Активация опухолевого супрессора р53 при ингибировании iii комплекса дыхательной цепи митохондрий

На правах рукописи

ХУТОРНЕНКО Анастасия Александровна Активация опухолевого супрессора р53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий 03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова”

Научный консультант:

доктор химических наук Евстафьева Александра Георгиевна

Официальные оппоненты:

Копылов Алексей Михайлович, доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования государственный университет имени М.В.Ломоносова”, химический “Московский факультет, профессор.

Кравченко Юлия Евгеньевна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.

Энгельгардта Российской академии наук, научный сотрудник.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт канцерогенеза ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина»

В нашей работе впервые показано, что ингибирование именно III комплекса ДЦ приводит к активации р 53, сопровождающейся р53 -зависимым апоптозом, в то время как ингибирование I, II или IV комплексов существенного влияния на р 53 не оказывает. При этом разобщители окислительного фосфорилирования не приводили к заметному увеличению уровня и активности р53, что свидетельствует против гипотезы Behrend и др. о ключевой роли деполяризации митохондриальной мембраны в активации р53.

Исследуя механизм этого явления, мы обнаружили, что причиной активации р является нарушение работы дигидрооротат дегидрогеназы (ДГОДГ), одного из ферментов пути биосинтеза пиримидинов в клетке. ДГОДГ – это белок, встроенный во внутреннюю митохондриальную мембрану, его функционирование сопряжено с III комплексом ДЦ митохондрий через убихинон, акцептирующий электроны при окислении дигидрооротата.

То, что ингибирование ДГОДГ должно приводить к активации р 53, было предсказано ранее, но не было подтверждено экспериментально. Таким образом, наша работа впервые экспериментально продемонстрировала, что биосинтез пиримидинов de novo является связующим звеном между дыхательной цепью митохондрий и о пухолевым супрессором р53.

В настоящее время, как ни странно, нет общепринятого молекулярного механизма активации р 53 при дефиците пиримидиновых нуклеотидов. Ингибирование биосинтеза пиримидинов должно приводить к нарушениям синтеза РНК и ДНК. Нарушение репликации ДНК обычно сопровождается генотоксическим стрессом и, вследствие этого,

Далее изучали влияние ингибиторов ДЦ митохондрий на транскрипционную активность р 53. Для измерения транскрипционной активности р 53 клетки HeLa трансфицировали плазмидой, несущей ген люциферазы (luc) под контролем р53 зависимого промотора, а также плазмидой, несущей ген lacZ под контролем конститутивного промотора, для нормировки. Транскрипция значительно luc усиливалась при обработке клеток HeLa ингибиторами III комплекса дыхательной цепи миксотиазолом (MXT) и стигмателлином (STG) и в меньшей степени усиливалась под действием антимицина А (ANT) (Рис. 1, В). Ингибиторы I комплекса пирицидин (PRC), II комплекса TTFA и IV комплекса KCN не влияли на уровень транскрипции р53 зависимого репортерного гена (Рис. 1, В). При оценке репортерной активности в клетках других линий (RKO, A549) были получены похожие результаты, хотя эффекты были менее выраженными. Поскольку репортерная система работала наилучшим образом в клетках HeLa, то для изучения транскрипционной активности р53 использовали именно эту клеточную линию.

Методом жидкостной хроматографии мы измерили уровень пуринов и пиримидинов в клетках RKO после их обработки ингибиторами ДЦ митохондрий. Под действием миксотиазола, как и под действием специфического ингибитора DHODH лефлюномида, происходило снижение уровня пиримидинов (уридина и цитидина – U и rC, соответственно) в клетках, в то время как уровень пуринов (аденозина и гуанозина – rA и rG, соответственно) не изменялся (Рис. 8, лефлюномид – зеленые столбцы, миксотиазол – фиолетовые, контроль без обработок – синие). Обработка клеток ингибитором IV комплекса ДЦ KCN не приводила к изменению уровней ни пуринов, ни пиримидинов (Рис.

8, KCN – красные столбцы).

Рис. 13. Обработка ингибитором NQO1 дикумаролом и ингибитором NQO резвератролом снижает аккумуляцию и активацию р 53 при действии миксотиазола.

А) Совместная обработка клеток линии RKO 2 мкМ миксотиазола (MXT) в течение часов с ингибиторами NQO1 и NQO2 (инкубация с 300 мкМ дикумарола (DCM) в течение часов, и инкубация с 50 мкМ резвератрола (RSV) в течение 10 часов) приводит к значительному снижению аккумуляции р 53 по сравнению с аккумуляцией под действием миксотиазола. Б) Транскрипционная активность р53 в клетках линии HeLa, обработанных 2 мкМ миксотиазола (MXT), 300 мкМ дикумарола (DCM) и 50 мкМ резвератрола (RSV).

Дикумарол и резвератрол значительно подавляют активацию р 53 под действием миксотиазола.

Однако, так как дикумарол и резвератрол могут иметь какие-то другие активности, помимо ингибирования NQO1 и NQO2, необходимо было проверить это предположение альтернативными методами.