Взаимосвязь между ядерными рецепторами ppar,, и её роль в регуляции воспалительного ответа.
На правах рукописи
АЛЁШИН СТЕПАН ЕВГЕНЬЕВИЧ ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ЯДЕРНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ PPAR,, И ЕЁ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА.
Специальность 03.00.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2009
Работа выполнена на факультете Биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова в группе системной биологии липидов (отдел биокинетики).
Научный консультант: доктор химических наук Сергеева Марина Глебовна
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович доктор биологических наук Павлова Галина Валериевна
Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
Защита состоится «_» _ 2009 г. в «» часов на заседании совета Д 501.001. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:
119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.
Белозерского, лабораторный корпус «А», аудитория 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Москва.
Автореферат разослан “_” 2009г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Рецепторы пролифераторов пероксисом (PPAR) относятся к классу ядерных рецепторов, регулирующих транскрипцию. Существует три изоформы этих рецепторов –, и. Синтетические агонисты PPAR и PPAR используют для лечения гиперлипидемии и диабета 2 типа, и в настоящее время их предлагают как противовоспалительные средства. Агонисты PPAR как лекарственные средства ещё не зарегистрированы, тем не менее, они считаются перспективными для лечения дислипидемии, ожирения и нарушений механизмов восстановления и регенерации тканей.
Предполагают, что нарушение функций этих рецепторов приводит к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, возникновению рака, гипертонии, развитию нейродегенеративных заболеваний и хронического воспаления. По этой причине транскрипционные факторы PPAR активно изучаются. Эффективность применения синтетических агонистов PPAR для терапии таких дисфункций мозга как инсульт, травма, болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона и др. была показана на животных. Считается что нейропротективные свойства агонистов PPAR связаны с их противовоспалительными эффектами, поэтому в настоящее время актуальны исследования механизмов действия синтетических агонистов PPAR при воспалении, которое моделируется как на уровне целого организма, так и на уровне клеток мозга.
В развитии воспалительных процессов в мозге ключевая роль принадлежит клеткам глии. Среди глиальных клеток следует выделить астроциты, являющиеся основным источником полиненасыщенных жирных кислот и простагландинов важных провоспалительных веществ и эндогенных лигандов PPAR. Ключевыми ферментами продукции полиненасыщенных жирных кислот и простагландинов являются фосфолипазы А2 и циклооксигеназы, соответственно. Эти ферменты относятся к так называемым PPAR лиганд-синтезирующим ферментам.
Имеются сведения, что применение синтетических агонистов PPAR может приводить к изменениям уровней экспрессии фосфолипаз и циклооксигеназ, однако влияние лигандов PPAR на экспрессию этих ферментов в астроцитах не изучено. В последние годы было охарактеризовано влияние агонистов PPAR и PPAR на различные клеточные ответы астроцитов (пролиферацию, выброс цитокинов, и др.), однако экспрессия самих PPAR при этом не изучалась, хотя известно, что изменение экспрессии PPAR является одним из важных механизмов регуляции этих транскрипционных факторов. Не смотря на то, что ряд данных позволяет предположить наличие взаимодействий между изотипами PPAR на уровне взаимной регуляции их экспрессии, в настоящий момент практически не существует работ, посвящённых исследованию взаимодействий всех трёх изотипов PPAR.
Способность PPAR регулировать экспрессию своих лиганд синтезирующих ферментов с одной стороны, и участие лигандов в регуляции экспрессии самих PPAR с другой стороны, указывают на наличие сложной системы взаимодействий между фосфолипазами А2, циклооксигеназами и PPAR. Тем не менее, до сих пор не было попыток изучить эти белки и взаимосвязи между ними как единую систему функционально взаимодействующих белков. Изучению этой системы и посвящена данная работа.
Цели и задачи исследования Целью данной работы было исследовать взаимосвязь между изоформами PPAR,, и их лиганд-синтезирующих ферментов циклооксигеназы и фосфолипазы А2;
установить роль этой взаимосвязи при ответе астроцитов на провоспалительную стимуляцию.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить влияние синтетических агонистов PPAR на экспрессию PPAR, и ;
цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 и циклооксигеназ.
2. Установить наличие и характер взаимодействия между изоформами PPAR в астроцитах, стимулированных липополисахаридом (ЛПС), изучить влияние комбинаций синтетических агонистов PPAR на уровни экспрессии PPAR, и.
3. Изучить совместное влияние изоформ PPAR на экспрессию ключевого фермента синтеза простагландинов циклооксигеназы в астроцитах, стимулированных ЛПС.
4. Установить влияние различных изоформ PPAR на экспрессию цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 в астроцитах, стимулированных ЛПС.
5. Установить PPAR-лигандсинтезирующую роль фосфолипаз А2 и циклооксигеназы в регуляции PPAR-опосредованной транскрипции циклооксигеназы в астроцитах, стимулированных ЛПС.
Научная новизна и практическая значимость работы В работе было впервые показано, что изоформы ядерных рецепторов PPAR, и способны регулировать экспрессию друг друга. В настоящее время многие фармацевтические компании ведут разработки двойных агонистов PPAR, активирующих сразу несколько изоформ PPAR. Данные о взаимодействии изоформ PPAR позволят лучше прогнозировать эффекты этих агонистов.
Впервые было охарактеризовано влияние комбинированного воздействия синтетических PPAR агонистов на уровень экспрессии COX-2. С использованием ингибиторного анализа и метода нокдауна получены данные, подтверждающие ключевую роль PPAR в регуляции экспрессии COX-2;
показано, что эндогенные PPAR лиганды, продуцируемые COX-2 и фосфолипазой А2, участвуют в активации ЛПС-индуцированной транскрипции COX-2 за счет связывания с PPAR. Обнаруженные эффекты по влиянию комбинированного применения PPAR агонистов на экспрессию COX-2 позволят разработать методы регулирования экспрессии гена этого фермента при терапии заболеваний с воспалительной компонентой.
Показано участие всех трёх изоформ PPAR в регуляции уровня экспрессии цитозольной и секреторной изоформ фосфолипазы А2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Результаты, демонстрирующие различие в динамике экспрессии фосфолипаз А2 при обработке астроцитов агонистами различных изоформ PPAR, не имеют аналогов в мировой литературе.
В результате проделанной работы была предложена схема системы взаимодействий трёх изоформ PPAR, фосфолипаз А2 и COX-2. В данной схеме учитывается влияние как синтетических, так и эндогенных лигандов, продуцируемых при активации фосфолипаз и циклооксигеназы в процессе воспалительного ответа.
Важность полученных результатов для фундаментальной науки и практической медицины заключена в том, что активация этих ферментов является одним из основных компонентов ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний. Результаты этой работы могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии, патофизиологии и фармакологии.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIV, XV и XVI международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2007, 2008, 2009), Международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 5-7 июня 2007 г.;
2-4 июня 2009 г.)", 48ой встрече американского общества клеточных биологов в Сан-Франциско «The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting 2008».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них статей - 2, статей в сборниках -2, материалов конференций - 6.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на _ страницах, содержит рисунков и таблиц, и включает следующие разделы:
«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы» и «Список литературы» (_ цитированных работ).
Список сокращений. PPAR– рецепторы активаторов пролиферации пероксисом;
COX– циклооксигеназа;
ФЛА2– фосфолипаза А2;
ЛПС– липополисахарид клеточной стенки бактерий;
ГАФД– глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназа;
ПНЖК– полиненасыщенные жирные кислоты;
ПГ– простагландины.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Астроциты выделяли из мозгов новорожденных крыс, работали на клетках второго пассажа. Воспалительный ответ моделировали липополисахаридом (ЛПС), который является широко используемым провоспалительным стимулом. ЛПС связывается с так называемыми Толл подобными рецепторами, которые встречаются практически на всех клетках животных, в том числе и на астроцитах. Определение экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени с помощью набора «SYBR green PCR Master Mix» (Bio-Rad). Уровень экспрессии генов сравнивали с уровнем экспрессии ГАФД и нормировали на значения, полученные для контрольных клеток. Определение количества белка проводилось методом иммуноблотинга, для проявки использовался ECL-реагент. Данные нормировалась на концентрацию -тубулина, количество белка в контрольных клетках принимали за единицу. ДНК-связывающая активность изоформ PPAR определялась с помощью иммуноферментного набора «PPAR,, Complete Transcription Factor Assay Kit» (Cayman Chemical). Значение активности нормировалось на контрольные клетки, ДНК-связывающая активность изоформ PPAR в которых принималась за 100%. Для трансфекции астроцитов миРНК и плазмидой, сверхэкспрессирующей PPAR, использовалась магнитная трансфекция. Для измерения эффективности нокдауна и сверхэкспрессии использовали иммуноблотинг. Нокдаун считался эффективным при снижении уровня белка на 90%. Концентрация простагландина Е2 в культуральной жидкости измерялась методами ESI/MS и ИФА. Полученные данные обрабатывали по методам корреляционного и вариационного анализа (ANOVA) и критерия Стьюдента (t-тест). Все измерения проводились не менее трех раз. Достоверными считали различия при р0,05. Все погрешности отражают стандартное квадратичное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Исследование влияния синтетических агонистов PPAR на экспрессию PPAR, и ;
цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 и циклооксигеназ Влияние синтетических агонистов PPAR на экспрессию изоформ PPAR и их лиганд-синтезирующих ферментов ранее не изучалось, поэтому мы исследовали влияние GW7647 (PPAR агонист), L-165041 (PPAR агонист) и росиглитазона (PPAR агонист) на экспрессию этой группы генов. Показано, что синтетический агонист PPAR увеличивает экспрессию PPAR, COX-1 и уменьшает экспрессию цитозольной и секреторной фосфолипаз А2;
синтетический агонист PPAR увеличивает экспрессию PPAR, COX-1, и уменьшает экспрессию PPAR, цитозольной и секреторной фосфолипаз А2;
синтетический агонист PPAR уменьшает экспрессию PPAR, PPAR, COX-2, цитозольной и секреторной фосфолипаз А2. Таким образом, синтетические агонисты всех трех изоформ PPAR оказывают влияние на экспрессию PPAR, и ;
цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 и циклооксигеназ.
2. Взаимосвязь PPAR, и в астроцитах, стимулированных ЛПС К началу нашей работы было известно, что уровень экспрессии PPAR и PPAR может меняться под воздействием провоспалительных стимулов.
Тем не менее, на клетках мозга подобных работ не проводилось. Более того, ничего не было известно об изменении уровня экспрессии PPAR под действием провоспалительных стимулов. Поэтому мы исследовали уровни экспрессии трех изоформ PPAR при стимуляции астроцитов ЛПС. Поскольку воспалительный ответ является сложным, динамически развивающимся процессом, на разных этапах которого могут активироваться различные транскрипционные факторы, мы изучали астроциты стимулированные ЛПС в течение 2, 4, 16 и 24 ч.
Получено, что уровни экспрессии PPAR и PPAR при инкубации клеток с ЛПС в течение 2-24 часов снижаются с минимумом при 4 часах стимуляции (Рис. 1А). Эти результаты согласуются с данными полученными на других типах клеток. Нами показано, что уровень мРНК PPAR возрастает при ЛПС стимуляции и к 24 часам значимо отличается от уровня экспрессии PPAR в контрольных клетках (Рис. 1А). Изменения уровней мРНК коррелируют с изменениями количества белка, измеренного иммуноблотингом (Рис. 1Б).
Так как при 4 часах ЛПС стимуляции наблюдаются самые значительные изменения уровней экспрессии, то для дальнейшего изучения нами была выбрана временная точка 4 часа.
Рис. 1. ЛПС снижает экспрессию PPAR, PPAR и увеличивает экспрессию PPAR.
Клетки стимулировались ЛПС в течение 2, 4, 16 и 24 часов. (А) Уровни мРНК изоформ PPAR, измеренные ПЦР в реальном времени;
(Б) Количество белка изоформ PPAR определялось с помощью иммуноблотинга. Приведена одна типич ная электрофореграмма и результаты денсито метрии. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
На основании анализа литературных данных мы предположили, что лиганды одной изоформы PPAR, способны изменять экспрессию другой изоформы. Для проверки этой гипотезы мы проводили следующие эксперименты: астроциты предынкубировались в течение 10 минут с различными концентрациями GW7647 (PPAR агонист), L-165041 (PPAR агонист) и росиглитазона (PPAR агонист). Далее клетки стимулировали ЛПС, через 4 часа стимуляции из астроцитов выделяли тотальную РНК и с помощью ПЦР в реальном времени анализировали уровни экспрессии изоформ PPAR. Получено, что в астроцитах, стимулированных ЛПС, агонист PPAR GW7647 концентрационно-зависимо снижает экспрессию своего рецептора (Рис. 2А). При использовании 10 мкМ GW7647 уровень экспрессии PPAR снижается в два раза. Обработка астроцитов 10 мкМ агониста PPAR L-165041, приводит к двукратному увеличению уровня экспрессии PPAR. PPAR агонист росиглитазон не оказывал влияния на экспрессию PPAR изоформы (Рис. 2А), то есть экспрессия PPAR регулируется агонистами PPAR и PPAR. В аналогичных экспериментах было показано, что только синтетический агонист PPAR влияет на экспрессию PPAR и PPAR, увеличивая её. (Рис. 2Б,В). Таким образом, все три агониста способны влиять на экспрессию изоформ PPAR в астроцитах, стимулированных ЛПС. Полученные данные указывают на существование взаимосвязей между тремя изоформами PPAR на уровне их экспрессии в астроцитах, стимулированных ЛПС.
Рис. 2. Агонисты PPAR модулируют экспрессию изоформ PPAR. Астроциты обрабатывали указанными концентрациями PPAR (GW7647), PPAR (L-165041) и PPAR (Рос) агонистов, через 10 мин. клетки стимулировались ЛПС. Через 4 ч стимуляции экспрессия PPAR (A), PPAR (Б) и PPAR (В) определялась с помощью ПЦР в реа льном времени. Экспрессия генов в конт рольных клетках принята за 1. Все экспе рименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
2.1. Влияние комбинаций агонистов PPAR на экспрессию PPAR,,.
Так как было показано, что агонисты PPAR способны менять уровни экспрессии изоформ этого семейства транскрипционных факторов, то можно предположить, что совместная обработка клеток агонистами нескольких изоформ PPAR будет приводить к синергетическим эффектам. Для проверки этого предположения мы предынкубировали астроциты с различными комбинациями PPAR агонистов, затем стимулировали клетки ЛПС и измеряли уровни экспрессии изоформ PPAR на уровне мРНК и белка. Добавление только L-165041 или росиглитазона не оказывало влияния на экспрессию PPAR, однако совместное добавление росиглитазона и L-165041 приводило к увеличению экспрессии PPAR (Рис. 3;
столбец 3). Эффект совместного применения может быть объяснен тем, что росиглитазон увеличивает уровень экспрессии PPAR (Рис. 3;
столбец 2), порог чувствительности клеток к действию PPAR агониста снижается, и он начинает действовать в меньших концентрациях.
Интересно, что PPAR агонист GW7647 не оказывает влияния на экспрессию PPAR, однако снимает росиглитазон-индуцированную экспрессию PPAR (Рис. 3;
столбцы 2 и 4). Совместное добавление, всех трех агонистов приводит к максимальному падению экспрессии PPAR (Рис.
3;
столбец 6). Это может объясняться тем, что в этих условиях экспрессия PPAR максимальна, а также имеется избыток его агониста GW7647, то есть активность PPAR также максимальна. Таким образом, комбинированное применение агонистов PPAR может приводить к сложным вторичным эффектам за счет модулирования уровней экспрессии их рецепторов.
Рис. 3. Комбинации агонистов PPAR модулируют экспрессию изоформ PPAR. Астроциты предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Экспрессия изоформ PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трёх раз. * p0.05.
2.2. Росиглитазон индуцирует экспрессию PPAR через PPAR опосредованный путь Агонисты PPAR могут действовать как через специфическую активацию PPAR, так и через неспецифические взаимодействия с другими мишенями в клетке. Для выяснения специфичности действия росиглитазона как PPAR агониста мы использовали циглитазон, который является агонистом PPAR, но имеет другую химическую структуру, а также антагонист PPAR GW9662.
Получено, что циглитазон оказывает такой же эффект, что и росиглитазон (Рис. 4). Предобработка клеток антагонистом GW9662 снимает индукцию экспрессии PPAR росиглитазоном или циглитазоном (Рис. 4). Эти результаты указывают на специфическое действие росиглитазона и циглитазона как PPAR агонистов. Для подтверждения этого предположения мы исследовали астроциты с нокдауном PPAR (Рис. 4). Полученные данные подтверждают, что росиглитазон увеличивает уровень экспрессии PPAR через активацию PPAR рецептора.
Рис. 4. Активация PPAR увеличивает экспрессию PPAR в астроцитах, стимулированных ЛПС. Астроциты пред обрабатывались антагонистом PPAR GW (1 мкМ) в течение 10 мин или исполь зовались астроциты с нокдауном PPAR.
Далее клетки обрабатывали PPAR агонис тами росиглитазоном (Р) и циглитазоном (Ц) в концентрации 20 и 40 мкМ соответственно, затем астроциты стимулировались ЛПС.
Через 4 ч стимуляции экспрессия PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
2.3. PPAR агонист GW7647 снижает экспрессию PPAR через PPAR-опосредованный путь Агонисты PPAR также могут оказывать PPAR неспецифические эффекты, поэтому для доказательства того, что влияние GW7647 на экспрессию PPAR является PPAR- опосредованным процессом, мы получили астроциты с нокдауном PPAR. Добавление GW7647 к изучаемой системе не оказывало влияния на экспрессию PPAR в астроцитах с нокдауном PPAR (Рис. 5;
столбец 6), что указывает на PPAR опосредованный эффект этого агониста. Более того, измерение уровней мРНК в ЛПС-стимулированных клетках показало, что нокдаун PPAR приводит к увеличению экспрессии PPAR в 2,5 раза (Рис. 5;
столбцы 1 и 2).
Далее было показано, что изменение уровней мРНК PPAR коррелирует с изменениями количества белка PPAR. Таким образом, мы показали, что экспрессия PPAR находится под негативным контролем PPAR.
Рис. 5. Активация PPAR снимает увеличение экспрессии PPAR, вызванное активацией PPAR.
Контрольные астроциты, также как и астроциты с нокдауном PPAR предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L 165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение ч. Экспрессия PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени.
Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
2.4. PPAR агонист L-165041 увеличивает экспрессию и активность PPAR в астроцитах, стимулированных ЛПС, через PPAR опосредованный путь Поскольку было получено, что экспрессия PPAR увеличивается только в астроцитах совместно обработанных росиглитазоном и L-165041, то есть в условиях активации, то мы предположили, что именно PPAR отвечает за увеличение уровня экспрессии PPAR. Для того, чтобы доказать наличие связи между PPAR и PPAR мы получили и исследовали астроциты с нокдауном PPAR. Действительно, в астроцитах, обработанных росиглитазоном и L-165041 совместно, нокдаун PPAR приводил к трехкратному снижению уровня экспрессии PPAR (Рис. 6А;
столбцы 7 и 8).
Аналогичные результаты были получены и при измерении количества белка PPAR.
Для подтверждения ключевой роли PPAR в индукции экспрессии PPAR мы получили астроциты со сверхэкспрессией PPAR и провели их исследование. Показано, что избыток PPAR приводит к значительному увеличению уровня экспрессии мРНК PPAR в клетках, обработанных PPAR агонистом (Рис. 6Б;
столбцы 3 и 4). Этот эксперимент доказывает, что PPAR является позитивным регулятором экспрессии PPAR. Поскольку нокдаун PPAR изоформы в контрольных клетках приводил к снижению экспрессии PPAR в астроцитах, обработанных росиглитазоном и L-165041 совместно (Рис. 6Б;
столбцы 5 и 7), а сверхэкспрессия PPAR снимала этот супрессирующий эффект нокдауна PPAR (Рис. 6Б;
столбцы 7 и 8), то можно сделать вывод, что роль PPAR агониста в увеличении экспрессии PPAR сводится к индукции экспрессии PPAR. Таким образом, наряду с позитивной регуляцией PPAR изоформой и негативной регуляцией PPAR изоформой, PPAR изоформа увеличивает экспрессию PPAR.
Рис. 6. Активация PPAR приводит к увеличению экспрессии PPAR.
Астроциты с нокдауном (А) или сверхэкспрессией (Б) PPAR предынкубировались с PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Экспрессия PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
2.5. Взаимодействие изоформ PPAR на уровне модуляции их активности Взаимодействие между изоформами PPAR было обнаружено на уровне их количества. Тем не менее, известно, что количество транскрипционного фактора не обязательно согласуется с его активностью, поэтому для проверки наличия взаимодействия PPAR на уровне их ДНК-связывающей активности мы измерили активность PPAR в астроцитах, обработанных различными комбинациями PPAR агонистов. Показано, что при обработке астроцитов PPAR агонистом GW7647 совместно с PPAR агонистом росиглитазоном активность PPAR не изменялась, однако добавление L 165041 к этим агонистам более чем в 4 раза увеличивало активность PPAR (Рис. 7А). Эти данные показывают, что PPAR увеличивает активность PPAR. Показано, что добавление росиглитазона в 2,5 раза увеличивает активность PPAR (Рис. 7Б), а комбинированная обработка астроцитов росиглитазоном и L-165041 приводит к увеличению активности PPAR в 5, раз (Рис. 7Б), то есть PPAR увеличивает активность PPAR. Эта индукция активности PPAR снимается агонистом PPAR (Рис. 7Б), что подтверждает негативную роль PPAR в регуляции PPAR. Таким образом, регуляция PPAR на уровне активности совпадает с их регуляцией на уровне экспрессии.
Рис. 7. Активность PPAR модулируется схоже с их экспрессией. Астроциты 10 мин предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Активность PPAR (A) и PPAR (Б) определялась с иммуноферментного набора. Активность PPAR в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
3. Влияние агонистов PPAR на экспрессию COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС Важной функцией астроцитов при развитии воспалительного ответа является синтез простагландинов. Ключевым ферментом синтеза простагландинов является циклооксигеназа. В астроцитах экспрессируются две изоформы COX (COX-1 и COX-2). В литературе имеются сведения о влиянии синтетических агонистов различных изоформ PPAR на экспрессию COX-2, однако они противоречивы и зависят от типа изучаемых клеток и параметров эксперимента. Поэтому мы исследовали возможность регуляции COX-1 и COX-2 синтетическими агонистами PPAR, и в астроцитах, стимулированных ЛПС.
Исследование динамики экспрессии COX показало, что уровень мРНК COX-2 начинает возрастать уже через 2 ч после ЛПС стимуляции, достигает максимума к 4 ч инкубации астроцитов с ЛПС, незначительно снижается к 16 ч и остается на этом уровне до 24 часов инкубации астроцитов с ЛПС.
Данные иммуноблотинга показали, что уровень белка COX-2 значительно возрастает к 4 ч ЛПС стимуляции и далее практически не растет. ЛПС приводит к незначительному падению уровня экспрессии COX-1 к 4 ч, далее этот уровень сохраняется. Хотя ранее таких исследований на астроцитах не проводилось, однако полученные результаты согласуются с общепринятыми представлениями о COX-1 как о конститутивно экспрессирующемся гене и о COX-2 как о ферменте, индуцируемом при воспалительном ответе.
При добавлении различных концентраций синтетических агонистов PPAR (0,1-10 мкМ GW7647), PPAR (0,1-10 мкM L-165041) и PPAR (0,1- мкМ росиглитазона) значимого влияния агонистов на экспрессию COX-1 не обнаружено. Добавление PPAR агонистов (росиглитазона и циглитазона) увеличивало ЛПС-индуцированную экспрессию мРНК COX-2 (Рис. 8), агонисты PPAR и PPAR влияния на экспрессию COX-2 не оказывали.
Для того, чтобы проверить является ли, обнаруженное потенцирование COX-2, вызванное росиглитазоном и циглитазоном специфическим, то есть PPAR-зависимым процессом, мы использовали два независимых подхода:
предобработка астроцитов PPAR антагонистом GW9662 и изучение астроцитов с нокдауном PPAR. Получено, что как ингибирование активности PPAR антагонистом GW9662, так и нокдаун PPAR приводит к снятию эффектов агонистов PPAR (Рис. 8), то есть эффекты росиглитазона и циглитазона являются PPAR-зависимым. Следует отметить, что «базовый» уровень экспрессии COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС, не менялся при обработке астроцитов антагонистом или нокдауне PPAR (Рис. 8), то есть индукция экспрессии COX-2 при обработке астроцитов ЛПС не является PPAR зависимым процессом. Тем не менее, добавление синтетических агонистов PPAR включает механизмы, которые приводят к потенцированию эффекта ЛПС. Рис. 8. Активация PPAR увеличивает экспрессию COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Астроциты 10 мин пред-обрабатывались антагонистом PPAR или использовались астроциты с нокдауном PPAR. Далее их обрабатывали PPAR агонистами росиглитазоном (Р) и циглитазон ом (Ц), затем астроциты стимулировались ЛПС. Через 4 ч стимуляции определялась экспрессия COX-2. Экспрессия генов в конт рольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз.
* p0.05.
3.1. Влияние комбинированного применения агонистов PPAR на экспрессию COX- Так как эффекты взаимодействия изоформ PPAR наиболее ярко проявляются при комбинированном применении их синтетических агонистов, то мы изучили ЛПС-стимулированные астроциты, обработанные различными комбинациями синтетических PPAR агонистов. Получено, что после совместной обработки клеток PPAR и PPAR агонистами уровень экспрессии COX-2 не менялся по сравнению с клетками обработанными только PPAR агонистом (Рис. 9;
столбцы 2 и 3). Совместная обработка клеток PPAR и PPAR агонистами приводила к 3-х кратному увеличению экспрессии (Рис. 9;
столбцы 1 и 4), однако это увеличение снималось при добавлении агониста PPAR (сравнение столбцов 4 и 6 на Рис. 9). С использованием метода иммуноблотинга показано, что данные по количеству мРНК соответствуют данным по количеству белка. Таким образом, показано, что взаимодействия между изоформами PPAR вносят значительный вклад в регуляцию экспрессии COX-2, ключевого фермента синтеза простагландинов в активированных астроцитах.
Рис. 9. Комбинации агонистов PPAR модулируют экспрессию COX-2.
Астроциты предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агони стами росиглитазоном (Рос) (20мкМ) и циглитазоном (Циг) (40 мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч.
Экспрессия COX-2 определялась с помощью ПЦР в реальном времени.
Экспрессия COX-2 в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
3.2. Центральная роль PPAR в регуляции ЛПС-индуцированной экспрессии COX- Поскольку мы показали, что агонист PPAR росиглитазон приводит к индукции экспрессии PPAR, то логично было предположить, что этот эффект может быть причиной наблюдаемого потенцирования экспрессии COX-2 росиглитазоном. Для доказательства этой гипотезы мы использовали астроциты с нокдауном PPAR. На этих клетках были изучены эффекты комбинированного применения PPAR агониста росиглитазона с PPAR агонистом L-165041. Получено, что хотя «базовый» уровень экспрессии COX-2 в ЛПС- стимулированных астроцитах не изменяется (Рис. 10;
столбцы 1 и 2), однако нокдаун PPAR снимает эффект как росиглитазона, так и комбинации росиглитазона с L-165041 (Рис. 10;
сравнение столбцов 5,6 и столбцов 3,4). Эти результаты позволяют сделать вывод, что для проявления эффекта росиглитазона на экспрессию COX-2 необходимо наличие активного PPAR. Полученные результаты позволяют предположить, что роль других изоформ PPAR сводится к изменению количества и активности изоформы PPAR.
Рис. 10. Ключевая роль PPAR в модуляции экспрессии COX-2. Как контрольные, так и астроциты с нокдауном PPAR предынкубировались с PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Экспрессия COX- определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия COX-2 в контроль ных клетках принята за 1. Все экспе рименты проводили не менее трех раз.
* p0.05.
Для проверки этой гипотезы мы трансфецировали астроциты плазмидой, сверхэкспрессирующей PPAR и изучили влияние различных комбинаций агонистов PPAR на экспрессию COX-2 в данной клеточной модели. Обнаружено, что увеличение экспрессии PPAR приводит к увеличению уровня экспрессии COX-2 в 2 раза. Добавление агониста PPAR L-165140 увеличивает этот уровень еще в 2 раза, причем эффект становится независимым от добавления агонистов PPAR, или PPAR, то есть можно предположить, что клетки при избытке PPAR становятся нечувствительными к регуляции экспрессии COX-2 агонистами PPAR и PPAR. Для доказательства этой гипотезы, мы изучили эффекты агонистов PPAR и PPAR на астроцитах, сверхэкспрессирующих PPAR, но с нокдауном PPAR или PPAR. Было получено, что нокдаун PPAR или PPAR не влиял на уровень COX-2 в таких астроцитах при обработке их L-165140. Эти данные подтверждают, что PPAR играет центральную роль в потенцировании экспрессии COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС, а роль остальных изоформ PPAR сводится к модуляции экспрессии PPAR. Проведенные эксперименты позволили предложить следующую схему взаимодействия изотипов PPAR при регуляции ЛПС-индуцированной экспрессии COX- (Рис.11): PPAR активирует (Рис.11;
путь 1), а PPAR ингибирует (Рис.11;
путь 2) экспрессию и активность PPAR. Активация PPAR приводит к потенцированию ЛПС-индуцированной экспрессии COX-2 (Рис.11;
путь 3).
При этом PPAR увеличивает экспрессию и активность PPAR (Рис.11;
путь 4), то есть описанная система способна к терминации экспрессии COX-2.
Рис. 11. Схема взаимодействия изотипов PPAR при регуляции экспрессии COX-2. 1) PPAR активирует PPAR;
2) PPAR супрессирует экспрессию и активность PPAR;
3) Активация PPAR приводит к увеличению экспрессии COX-2;
4) Активация PPAR приводит к активации PPAR.
3.3. Изучение физиологической значимости росиглитазон индуцированной экспрессии COX- Обнаруженное влияние росиглитазона на экспрессию COX- исключительно важно в свете предполагаемого использования синтетических PPAR агонистов как нейропротективных средств. Поэтому нами были проведены исследования по влиянию росиглитазона на выброс физиологически активных медиаторов воспаления- простагландинов. Был разработан метод количественного определения концентрации простагландинов с помощью метода масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. В ходе работы было показано, что концентрации всех изучаемых простагландинов при ответе астроцитов на ЛПС меняются согласованно с простагландином Е2, который является общепризнанным маркером воспаления. Поэтому далее активность полиферментной системы синтеза простагландинов оценивалась по уровню выбрасываемого астроцитами простагландина Е2, который измеряли иммуноферментным методом. Был показано, что стимуляция астроцитов ЛПС приводит к выбросу простагландина Е2, концентрация которого становится равной 1,1±0, нг/мл, а росиглитазон PPAR увеличивает этот выброс до концентрации 2,1±0,09 нг/мл. Действие росиглитазона снимается в присутствии антагониста PPAR, который снижает уровень простагландина Е2 до 0,9±0, нг/мл. Таким образом, обнаруженная росиглитазон-индуцированная экспрессия COX-2 является физиологически значимой.
4. Влияние агонистов PPAR на экспрессию цитозольной и секреторной ФЛА2 в астроцитах, стимулированных ЛПС Важной характеристикой действия провоспалительных стимулов на астроциты является активация фосфолипазы А2 (ФЛА2) и высвобождение полиненасыщенных жирных кислот. ФЛА2 относится к классу PPAR лиганд синтезирующих ферментов. Известно, что в астроцитах при воспалении главную роль играют секреторная и цитозольная ФЛА2, а в литературе имеются указания на возможность регуляции секреторной и цитозольной ФЛА2 агонистами PPAR, но работ по изучению влияния всех трех изотипов PPAR на экспрессию ФЛА2 в не проводилось. Не было сведений и о регуляции ФЛА2 агонистами PPAR в астроцитах. Поэтому мы изучили влияние ЛПС на экспрессию секреторной и цитозольной ФЛА2.
Получено, что уровень экспрессии цитозольной ФЛА2 увеличивается в 2 раза к 16 ч инкубации астроцитов с ЛПС и далее остается на постоянном уровне (Рис. 12 А). Эти результаты согласуются с общепринятым представлением, что активация ФЛА2 на начальных этапах ответа на провоспалительные стимулы происходит за счет фосфорилирования уже существующего белка и лишь на более поздних этапах идет регуляция ее экспрессии. PPAR агонист росиглитазон приводил к росту уровня экспрессии цитозольной ФЛА2 начиная с 2 ч инкубации, который достигал максимального (троекратного по сравнению с ЛПС-стимулированными астроцитами) уровня к 4 часам. К 16 часам уровень цитозольной ФЛА2 не отличался от уровня цитозольной ФЛА2 в контрольных клетках (Рис. 12 A).
Нокдаун PPAR снимал эффекты росиглитазона (Рис. 12 A), что говорит о PPAR специфическом действии этого агониста. Аналогично исследовали эффекты PPAR и PPAR агонистов. Активация PPAR его агонистом L 165041, приводит к увеличению уровня цитозольной ФЛА2 на всех сроках ЛПС стимуляции (2-24 часа). Показано, что агонист GW7647 через активацию PPAR приводит к значимому увеличению экспрессии цитозольной ФЛА2 после четырехчасовой ЛПС-стимуляции. Таким образом, все три изоформы PPAR принимают участие в модуляции ЛПС индуцированного уровня экспрессии цитозольной ФЛА2.
Экспрессия секреторной ФЛА2 увеличивается в 3 раза после 4 ч стимуляции, к 16 ч возвращается к исходному уровню и не меняется в дальнейшем (Рис. 12 Б). Несколько другой тип воздействия оказывают PPAR на экспрессию секреторной ФЛА2. PPAR и PPAR агонисты не влияют на экспрессию секреторной ФЛА2 в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкM.
Обработка астроцитов росиглитазоном приводит к трехкратному увеличению уровня секреторной ФЛА2 после 2 часов стимуляции и к двукратному увеличению после 4 ч стимуляции ЛПС (Рис. 12 Б). К 16 ч уровень секреторной ФЛА2 в обработанных росиглитазоном клетках падает до уровня в контрольных клетках и остается постоянным вплоть до окончания измерений (24 часа стимуляции) (Рис. 12 Б). На клетках с нокдауном PPAR показано, что эффект росиглитазона является PPAR зависимым (Рис. 12 Б).
Таким образом, все три изоформы PPAR участвуют в регуляции экспрессии цитозольной ФЛА2 и только активация PPAR увеличивает уровень экспрессии секреторной ФЛА2, тем не менее PPAR не влияют на «базовый» ЛПС-индуцированный уровень экспрессии ФЛА2, а участвуют только в его потенцировании.
Рис. 12. Активация PPAR увеличивает экспрессию цитозольной (цФЛА2) и секреторной (сФЛА2) фосфолипаз А2. Контрольные астроциты, также как и астроциты с нокдауном PPAR предынкубировались с PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (5 мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 2, 4, 16 и 24 ч. Экспрессия цитозольной (цФЛА2) (А) и секреторной (сФЛА2) (Б) фосфолипаз А2 определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
5. Роль эндогенных лигандов PPAR, продуцируемых ФЛА2 и COX-2, в развитии воспалительного ответа Нами было показано, что PPAR участвуют в активации экспрессии PPAR лиганд-синтезирующих ферментов: ФЛА2 и COX-2, регулируют количество своих эндогенных лигандов при ответе на провоспалительный стимул. Для подтверждения наличия взаимосвязи между PPAR и их лиганд синтезирующими ферментами мы обрабатывали клетки ингибиторами ФЛА (MAFP и специфический ингибитор цитозольной ФЛА2), а также специфическим ингибитором COX-2 NS398. Получено, что ингибиторы не влияли на «базовый» уровень ЛПС-индуцированной экспрессии COX-2 (Рис.
13А, белые столбцы), однако снимали росиглитазон-индуцированную экспрессию COX-2 (Рис. 13 А, серые столбцы), то есть эндогенные лиганды, продуцируемые ФЛА2 и COX-2 играют важную роль в реализации эффекта росиглитазона. Агонистом PPAR восстанавливает уровень экспрессии COX- при всех обработках (Рис. 13 А), что указывает на то, что эндогенные лиганды в рассматриваемой системе являются лигандами PPAR. Можно предложить следующую схему, объясняющую взаимодействия PPAR и их лиганд-синтезирующих ферментов (Рис. 13 Б): провоспалительный стимул активирует COX-2 и ФЛА2, которые синтезируют простагландины и полиненасыщенные жирные кислоты;
эти вещества являются эндогенными лигандами PPAR (Рис. 13 Б).
Рис. 13. Фосфолипазы А2 и COX-2 продуцируют эндогенные лиганды PPAR.
(А) Астроциты 10 мин предынкубировались с MAFP (5 мкМ), специфическим ингибитором цитозольной фосфолипазы цФЛА2инг (1 мкМ) и со специфическим ингибитором COX-2 NS398 ( мкМ). Далее клетки обрабатывались PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ). После 4 часов ЛПС стимуляции с помощью ПЦР в реальном времени измерялась экспрессия COX 2. Экспрессия COX-2 в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p0.05.
(B) При воздействии провоспалительного стимула фосфолипазы А2 выщепляют полиненасыщенные жирные кислоты из фосфолипидов (1);
эти жирные кислоты являются субстратом для COX-2 (2), который превращает их в простагландины (3);
и жирные кислоты и простагландины являются эндогенными лигандами PPAR (4), активация которого индуцирует экспрессию COX-2 (5) и ФЛА2 (6).
ВЫВОДЫ 1. Исследовано влияние синтетических агонистов ядерных рецепторов PPAR на экспрессию генов самих ядерных рецепторов PPAR,, и ферментов классов фосфолипаз А2 и циклооксигеназ. Показано, что синтетические агонисты изоформ PPAR влияют на экспрессию этих генов.
2. Изучена взаимосвязь между изоформами PPAR, и в астроцитах, стимулированных ЛПС. Показано, что PPAR увеличивает, а PPAR снижает уровень экспрессии и активность PPAR;
PPAR увеличивает уровень экспрессии и активность PPAR.
3. Показано положительное влияние агонистов PPAR и отрицательное влияние агонистов PPAR на экспрессию COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Установлено, что механизм действия этих агонистов заключается в модуляции активности PPAR, который играет ключевую роль в регуляции экспрессии COX-2.
4. В результате исследования влияния ядерных рецепторов PPAR, и на экспрессию цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 в астроцитах, стимулированных ЛПС, установлено, что экспрессия цитозольной фосфолипазы А2 находится под положительным контролем PPAR, и, а экспрессия секреторной фосфолипазы А находится под положительным контролем PPAR.
5. Показано, что активность цитозольной фосфолипазы А2 и COX- необходима для PPAR-опосредованной регуляции экспрессии COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Установлено, что в данной системе эти ферменты продуцируют эндогенные лиганды PPAR.
СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
1. Aleshin S, Grabeklis S, Hanck T, Sergeeva M, Reiser G. (2009).
Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-gamma positively controls and PPARalpha negatively controls cyclooxygenase-2 expression in rat brain astrocytes through a convergence on PPARbeta/delta via mutual control of PPAR expression levels. Mol Pharmacol. 76(2): 414- 2. Каратассо Ю.О., Алёшин С.Е., Попова Н.В., Чистяков В.В., Сергеева М.Г., Варфоломеев С.Д. (2007). Количественный анализ простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот методом масс спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Масс спектрометрия т.4, в. 3: 173- Тезисы конференций и статьи в сборниках:
3. Каратассо Ю.О., Алёшин С.Е., Попова Н.В Использование масс спектрометрии с электрораспылением для количественного анализа липидомов клеток животных на примере полиненасыщенных жирных кислот и эйкозаноидов. XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва, Россия, 11- апреля, 2007, сборник тезисов стр. 4. Попова Н.В, Алёшин С.Е., Каратассо Ю.О. Валидация метода ESI/MS для задач липидомики. XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва, Россия, 11- апреля, 2007, сборник тезисов, стр. 29-30.
5. Грабеклис С.А., Алёшин С.Е., Сергеева М.Г., Райзер Г. Использование пары "агонист-антагонист" для модуляции эффектов, вызванных транскрипционными факторами PPAR. Сборник статей Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация (5-7 июня 2007 г.)", стр. 15- 6. Алёшин С.Е., Грабеклис С.А. Регуляция экспрессии провоспалительного гена СОХ-2 при сочетаном применении синтетических агонистов ядерных рецепторов (PPAR). XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва, Россия, 8 - 11 апреля, 2008, сборник тезисов, стр. 2.
7. Aleshin S, Sergeeva M, Reiser G. PPAR Positively and PPAR Negatively Controls Cyclooxygenase-2 Expression in Rat Brain Astrocytes through a PPAR-Dependent Pathway (2009). Mol. Biol. Cell 19 (suppl), abstract #.W-L 8. Алёшин С.Е. Механизм действия росиглитазона на экспрессию циклооксигеназы-2 (СОХ-2). XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва, Россия, 13-18 апреля, 2009, сборник тезисов, стр.2.
9. Грабеклис С.А., Алёшин С.Е., Сергеева М.Г., Райзер Г. Сочетанное применение агонистов и антагонистов ядерного рецептора PPAR снижает негативные последствия реактивного астроглиоза. Сборник статей Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация (2-4 июня 2009 г.)", стр. 350-353.