Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей
На правах рукописи
ШУЛЕПКО МИХАИЛ АНАТОЛЬЕВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ НА ПРИМЕРЕ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И ТОКСИНОВ ИЗ ЯДА ЗМЕЙ Специальность: 03.00.02 - Биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена на кафедре биоинженерии Государственного учебно-научного учреждения Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории инженерии белка Учреждения российской академии наук Институт биоорганической химии им.
академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Научные руководители: профессор, д.б.н. Д.А.Долгих к.б.н. Е.Н.Люкманова
Официальные оппоненты: профессор, д.б.н. П.Г.Свешников доцент, д.х.н. В.В.Чупин Ведущая организация Учреждение Российской академии наук центр "Биоинженерия" РАН
Защита состоится “12” ноября 2009 г. в 15 ч. 30 мин. На заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан « 9 » октября 2009 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, профессор, д.б.н. Т.Е. Кренделева
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Изучение лиганд-рецепторных взаимодействий является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии и биофизики. Эти взаимодействия играют центральную роль во многих процессах, таких как гормональная регуляция, межклеточная сигнализация, транспорт биомолекул, передача нервного импульса и др.
Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) представляет собой лиганд зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов, и является одним из наиболее распространенных рецепторов центральной и периферической нервных систем млекопитающих. В зависимости от локализации рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса: мышечные и нейрональные. -Нейротоксины яда змей известны как высокоспецифичные конкурентные ингибиторы нАХР. Эти белки имеют характерную «трех-петельную» -структуру, стабилизированную 4-5 дисульфидными связями. Небольшие размеры и жесткая структура делают -нейротоксины удобными инструментами для исследования свойств нАХР. Со структурной точки зрения -нейротоксины из яда змей можно подразделить на 3 класса: короткие, длинные и «необычные» нейротоксины (Рис.1). Короткие и длинные -нейротоксины эффективно ингибируют нАХР мышечного типа, однако только длинные -нейротоксины с пятой дисульфидной связью в центральной петле эффективно взаимодействуют с нАХР нейронального типа. Мишенями действия «необычных» токсинов с пятой дисульфидной связью, локализованной в N-концевой петле, выступают как мышечные нАХР, так и нейрональные нАХР, а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к семейству G-белок сопряженных рецепторов.
Изучение механизмов, лежащих в основе взаимодействия -нейротоксин/нАХР, представляет интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и необходимо для создания новых лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний нервной системы, связанных с дисфункциями нАХР.
Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось получение методами генной и белковой инженерии -нейротоксинов длинного и «необычного» типов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов, а также выявление структурных детерминант, важных для взаимодействия этих токсинов с различными подтипами нАХР.
Основные задачи исследования.
1. Получить гены химерных длинных -нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII) путем введения в последовательность NTII дополнительных аминокислотных остатков, и «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX, weak toxin), относящегося к классу «необычных» токсинов.
2. Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных -нейротоксинов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов.
Наработать рекомбинантные -нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченые варианты в необходимых для исследования количествах. Провести физико химический анализ рекомбинантных белков.
3. Исследовать биологические свойства химерных длинных -нейротоксинов.
Изучить специфичность химерных длинных -нейротоксинов по отношению к нейрональным нАХР 7 и 32 типов.
4. Исследовать биологическую активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному и нейрональному нАХР 7 типа.
Идентифицировать аминокислотные остатки мутантных вариантов WTX, которые важны для взаимодействия с различными типами нАХР.
5. Исследовать влияние конформационной гетерогенности в молекуле WTX на функциональную активность.
Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.
1. На примере химерных длинных -нейротоксинов впервые исследовано влияние точечной мутации Ala/Lys в центральной петле длинных -нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР 32 типа.
2. Впервые разработана эффективная система продукции «слабого» токсина из яда Naja kaouthia. Впервые разработаны протоколы выделения и очистки рекомбинантного WTX.
3. Впервые получены мутантные формы WTX, выявлены аминокислотные остатки токсина, важные для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального типов.
4. Впервые получен 15N-меченный WTX и проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах токсина.
5. Впервые изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность молекулы токсина.
Данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, будут интересны не только с точки зрения фундаментальной науки, но, в перспективе, также могут быть применены для разработки лекарственных препаратов, имитирующих свойства лигандов нАХР.
Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на следующих российских и международных конференциях: Симпозиуме ”Нейрорецепторы: Структура, механизм действия и роль в патологиях.” (Москва 2007);
37-й Ежегодной конференции общества нейробиологов, (Сан Диего, США 2007);
4-й Конференции, международном симпозиуме и летней школе “ЯМР в биологии,” (Санкт-петербург 2007);
15-й Международной конференция “Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии” (Гурзуф, Украина 2007);
20-й Зимней международной молодежной научной школе “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва 2008);
4-м Ежегодном саммите по инженерии белков (Бостон, США. 2008);
33-м Конгрессе европейских биохимических обществ “Биохимия клеточной регуляции” (Афины, Греция 2008);
4-й Конференции европейского общества нейробиологов ”Успехи изучения молекулярных механизмов нейрологических заболеваний” (Лейпциг, Германия 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75 летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК и 9 тезисов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 5 таблиц и 24 рисунка. Список литературы содержит 173 наименования.
Основное содержание работы
I. Исследование влияния точечной замены Ala/Lys в центральной петле длинных -нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР 32 типа 1. Конструирование химерных длинных -нейротоксинов Многочисленные исследования мутантных и химически модифицированных длинных и коротких -нейротоксинов установили, что участок центральной петли, содержащий дисульфидную связь (Рис.1), необходим для взаимодействия с нейрональными нАХР. Наряду с этим было замечено, что длинные -нейротоксины эффективно ингибируют нейрональные нАХР 7 типа, и только некоторые из них способны ингибировать нейрональные нАХР других типов. К таким токсинам Рис. 1. Пространственные структуры -нейротоксинов в ленточном представлении. (А).
Короткий нейротоксин II из яда Naja oxiana, (Б). Длинный -кобратоксин из яда Naja siamensis, (В). “Необычный” токсин кандоксин из яда Bungarus candidus. Петли, образованные -листами, обозначены римскими цифрами. Желто-серыми линиями показаны консервативные S-S связи, красно-серыми линиями – дополнительная дисульфидная связь длинных и “необычных” нейротоксинов.
относится -бунгаротоксин из яда Bungarus multicinctus, высокоэффективный ингибитор нАХР 32 типа, также являющийся длинным -нейротоксином.
Сравнительный анализ аминокислотного состава центральной петли длинного кобратоксина из яда Naja siamensis (-Cbtx) и -бунгаротоксина показал, что концевые фрагменты центральных петлей этих двух токсинов отличаются лишь одним аминокислотным остатком в 29 положении (Рис.2). Было выдвинуто предположение, что, возможно, это различие и определяет способность бунгаротоксина ингибировать как нАХР 7 типа, так и нАХР 32 типа (Bourne et al.,EMBO J., 2005).
Рис. 2. (А). Сравнение аминокислотных поледовательностей -нейротоксинов яда змей и химерных токсинов. Аминокислотные остатки, локализованные на конце центральной петли, заключены в красный прямоугольник. Остатки Cys выделены желтым цветом. Остатки Ala/Lys в положении 29 выделены зеленым/красным цветом. (Б). Сравнение фрагментов центральных петель нейротоксина II, нейротоксина I и -бунгаротоксина.
Для проверки этой гипотезы на основе короткого NTII было сконструировано два химерных длинных -нейротоксина NTII/I и NTII/I[A29K]. Химерный токсин NTII/I был получен путем замены фрагмента центральной петли короткого токсина NTII на аналогичный фрагмент центральной петли длинного -нейротоксина I из яда Naja oxiana. В химерный токсин NTII/I[A29K] была введена дополнительная замена остатка аланина в положении 29 на остаток лизина (Рис.2). Гены NTII/I и NTII/I[A29K] были получены методом сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР. В качестве матрицы была использована плазмида pET22b(+)/STII/NTII.
Плазмиды, содержащие гены NTII/I и NTII/I[A29K], были названы pET22b(+)/STII/NTII/I и pET22b(+)/STII/NTII/I[A29K], соответственно (Рис.3).
Рис. 3. Конструкция для секреции в E. coli химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K].
2. Биосинтез, выделение и очистка NTII/I и NTII/I[A29K] Экспрессионная система, разработанная ранее в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН для бактериальной секреции NTII, была адаптирована для продукции NTII/I и NTII/I[A29K], и позволила получить достаточные для структурно функциональных исследований количества рекомбинантных токсинов. В этой системе NTII/I и NTII/I[A29K] синтезировали вместе с лидерным пептидом энтеротоксина II из E.coli, - STII. Наличие лидерного пептида определяло преимущественное накопление рекомбинантных токсинов в периплазматическом пространстве клеток E. сoli и в культуральной жидкости.
Наработку NTII/I и NTII/I[A29K] осуществляли в штамме BL21(DE3) E. coli.
Культивирование клеток, трансформированных соответствующей плазмидой, проводили в среде ТВ при 37С до достижения плотности культуры показателя оптического поглощения 0.6 на длине волны 600 нм. Затем клетки центрифугировали в течение 15 мин при 1000 g и переносили в минимальную среду M9. Индуцировали экспрессию генов NTII/I и NTII/I[A29K] добавлением 0.05 мМ ИПТГ и продолжали культивирование в течение 15 часов при 37С.
После культивирования клетки осаждали центрифугированием и продолжали работу с культуральной жидкостью. Очистку белков осуществляли в два этапа: с помощью хроматографии на смоле SP-Sepharose (GE Healthcare) и на смоле Ceramic hydroxiapatite (Bio-Rad). Конечные выходы химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K] составили 1 мг/л и 5 мг/л, соответственно.
3. Анализ физико-химических свойств NTII/I и NTII/I[A29K] Анализ химерных -нейротоксинов NTII/I и NTII/I[A29K] методом деградации по Эдману показал, что полученные белки имеют N-концевую последовательность идентичную последовательности NTII. Масс-спектрометрический анализ NTI, NTII, NTII/I и NTII/I[A29K] выявил соответствие экспериментальных масс теоретически рассчитанным. Чистота полученных химерных токсинов NTII/I и NTII/I[A29K] была проанализирована с помощью ВЭЖХ, и составила не менее 95% (Рис. 4). На рисунке видно, что время элюции химерных -нейротоксинов NTII/I и NTII/I[A29K] находится в интервале между временами элюции природного NTII и природного NTI. При этом, химерный токсин NTII/I[A29K] сходил с колонки несколько раньше, что видимо, обусловлено понижением гидрофобности токсина, вызванным заменой остатка аланина на остаток лизина.
Рис. 4. ВЭЖХ анализ NTI, NTII, NTII/I и NTII/I[A29K]. Хроматография была выполнена на колонке Jupiter C (4.6X250мм) в градиенте ацетонитрила 15-45% за 30 мин в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты. В качестве контрольных препаратов были использованы NTI и NTII, выделенные из яда Naja oxiana.
4. Исследование пространственной структуры химерных -нейротоксинов Все структурные исследования, описываемые в этой работе, были выполнены совместно с З.О. Шенкаревым, научным сотрудником лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН. Фрагмент центральной петли, пересаженный в молекулу нейротоксина II из молекулы нейротоксина I, состоит из остатков и содержит дополнительную дисульфидную связь. С целью установить возможные изменения в пространственной структуре химерных -нейротоксинов, вызванные введением этой замены, было проведено исследование химерных нейротоксинов методами ЯМР-спектроскопии. Анализ 1D Н ЯМР спектров рекомбинантных белков NTII/I и NTII/I[А29K] выявил узкие линии сигналов и значительную дисперсию химических сдвигов NH-протонов. Большой сдвиг сигналов протонов некоторых алифатических боковых цепей в сильное поле свидетельствовало о пространственной сближености этих боковых цепей с ароматическими остатками, что часто наблюдается в -структре. Сравнение 2D 1Н 15 N корреляционных ЯМР спектров рекомбинантного N-меченного NTII и химерного токсина NTII/I (Рис. 5А,Б) выявило практически полное совпадение химических сдвигов 1Н и N для амидных групп общих остатков токсинов.
Сравнение одномерного 1Н ЯМР спектра химерного токсина NTII/I[А29K] с HSQC спектром токсина NTII/I (Рис. 5В) показало, что точечная мутация A29K не приводит к изменению пространственной структуры химерного токсина. Таким образом, можно сделать вывод, что все исследуемые белки обладали жесткой пространственной структурой, схожей со структурой нейротоксина II.
Рис. 5. (А). 1Н-15N HSQC спектр NTII. Сигналы NH групп соотнесены с номером остатка. Сигналы боковых цепей Trp, Asn и Gln помечены буквой S.
(Б). 1Н-15N HSQC спектр NTII/I. Отнесение сигналов сделано по аналогии с панелью A.
Дополнительные сигналы, возможно соответствующие введенным в центральную петлю остаткам, заключены в кружок. (В). Область амидных сигналов 1D 1Н ЯМР спектра NTII/I[А29K].
5. Исследование биологической активности химерных токсинов Исследования биологической активности, описываемые в этом разделе, были проведены совместно с сотрудниками лаборатории проф. Д. Бертрана кафедры нейробиологии медицинского факультета Центрального медицинского университета, Женева, Швейцария. Тестирование биологической активности химерных -нейротоксинов NTII/I и NTII/I[А29K] проводили in vitro методами электрофизиологии, измеряя способность белковых препаратов ингибировать токи через ионные каналы нейрональных нАХР 7 и 32 типов, экспрессированных на поверхности ооцитов Xenopus laevis. Было показано, что оба химерных нейротоксина приобрели способность ингибировать нАХР 7 типа. Причем химерный токсин NTII/I оказался несколько активнее природного NTI по отношению к нейрональному нАХР 7 типа (IC50-6.1 нМ и 34 нМ, соответственно, Рис 6А,Б). Таким образом, в отличие от исходного короткого токсина NTII, химерный токсин NTII/I приобрел способность взаимодействовать с нАХР 7 типа, что подтвердило ключевую роль центральной петли длинных -нейротоксинов в селективном взаимодействии с нейрональным нАХР 7 типа.
Многочисленные исследования указывают на то, что удлиненный С-концевой фрагмент длинных -нейротоксинов возможно принимает участие во взаимодействии с нАХР 7 типа. Исследуемые в настоящей работе химерные нейротоксины были получены на основе короткого токсина NTII, не обладающего подобным фрагментом. Однако, наличие высокой активности химерного токсина NTII/I по отношению к нейрональному рецептору говорит о том, что, по крайней мере, для взаимодействия NTI с нАХР 7 типа не требуется наличия удлиненной С концевой последовательности.
Предполагалось, что химерный токсин NTII/I[А29K] с заменой Ala/Lys приобретет способность взаимодействовать с нАХР 32 типа. Однако электрофизиологические эксперименты показали, что введение вышеуказанной мутации в молекулу NTII/I не привело к возникновению активности по отношению к нАХР 32 типа. Кроме того, введение мутации Ala/Lys в молекулу NTII/I привело к снижению активности NTII/I[A29K] по отношению к нейрональному нАХР типа (IC50-126 нМ, Рис 6В). Полученные данные свидетельствуют о том, что во взаимодействии -бунгаротоксина с нАХР 32 типа ключевую роль играют другие аминокислотные остатки, локализованные не на конце центральной петли.
Возможно, селективность действия -бунгаротоксина на нАХР 32 типа связана со склонностью этого токсина к димеризации.
Рис. 6. Ингибирование ионных токов, индуцированных добавлением ацетилхолина, в ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих нейрональный нАХР 7 типа препаратами NTI, NTII и химерными токсинами. (А). NTI ингибирует токи с константой IC50-34 нМ, в то время как NTII не вызывает подобного эффекта. (Б). Химерный токсин NTII/I ингибирует токи с константой IC50-6 нМ. (В). Химерный токсин NTII/I[А29K] ингибирует токи с константой IC50-126 нМ.
6. Моделирование комплексов химерных токсинов с нАХР Молекулярное моделирование было выполнено совместно с Д.Ю.
Мордвинцевым, сотрудником лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН.
Модели пространственных структур химерных токсинов были построены методом моделирования по гомологии на основе трехмерных структур длинных нейротоксинов NTI и -Cbtx и короткого -нейротоксина NTII (PDB коды 1ntn, 1ctx, 1nor, соответственно). Модели внеклеточных доменов нАХР 7 и 32 типов были построены методом моделирования по гомологии на основе трехмерной структуры ацетилхолин-связывающего белка (АХСБ) из моллюска Lymnaea stagnalis (PDB код 1I9B). В экспериментах по докингу NTII и NTI с 7 и 32 нАХР было установлено, что стабильный комплекс образуется только в случае взаимодействия NTI с 7нАХР. Взаимодействие химерного токсина NTII/I было возможно как с 7нАХР, так и с 32нАХР, но только комплекс 7нАХР/NTII/I был стабилен в течение молекулярно-динамического эксперимента с длиной траектории 10 нс. Основные взаимодействия наблюдались между C-петлей рецептора и центральной петлей NTII/I, также как и в случае комплекса АХСБ/-Cbtx (Bourne et al.,EMBO J., 2005).
При этом между остатком Ala в положении 29 и остатками С-петли нАХР устанавливались слабые гидрофобные взаимодействия. Моделирование связывания NTII/I[А29K] с 7нАХР выявило, что остаток Lys в положении 29 не может участвовать в специфических взаимодействиях с остатками С-петли рецептора и отталкивается от положительно заряженного Lys192 7нАХР (Рис.7). Возможно, этот факт и объясняет уменьшение активности химерного токсина NTII/I[А29K] по отношению к 7нАХР. С другой стороны, результаты молекулярного моделирования позволяют предположить, что Lys29 способен взаимодействовать с отрицательно заряженной боковой цепью остатка Glu190 из 3 субъединицы нАХР 32 типа. Однако комплекс 32нАХР/NTII/I[А29K] был нестабилен в течение молекулярно-динамической траектории (10 нс). Определенные энергии взаимодействия химерного токсина NTII/I[А29K] с нАХР 7 и 32 типов составили 1400 кДж/моль/связывающий сайт и 340 кДж/моль/связывающий сайт, соответственно.
Рис. 7. Модель взаимодействия химерных токсинов с 7 нАХР. Часть, относящаяся к молекуле NTII показана голубым цветом. Часть, относящаяся к молекуле NTI, показана розовым цветом. Одна субъединица нАХР (главная поверхность взаимодействия) показана белым цветом. Вторая субъединица нАХР (комплементарная поверхность взаимодействия) показана бежевым цветом. Показаны боковые цепи остатков NTII/I, NTII/I[А29K] и С-петли главной поверхности нАХР.
II. Структурно-функциональные исследования «слабого» токсина и его мутантных форм 7. Экспрессирующие конструкции для продукции «слабого» токсина Ранее в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН были разработаны и успешно применены две системы бактериальной продукции NTII и его изотопно-меченных вариантов. В одной из этих систем нейротоксин нарабатывали в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином. Между последовательностями нейротоксина и тиоредоксина был предусмотрен специальный линкер, содержащий сайты для специфического гидролиза энтеропептидазой. Вторая система, более успешная с точки зрения конечного выхода целевого белка, была предназначена для бактериальной секреции нейротоксина. Именно эта система позволила получить химерные нейротоксины NTII/I и NTII/I[А29K].
В ходе работы обе системы (Рис. 8А,Б) были опробованы для бактериальной продукции WTX. В первой системе гибридный белок WTX–тиоредоксин накапливался в растворимой форме в цитоплазме. Был подобран протокол очистки гибридного белка с помощью металл-аффинной хроматографии. Однако найти условия специфического гидролиза слитного белка энтеропептидазой не удалось.
Возможно, это связано с тем, что молекула «слабого» токсина содержит дисульфидную связь, образованную третьим и двадцать четвертым остатками цистеина, что, видимо, создает стерические затруднения для работы энтеропептидазы. Использование второй системы, разработанной для бактериальной секреции, оказалось еще менее удачным, так как в этом случае выход целевого белка был ничтожно мал (~ 50 мкг с 1 л бактериальной культуры).
Рис. 8. Схематическое изображение гена WTX в составе различных конструкций для бактериальной продукции «слабого» токсина. (А). Конструкция для продукции «слабого» токсина в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином. (Б).
Конструкция для секреции «слабого» токсина. В качестве лидерного пептида был использован пептид STII. (В). Конструкция для прямой экспрессии гена «слабого» токсина.
В связи с этим на основе коммерческого вектора рЕТ22b(+) была разработана система для «прямой» экспрессии гена WTX (Рис. 8В), в результате которой рекомбинантный токсин накапливался в цитоплазме бактериальной клетки в виде телец включения. Все мутантные гены WTX были получены методами сайт направленного мутагенеза с помощью ПЦР.
8. Биосинтез «слабого» токсина и его мутантных форм Была разработана система продукции «слабого» токсина и его изотопно меченого и мутантных вариантов в штамме BL21(DE3) E. сoli. С целью подбора оптимальных условий продукции WTX были опробованы различные концентрации ИПТГ в диапазоне 0,01–1 мМ и разные сроки культивирования клеток на среде ТВ после индукции (3, 9, 18, 24 и 36 ч). В качестве оптимальных параметров выбраны:
концентрация ИПТГ 0.025 мМ (по достижении культурой плотности клеток, соответствующей значению оптической плотности 1.0 на длине волны 600 нм) и время культивирования клеток после добавления ИПТГ 18 ч. Проведенный с помощью SDS-ПААГ электрофореза анализ показал, что рекомбинантный WTX накапливался исключительно в тельцах включения.
Для продукции N-меченого «слабого» токсина клеточную культуру, предварительно выращенную на среде ТВ в колбах до оптической плотности 1.0 при 600 нм, осаждали в мягких условиях (1000 g). Клеточный осадок стерильно ресуспендировали в 1 л минимальной среды М9, содержащей в качестве источника азота [15N]хлорид аммония («CIL», США). Индукцию и дальнейшее выращивание проводили аналогично культивированию на среде ТВ.
9. Ренатурация «слабого» токсина из телец включения Были опробованы различные подходы ренатурации «слабого» токсина из телец включения. (Рис. 9.) Варьировались следующие параметры: соотношение восстановленного глутатиона (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG), рН среды, в которой происходит ренатурация и природа буферного состава среды. Также было исследовано влияние мочевины на ренатурацию токсина. В результате в качестве оптимальной среды для ренатурации был найден буфер следующего состава: 50 мМ Tris/HCl, рН 8.5, содержащий 1.5 М мочевину и смесь GSH/GSSG (3/0,3 мМ).
Конечный выход ренатурированного токсина составил ~5 мг с литра бактериальной культуры.
Рис.9. Ренатурация WTX в различных условиях. Контроль осуществляли с помощью ВЭЖХ.
Хроматографический профиль природного WTX везде обозначен звездочкой. (А). Анализ влияния концентрации GSH/GSSG на эффективность ренатурации WTX в фосфатном буфере, содержащем GSH, GSSG в молярных соотношениях 2:1, 4:1 и 10:1, рН 7.4, при 4°С (хроматографические профили 1-3, соответственно). (Б). Анализ влияния различных значений рН на эффективность ренатурации (хроматографические профили 1-5 соответствуют значениям рН 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, соответственно). (В). Анализ влияния буферного состава среды на ренатурацию (хроматографические профили 1,2 соответствуют буферным системам на основе NaPi и Tris/HCl, соответственно;
хроматографический профиль 3 соответствует буферной системе Tris/HCl с добавлением 1.5 М мочевины, 4 - хроматографический профиль рекомбинантного WTX после ренатурации и финальной рехроматографии с помощью ВЭЖХ).
10. Анализ рекомбинантного «слабого» токсина Ренатурированный рекомбинантный «слабый» токсин был проанализирован с помощью масс-спектрометрии (Рис. 10.). Было показано, что экспериментальная масса рекомбинантного WTX (7750 Да) в пределах ошибки измерения совпадает с теоретически расчитанной массой, при этом экспериментальная масса природного токсина, выступавшего в качестве контроля, составила 7619 Да. Разница в значениях масс рекомбинантного и природного токсинов объясняется наличием у рекомбинантного токсина дополнительного остатка метионина на N-конце молекулы. Данные ВЭЖХ, SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, а также данные КД- и ЯМР-спектроскопии свидетельствуют о схожих свойствах рекомбинантного и природного WTX. Полное замыкание всех дисульфидных связей в молекуле WTX после ренатурации было подтверждено с помощью реактива Элмана (5,5-дитио-бис(2-нитробензойная кислота).
Рис. 10. Масс-спектрометрический анализ смеси природного и рекомбинантного «слабого» токсина.
Вставка: электрофоретический анализ препаратов природного (1) и рекомбинантного (2) WTX, 3 – белки-маркеры молекулярных масс (116, 66, 45, 35, 25, 18,14 кДа).
11. Анализ пространственной структуры рекомбинантного «слабого» токсина Вторичная структура ренатурированного токсина была исследована методом КД-спектроскопии. Спектр рекомбинантного ренатурированного токсина был идентичен в пределах погрешности спектру природного токсина (рис.11А., точечная и пунктирная линии, соответственно) и указывал на преимущественно структурную организацию молекулы токсина. Полученные оценки содержания различных элементов вторичной структуры рекомбинантного токсина (50% структура, 40% неупорядоченная структура), примерно соответствовали данным, полученным для природного токсина (45% -структура, 50% неупорядоченная структура). При этом анализ вторичной структуры токсина с восстановленными дисульфидными связями показал наличие только неупорядоченной структуры (рис.11А., точечно-пунктирная линия). Вероятно, формирование вторичной структуры «слабого» токсина происходит одновременно с замыканием дисульфидных связей. Возможно, именно это свойство нейротоксинов затрудняет бактериальную продукцию и последующую ренатурацию этих белков.
Качественный анализ пространственной структуры рекомбинантного токсина был проведен также с помощью метода 1Н ЯМР-спектроскопии. Полученный спектр рекомбинантного токсина (Рис. 11Б,В) был практически идентичен спектру природного токсина. Наблюдаемые минорные изменения, возможно, связаны с различиями в протоколах очистки природного и рекомбинантного белков, приводящими к отличиям в солевом составе препаратов. Значительная дисперсия химических сдвигов HN-протонов и сдвиг многих из этих сигналов в область слабого поля подтверждают преимущественно -структурную организацию молекулы токсина. В то же время, расщепление HN сигнала боковой цепи единственного аминокислотного остатка триптофана в 36-ом положении, наблюдаемого в районе 10 м.д., на две линии с соотношением интегральных интенсивностей 1:1 указывает на наличие процесса конформационного обмена в молекуле токсина. Этот обменный процесс, наблюдаемый также и в природном токсине, происходит медленно по шкале времен ЯМР с характерным временем более 100 мс.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что рекомбинантный токсин имеет не только пространственную организацию аналогичную организации природного «слабого» токсина, но и обладает молекулярно-динамическими свойствами природного токсина.
Рис. 11. (А). Анализ вторичной структуры рекомбинантного и природного WTX с помощью КД спектроскопии. Пунктирной линией изображен спектр природного WTX, точечной линией изображен спектр ренатурированного рекомбинантного WTX, точечно-пунктирной линией изображен спектр рекомбинантного WTX c восстановленными дисульфидными связями. (Б), (В), Н ЯМР спектры природного и рекомбинантного WTX, соответственно.
12. Исследование биологической активности «слабого» токсина Исследования биологической активности, описываемые в этом разделе, были проведены совместно с И.Е. Кашеверовым, ведущим научным сотрудником лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН. Способность рекомбинантного токсина специфически взаимодействовать с мышечным нАХР и нейрональным 7нАХР была оценена по конкуренции с I-меченным -бунгаротоксином за связывание с мембранами из электрического органа Torpedo californica и клетками GH4C1, трансфецированными 7нАХР человека, соответственно (Рис. 12). В качестве сравнения использовали природный «слабый» токсин, выделенный из яда N. kaouthia. Анализ кривых ингибирования позволил определить значения IC50 для рекомбинантного «слабого» токсина и природного «слабого» токсина на мышечном рецепторе (рис.6А, IC50 4.3±0.3 мкМ и 3.0±0.5 мкМ, соответственно) и нейрональном 7нАХР (рис.6Б, IC50 31±5 мкМ и 14.8±1.3 мкМ, соответственно).
Активность рекомбинантного продукта оказалась несколько меньшей, чем у природного токсина, что возможно обусловлено наличием на N-конце молекулы рекомбинантного токсина дополнительного остатка метионина.
Рис. 12. Кривые конкурентного ингибирования связывания 125I--бунгаротоксина с мембранами из электрического органа Torpedo californica, содержащими мышечный нАХР (А), и линией клеток GH4C1 содержащими 7нАХР человека (Б), построенные для рекомбинантного и природного «слабого» токсина.
13. Конструирование и исследование биологической активности мутантных вариантов «слабого» токсина С целью исследования влияния основных структурных особенностей «слабого» токсина на функциональную активность с помощью сайт-направленного мутагенеза было сконструировано 11 мутантных вариантов WTX (Рис. 13). Основная структурная особенность «необычных» токсинов и в частности WTX, отличающая их от других -нейротоксинов, – наличие дополнительной, пятой дисульфидной связи, расположенной в N-концевой петле молекулы. C целью исследовать функциональную значимость наличия дисульфидной связи в N-концевой петле Рис. 13. Сравнение аминокислотных последовательностей «слабого» токсина, его мутантных форм и кандоксина (Bungarus сandidus). Введенные мутации выделены красным цветом. Желтым цветом обозначены остатки Cys.
WTX был сконструирован мутант С6S/C11S, в котором остатки Cys в N-концевой петле были заменены на остатки Ser. Ранее для коротких и длинных нейротоксинов было показано, что аминокислотные остатки, ответственные за взаимодействие с рецептором, расположены на конце центральной петли. Было выдвинуто предположение, что остаток Trp36, расположенный на конце центральной петли WTX, может играть важную роль при взаимодействии с нАХР.
Для проверки функциональной значимости этого остатка был сконструирован мутант W36A. Для исследования значимости заряженных аминокислотных остатков Arg31 и Arg32, также расположенных в центральной петле, были сконструированы следующие мутантные формы: R31A, R32A, R31A/R32A, R31A/R32E, R31E/R32A.
Известно, что «слабый» токсин в растворе обладает конформационной гетерогенностью вследствие cis-trans изомерии пептидных связей Xxx-Pro. Для выяснения влияния этого свойства «слабого» токсина на биологическую активность были получены мутанты P7A, P33A и P7A/P33A. «Необычные» токсины, как правило, обладают слабой афинностью по отношению к нАХР мышечного типа.
Однако для «необычного» токсина кандоксина из яда Bungarus сandidus значение IC50 для нАХР из Torpedo californica cоставляет 50 нМ, что сопоставимо со значениями констант ингибирования, определяемых для коротких и длинных нейротоксинов. По аналогии с короткими и длинными -нейротоксинами было выдвинуто предположение, что остатки, расположенные на конце центральной петли кандоксина, ответственны за высокое сродство токсина к рецептору. Для проверки этого предположения, был получен химерный токсин, в котором участок центральной петли «слабого» токсина (Q30-W36) был заменен на аналогичный фрагмент кандоксина (REARGT). Предполагалось, что в случае истинности этого предположения мутант Q30RRPLSW36/REARGT будет обладать повышенным сродством к нАХР из Torpedo californica.
Способность мутантов «слабого» токсина специфически взаимодействовать с мышечным и нейрональным 7нАХР была оценена по конкуренции с 125I-меченным -бунгаротоксином за связывание с мембранами из электрического органа Torpedo californica и клетками GH4C1, трансфецированными 7нАХР человека, соответственно (Табл. 1.). Анализ активности полученных мутантов выявил, что: 1) наличие дополнительной дисульфидной связи в первой петле снижает сродство WTX к обоим типам рецептора;
2) конформационная гетерогенность WTX не оказывает значительного влияния на активность токсина;
3) остаток Trp36, находящийся на конце центральной петли токсина, важен только для взаимодействия с мышечным нАХР;
4) замена положительно заряженных остатков Arg в положениях 31 и 32 на нейтральные или отрицательно заряженные остатки негативно сказывается на активности «слабого» токсина по отношению к обоим типам рецептора, при этом одновременная замена обоих остатков Arg приводит к селективному исчезновению активности WTX по отношению к 7нАХР. Замена Мутанты IC50 мкМ IC50 мкМ Таблица. 1. Значения IC50, «слабого» -7нАХР Torpedo характеризующие взаимодействие токсина californica «слабого» токсина и его мутантов с мышечным и нейрональным Дикий тип 5.1+0.2 52+ нАХР, оцененные по конкуренции с С6S/C11S 1.8+0.1 18+ I-меченным -бунгаротоксином.
30 Q RRPLSW / 23.0+0.2 200+ REARGT W36A 16.0+1.0 49+ P7A 7.9+0.3 30+ P33A 7.3+0.6 48+ P7A/P33A 5.8+0.1 30+ R31A 15.1+0.1 66+ R32A 14.4+0.3 89+ R31A/R32A 19.4+0.3 R31E/R32A 19.4+0.6 R31A/R32E 15.8+0.2 фрагмента центральной петли WTX на фрагмент центральной петли кандоксина также приводит к значительному уменьшению активности химерного токсина.
Вероятно, за высокое сродство кандоксина с рецептором отвечают другие остатки.
14. ЯМР анализ влияния точечных мутаций «слабого» токсина на конформационную гетерогенность Анализ спектров ЯМР 15N-меченого аналога «слабого» токсина показал, что степень введения метки составляет не менее 97%. Полученный двумерный 1Н-15N-HSQC спектр этого препарата (Рис. 14) подтвердил наличие двух конформационных состояний в молекуле WTX. Методами ЯМР спектроскопии, используя 3D спектры Н-15N-NOESY-HSQC и 1Н-15N-TOCSY-HSQC, было получено практически полное отнесение сигналов токсина в воде при pH 5.5 (Рис. 14). Наибольшие различия химических сдвигов сигналов HN групп основной цепи между двумя формами пептида наблюдались для остатков, сближенных с остатками Pro7 и Pro33, в последовательности токсина. Анализ 2D 1Н-NOESY спектров «слабого» токсина Рис. 14. 1Н-15N-HSQC-спектр ЯМР 15N-меченого «слабого» токсина (pH 5.5, 40°C). Сигналы формы токсина соответствующей trans-конфигурации пептидной связи Arg32-Pro33 показаны красным цветом. Сигналы cis-формы обозначены звездочками и показаны синим цветом. Сигналы HN и H2N групп боковых цепей обозначены знаком “s”. Сигнал HN1 боковой цепи Trp36 обведен.
Сигналы HN групп основной цепи, для которых наблюдаются наибольшие различия в химических сдвигах между двумя формами пептида, соединены зелеными стрелками.
подтвердил, что наблюдаемая конформационная гетерогенность WTX обусловлена cis-trans изомерией пептидной связи Arg32-Pro33.
Рис. 15. Фрагменты 1D 1H-ЯМР спектров природного «слабого» токсина, рекомбинантного «слабого» токсина и его мутантных форм. Показана область с сигналами HN1 боковой цепи Trp36. Показано содержание конформационной формы токсина, соответствующей trans-конфигурации пептидной связи Ххх32-Pro33. Названия мутантных форм «слабого» токсина, не демонстрирующих конформационной гетерогенности, подчеркнуты. В качестве контроля показан фрагмент спектра мутанта с заменой Trp36/Ala.
Для изучения влияния точечных мутаций на процессы конформационного обмена в молекуле WTX были проанализированы 1D 1H-ЯМР спектры мутантных форм токсина. Для оценки относительного содержания различных конформеров токсина в растворе, использовали сигналы протона HN1 боковой цепи Trp36, который демонстрировал разные химические сдвиги в двух конформациях WTX, содержащих пептидную связь Arg32-Pro33 в cis- и trans-конфигурации (Рис. 15).
Несмотря на меньшую полуширину сигнала HN1 Trp36 в trans-конформере, интегральная интенсивность обоих сигналов была примерно одинакова, что указывало на приблизительно одинаковое содержание обеих конформационных форм. Как и ожидалось, при введении замены Pro33/Ala, сигнал, соответствующий cis-конфигурации пептидной связи Arg32-Pro33, переставал детектироваться в спектрах ЯМР. Размыкание дисульфидной связи в первой петле токсина путем введения двойной замены Cys6/Ser и Cys11/Ser или введение мутации Pro7/Ala вело к изменению заселенностей конформеров (рис. 15). При этом содержание формы токсина, имеющей trans-конфигурацию пептидной связи Arg32-Pro33, возрастало до 60 и 65%, соответственно. Видимо, изменения в конформации первого петлевого участка токсина влияют на конформацию второй петли, содержащей остатки Pro и Trp36, что, возможно, указывает на пространственную сближенность фрагментов первой и второй петель токсина. Заметное увеличение заселенности trans конформационной формы токсина (до 75%) также наблюдалось при введении замены Arg32/Ala. При этом, введение в положение 31 остатка Ala, равно как и замена Arg32/Glu не приводили к перераспределению заселенностей. Полученные результаты указывают на важность заряженного остатка в 32 положении (Arg или Glu) для стабилизации cis-конфигурации пептидной связи Ххх32-Pro33.
Выводы 1. Получены гены химерных длинных -нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII), путем введения в центральную петлю NTII дополнительных аминокислотных остатков, а также гены «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX), относящегося к классу «необычных» токсинов, и его мутантных вариантов. Разработанные эффективные схемы биосинтеза, выделения и очистки позволили наработать рекомбинантные нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченные варианты в необходимых для исследования количествах.
2. Показано, что химерные -нейротоксины, полученные на основе NTII, приобрели способность взаимодействовать с нАХР 7 типа, что подтвердило ключевую роль центральной петли длинных -нейротоксинов в селективном взаимодействии с этим рецептором. Показано, что замена Ala/Lys в центральной петле длинных -нейротоксинов не приводит к возникновению активности по отношению к нАХР 32 типа.
3. Исследована биологическая активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному нАХР и нейрональному нАХР 7 типа.
Показано, что:
- удаление дополнительной дисульфидной связи в N-концевой петле WTX увеличивает его сродство к рецепторам обоих типов;
- остаток Trp36 важен только для взаимодействия с нАХР мышечного типа;
- cis-trans изомерия пептидной связи Arg32-Pro33 в молекуле WTX, как и наличие остатка Pro7, не оказывает значительного влияния на биологическую активность токсина;
- заряженные остатки Arg31 и Arg32 центральной петли токсина важны для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального 7 типа, при этом замена обоих остатков аргинина приводит к селективной потере активности по отношению к нейрональному нАХР 7 типа.
4. Методами спектроскопии ЯМР проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах 15N-меченого аналога WTX. Изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность токсина, обусловленную cis-trans изомерией пептидной связи Arg32-Pro33.
Основные научные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:
1. Dmitry Lesovoy, Eduard Bocharov, Ekaterina Lyukmanova, Yurij Kosinsky, Mikhail Shulepko, Dmitry Dolgikh, Mikhail Kirpichnikov, Roman Efremov, and Alexander Arseniev. Specific membrane binding of neurotoxin II can facilitate its delivery to acetylcholine receptor. Biophys. J., 2009, 97, 2089-2097.
2. Е.Н. Люкманова, М.А. Шулепко, Р.В. Тихонов, З.О. Шенкарев, А.Н. Вульфсон, И.Е. Кашеверов, Т.Л. Устич, Ю.Н. Уткин, А.С. Арсеньев, В.И. Цетлин, Д.А.
Долгих, М.П. Кирпичников. Бактериальная продукция и ренатурация из телец включения «слабого» токсина, белка с высоким содержанием дисульфидных связей. Биохимия, 2009, 74(10), 1142-1149.
3. Е.Н. Люкманова, М.А. Шулепко, И.Е. Кашеверов, З.О. Шенкарев, К.С. Минаев, А.С. Парамонов, А.С. Арсеньев, Д.А. Долгих, В.И. Цетлин, М.П. Кирпичников.
Структурно-функциональные исследования механизмов молекулярного действия эндогенных нейромодуляторов никотинового ацетилхолинового рецептора.
Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.
Овчинникова. Москва-Пущино. 2009, 130.
4. E.N. Lyukmanova, M.A. Shulepko, Z.O. Shenkarev, I. Kasheverov, Yu.N. Utkin, V.I.
Tsetlin, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. Structure-functional investigation of ‘weak’ toxin from Naja kaouthia: bacterial production, refolding, mutagenesis and NMR study.
J. Neurochem. 2009, 110(suppl.1), 81.
5. М.А. Shulepko, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov.
Effective bacterial expression of three-finger neurotoxins from snake venom. FEBS J.
2008, 275(suppl.1), 412.
6. Е.Н. Люкманова, З.О. Шенкарев, М.А. Шулепко, Г.С. Копеина, И.Е. Кашеверов, Д.М. Лесовой, Э.В. Бочаров, Ю. Косинский, В.И. Цетлин, Д.А. Долгих, А.С.
Арсеньев, М.П. Кирпичников, Нейротоксины яда змей и никотиновый ацетилхолиновый рецептор: исследование лиганд-рецепторных взаимодействий.
XX Зимняя международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии”. Москва. 2008, 21.
7. E.N. Lyukmanova, M.A. Shoulepko, D.A. Dolgikh, M.P. Kirpichnikov. Bacterial Expression of Disulfide-Rich Snake Neurotoxins. Essential Protein Enginering Summit.
Boston, USA. 2008, 219.
8. Ekaterina N. Lyukmanova, Zakhar O. Shenkarev, Alexey A. Schulga, Yaroslav S.
Ermolyuk, Dmitry Yu. Mordvintsev, Yurii N. Utkin, Mikhail A. Shoulepko, Ron C.
Hogg, Daniel Bertran, Dmitry A. Dolgikh, Victor I. Tsetlin, and Mikhail P.
Kirpichnikov. Bacterial Expression, NMR, and Electrophysiology Analysis of Chimeric Short/Long-chain -Neurotoxins Acting on Neuronal Nicotinic Receptors. J.
Biol. Chem., 2007, 282(34), 24784-24791.
9. R.C. Hogg, E.N. Lyukmanova, Z.O. Shenkarev, A.A. Schulga, Y.S. Ermolyuk, D.Y.
Mordvintsev, Y.N. Utkin, M.A. Shoulepko, D.Bertrand, D.A. Dolgikh, V.I. Tsetlin, M.P. Kirpichnikov. Investigation of the structural determinants underlying the receptor selectivity of short- and long-chain alpha-neurotoxins. 37th annual meeting of the Society for Neuroscience. USA. 2007.
10. Ekaterina N. Lyukmanova, Zakhar O. Shenkarev, Alexey A. Schulga, Yaroslav S.
Ermolyuk, Dmitry Yu. Mordvintsev, Yurii N. Utkin, Mikhail A. Shulepko, Ron C.
Hogg, Daniel Bertrand, Alexander S. Arseniev, Dmitry A. Dolgikh, Victor I. Tsetlin, and Mikhail A. Kirpichnikov. Heterologously expressed three-finger toxins for analysis of ligand-receptor interactions. Symposium, ”Neuroreceptors: structure, mechanism of action and role in pathologies”. Moscow. 2007, 19.
11. Ekaterina N. Lyukmanova, Dmitry M Lesovoy, Mikhail A. Shulepko, Eduard V.
Bocharov Yuri Kosinsky, Igor E. Kasheverov, Victor I. Tsetlin, Dmitry A. Dolgikh, Alexander S. Arseniev, Mikhail A. Kirpichnikov. Structural determinants of neurotoxin II binding to nicotincic acetylcholine receptor. NMR and mutagenesis study. International Symposium and Summer school, “4th Meeting NMR in life Sciences”. Saint Petersburg. 2007, 89-90.
12. Е.Н. Люкманова, М.А. Шулепко, Е.В. Крюкова, Ю.Н. Уткин, З.О. Шенкарев, В.И. Цетлин, Д.А. Долгих, М.П. Кирпичников. Бактериальная продукция слабого токсина из яда кобры Naja knaouthia. Международная конференция, ”Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии”. Украина. 2007, 294.
Принято к исполнению 8.10. Исполнено 9.10. Заказ № Тираж 100 экз.
Рекламно-производственная компания “Дип-Грин” Москва, Миклухо-маклая 16/10.