Клонирование, экспрессия и характеристика l-аспарагиназы helicobacter pylori с противоопухолевой активностью
На правах рукописи
ГЛАДИЛИНА Юлия Алексеевна КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА L-АСПАРАГИНАЗЫ HELICOBACTER PYLORI С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2008
Работа выполнена в Государственном учреждении Научно исследовательском институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук.
Научный консультант: кандидат биологических наук Красоткина Юлия Валерьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Колесанова Екатерина Федоровна доктор биологических наук, профессор Шишкин Сергей Сергеевич
Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН
Защита состоится «» октября 2008 г. в _ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., д.10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН.
Автореферат разослан «_» 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Карпова Е.А.
кандидат химических наук.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Данная работа посвящена одной из актуальнейших проблем современной биохимии, онкологии и медицины – созданию эффективных препаратов, подав ляющих рост опухолевой клетки в результате целенаправленного воздействия на ее метаболизм. На сегодня единственным примером практического исполь зования ферментов в онкотерапии является применение бактериальной аспара гиназы в схемах комбинированной химиотерапии острых лимфобластных лей козов, лимфо-и ретикулобластом (Narta U.K., 2007).
Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза;
КФ 3.5.1.1.) катализирует гид ролиз аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты и иона аммония.
Именно это свойство аспарагиназы и определяет ее противоопухолевое дейст вие. При введении аспарагиназы в организм человека происходит снижение концентрации аспарагина в крови и тканевой жидкости. В лейкозных клетках, в отличие от нормальных тканей, активность аспарагинсинтазы снижена или полностью отсутствует. При уменьшении концентрации экзогенного аспараги на лейкозные клетки испытывают дефицит этой аминокислоты, происходит ин гибирование синтеза белка и нуклеиновых кислот, и, в конечном счете, гибель раковой клетки. Таким образом, достигается избирательная регрессия опухоле вой ткани при терапии аспарагиназой.
Несмотря на большое число бактериальных аспарагиназ с установленным противоопухолевым действием, только два фермента Escherihia сoli (ЕсА) и Erwinia chrysanthemi (ErA) используются в клинической практике (Wriston J.J., et al, 1995). Широкий спектр функциональных нарушений, индуцированных применением аспарагиназы, включает в себя поражения печени и поджелудоч ной железы, панкреатит, тромбозы и эмболии, нейротоксичность и подавление иммунной системы. (Narta U.K, 2007).
Основной причиной токсичности аспарагиназы принято считать снижение уровня внеклеточного глутамина вследствие частичной глутаминазной актив ности фермента. Kafkewitz и соавт. суммировали в своем обзоре результаты экспериментальных работ, которые показывают, что дефицит глутамина в ор ганизме заметно подавляет функцию иммунной системы, в то время как дефи цит аспарагина такого действия не оказывает (Kafkewitz, et al, 1983). Поэтому поиск новых аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью является акту альной задачей медицинской биохимии.
Попытки сделать аспарагиназу менее токсичной традиционно предприни маются двумя путями. Первый из них предполагает снижение глутаминазной активности направленным мутагенезом аминокислотных остатков, определяю щих субстратную специфичность фермента. Глутаминазная активность наибо лее удачного мутанта EcA N248A была снижена в 2 раза по сравнению с фер ментом дикого штамма. (Derst C, et al, 2000). Однако аспарагиназная активность этого производного EcA также была снижена и при физиологических условиях составляла не более 12% от первоначальной.
Второй подход, состоящий в поиске новых аспарагиназ с низкой глутами назной активностью, и был реализован в данной работе.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в разработке метода получения рекомбинантной аспа рагиназы H. pylori и характеристике ее терапевтически значимых свойств.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:
1. Клонирование и экспрессия гена HpA в клетках E.coli. Получение реком бинантного штамма-продуцента, обеспечивающего устойчивую экспрессию HpA.
2. Разработка лабораторного способа выделения гомогенного препарата HpA, пригодного для создания на его основе крупномасштабного метода полу чения фермента.
3. Характеристика терапевтически значимых физико-химических и катали тических свойств НрА.
4. Определение цитотоксической активности НрА по отношению к клеткам лейкозов человека.
5. Сравнение антигенности НрА и основной терапевтической аспарагиназы EcA.
Научная новизна работы, прежде всего, состоит в выделении и характери стике новой бактериальной аспарагиназы. Впервые клонирован ген периплаз матической аспарагиназы из штамма Helicobacter pylori, получен рекомбинант ный штамм E.coli, продуцирующий HpA. Разработаны оптимальные условия экспрессии, простой и эффективный способ очистки, что позволило впервые получить гомогенный препарат HpA. Проведена детальная характеристика фи зико-химических и каталитических свойств HpA. Определены кинетические константы гидролиза основных физиологических субстратов HpA – аспарагина и глутамина. Показано, что глутаминазная активность фермента не превышает 0,01% от аспарагиназной активности. Установлено, что HpA обладает высокой цитотоксической активностью в отношении клеток острого лимфобластного лейкоза MOLT-4, лимфомы Беркитта Raji, а также хронического миелоидного лейкоза K-562. Показано, что HpA вызывает гибель лейкозной клетки по меха низму апопотоза. Установлено, что HpA иммунохимически отлична от аспара гиназы E.coli.
Практическая значимость исследования.
Результаты, полученные в данной работе, могут быть применены для разра ботки нового противолейкозного препарата. Острый лимфобластный лейкоз яв ляется самым частым онкологическим заболеванием в педиатрии. На его долю приходится более 30% всех опухолей у детей (Павлова М.М., 1996). Ежегодно в России, регистрируют до 3000 новых случаев этого заболевания (Кривошеи на Е.Л., 2005). Установленные в данной работе свойства НрА обеспечат лекар ственному препарату на его основе ряд существенных преимуществ перед со временными терапевтическими аспарагиназами: (а) низкая токсичность позво лит избежать развития множества побочных эффектов, типичных для аспараги назной терапии;
(б) низкая себестоимость его производства как рекомбинантно го фермента уменьшит стоимость лечения;
(в) отличная от ЕсА антигенность НрА, указывает на возможность использования фермента для заместительной аспарагиназной терапии. Учитывая, что в нашей стране аспарагиназа никогда не производилась, результаты данной работы представляют интерес в качестве основы для создания первого отечественного препарата для лечения различных форм лейкозов.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы доложены на научно практической конференции с международным участием «Актуальные пробле мы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), Между народной научной конференции «Перспективы современной медицинской нау ки» (Винница, 2007), международном конгрессе «ПЕРСПЕКТИВА-2007» (Нальчик, 2007).
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 публикаций в сбор никах докладов научных конференций.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 147 источников. Ра бота изложена на _ страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Клонирование и экспрессия НрА.
В работе использовались стандартные методы генетики E. coli. В качестве источника гена аспарагиназы HpA была использована геномная ДНК Helico bacter pylori, любезно предоставленная К. Мамонолиевым (ЗАО «ПИННИ», www.pynny.ru). Ген был выделен методом амплификации. Нуклеотидная после довательность, соответствующая гену HpA по сайтам рестрикции EcoRI и NotI, была вставлена в TA-вектор pGEM-T Easy («Promega»). Для целей данной рабо ты ген HpA был переклонирован в вектор рАСНС177 по сайтам рестрикции EcoRI и NotI, а также в вектора pET22 (NcoI, NdeI и NotI) и pET11 (NdeI и NotI).
Манипуляции с ДНК осуществлялись в соответствии со стандартными прото колами (Маниатис Т. и др., 1984).
Культивирование штамма-продуцента E.coli проводили в конических колбах Эрленмейера (объемом 250 или 1000 мл) на термостатируемой качалке «GFL» (Германия) при 37°С. Объем LB-среды составлял 50 или 200 мл, в зави симости от объема колб.
Выделение рекомбинантного фермента методом колоночной хромато графии. Все стадии очистки проводили при 4°С. 10-12 г биомассы E. coli, сус пендировали в 20 мМ калий-фосфатном буфере, pH 5,8 (буфер А), до общего объема смеси 85 мл. Клетки разрушали ультразвуком (Дезинтегратор УЗДН-2Т, Россия) в течение 5 мин при режиме: 30 с озвучивания, 30 с перерыв. Разруше ние клеток проводили на ледяной бане, поддерживая t=2-4°С. Далее рН суспен зии доводили 1М NaH2PO4 до 5,8 и оставляли при 4°С и непрерывном переме шивании на 30 мин для преципитации части балластных белков. Растворимую фракцию клеточного экстракта получали центрифугированием при об/мин (30мин) и наносили на колонку с SP-Сефарозой FF (2.5 см х 10 см), уравновешенную буфером А. После нанесения белка SP-Сефарозу последова тельно промывали соответствующим буфером до исчезновения следов белка в элюате. Скорость нанесения образца и промывки колонки составляли от 0,5 до 3 мл/мин. Элюцию проводили 100 мл буфера А с рН 7,0, при скорости мл/мин. Фракции, содержащие L-аспарагиназу, объединяли. Объединенные фракции помещали в ячейку-концентратор Amicon объемом 12 мл, содержа щую фильтр Millipore (Ultrafiltration membrane NMWL 30000) и центрифугиро вали (Beckman, JA-25,5 4000 об/мин).
Определение концентрации белка.
Белок определяли модифицированным методом Лоури (Hartree E.,1991), а также через коэффициент экстинкции 0,1%280=0,61 (ProtParam, www.expasy.org).
Электрофорез белков в денатурирующих условиях осуществляли в соответ ствии с методикой (Laemmli, 1970), аспарагиназную активность определяли по методу Несслера (Wriston J., 1973), изоэлектрическое фокусирование проводи ли, как описано у Остерман М., 1983.
Определение кинетических параметров аспарагиназы.
Скорости гидролиза L-аспарагина и L-глутамина определяли спектрофото метрически по убыванию поглощения амидной связи при 215 нм (A215 = 102,5) с помощью спектрофотометра «Hewlett Packard» (Howard et.al., 1972). Для этого 27-1350 мкМ фермента добавляли к 2 мл 12,5 мМ боратного буфера, содержа щего субстраты в концентрации 30-3600 мкМ. Реакцию проводили при 37°С.
Определение цитотоксической активности аспарагиназы in vitro*.
Для определения влияния аспарагиназы на пролиферацию тест-культуры и оценки силы ее прямого токсического действия на чувствительные к аспараги назе клеточные линии K-562 (хронический миелоидный лейкоз), Raji (лимфома Беркитта), MOLT-4 и Jurkat (острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз), а так же нечувствительные к аспарагиназе фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) использовали микроколориметрический метод – МТТ-тест. Метод ос нован на редукции тетразолевого кольца 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5 дифенилтетразолиум бромида (MMT) дегидрогеназами митохондрий только живых клеток с образованием нерастворимых фиолетовых кристаллов форма зана. После осаждения клеток, среду осторожно и тщательно удаляли, образо вавшиеся кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде и измеряли оптическую плотность при длине волны 540 нм на «Multiscan» EX («Labsystems»). Результаты эксперимента выражали в % к контролю.
Выживаемость клеток (CS) рассчитывалась по формуле:
С=ODa/ODk*100%, где ODa – оптическая плотность в лунках с клетками, инкубированными с аспа рагиназой;
ODk – средняя оптическая плотность в контрольных лунках c клет ками, инкубированными без аспарагиназы.
Для характеристики цитотоксического эффекта использовали значение LC50 – концентрация препарата, приводящая к гибели 50% клеток, которое вы числяли путем аппроксимации кривой сигмоидной формы (рис.1) данных не скольких параллельных измерений для каждой концентрации препарата аспара гиназы.
CS(E) = A1+(A2-A1)/(1+10(LC50-E)p), где A1, A2 – нижняя и верхняя асимптоты, E- концентрация фермента, p- пара метр аппроксимации.
* Работа проводилась совместно с к.б.н. Посыпановой Г.А. (ММА им. И.М. Сеченова) и д.б.н. Абакумо вой О.Ю. (ГУ НИИ БМХ РАМН) Рис.1. Выбранная для аппроксимации выживаемости клеток кривая сигмоидной формы.
Морфологические признаки апоптоза, индуцируемого в лейкозных клетках аспарагиназой HpA, выявляли методом световой микроскопии, а также путем определения конденсации хроматина с использованием флуоресцентного мик роскопа после окраски лейкозных клеток Hoechst 33258 (2-(4-гидроксифенил) 5-(4-метил-1-пиперазинил)-2,5-би-1H-бензимидазолтригидрохлорид) (Yuste V.J., 2005).
Получение специфических поликлональных антител. В эксперименте использовали беспородных белых мышей-самцов с массой тела 19-22 г. Анти ген вводили с помощью внутрибрюшинных инъекций в количестве 25 мкг в 0,2-0,3 мл физиологического раствора, содержащего 50% полного адъюванта Фрейнда. Мышей иммунизировали на 7, 14 и 21-е сутки. Забор крови проводи ли декапитацией мышей на 28-й день. Кровь оставляли для свертывания при 37°С на 1 час. Отбирали аликвоты сывороток по 50-100 мкл и хранили при 20°С.
Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения ИФА использовали планшеты высокой сорбционной емкости («Nunc», марки «Polysorp»). Антиген в концентрации 20 мкг/мл сорбировали в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфе ре, pH 9,6, в течение ночи. В качестве блокирующего раствора применяли 50% ное молоко 0,5%-ной жирности в 0,01 М фосфатно-солевом буфере, рН 7, (PBS). Начальное разведение антисывороток варьировало от 1:2 до 1:4 в зави симости от титра специфических антител. Оптимальное начальное разведение (для достижения конечной точки титрования) определяли по результатам пред варительного эксперимента, проводимого в тех же условиях. Коньюгаты анти мышиных козьих IgG с пероксидазой хрена («Stressgen») разводили 1:2000 в PBS, содержащий 50%-ное обезжиренное молоко и 0,05% Tween 20. В качестве субстрата использовали 0,5 мг/мл ABTS в 0,1 М цитратном буфере, 1% H2O2, pH 4,0. Непосредственно перед инкубацией добавляли H2O2 до конечной кон центрации 1%. Реакцию останавливали внесением в лунки 100 мкл 1%-ного раствора SDS и измеряли оптическую плотность при длине волны 405 нм на плашечном фотометре «Multiscan» EX («Labsystems»). За титр принимали точку перегиба сигмоидной кривой логистического регрессионного уравнения (y=A2 + (A1-A2)/(1+(x/x0)p)), аппроксимирующей данные нескольких независи мых экспериментов (рис.2) (Свежова Н.В. и др., 2008).
Рис.2. Выбранная для аппроксимации оптической плотности кривая сигмоидной формы.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ ных продуктов «OriginLab Origin 7.0» и «Microsoft Excel 2003». Достоверность полученных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Клонирование гена HpA.
Цель данной работы состояла в получении аспарагиназы с низкой глутами назной активностью. В настоящее время только один фермент из штамма Wolinella succinogens (WsA), претендует на звание аспарагиназы, свободной от глутаминазной активности (0,015 % от аспарагиназной активности) (Distasio J., et al, 1972). Однако эти данные не были подтверждены для рекомбинантного фермента, экспрессированного в E.coli (Derst C. et al, 2000). Тем не менее, за от сутствием другой отправной точки, было решено получить фермент наиболее гомологичный WsA. Поиск по подобию в базе белковых и транслированных нуклеотидных последовательностей GeneBank, (доступных на сервере NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) программой BLAST с использованием аминокислотной последовательности аспарагиназы WsA (CAA61503) показал, что аспарагиназа штамма Helicobacter pylori (NP_223379) является одним из 10 наиболее близких гомологов WsA. Степень идентичности HpA и WsA составляет 53%, а гомоло гии – 73%.
Бактериальные аспарагиназы 2-го типа являются периплазматическими ферментами, которые характеризуются наличием сигнального пептида. Нали чие сигнального пептида в аминокислотной последовательности HpА было предсказано с вероятностью 0,98 программой SignalP 3.0 (Nielsen H. et al, 1997, Dyrlov J., et al, 2004). Положение сайта протеолиза между Glu20 и Asn21 ами нокислотными остатками было определено с вероятностью 0,965.
На основе анализа нуклеотидной последовательности mRNA аспарагиназы HpA, были подобраны праймеры для амплифицикации гена предшественника аспарагиназы и фрагмента гена, соответствующего процессированной форме фермента. Обратный праймер использовался для амплификации обеих форм.
Фрагменты ожидаемого размера были амплифицированы после оптимизации параметров ПЦР (рис.3). Температура отжига, равная 54оС, обеспечивала мак симальный выход ПЦР-продукта, тем не менее, эффективность амплификации полноразмерной формы гена HpA была существенно ниже, чем для его процес сированной формы.
Рис.3. ПЦР-продукты амплификации (1) полноразмерного гена HpA и (2) его фрагмента, соответствующего процессированной форме фермента. (3) Маркер молекулярных масс (Fermentas, #SM0332) После экстракции из 1%-ного агарозного геля фрагменты ДНК были клони рованы в ТА-вектор pGEM-T Easy («Promega»). Селекция клонов, предположи тельно содержащих целевые амплификаты, была проведена с помощью бело синего теста (Zhou M.Y. et al, 1995, Kobs G., 1997).
Рестрикция ферментом EcoRI плазмиды pGEM-TEasy, выделенной из ото бранных трансформантов, показала наличие вставки размером ~1 кб (рис. 4).
Вектор, несущий полноразмерный ген HpA, был обозначен pGEM-Т/HpA-P, а плазмида, содержащая фрагмент гена, соответствующий процессированной форме аспарагиназы, был назван pGEM-Т/HpA-М.
Рис.4. Рестрикционный анализ плазмид pGEMT/HpA-P, pGEMT/HpA-M EcoRI фрагменты(А);
pACYC/HpA-P, EcoRI –NotI фрагменты(B);
pET22/HpA-M, Nco–NotI фрагмен ты;
pET22/HpA-P, NdeI–NotI фрагменты;
pET11/HpA-M, NdeI–NotI фрагменты(C);
маркер мо лекулярных масс (Fermentas, #SM0332) (D).
Секвенирование показало, что последовательности HpA-P и HpA-M иден тичны нуклеотидным последовательностям гена аспарагиназы Helicobacter pylori. Аналогично были получены плазмиды pGEM-TEasу, содержащие после довательности HpA-P и HpA-M, которые фланкированы сайтами рестрикции NdeI или NcoI c 5’-конца.
EcoRI/NotI фрагменты pGEM-TEasy/HpA-P были клонированы в экспресси рующий вектор pACYC177. Именно этот клон и был использован в дальнейшей работе. Полученная в результате плазмида pACYC177/HpA-P была трансформи рована в клетки E.coli 21(DE3). Однако после индукции экспрессии HpA синте за рекомбинантного фермента не наблюдалось (рис. 5). Удельная аспарагиназ ная активность биомассы после индукции составляла 1,2±0,4 МЕ/мг, что соот ветствует активности нетрансформированной культуры E.coli 21(DE3).
Рис. 5.Электрофореграмма клеточного экстракта E.coli 21(DE3) с плазмидой pACYC177/HpA-P до (1) и после индукции 1мМ (2), 0,5 мМ (3) и 0,1 мМ ИРТГ(4).
Основными возможными причинами отсутствия экспрессии могли являться:
1. Наличие «редких» кодонов в нуклеотидной последовательности HpA.
2. Неузнавание сигнального пептида HpA транспортными белками E.coli.
3. Токсичность каталитически активной формы HpA для клетки-продуцента.
Первые две причины являются следствием существенной таксономической удаленности штаммов E.coli и H.pylori. Токсичность же является следствием дефицита аспарагина при экспрессии рекомбинантной аспарагиназы. Для уст ранения этих причин была проведена оптимизация экспрессии HpA.
Оптимизация генетической конструкции для экспрессии HpA в клетках E.coli.
Экспрессия чужеродного белка в E.coli может оказаться неэффективной, если нуклеотидная последовательность соответствующего гена содержит так назы ваемые «редкие» кодоны, т.е. такие триплеты, для которых концентрация тРНК является очень низкой.
Поиск редких кодонов в нуклеотидной последовательности HpA выявил их наличие в гене аспарагиназы. Тем не менее, отсутствие тандемных повторов по зволило предположить, что в данном случае эти триплеты не оказывают ре шающего влияния на экспрессию белка.
Для того, чтобы проверить это предположение HpA-М был клонирован в рЕТ11 для его экспрессии под регуляцией сильного Т7 промотора, но в заведо мо неактивной форме, благодаря включению 6-ти гистидинов и сайта расщеп ления TEV-протеазой на N-конце. Уровень экспрессии в данном случае был ожидаемо высоким (рис. 6). Этот результат показывал, что наличие редких ко донов не препятствует синтезу полипептидной цепи HpA в клетках E.coli. Ана логичный результат был получен при экспрессии HpA-Р с использованием плазмиды рЕТ22/ HpA-Р. В данном случае также наблюдалось постепенное на копление рекомбинантного белка в клетке-продуценте, однако фермент экс прессировался исключительно в виде телец включения (рис. 7). Увеличения ас парагиназной активности в культуре после внесения индуктора не наблюда лось. Синтезируемый в виде предшественника фермент не подвергался по сттрансляционной модификации, т.к., по всей видимости, сигнальный пептид HpA не узнавался транспортными белками и протеазами E.coli.
Рис.6. Экспрессия неактивной формы HpA под кон тролем Т7 промотора. Электрофорез в 12% ПААГ/ДСН клеточного экстракта BL21(DE3)/pET1 HpA-М до (А) и после (В) 24 часовой индукции 1мМ ИПТГ.
Рис.7. Экспрессия HpA-P под контролем Т7 про мотора. Электрофорез в 12% ПААГ/ДСН клеточ ного экстракта BL21(DE3)/pET22-HpA-P до (C) и после 8 (А) и 24 часовой (В) индукции 1мМ ИПТГ.
Для обеспечения правильной посттрансляционной модификации, фрагмент гена HpA, соответствующий процессированной форме фермента, был клониро ван в плазмиду рET22 непосредственно за последовательностью pelB. Получен ный вектор был назван pET22b/HpApelB. В результате HpA был экспрессирован в виде химерного предшественника с сигнальным пептидом на N-конце для на правленной секреции рекомбинантного фермента в периплазму E.coli. При ис пользовании этой генетической конструкции после индукции синтеза белка удельная активность культуры-продуцента увеличивалась до 5-6 ME/мг, что со ответствовало ~5% активного рекомбинантного фермента от общего белка E.coli.
Экспрессия рекомбинаной аспарагиназы HpA.
Единичную колонию рекомбинантного штамма инокулируют в 5 мл среды LB и выращивают в течение 18-20 часов при 37°С и непрерывном перемешива нии. Адаптированную культуру используют для приготовления необходимого объема посевного материала для ферментации, которую проводят при 37°С с использованием среды LB в условиях непрерывной аэрации и перемешивания.
Экспрессию HpA индуцируют ИПТГ конечной концентрации 0,5 мМ, который добавляют в среду при достижении культурой оптической плотности OD600=0,6.
После этого клетки инкубируют 16-18 часов при 37°С. Клетки собирают цен трифугированием при 4000 g в течение 15 мин и либо сразу используют для выделения аспарагиназы HpA, либо хранят в замороженном виде при – 20°С.
Выделение аспарагиназы HpA.
На начальном этапе работы необходимо было получить препарат аспараги назы в количестве, достаточном для определения терапевтически значимых свойств фермента.
Наибольшие потери фермента происходят на начальной стадии получения бесклеточного экстракта. Для получения бесклеточного экстракта мы решили использовать ультразвуковую обработку. Результаты очистки фермента пред ставлены в таблице 6. Аспарагиназная активность в бесклеточном экстракте со ставляла 5,1 МЕ/мг, что соответствует 5-6% активного фермента от общего ко личества белка. При последующем центрифугировании, вероятно вследствие адсорбции L-аспарагиназы осадком разрушенных клеток, терялось 15-20% ферментативной активности, однако, на этой стадии происходило и удаление почти 50% балластных белков. Таким образом, выход фермента был достаточно высоким (около 80%). Нанесение растворимой фракции бесклеточного экстрак та на SP-Сефарозу при рН 5,8 позволило избавиться от основной массы балла стных белков. Значение ИЭТ рекомбинантной аспарагиназы равно 8,1, Таб.1. Типичная процедура выделения HpA.
Стадии очистки Объем, Белок, Активность, Удельная Выход, Степень мл мг МЕ активность, % очистки МЕ/мг Бесклеточный 75 602 3096 5,1 100 экстракт Растворимая фрак- 100 462 2900 6,2 94 1, ция бесклеточного экстракта, pH 7, Растворимая фрак- 102 375 2443 6,5 79 1, ция бесклеточного экстракта, pH 5, Хроматография на 6 21 1911 91 62 SP-cефарозе поэтому более 95% аспарагиназы H. pylori, нанесенной на сильный катионооб менник SP-Сефарозу при рН 5,8, связывается с сорбентом, а большинство бел ков E. coli, имеющих ИЭТ в кислой области рН, обнаруживается в элюате. По сле промывки сорбента низкосолевым фосфатным буфером с рН 5,8, аспараги назу элюировали тем же раствором при рН 7,0. Использование однокомпонент ного элюата вместо градиента концентрации соли исключало необходимость дальнейшего обессоливания и концентрирования белка, а также позволяло зна чительно облегчить процесс выделения рекомбинантной аспарагиназы. После хроматографической стадии очистки удельная активность фермента составляла 91 МЕ/мг, что в 18 раз превышает значение исходной активности.
При электрофорезе очищенного препарата аспарагиназы в 12%-ном полиак риламидном геле выявляется один основной компонент с молекулярной массой 34 кДа, свидетельствующий о содержании целевого фермента в полученном препарате более 90% (рис.8). Иногда могут наблюдаться несколько минорных компонентов с Mr 15-30 кДа. Аналогичные компоненты присутствуют и в пре паратах аспарагиназы Erw. chrysanthemi («Sigma») и аспарагиназы E. coli про изводства Медак, предназначенных для внутривенного введения (рис.9).
Рис.8. Электрофорез в 12% ПААГ/ДСН. Очищенный препарат аспарагиназы HpA(А);
клеточный экс тракт BL21(DE3)pLYSE/pET22-HpA-M до (С) и после (В) 24 часовой индукции 0,5мМ ИПТГ;
Рис.9. Присутствие низкомолеку лярных компонентов в водных раство рах аспаргиназ ErA(A), EcA (B) и HpA(С). Электрофорез в 12% ПААГ/ДСН.
Эти компоненты, количество которых увеличивается при хранении раствора фермента, являются продуктами гидролиза аспарагиназы, по-видимому, вслед ствие присутствия следовых количеств протеаз. Мы не использовали ингибито ры протеаз в процессе выделения, т.к. они являются высокотоксичными соеди нениями, присутствие которых недопустимо в препарате, предназначенном для внутривенного использования.
Характеристика рекомбинантной HpA.
Физико-химические свойства HpA.
Цель физико-химической характеристики рекомбинантного фермента со стояла, прежде всего, в определении терапевтически-значимых свойств аспара гиназы (табл.2), а также стабильности при денатурирующих условиях и при хранении.
Табл.2. Физико-химические свойства HpA Свойство Значение Молекулярная масса, ПААГ/ДСН (субъединица) 34 pH-оптимум 5,0 – 9, 65oC Температура денатурации pI 8, Зависимость удельной активности HpA определяли в диапазоне рН от 5 до 9. При этом использовали калий-фосфатный (рН 5 – 7) и Трис-HCl (рН 7,5 – 9) буферные растворы. Рекомбинантный фермент оказался каталитически актив ным в широком диапазоне рН (рис. 10). Температурный оптимум действия фермента определен в диапазоне температур от 37°С до 55°С. Увеличение ак тивности фермента при повышении температуры вызвано снижением энергии активации реакции (Oakley et al., 1997;
Peng et al., 2003), а резкое падение ак тивности связано с тепловой денатурацией белка.
Активность, МЕ/мг 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9, рН Рис.10. Зависимость удельной активности HpA() и EcA() от pH.
Учитывая возможную перспективу создания лекарственного препарата на основе HpA, представлялось интересным исследовать стабильность рекомби нантной аспарагиназы под воздействием различных денатурирующих факто ров. При этом, в тех же экспериментах измеряли и стабильность лекарственного препарата EcA (Медак, Германия) для того, чтобы сравнить соответствующие свойства этих двух аспарагиназ.
Температуру денатурации ферментов определяли по изменению их удель ной активности. Можно видеть (рис. 11), что инкубация при температурах до 60°С практически не изменяет активность рекомбинантного фермента. При на гревании раствора HpA выше 60°С происходит его инактивация. При этом ре натурации аспарагиназы в каталитически активную форму не наблюдается.
Аналогичное поведение обнаруживает EcA, однако в данном случае снижение активности при температуре 60°С и выше не такое резкое, как для HpA.
Активность, % 0 20 40 60 80 o T, C Рис.11 Термостабильность НрA() и EcA() Сходные данные были получены при определении стабильности аспараги назы в растворе мочевины (рис.12).
Рис.12. Стабильность НрA() и EcA() в растворе мочевины.
Стабильность рекомбинантного фермента также оценивали при многократ ных циклах замораживания – оттаивания, как это описано у (Jameel F., et al, 1997). Как показывают результаты (рис. 13), после 50 повторных циклов замо раживания-оттаивания HpA сохраняет не менее 80% удельной активности от первоначального значения. В этом эксперименте стабильность рекомбинантно го фермента оказалась практически такой же, как и стабильность аспарагиназы EcA (Медак).
Активность, % 0 10 20 30 40 Число циклов разморозки/заморозки Рис. 13. Стабильность аспарагиназ HpA() и EcA() при многократных циклах замора живания-оттаивания Каталитические свойства аспарагиназы HpA.
Кинетические параметры гидролиза субстратов под действием HpA.
Для рекомбинантной аспарагиназы НрА характерна гиперболическая зави симость скорости гидролиза обоих стереоизомеров аспарагина. Соответствую щие кинетические параметры HpA суммированы в табл. 3.
Как и ожидалось, глутаминазная активность HpA, измеренная при концен трации L-Gln 5мМ, оказалась крайне низкой, 0,0083 МЕ/мл, что составляет 0,0009% от аспарагиназной активности. Эти данные сопоставимы с каталитиче скими свойствами WsA (табл. 3) (Distasio J. et al, 1972). Нам не удалось опреде лить зависимость скорости гидролиза глутамина от его концентрации вследст вие крайне низкой скорости реакции. До концентрации 5 мМ скорость гидроли за линейно повышается с увеличением концентрации глутамина. Мы не исполь зовали концентрации L-Gln больше 5 мМ, т.к. оптическая плотность такого рас твора глутамина в фосфатном буфере превышает 1,5, что препятствует адекват ному измерению скорости гидролиза.
Табл. 3. Сравнение равновесных кинетических параметров для реакций гидролиза L-, D аспарагина и L-глутамина аспарагиназами HpA1, WsA2,EcA3 и EwA kcat, с -1 kcat/Km, M-1 с - Vmax, мкМоль/мг·мин Km, мкM L-Asp 5,2 · HpA 94 103 WsA 204 n/d n/d n/d 1,6 · EcA 220 240 3,3 · EwA 560 321 D-Asp 3,8 · HpA 2,6 1,5 WsA 6,5 n/d n/d n/d EcA n/d n/d n/d n/d 1,7 · EwA 24 14 L-Gln HpA 0,0083 n/d n/d n/d WsA 0,015 n/d n/d n/d EcA 3 0,33 3500 6,1 · EwA 15 8,6 -результаты данного исследования. Расчет kcat был сделан в предположении одного активно го центра на один мономер аспарагиназы с Mr 35 кДа;
2-скорость гидролиза определена для концентрации субстрата 40 мM (Distasio J. and Niederman R., 1976);
3-(Derst C. Et al, 2000);
4 (Krasotkina et al, 2004);
5-скорость гидролиза L-Gln определена при концентрации субстрата 5мМ.
Кинетические эксперименты показывают, что введение HpA обеспечит эф фективное снижение уровня аспарагина, но при этом концентрация глутамина в крови останется фактически неизменной.
Цитотоксическая активность HpA.
Ингибирование роста лейкозных клеток. Исследования цитотоксической активности HpA показали, что фермент эффективно ингибирует рост клеток лейкоза человека (рис.14). Антипролиферативная активность HpA имеет выра женную концентрационную зависимость. Наибольшую чувствительность пока зали клетки лимфомы Беркита Raji. Через 72 часа инкубации с 0,6 МЕ/мл HpA количество клеток этой линии уменьшалось на 50% по сравнению с контролем.
Значение IC50 для клеток острого лимфобластного лейкоза MOLT-4 составляло 1 МЕ/мл. Аналогичные данные были получены для линии Jurkat. Наименее чув ствительной к действию аспарагиназы HpA оказалась линия хронической мие лоидной лейкемии К-562. В этом случае 50%-ное ингибирование роста клеток достигалось при концентрации фермента более 2,1 МЕ/мл. Эти результаты на ходятся в хорошем соответствии с литературными данными относительно ци тотоксичности бактериальных аспарагиназ, в частности нативной и рекомби нантной аспарагиназ из штамма E.coli, а также коммерческого препарата аспа рагиназы Erwinia chrysanthemi.
В тоже время аспарагиназа HpA не подавляла рост культуры фибробластов, которые не являются чувствительными к действию аспарагиназы. Это показы вает, что цитотоксичность в отношении лейкозных клеток является специфиче ской и проявляется только для клеток, которые зависят от внеклеточного уров ня аспарагина.
120 A Б 100 Выживаемость, % 80 40 0,01 0,1 0,5 1 2 5 0,01 0,1 0,5 1 2 5 Аспарагиназа, МЕ/мл Аспарагиназа, МЕ/мл Рис 14. Цитотоксическая активность аспарагиназ НрА() и ЕсА() для лимфобластной Т клеточной лимфомы MOLT-4(А) и лимфомы Беркитта Raji(Б).
Морфологические изменения, индуцируемые аспарагиназой HpA в лейкоз ной клетке, выявляли методом световой микроскопии, а также путем определе ния конденсации хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа после окраски лейкозных клеток Hoechst. Результаты проведенных нами мик роскопических исследований позволили установить, что аспарагиназа HpA ин дуцирует апоптоз лейкозной клетки. Эти результаты находятся в соответствии с установленным механизмом гибели лейкозных клеток под действием аспараги назы.
Перекрестная антигенность HpA и EcA. На заключительном этапе ра боты был проведен сравнительный анализ иммуногенности аспарагиназ НрА и ЕсА. Перекрестную антигенность аспарагиназ HpA и EcA определяли методом ИФА с использованием мышиных поликлональных антител. Результаты экспе римента показали, что сыворотка, полученная, например, к одной из аспараги наз слабо реагировала с другим, иммобилизованным на планшет, ферментом (рис. 15). Так в случае, когда на планшет была нанесена HpA отношение титров антисывороток HpA/EcA равнялось 160, а при иммобилизации на планшет EcA отношение титров антисывороток EcA/HpA – 200. Низкая перекрестная анти генность аспарагиназ HpA и EcA позволяет предположить, что HpA может ис пользоваться как препарат для заместительной терапии при развитии гиперчув ствительности к EcA.
3,0 3, B А 2,5 2, Поглощение (405 нм) 2,0 2, 1,5 1, 1,0 1, 0,5 0, 0, 0, 10 100 1000 10000 100000 10 100 1000 10000 100000 Разведение сыворотки Разведение сыворотки Рис.15. Перекрестная антигенность HpA и EcA. ИФА с использованием мышиной поликло нальной сыворотки, полученной для HpA () и EcA (). HpA иммобилизована на планшет (A);
EcA иммобилизована на планшет (В).
ВЫВОДЫ 1. Клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма H. pylori.
Получен рекомбинантный штамм E.coli, устойчиво продуцирующий каталити чески активную НрА.
2. Разработана лабораторная процедура очистки НрА, которая является при годной для промышленного крупномасштабного получения рекомбинантной аспарагиназы и обеспечивает выход активного фермента более 60%.
3. Проведена характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА. Фермент имеет широкий оптимум рН и харак теризуется высокой стабильностью при денатурирующих условиях. Удельная аспарагиназная активность при физиологических условиях составляет МЕ/мг, что значительно превышает глутаминазную активность 0,0083 МЕ/мг.
4. Установлено, что НрА эффективно подавляет рост клеток острой лим фобластной лейкемии MOLT-4, лимфомы Беркита Raji и хронического миело идного лейкоза К562. Определены соответствующие значения LC50. Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апоптоза.
5. Показано, что антигенность НрА отличается от антигенности основной терапевтической аспарагиназы из штамма Е.coli.
Список опубликованных работ по теме диссертации.
1. Гладилина Ю.А., Соколов Н.Н., Красоткина Ю.В. Клонирование, экс прессия и выделение L-аспарагиназы Helicobacter pylori.//Биомедицинская хи мия. – 2008.-Т.54. №4- С.482-486.
2. Красоткина Ю.В., Посыпанова Г.А., Гладилина Ю.А., Борисова А.А., Гер вазиев Ю.В., Занин В.А., Соколов Н.Н. Кинетические свойства и цитотоксиче ская активность рекомбинантной аспарагиназы Pectobacterium atrosepticum.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2008.-№3 С.18-21.
3. Гладилина Ю.А., Соколов Н.Н., Красоткина Ю.В. Оптимизация экспрес сии рекомбинантной L-аспарагиназы Helicobacter pylori. // Материалы IV меж дународной научно-практической конференции «Динамика исследований» - г.
София, Болгария. – 2008. – С.38-42.
4. Красоткина Ю.В., Леонова Ю.А. Выделение и очистка рекомбинантной аспарагиназы HpA.. // Сборник докладов научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и кли нической медицины» - г. Волгоград. - 2007.- С.25-26.
5. Леонова Ю.А., Соколов Н.Н., Красоткина Ю.В. Клонирование рекомби нантной аспарагиназы Helicobacter pylori J99. // Сборник трудов XII Всероссий ской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» - г. Казань - 2007.- С.259.
6. Леонова Ю.А., Кучумова Н.В., Красоткина Ю.В. Одностадийное выделе ние и кинетические свойства рекомбинантной аспарагиназы Erwinia carotovora.
// Сборник докладов международного конгресса «ПЕРСПЕКТИВА- 2007», сек ция «Биология»– г. Нальчик. - 2007. – С. 37-39.
7. Леонова Ю.А., Соколов Н.Н., Красоткина Ю.В. Клонирование рекомби нантной аспарагиназы Helicobacter pylori // Материалы IV Международной на учной конференции «Перспективы современной медицинской науки» - г. Вин ница, Украина. – 2007. – С.167.