научных экспериментов, обработке результатов и их интерпретации, а также в подготовке публикаций по выполненной работе. Исследования с помощью метода атомно силовой микроскопии проведены совместно с к.ф-м.н. вед. инженером А.Д. Протоповой (физический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, – 2, материалов международных и российских конференций – 8.
Структура работы Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы». Работа содержит список цитируемой литературы ( ссылок),... рисунков, … таблицы. Общий объем диссертации страниц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Х-вирус картофеля (ХВК) – представитель рода Potexvirus семейства Alfaflexiviridae.
Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные частицы длиной 515 нм и диаметром 13,5 нм и содержат около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки (БО) (25 кДа), упакованных в виде спирали, между оборотами которой заключена вирусная РНК (Tollin and Wilson, 1998). Геном ХВК представлен одноцепочечной (+) РНК длиной 6435 нуклеотидов (Skryabin et al., 1988). РНК содержит на 5'-конце кэп-структуру, на 3'-конце – поли-А последовательность (Morozov et al., 1991).
Ранее было продемонстрировано, что ХВК может быть реконструирован in vitro, и что БО ХВК способен образовывать вРНП не только с РНК ХВК, но и с гетерологичными нуклеиновыми кислотами (РНК вируса табачной мозаики – ВТМ, вируса мозаики костра – ВМК, вируса штриховатой мозаики ячменя и др.) (Новиков и др., 1972). Однако структура и свойства этих вРНП не были изучены.
1. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК Для получения вРНП, содержащих гетерологичные РНК, БО ХВК и РНК инкубировали при молярном соотношении 700:1 в условиях, описанных ранее (Karpova et al., 2006). В качестве чужеродных РНК были использованы РНК потексвирусов (вирус мозаики нарцисса – ВМН, вирус аукуба мозаики картофеля – ВАМК, вирус мозаики альтернантеры – ВМАльт);
тобамовируса (ВТМ);
бромовируса (ВМК);
пикорнавируса (вирус энцефаломиокардита – вирус Менго) В качестве контроля использовали вРНП, полученные при инкубации РНК ХВК с БО ХВК (гомологичные вРНП). Следует отметить, что БО ХВК не способен полимеризоваться в отсутствие РНК (Kaftanova et al., 1975). Методами просвечивающей электронной (ПЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) показано, что при инкубации гетерологичных РНК с БО ХВК образуются нитевидные частицы различной длины, морфологически сходные с гомологичными вРНП (Рис. 1.А, 2.Б). Ранее в нашей лаборатории было показано, что гомологичные вРНП идентичны по своей структуре нативным вирионам ХВК (Рис. 1.З, 2.А) и (Karpova et al., 2006).
С помощью метода АСМ был проведен сравнительный анализ высоты и длины полученных вРНП и нативных вирионов. По данным АСМ средняя высота гомологичного комплекса составила 9,7 ± 1,3 нм, гетерологичных (чужеродная РНК – БО ХВК) – от 8,2 до 10,9 нм. В пределах погрешности эти значения совпадают между собой и соответствуют высоте нативного ХВК (9,4 ± 1,4 нм), что может свидетельствовать о схожем строении частиц. При соотношении РНК:БО 1:700 гетерологичные частицы, содержащие в своем составе РНК потексвирусов ВМН (6955 нт), ВАМК (7059 нт), ВМАльт (6606 нт) и тобамовируса ВТМ (6395 нт), имели среднюю длину около 200 нм (215 ± 71;
220 ± 50;
200 ± 63 и 197 ± 38 нм соответственно) и были близки по длине гомологичным вРНП (201 ± 48 нм).
В случае инкапсидации более коротких вирусных РНК (тотальный препарат РНК ВМК состоит из четырех РНК протяженностью от 800 до 3234 нт) возрастало количество коротких Рис. 1. Электронные микрофотографии вРНП, образованных при инкубации БО ХВК и гомологичной и гетерологичных РНК in vitro. А – РНК ХВК;
Б – РНК ВМН;
B – РНК ВАМК;
Г – Тотальная РНК ВМК;
Д – РНК вируса Менго;
Е – РНК ВТМ;
Ж – РНК ВМАльт, З – Вирионы ХВК. Молярное соотношение РНК:БО = 1:700. Контрастирование 2% уранилацетатом. Масштабные отрезки 100 нм.
Рис. 2. Анализ методом АСМ вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с гомологичной и гетерологичными РНК in vitro.
А – Вирионы ХВК;
Б – РНК ХВК;
В – РНК ВМАльт;
Г – РНК ВТМ;
Д – РНК ВМН;
Е – Тотальная РНК ВМК;
Ж – РНК вируса Менго;
З – РНК ВАМК.
Все образцы анализировали на подложке из слюды, кроме Д (на графите).
Для вРНП молярное соотношение РНК:БО = 1:700. Стрелками указаны участки РНК в составе вРНП, свободные от БО ХВК.
Масштабные отрезки мкм.
частиц (80-100 нм), а при инкубации с БО ХВК РНК вируса Менго (длина 8400 нт) средний размер частиц увеличивался до 285 ± 61 нм. Так как распределение по длине частиц зависит от длины РНК, входящей в состав вРНП, и молярного соотношения РНК:БО, то основным показателем формирования вРНП являлась морфология частиц и их высота по сравнению с гомологичными вРНП и свободным БО ХВК, проинкубированным в условиях сборки. При инкубации БО ХВК в отсутствие НК в условиях сборки (отрицательный контроль) были образованы неструктурированные агрегаты, средняя высота которых составила 2,9 ± 1,1 нм.
Высота же вРНП, содержащих гетерологичную РНК, соответствовала высоте гомологичных вРНП и нативных вирионов ХВК, что свидетельствовало о формировании идентичных по морфологии частиц.
При молярном соотношении РНК:БО = 1:700 БО недостаточно для инкапсидации всей РНК, и в результате АСМ выявляет частицы, у которых часть молекулы РНК в составе вРНП остается свободной от БО (Рис. 2.Б, В, Г, З). «Однохвостые частицы» с 3'-концом РНК, свободным от БО, и палочковидными «головками», сформированными в результате спиральной упаковки БО на 5'-концевом фрагменте РНК, были ранее описаны для гомологичных вРНП и названы STP-частицами (single tailed particles) (Karpova et al., 2006).
Ранее в нашей лаборатории было продемонстрировано, что в отличие от ряда вирусов, РНК ХВК в составе вириона и гомологичных вРНП недоступна для рибосом. Но она становится трансляционно активной при взаимодействии вириона с транспортным белком (ТБ1) ХВК (Atabekov et al., 2000, 2001;
Karpova et al., 2006). Ранее было показано (положительный контроль на рис. 3.А, дор. 1-3), что трансляция РНК ХВК в составе вРНП, образованных с БО ХВК, подавляется, но может быть активирована после взаимодействия с ТБ1 ХВК (Karpova et al., 2006). Как видно из рис. 3.Б-Ж, добавление БО ХВК к РНК в соотношении 700:1 приводит к заметному подавлению трансляции тотального препарата РНК ВМК (Рис. 3.Б, дор. 2), РНК ВАМК (Рис. 3.В, дор. 2), РНК ВМН (Рис. 3.Г, дор. 2), РНК ВТМ (Рис. 3.Д, дор. 2), РНК вируса Менго (Рис. 3.Е, дор. 2) и РНК ВМАльт (Рис. 3.Ж, дор. 2) в составе вРНП по сравнению с тем же количеством свободной РНК (Рис. 3.Б-Ж, дор. соответственно). Увеличение количества белка до соотношения РНК:БО 1:2100 приводит к практически полному подавлению трансляции гетерологичной инкапсидированной РНК (представлены результаты для РНК ВМН (Рис. 3.Г, дор. 4) и ВТМ (Рис. 3.Д, дор. 4)). При добавлении ТБ1 ХВК к гетерологичным вРНП эффективность трансляции восстанавливается до уровня свободной РНК (Рис. 3.Б-Ж, дор. 1 и 3). Таким образом, БО ХВК подавляет трансляцию гетерологичных РНК в составе вРНП так же, как и в случае с РНК ХВК. При ТБ1-зависимой трансляционной активации РНК в составе вирусных частиц или вРНП основную роль играют белок-белковые взаимодействия БО, уложенного в спиральную Рис. 3. Трансляционная активация РНК в составе вРНП, образованных при инкубации РНК с БО ХВК при молярном соотношении 1:700 in vitro.
Радиоавтограмма продуктов трансляции после разделения электрофорезом в 8–20% ном ДСН-ПААГ.
А – РНК ХВК;
Б – Тотальная РНК ВМК;
В – РНК ВАМК;
Г – РНК ВМН;
Д – РНК ВТМ;
Е – РНК вируса Менго, Ж – РНК ВМАльт.
1 – РНК;
2 – РНК + БО ХВК;
3 – (РНК + БО ХВК) + ТБ1 ХВК.
На рис. Г и Д дор. 4 РНК проинкубирована с БО ХВК при молярном соотношении 1:2100.
Концентрация РНК в трансляционной пробе от до 40 мкг/мкл.
структуру и ТБ1 (Rodionova et al., 2003;
Karpova et al., 2006 Zayakina et al., 2009).
Возможность эффективной трансляционной активации гетерологичных РНК в составе вРНП при их взаимодействии с ТБ1 ХВК свидетельствует о том, что структура белковой спирали этих вРНП идентична структуре спирали гомологичных вРНП и нативных вирионов ХВК (Karpova et al., 2006).
Результаты анализа трансляционных свойств (трансляционный тест) гетерологичных вРНП позволяют утверждать, что инициация сборки гетерологичных вРНП in vitro начинается с 5'-концевого района РНК и продолжается в 5'-3' направлении, как и у гомологичных вРНП (Karpova et al., 2006). Сравнение нуклеотидных последовательностей первых 100 нт 5'-концевых районов РНК ХВК, ВМН, ВМАльт, ВМК 1-4, вируса Менго, ВАМК и ВТМ не дало возможности выявить общие участки нуклеотидной последовательности, которые бы могли служить сигналом инициации сборки у ХВК. На основании полученных данных можно сделать вывод, что при инкубации БО ХВК с геномными РНК вирусов, относящихся к различным таксономическим группам (гетерологичными РНК), in vitro образуются вРНП, идентичные по структуре и свойствам гомологичным вРНП и нативным вирионам ХВК. Образование вРНП при инкубации РНК с БО ХВК in vitro не зависит от нуклеотидной последовательности 5'-конца РНК. Скорее всего, определяющую роль в инициации формирования вРНП играет белок оболочки вируса, по крайней мере, в случае БО ХВК.
2. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с компонентами генома ВМК и функционально активным фрагментом РНК 3 ВМК На следующем этапе работы в качестве модельного объекта были использованы геномные РНК 1, 2 и 3 и субгеномная РНК 4 ВМК, выделенные из тотального препарата РНК ВМК, и функционально активный фрагмент геномной РНК 3 ВМК. ВМК является представителем семейства Bromoviridae и относится к группе сферических вирусов.
Вирионы ВМК содержат четыре (+) РНК: РНК 1 – 3234 нт;
РНК 2 – 2865 нт;
РНК 3 – 2114 нт и РНК 4 – 876 нт. РНК 1, 2 и 3 необходимы для репродукции вируса, в то время как РНК является субгеномной, кодирует БО и соответствует по нуклеотидной последовательности 3' концевой области РНК 3. Между генами ТБ и БО ВМК в бицистронной РНК 3 ВМК находится некодирующая последовательность, содержащая поли(А)-тракт, который располагается за 20 нт до начала последовательности 4-й РНК. При сайт-специфическом разрезании 3-й РНК ВМК РНКазой Н в присутствии олиго-d(T)10 образуются два фрагмента:
длинный L-фрагмент и короткий Sh-фрагмент, соответствующий 4-й РНК ВМК, но без кэп структуры и с дополнительными 20-22 нт на 5'-конце (Рис. 4). Sh-фрагмент в бесклеточной белок синтезирующей системе направляет синтез БО ВМК (Karpova et al., 1989;
Smirnyagina et al., 1989).
Рис. 4. Схема получения L- и Sh-фрагментов при гидролизе РНК 3 ВМК РНКазой Н в присутствии олиго-d(T)10. () Положение 5'-терминального нуклеотида РНК 4 ВМК, (O) кэп-структура.
РНК ВМК 1+2, 3 и 4 были проинкубированы с БО ХВК в стандартных условиях in vitro. Методами ПЭМ и АСМ было зафиксировано образование вРНП (Рис. 5.А-Г). Однако при инкубации БО ХВК с Sh-фрагментом вРНП не были обнаружены (Рис. 5.Д). В поле зрения можно было наблюдать только агрегаты небольшого размера без четкой структуры, аналогичные тем, что были зафиксированы при инкубации БО в отсутствии РНК (Рис. 5.Е), и которые по данным Kaftanova с соавторами (1975) соответствовали мономерам и димерам БО ХВК. Средняя высота частиц, образованных при инкубации БО ХВК с РНК 1+2, 3 и ВМК и РНК ХВК (положительный контроль) по данным АСМ составила 9,3 ± 1,0 нм, 9,2 ± 0,9 нм, 9,4 ± 0,9 нм и 8,9 ± 0,6 нм соответственно, что свидетельствует о формировании вРНП. В случае образования вРНП с помощью АСМ можно измерить как длину, так и высоту частиц, в то время как при измерении агрегатов, образованных при инкубации Sh фрагмента с БО ХВК или БО ХВК в отсутствие РНК, длина объектов равнялась высоте, и составила 3,1 ± 0,8 нм и 2,4 ± 0,7 нм, и соответствовала по морфологии и размерам мономерам и димерам БО ХВК по данным АСМ (Kyseleva et al., 2003).
Рис. 5. Электронные микрофотографии вРНП, образованных in vitro при инкубации БО ХВК и геномных РНК 1, 2 и 3, субгеномной РНК 4 ВМК и функционально активного фрагмента геномной РНК 3 ВМК (Sh-фрагмент). А – Тотальная РНК ВМК;
Б – РНК 1+ ВМК;
B – РНК 3 ВМК;
Г – РНК 4 ВМК;
Д – Sh-фрагмент;
Е – БО ХВК в отсутствие РНК.
Молярное соотношение РНК:БО = 1:700. Контрастирование 2% уранилацетатом.
Масштабные отрезки 100 нм.
Использование трансляционного теста (Karpova et al., 2006) позволило выявить, что при инкубации РНК 1+2, 3 и 4 ВМК с БО ХВК происходит связывание 5'-конца части молекул РНК с БО, и он становится недоступным для рибосом (трансляция подавляется), а количество вирус-специфических продуктов уменьшается (Рис. 6, дор. 2, 5, 8).
Следовательно, РНК связывается с БО ХВК с образованием вРНП. При добавлении к полученным частицам ТБ1 ХВК РНК 1+2, 3 и 4 ВМК в составе вРНП трансляционно Рис. 6. Трансляционная активация РНК в составе вРНП, образованных при инкубации геномных РНК 1, 2 и 3 ВМК, субгеномной РНК 4 ВМК и функционально активного фрагмента геномной РНК 3 ВМК (Sh-фрагмента) с БО ХВК in vitro. Молярное соотношение РНК:БО = 1:700. 1 – РНК 1+2 ВМК;
2 – РНК 1+2 ВМК + БО ХВК;
3 – (РНК 1+2 ВМК + БО ХВК) + ТБ1 ХВК;
4 –РНК 3 ВМК;
5 – РНК 3 ВМК + БО ХВК;
6 – (РНК ВМК + БО ХВК) + ТБ1 ХВК;
7 – РНК4 ВМК;
8 – РНК4 ВМК + БО ХВК;
9 – (РНК4 ВМК + БО ХВК) + ТБ1 ХВК;
10 – Sh-фрагмент;
11 – Sh-фрагмент + БО ХВК. Радиоавтограмма продуктов трансляции после разделения электрофорезом в 8–20%-ном ДСН-ПААГ.
Концентрация РНК в пробе 40 мкг/мкл.
активируются (Рис. 6, дор. 3, 6, 9) и эффективно транслируются. Так как основную роль при этом играют белок-белковые взаимодействия ТБ1 и БО ХВК и их конформационные состояния, то можно сделать вывод, что при инкубации БО ХВК с РНК 1+2, 3 и 4 ВМК образуются частицы, сходные по структуре с гомологичными частицами и нативными вирионами ХВК (Karpova et al., 2006;
Zayakina et al., 2008). При инкубации Sh-фрагмента с БО ХВК подавления трансляции не происходит (дор. 10 и 11 на рис. 6), то есть он не взаимодействует с БО ХВК, частицы не образуются, что согласуется с данными ПЭМ (Рис.
5.Д).
Основным отличием Sh-фрагмента от РНК 4 ВМК являлось присутствие дополнительных 20-22 нт с 5'-конца и отсутствие кэп-структуры на 5'-конце Sh-фрагмента.
Однако 20-22 нт на 5'-конце Sh-фрагмента вряд ли могли влиять на образование вРНП при инкубации с БО ХВК, поскольку эффективность формирования вРНП при инкубации РНК с БО ХВК in vitro не зависела от нуклеотидной последовательности 5'-конца молекулы РНК.
Для выяснения возможной роли кэп-структуры Sh-фрагмент был кэпирован с использованием кэпирующей системы вируса осповакцины. Анализ инкубационной смеси кэпированного Sh-фрагмента с БО ХВК методом АСМ выявил образование вРНП (Рис. 7.Г, г), средняя высота которых (8,3 ± 0,9 нм) соответствовала высоте вРНП с РНК 4 ВМК, использованной в данном эксперименте в качестве положительного контроля (9,4 ± 0,9 нм) Рис. 7. Анализ методом АСМ вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с РНК ВМК, Sh-фрагментом и кэпированным Sh фрагментом in vitro.
А, а – РНК 4 ВМК + БО ХВК (положительный контроль);
Б, б – БО ХВК (отрицательный контроль);
В, в – Sh-фрагмент + БО ХВК;
Г, г – Кэпированный Sh фрагмент + БО ХВК.
АСМ-изображения (А-Г) и составленные по данным АСМ гистограммы распределения по высоте (а-г). Молярное соотношение РНК:БО = 1:700. N – число частиц. Масштабные отрезки 500 нм.
(Рис. 7.А, а). Высоты структур, полученных при инкубации БО ХВК в отсутствие РНК и некэпированного Sh-фрагмента с БО ХВК в тех же условиях, составили 2,4 ± 0,7 и 3,1 ± 0, нм соответственно (Рис. 7.Б, б и В, в). Таким образом, показано, что кэпирование Sh фрагмента влияет на эффективность его взаимодействия с БО ХВК и приводит к образованию вРНП in vitro.
В работе Kaye с соавторами (2009) было показано, что присутствие кэп-структуры у -глобиновых мРНК влияет на конформацию 5'-конца молекулы и тем самым способствует ее взаимодействию с рибосомами. Можно предположить, что после кэпирования молекула РНК Sh-фрагмента принимает состояние, более выгодное для взаимодействия с БО ХВК и способствующее инициации сборки вРНП.
3. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с некэпированными и кэпированными 5'-концевыми транскриптами РНК ХВК Для дальнейшего выяснения влияния кэп-структуры на эффективность сборки вРНП in vitro были получены кэпированные и некэпированные транскрипты, соответствующие 5' концевому району РНК ХВК и содержащие участок, который, по данным литературы, может являться определяющим при взаимодействии РНК ХВК с БО ХВК (Kwon et al., 2005;
Lough et al., 2006). При инкубации БО ХВК с некэпированным 5'-концевым транкскриптом ХВК длиной 1320 нт (ХВК-1320) образование вРНП методами ПЭМ и АСМ зафиксировать не удалось (Рис. 8.А, 9.А). Средняя высота выявленных при этом неструктурированных агрегатов составила 3,1 ± 1,0 нм (Рис. 9.а). Часть полученного транскрипта была кэпирована с использованием кэпирующей системы вируса осповакцины и проинкубирована с БО ХВК.
Как видно из рисунков 8.Б, 9.Б в этом случае были сформированы частицы, близкие по морфологии гомологичным вРНП (Рис. 8.В, 9.В) и имеющие среднюю высоту 8,5 ± 0,6 нм (Рис. 9.б). Средняя высота гомологичных вРНП составила 9,7 ± 1,3 нм (Рис. 9.в). В качестве отрицательного контроля был использован свободный от РНК БО ХВК, проинкубированный в условиях сборки (Рис. 8.Г, 9.Г), средняя высота которого составила 2,4 ± 0,7 нм (Рис. 9.г).
Рис. 8. Образование вРНП при инкубации кэпированного транскрипта ХВК-1320 с БО ХВК in vitro. А – Транскрипт ХВК-1320 + БО ХВК;
Б – Кэпированный транскрипт ХВК 1320 + БО ХВК;
В – РНК ХВК + БО ХВК;
Г – БО ХВК. Электронные микрофотографии, угловое оттенение металлом (Pt+Pd, 7°). Масштабные отрезки 100 нм.
В ряде случаев при анализе методом АСМ частиц, полученных при инкубации кэпированного транскрипта ХВК-1320 с БО ХВК, как и при исследовании гетерологичных (Рис. 2.В, Г, З) и гомологичных вРНП (Рис. 2.Б;
9.В;
10.Б, б), были выявлены «однохвостые» частицы (Рис. 10.А, а), состоящие из неодетого «хвоста» РНК и белковой «головки», локализованной только на одной конце молекулы (STP).
Рис. 9. Анализ методом АСМ вРНП, образованных in vitro при инкубации БО ХВК с кэпированным транскриптом ХВК-1320.
А, а – Транскрипт ХВК 1320 + БО ХВК;
Б, б – Кэпированный транскрипт ХВК-1320 + БО ХВК;
В, в – РНК ХВК + БО ХВК;
Г, г – БО ХВК.
АСМ-изображения (А-Г) и составленные по данным АСМ гистограммы распределения по высоте (а-г). N – число частиц.
Стрелками указаны участки РНК в составе вРНП, свободные от белка оболочки ХВК.
Масштабные отрезки нм. Для дальнейшего изучения влияния кэп-структуры на формирование вРНП in vitro в отдельной серии экспериментов в инкубационную смесь, содержащую БО ХВК и кэпированный или некэпированный транскрипт ХВК-1320, был добавлен кэп-аналог in trans.
Рис. 10. Анализ методом АСМ вРНП, образованных при инкубации in vitro БО ХВК с кэпированным транскриптом ХВК-1320 (А, а) и РНК ХВК (Б, б).
Двухмерные (А-В) и трехмерные (а-в) изображения.
Рис. 11. Трансляционная активация РНК в составе вРНП, образованных при инкубации транскриптов ХВК-1320 с БО ХВК in vitro.
1 – Некэпированный транскрипт ХВК-1320;
2 – Некэпированный транскрипт ХВК-1320 + БО ХВК;
3 – Кэпированный транскрипт ХВК 1320;
4 – Кэпированный транскрипт ХВК 1320 + БО ХВК;
5 – (Кэпированный транскрипт ХВК-1320 + БО ХВК) + ТБ1 ХВК.
Молярное соотношение РНК:БО = 1:700. Радиоавтограмма продуктов трансляции после разделения электрофорезом в 8–20%-ном ДСН-ПААГ. Слева представлено положение маркеров молекулярной массы в кДа.
Было показано, что при добавлении кэп-аналога in trans к некэпированному транскрипту ХВК-1320 и инкубации с БО ХВК вРНП не образуются. Кэп-структура, вероятно, может влиять на образование вРНП только в случае ковалентного присоединения к молекуле РНК.
Для анализа структуры белковой оболочки вРНП, образующихся при инкубации кэпированного транскрипта ХВК-1320 с БО ХВК, был применен трансляционный тест. Из рисунка 11 следует, что при инкубации некэпированного транскрипта с БО ХВК подавления трансляции не происходит (Рис. 11, дор. 2) по сравнению с трансляцией свободного некэпированного транскрипта ХВК-1320 (Рис. 11, дор. 1). При анализе методом ПЭМ и АСМ в этих пробах не удалось выявить вирусоподобные частицы (Рис. 8.А, 9.А). Это подтверждают результаты трансляционного теста – отсутствие подавления трансляции при инкубации некэпированного транскрипта ХВК-1320 с БО ХВК. При инкубации с БО ХВК кэпированного транскрипта ХВК-1320, напротив, происходит супрессия синтеза вирус специфических белков (Рис. 11, дор. 4) по сравнению с трансляцией свободного кэпированного транскрипта (Рис. 11, дор. 3), однако уровень трансляции восстанавливается до исходного при добавлении ТБ1 ХВК к инкубационной смеси (Рис. 11, дор. 5).
Таким образом, образованные при инкубации кэпированного транскрипта ХВК-1320 с БО ХВК частицы и обнаруженные методами ПЭМ (Рис. 8.Б) и АСМ (Рис. 9.Б) не только близки по морфологии гомологичным вРНП и нативным вирионам ХВК, но и имеют идентичную по структуре белковую оболочку. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что некэпированные транскрипты ХВК-1320 не формируют вРНП при инкубации с БО ХВК, в то время как кэпирование приводит к их эффективному взаимодействию с БО ХВК и образованию вРНП.
В отдельной серии экспериментов была исследована возможность формирования вРНП при инкубации БО ХВК с 5'-концевыми транскриптами РНК ХВК различной длины (1 3944 нт, 1-4950 нт) и полноразмерным транскриптом РНК ХВК (1-6435 нт) – ХВК-full. Было показано, что независимо от длины транскриптов некэпированные транскрипты РНК ХВК, содержащие 5'-конец РНК ХВК, не образуют вРНП при инкубации с БО ХВК, в то время как кэпирование способствует образованию вРНП, идентичных по морфологии и высоте гомологичным (Рис. 12).
hср. = 2,5 ± 1,1 нм hср. = 8,9 ± 0,8 нм hср. = 2,0 ± 0,7 нм N = 280 N = 320 N = Рис. 12. Анализ методом АСМ вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с транскриптом ХВК-full in vitro. А – Транскрипт ХВК-full + БО ХВК;
Б – Кэпированный транскрипт ХВК-full + БО ХВК;
В – БО ХВК. Указаны средние высоты образованных структур (hср.), полученные по данным АСМ, и число измеренных частиц (N).
4. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с декэпированными транскриптами ХВК.
Для дальнейшего изучения влияния кэп-структуры на формирование конформационного сигнала упаковки РНК было решено удалить кэп-структуру с кэпированных транскриптов, инкубация которых с БО ХВК приводила к образованию вРНП.
Рис. 13. Образование вРНП при инкубации БО ХВК с кэпированным и декэпированным транскриптом ХВК-1320 in vitro. А – Транскрипт ХВК-1320 + БО ХВК;
Б – Кэпированный транскрипт ХВК-1320 + БО ХВК;
В – Кэпированный транскрипт ХВК 1320, обработанный ТАР, + БО ХВК;
Г – БО ХВК. Электронные микрофотографии, круговое оттенение металлом (Pt+Pd). Масштабные отрезки 100 нм.
Транскрипт ХВК-1320 сначала был кэпирован при помощи кэпирующей системы вируса осповакцины. Было проверено и подтверждено, что его инкубация с БО ХВК приводит к формированию частиц (Рис.13.Б), после чего кэп-структура была удалена с помощью кислой пирофосфатазы табака (Tobacco Acid Pyrophosphatase - ТАР). Декэпированный транскрипт ХВК-1320 был проинкубирован с БО ХВК в стандартных условиях, и инкубационная смесь была проанализирована методом ПЭМ. Показано, что при инкубации декэпированного транскрипта ХВК-1320 с БО ХВК в стандартных условиях происходит образование вРНП (Рис. 13.В). В качестве контролей были использованы некэпированные и кэпированные транскрипты ХВК-1320, проинкубированные с БО ХВК в тех же условиях, и БО ХВК, проинкубированный в тех же условиях в отсутствие РНК (Рис. 13.Г). В первом случае, как и ранее, образование вРНП выявить не удалось (Рис. 13.А), а во втором вРНП были обнаружены (Рис. 13.Б). Удаление кэп-структуры не повлияло на эффективность взаимодействия декэпированных транскриптов с БО ХВК. По-видимому, кэп-структура сама по себе не является сигналом инициации сборки вРНП in vitro, но может оказывать влияние на конформацию 5'-конца молекулы РНК. Можно предположить, что последующее удаление кэпа из предварительно кэпированной РНК не оказывает решающего воздействия на эффективность взаимодействия ее 5'-конца с БО ХВК.
Аналогичные эксперименты были проведены с другими 5'-концевыми транскриптами РНК ХВК (3944 нт, 4950 нт и ХВК-full). Во всех случаях инкубация декэпированного траснкрипта с БО ХВК приводила к образованию вРНП. При анализе полученных данных нельзя было исключить возможность неполного кэпирования и/или декэпирования РНК в случае обработки транскриптов кэпирующей системой вируса осповакцины или ТАР. Был проведен анализ наличия кэп-структуры на 5'-конце РНК у кэпированных и декэпированных траснкриптов с помощью дрожжевой экзорибонуклеазы XRN-1, которая гидролизует одноцепочечную РНК в 5'-3' направлении, но не способна гидролизовать кэпированную РНК. Было показано, что некэпированный транскрипт полностью деградирует при обработке XRN-1. Кэпирование транскрипта и последующая обработка его экзорибонуклеазой XRN- приводит к тому, что РНК не гидролизуется полностью, хотя ее количество и снижается по сравнению с контролем. По-видимому, в нашем случае кэпирующая система вируса осповакцины кэпирует не все молекулы РНК транскриптов. Кэпированный транскрипт ХВК 1320, обработанный TAP, XRN-1 практически полностью гидролизует. Таким образом, может быть сделан вывод, что хотя кэпирующая система вируса осповакцины кэпирует не все молекулы РНК, удаление кэп-структуры с помощью ТАР происходит практически у всех кэпированных транскриптов.
5. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с некэпированным и кэпированным транскриптом ХВК с делецией первых нуклеотидов с 5'-конца РНК ХВК и декэпированной геномной РНК ХВК Ранее были опубликованы работы, указывающие на то, что участком инициации сборки ХВК может являться 5'-концевой фрагмент РНК ХВК длиной 84 нт (Kwon et al., 2005). По данным Lough с коллегами (2006) регуляторные элементы, необходимые для связывания РНК с БО ХВК, локализованы в области с 1-го по 107-й нт РНК ХВК. Поэтому мы решили проверить, повлияет ли кэпирование транскрипта с удаленными 96 нт с 5'-конца на его способность формировать вРНП in vitro. Был получен 5'-концевой транскрипт РНК ХВК с делецией первых 96 нт длиной 1470 нт (ХВК). Методами ПЭМ и АСМ было показано, что при инкубации транскрипта ХВК с БО ХВК вРНП не образуются (Рис. 14.А) – наблюдаемые структуры схожи со структурами, которые образует БО ХВК, проинкубированный в тех же условиях в отсутствие РНК (Рис. 14.Г). Кэпирование транскрипта ХВК с дальнейшей его инкубацией с БО ХВК приводит к образованию вРНП (Рис. 14.Б). Как и ожидалось, результатом инкубации БО ХВК с некэпированным транскриптом ХВК, не содержащим предполагаемый участок инициации сборки, было образование неструктурированных агрегатов. Однако кэпирование транскриптов ХВК и их последующая инкубация с БО ХВК привели к формированию вРНП, несмотря на отсутствие предполагаемых по данным литературы участков инициации сборки. Полученные данные еще раз указывают на то, что специфическая нуклеотидная последовательность 5'-конца РНК не играет ключевой роли при образовании вРНП in vitro, а кэпирование РНК является важным элементом процесса. Следует отметить, что удаление кэп-структуры из кэпированного транскрипта ХВК также не препятствовало формированию вРНП (Рис.
14.В).
Б А Г В Рис. 14. Анализ методом АСМ вРНП, образованных при инкубации транскриптов ХВК с БО ХВК in vitro. А – Транскрипт ХВК + БО ХВК;
Б – Кэпированный транскрипт ХВК + БО ХВК;
В – Кэпированный транскрипт ХВК, обработанный ТАР, + БО ХВК;
Г – БО ХВК.
Трехмерные изображения.
В заключение этой серии экспериментов мы решили выяснить, влияет ли декэпирование на эффективность образования вРНП при инкубации геномной РНК ХВК с БО ХВК. Показано, что при инкубации нативной РНК ХВК, обработанной ТАР, с БО ХВК эффективно образуются вРНП, средняя высота которых составила 9,0 ± 1,5 нм. В качестве положительного контроля использовали гомологичные вРНП, сформированные при инкубации нативной РНК ХВК, в качестве отрицательного контроля – БО ХВК. Их средние высоты составили 9,1 ± 1,0 и 2,8 ± 0,9 нм соответственно.
Таким образом, на основании представленных результатов можно предположить, что кэпирование оказывает влияние на вторичную структуру 5'-концевого фрагмента молекулы РНК, и, по-видимому, приводит к образованию конформационного сигнала упаковки вирусной РНК в БО ХВК. Сама кэп-структура не является фактором, необходимым для взаимодействия РНК с БО ХВК при формировании вРНП, и ее удаление, возможно, после формирования предполагаемого конформационного сигнала инициации сборки, не влияет на эффективность процесса сборки вРНП.
6. Изучение структуры и свойств вРНП, образованных при инкубации БО ХВК с 5' концевыми транскриптами геномной РНК вируса мозаики альтернантеры Влияние кэп-структуры на эффективность сборки вРНП было изучено на примере другого вируса, относящегося к группе потексвирусов – вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт). Участок начала сборки для ВМАльт не известен, однако специфический сигнал упаковки для близкого родственника ВМАльт – вируса мозаики папайи (ВМПап), с которым ВМАльт имеет гомологию 79,8% – был определен как первые 47 нт на 5'-конце РНК (Sit et al., 1994;
Geering and Thomas, 1999). Кроме того, данные по трансляционной активации вРНП ВМАльт, полученные в нашей лаборатории (Mukhamedzhanova et al., 2011), свидетельствуют о том, что сборка ВМАльт происходит с 5'-конца. РНК ВМАльт эффективно взаимодействует с БО ХВК с образованием вРНП, идентичных по структуре гомологичным вРНП и нативным вирионам ХВК (Рис. 1.Ж, 2.В, 3.Ж). Были получены транскрипты ВМАльт, соответствующие с 1-го по 1320-й нт (ВМАльт-1320) и с 100-го по 1639-й нт (ВМАльт) 5'-концу геномной РНК ВМАльт.
При инкубации некэпированных транскриптов ВМАльт с БО ХВК образование вРНП зафиксировать не удалось. При инкубации с БО ХВК кэпированных транскриптов ВМАльт частицы образуются, а удаление кэп-структуры не препятствует сборке вРНП. Удаление возможного сайта инициации сборки, по аналогии с ВМПап, не повлияло на результаты:
некэпированные транскрипты ВМАльт с делецией первых 99 нт не одевались белком оболочки ХВК (Рис. 15.А). Однако при инкубации кэпированных делеционных мутантов с БО ХВК происходило образование вРНП (Рис. 15.Б), несмотря на отсутствие нуклеотидной последовательности, являющейся по данным литературы Рис. 15. Образование вРНП при инкубации кэпированного транскрипта ВМАльт с БО ХВК in vitro.
А – Некэпированный транскрипт ВМАльт + БО ХВК;
Б – Кэпированный транскрипт ВМАльт + БО ХВК;
В – Кэпированный транскрипт ВМАльт, обработанный ТАР, + БО ХВК;
Г – БО ХВК.
Электронные микрофотографии, угловое оттенение металлом (Pt+Pd, 7°).
Масштабные отрезки 100 нм.
вероятным участком начала сборки. Таким образом, можно заключить, что кэпирование оказывает существенное влияние на процесс формирования вРНП in vitro и в случае образования вРНП при инкубации БО ХВК с 5'-концевыми транскриптами геномной РНК другого потексвируса – ВМАльт.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Специфическое узнавание вирусных РНК структурным белком играет ключевую роль в инкапсидации вирусных РНК-геномов при сборке вирусной частицы. Однако в настоящее время сигнал упаковки до сих пор не охарактеризован для большинства вирусов растений со спиральной структурой, поэтому поиск сигналов или необходимых структурных элементов крайне важен для понимания механизмов взаимодействия вирусных белка оболочки и РНК в процессе образования вирусной частицы.
Показано, что при инкубации БО ХВК с гетерологичными геномными РНК вирусов, принадлежащих к разным таксономическим группам, in vitro формируются вРНП, идентичные по морфологии гомологичным реконструированным вРНП (РНК ХВК – БО ХВК) и нативным вирионам. Использование трансляционного теста позволило сравнить структуру белковой спирали вРНП, содержащих гомологичную и гетерологичные РНК, так как трансляционная активация РНК в составе вРНП возможна только при взаимодействии БО и ТБ1, требующего определенного конформационного состояния обоих белков.
Трансляционные свойства РНК в составе гомологичных и гетерологичных вРНП (чужеродная РНК – БО ХВК) оказались идентичны, что свидетельствует о сходстве структуры торцевых субъединиц БО ХВК в составе спирали вРНП, содержащих гетерологичную или гомологичную РНК, и нативных вирионов ХВК. Выявлено, что инициация сборки гетерологичных вРНП in vitro начинается с 5'-концевого района РНК и продолжается в 5'-3' направлении, как и у гомологичных вРНП. Образование вРНП при инкубации БО ХВК с РНК in vitro не зависит от специфической нуклеотидной последовательности 5'-конца РНК.
Дальнейшие эксперименты по сборке вРНП с использованием индивидуальных геномных РНК ВМК и функционально активного фрагмента геномной РНК 3 ВМК позволили прийти к выводу, что присутствие кэп-структуры на 5'-конце молекулы РНК может играть важную роль при образовании вРНП in vitro. Было показано, что при инкубации БО ХВК с функционально активным фрагментом геномной РНК 3 ВМК, соответствующим 4-й РНК ВМК по нуклеотидной последовательности, но лишенным кэп структуры, были образованы неструктурированные агрегаты, идентичные образуемым при инкубации БО ХВК в условиях сборки в отсутствии РНК. Однако инкубация Sh-фрагмента, кэпированного с помощью кэпирующей системы вируса осповакцины, с БО ХВК привела к образованию вРНП.
Гипотеза о влиянии кэп-структуры на эффективность образования вРНП при инкубации РНК с БО ХВК in vitro была проверена с помощью 5'-концевых транскриптов РНК ХВК различной длины. Обнаружено, что при инкубации с БО ХВК некэпированных транскриптов, соответствующих 5'-концевому району РНК ХВК, вРНП не были сформированы. Инкубация кэпированных транскриптов различной длины, в том числе полноразмерного, с БО ХВК привела к их эффективному взаимодействию с БО ХВК с образованием частиц, идентичных гомологичным вРНП. Вероятно, кэпирование влияет на конформацию 5'-проксимального отрезка молекулы РНК, что способствует его узнаванию БО ХВК и сборке вРНП. При этом присутствие самой кэп-структуры при формировании вРНП in vitro не является строго обязательным, поскольку добавление кэп-структуры in trans не влияет на эффективность взаимодействия БО ХВК и РНК. Кроме того, декэпирование предварительно кэпированных транскриптов не приводило к подавлению образования вРНП при инкубации их in vitro с БО ХВК.
В ряде работ (Sit et al., 1994;
Kwon et al., 2005;
Lough et al., 2006;
Karpova et al., 2006) была показана существенная роль 5'-концевого района молекулы РНК потексвирусов при образовании вРНП. Нами был получен транскрипт с удаленными 96 нуклеотидами с 5'-конца РНК ХВК, которые содержали вероятный участок инициации сборки. Делеция 5'-конца не повлияла на формирование вРНП – как и ожидалось, инкубация некэпированных транскриптов с БО ХВК приводила к образованию неструктурированных агрегатов. Однако кэпирование делеционных транскриптов и их последующая инкубация с БО ХВК привели к формированию вРНП. Возможность образования вРНП при инкубации кэпированных и некэпированных транскриптов с БО ХВК была также проверена и на другом потексвирусе – ВМАльт. Были получены 5'-концевые транскрипты РНК ВМАльт, как содержащие предполагаемый участок инициации сборки по данным литературы для близкородственного ВМПап (с 1 по 47 нт), так и несущие делецию первых 99 нуклеотидов. Было обнаружено, что инкубация с БО ХВК некэпированных транскриптов ВМАльт, в отличие от кэпированных и декэпированных, не приводит к формированию вРНП. Делеция возможного участка инициации сборки не повлияла на результаты: некэпированные транскрипты в отличие от кэпированных и декэпированных не одевались белком оболочки ХВК.
Можно предположить, что кэпирование РНК оказывает влияние на вторичную структуру 5'-конца молекулы и приводит к образованию конформационного сигнала упаковки вирусной РНК. Сама кэп-структура не является фактором, необходимым для взаимодействия РНК с БО ХВК при формировании вРНП, и ее удаление в дальнейшем не влияет на процесс сборки вРНП.
ВЫВОДЫ 1. С помощью просвечивающей электронной и атомно-силовой микроскопии и трансляционного теста показано, что при инкубации белка оболочки (БО) ХВК с геномными РНК вирусов, относящихся к различным таксономическим группам (гетерологичными РНК) in vitro образуются вирусные рибонуклеопротеиды (вРНП), идентичные по структуре и свойствам гомологичным вРНП (РНК ХВК – БО ХВК) и нативным вирионам ХВК.
2. Образование вРНП при инкубации РНК с БО ХВК in vitro не зависит от нуклеотидной последовательности 5'-конца РНК.
3. 5'-концевые некэпированные транскрипты РНК потексвирусов и некэпированный фрагмент геномной вирусной РНК не образуют вРНП при инкубации с БО ХВК in vitro.
4. Инкубация БО ХВК с кэпированными транскриптами потексвирусов и кэпированным фрагментом геномной вирусной РНК приводит к формированию вРНП, идентичных по структуре и свойствам гомологичным вРНП и нативным вирионам ХВК.
5. Удаление кэп-структуры у кэпированных РНК или добавление аналога кэп-структуры in trans к некэпированным РНК не влияет на образование вРНП.
6. Кэп-структура РНК не является сигналом инициации сборки, но влияет на эффективность взаимодействия РНК с БО потексвирусов in vitro и образование вРНП.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:
1. Petrova E.K., Nikitin N.A., Protopopova A.D., Arkhipenko M.V., Yaminskii I.V., Karpova O.V., Atabekov J.G. The role of the 5' cap structure in viral ribonucleoproteins assembly from Potato Virus X coat protein and RNAs // Biochimie. – 2013. DOI: 10.1016/j.biochi.2013.09.004.
2. Архипенко М.В., Петрова Е.К., Никитин Н.А., Протопопова А.Д., Дубровин Е.В., Яминский И.В., Родионова Н.П., Карпова О.В., Атабеков И.Г. Искусственные вирусоподобные частицы, полученные in vitro из белка оболочки Х-вируса картофеля и чужеродных вирусных РНК // Acta naturae. – 2011. – Т. 3. № 3 (10). – С. 42-48.
Тезисы устных и стендовых докладов, материалы конференций и конгрессов:
1. Petrova E., Nikitin N., Karpova O., Atabekov J. The significant role of RNA cap-structure in the assembly of artificial viral particles in vitro // FEBS Journal, Abstracts of the 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress, 2012, V. 279, Suppl. 1, P. 330-331.
2. Петрова Е.К., Никитин Н.А., Саватеев М.Н., Протопопова А.Д., Карпова О.В. Роль кэп структуры при формировании искусственных вирусных частиц с использованием белка оболочки фитовируса // 6-я международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Сборник тезисов. – Москва. 2012. – С. 42.
3. Петрова Е.К., Никитин Н.А., Архипенко М.В., Карпова О.В., Атабеков И.Г. Упаковка чужеродного генетического материала в искусственные вирусные частицы // Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Материалы конференции. – Москва. 2012. – С. 248-249.
4. Петрова Е.К., Никитин Н.А., Протопопова А.Д., Дубровин Е.В. Искусственные вирусные частицы, содержащие чужеродный генетический материал // 2-ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и Наномедицина». Сборник тезисов. – Московская область. 2011. – С. 93-94.
5. Петрова Е.К., Архипенко М.В., Никитин Н.А., Протопопова А.Д., Дубровин Е.В., Яминский И.В., Карпова О.В., Атабеков И.Г. Искусственные вирусные частицы, образованные белком оболочки потексвируса и чужеродными вирусными РНК // 5-я Международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Сборник тезисов.
– Москва, физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова. 2011. – С. 36.
6. Петрова Е.К., Никитин Н.А., Сушко А.Д., Архипенко М.В. Изучение роли кэп структуры при образовании вирусных рибонуклеопротеидов in vitro // 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». Сборник тезисов. – Пущино: Институт Белка РАН. 2011. – С. 67.
7. Петрова Е.К., Никитин Н.А., Архипенко М.В. Сборка вирусоподобных частиц из РНК вируса мозаики костра и белка оболочки потексвируса // 14-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука ХХI века». Сборник тезисов. – Пущино: Институт Белка РАН. – 2010. – Т. 2. – С. 170.
8. Петрова Е.К. Изучение структуры и свойств вирусных частиц, собранных из белка оболочки фитовируса и гетерологичных РНК // XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Секция «Биология». Тезисы докладов. – М.: МАКС Пресс. – 2010. – С. 205-206.