Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков
На правах рукописи
Копеина Гелина Сергеевна ИССЛЕДОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Специальность: 03.01.02 - Биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа была выполнена в лаборатории инженерии белка Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.
Научный консультант: к.б.н. Е.Н. Люкманова
Официальные оппоненты: доцент, д.х.н. В.В. Чупин профессор, д.б.н. С.В. Машко
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Центр “Биоинженерия» РАН
Защита состоится «25» ноября 2010 г. в 14 ч. на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан «22» октября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.Г. Страховская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Мембранные белки (МБ) составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Эти белки играют основную роль в процессах передачи сигналов, как на уровне отдельной клетки, так и на уровне целого организма. МБ обуславливают функционирование нервной, иммунной и эндокринной систем в качестве различных рецепторов, передающих сигналы через клеточную мембрану, а также в качестве ионных каналов, ответственных за распространение импульсов вдоль нервных волокон. С прикладной точки зрения МБ представляют огромный интерес как мишени для создания новых фармакологических препаратов и в качестве объектов для биотехнологических разработок. В отличие от глобулярных водорастворимых белков, МБ остаются малоизученными, а примеры их удачного использования в области фармакологии и биотехнологии чрезвычайно редки. Основные трудности в исследовании и применении МБ обусловлены особенностями их пространственной организации. Большинство МБ представляют собой связки из нескольких трансмембранных (ТМ) спиралей. Так как ТМ спирали гидрофобны, МБ может иметь нативную структуру только в присутствии биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды. Это значительно затрудняет как получение достаточных количеств препаратов МБ в функционально-активной форме, так и их дальнейшие структурно-функциональные исследования и биотехнологическое применение.
В последнее время для продукции мембранных белков все большую популярность приобретают сопряженные бесклеточные системы синтеза (СБСС).
На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра трансляционной смеси (ТС), что дает возможность получать белковые препараты в количествах, необходимых для биологических, биохимических и биофизических исследований. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется в основном целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать синтезируемый полипептид в нативной конформации. Для продукции МБ в ТС добавляют мембраномоделирующие компоненты, поддерживающие МБ в растворимой форме, такие как мицеллы детергентов, липосомы или липопротеиновые частицы (липид белковые нанодиски, ЛБН). Кроме того, СБСС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований белков методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Таким образом, разработка новых методов эффективной бесклеточной продукции МБ является актуальной задачей молекулярной биологии, биотехнологии и биофизики и открывает широкие перспективы для структурно функциональных исследований и практического применения этих белков.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось исследование возможности применения СБСС на основе экстракта S30 из E. coli для продукции МБ и их доменов в нативной конформации для дальнейшего изучения их структурных и функциональных свойств. В качестве объектов исследования были выбраны:
внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека 7 типа (7ВД), -структурный белок, содержащий лиганд-связывающий участок;
бактериородопсин из Exiguobacterium sibiricum (БР-ES), – фотоактивируемый протонный насос психротолерантных бактерий, состоящий из семи ТМ спиралей, структурный прообраз мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками (рецепторов семейства GPCR);
и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого K+-канала KvAP из археи Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP), – структурный гомолог вольтсенсорных доменов потенциалозависимых Na+-, К+-, Ca2+- и H+-каналов млекопитающих, состоящий из четырех ТМ спиралей.
Данная цель подразумевает решение следующих задач:
Оптимизация бесклеточной системы синтеза на основе клеточного экстракта 1.
S30 из E. coli для максимального увеличения выхода целевых белков;
Разработка эффективной системы бесклеточной продукции 7ВД, подбор 2.
условий выделения и очистки рекомбинантного белка в нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;
Исследование физико-химических свойств и биологической активности 3.
полученного препарата 7ВД;
Разработка эффективной системы бесклеточной продукции БР-ES, подбор 4.
условий получения белка в функционально-активной форме в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;
Разработка эффективной системы бесклеточной продукции ВСД-KvAP в 5.
нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;
Исследование возможности получения селективно меченых мембранных 6.
белков в бактериальной бесклеточной системе для структурных исследований методом ЯМР-спектроскопии на примере ВСД-KvAP.
Научная новизна и значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые.
Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза 7ВД в 1.
виде осадка ТС. Подобраны условия ренатурации этого белка из осадка ТС.
Проведен анализ физико-химических и биологических свойств 7ВД.
2.
Методами ЯМР-спектроскопии показано, что белок, ренатурированный из осадка ТС, демонстрирует селективность по отношению к -нейротоксинам яда змей длинного и короткого типов, что свидетельствует о наличии у домена структуры, близкой к нативной.
Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза БР-ES в 3.
растворимой форме с использованием липид-белковых нанодисков в качестве мембраномоделирующего компонента ТС. Наличие функциональной активности у МБ, встроенного в ЛБН, свидетельствует о наличии структуры БР-ES, близкой к нативной.
Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза ВСД-KvAP 4.
в виде осадка ТС. Подобраны условия синтеза селективно меченого белка, а также условия его ренатурации из осадка ТС. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что ренатурированный 15N-Ala-ВСД-KvAP имеет пространственную структуру, близкую к нативной.
В ходе данного исследования были разработаны и успешно применены эффективные методы бесклеточного синтеза для продукции ряда мембранных белков и их доменов. Методами ЯМР-спектроскопии и с помощью функциональных тестов для всех исследуемых белков было показано наличие пространственной структуры, близкой к нативной, что указывает на универсальность выбранного подхода. Таким образом, разработка систем бесклеточного синтеза открывает новые возможности для структурно функциональных исследований не только никотинового ацетилхолинового рецептора, потенциалозависимого К+ канала KvAP и бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum, но может найти широкое применение в исследованиях и других мембранных белков.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 33-м Конгрессе европейских биохимических сообществ (Афины, Греция, 2008), XVI Международном симпозиуме «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008), XX Зимней международной молодежной научной школе «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), 4-ой Международной конференции европейского нейрохимического общества «Успехи в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Лейпциг, Германия, 2009), Заочной электронной конференции Российской академии естествознания «Технологии живых систем» (2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва, Россия, 2009), Международной конференции «Евромар-2010» (Флоренция, Италия, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе статьи в отечественных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), а также Заключения и Выводов.
Работа проиллюстрирована 24 рисунками. Библиографический указатель содержит 166 источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во Введении рассмотрена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и основные задачи работы, обоснованы практическое применение результатов, а также научная новизна и значимость работы.
В Главе 1 представлен литературный обзор, в котором рассмотрены принципы работы бесклеточных систем транскрипции-трансляции (сопряженных бесклеточных систем синтеза), история их открытия, основные методы их оптимального использования для получения рекомбинантных белков. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции работают на основе содержимого клеток (клеточного экстракта). Клеточные экстракты содержат рибосомы, факторы инициации, элонгации и терминации, они способны синтезировать различные белки, как про-, так и эукариотического происхождения. Синтез белка инициируется добавлением компонентов, необходимых для биосинтеза белка (аминокислоты, нуклеозидтрифосфаты, Т7-полимераза, пируваткиназа, плазмидная ДНК, содержащая ген целевого белка). Аналитический вариант бесклеточной системы, часто применяемый для тестовых экспериментов (так называемая batch-система), представляет собой находящуюся в одном объеме смесь клеточного экстракта, ферментов, матрицы и низкомолекулярных компонентов, таких как аминокислоты, нуклеозидтрифосфаты, соли. Однако для продукции белков в препаративных количествах используется другой вариант бесклеточной системы, – система диализного типа CECF (continuous exchange cell-free). Принцип ее работы заключается в том, что трансляционная смесь содержащая (ТС), высокомолекулярные компоненты, отделена от питающего раствора полупроницаемой мембраной (Рис. 1). Объем питающего раствора в 10-20 раз превосходит объем трансляционной смеси, поэтому концентрация низкомолекулярных веществ, необходимых для синтеза белка (аминокислоты, нуклеотиды, энергетические компоненты), остается достаточно высокой на протяжении многих часов. Данная система способна синтезировать целевой белок в течение всего времени инкубации (десятки часов), и выход продукта может составить несколько миллиграммов с одного миллилитра трансляционной смеси.
Рис. 1. Схема организации работы бесклеточной системы диализного типа.
Кроме того, в литературном обзоре описаны разнообразные современные способы решения проблемы агрегации белка, с которой часто сталкиваются исследователи как при продукции рекомбинантных белков в клетках, так и с использованием бесклеточных систем. Кроме того, дано описание объектов исследования, их основных структурных и функциональных особенностей, а также их научной и практической значимости.
В Главе 2 рассмотрены экспериментальные методики, примененные в работе.
Структурные исследования методами спектроскопии ЯМР проводились совместно с Шенкаревым З.О. и Парамоновым А.С., сотрудниками лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН.
В Главе 3 изложены основные результаты, полученные в ходе работы.
Продукция внеклеточного домена 7нАХР (7ВД) в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из E. coli Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы являются (нАХР) лигандозависимыми ионными каналами, встроенными в постсинаптические мембраны нейронов. Эти рецепторы состоят из пяти гомологичных субъединиц, трансмембранные части которых образуют ионопроводящую пору, а внеклеточные N-концевые домены содержат сайты связывания лигандов (Рис. 2). Одним из широко распространенных в нервной системе млекопитающих является гомопентамер нАХР 7 типа (7нАХР), с дисфункциями которого связано развитие ряда тяжелых заболеваний нервной и эндокринной систем. Исследования нАХР и разработка препаратов для лечения подобных заболеваний требуют наличия высокоэффективных систем продукции отдельных субъединиц и доменов рецептора, создание которых затруднено из-за склонности этих белков к агрегации.
На сегодняшний день для бесклеточной продукции белковых препаратов наиболее часто применяют бесклеточную систему транскрипции-трансляции, основанную на использовании бактериального клеточного экстракта, так как эта система является наиболее продуктивной из существующих бесклеточных систем.
В данной работе была исследована возможность применения бесклеточной системы на основе экстракта S30 из E. coli для получения белков, содержащих дисульфидные связи, на примере внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора 7 типа (7ВД), содержащего две дисульфидные связи и один неспаренный остаток цистеина.
На основе полноразмерного гена 7нАХР человека (любезно предоставленного проф. Дж. Линдстромом, США) были получены последовательности генов 7ВД и его мутантной формы (7ВД/DTES), содержащей замены, приводящие к повышению растворимости и стабильности домена (Рис. 2). Неспаренный остаток цистеина в положении 116 был заменен на остаток серина. Также была введена замена четырех гидрофобных аминокислотных остатков (Trp134-Phe-Pro-Phe137) на гидрофильные Asp-Thr-Glu-Ser по аналогии с ацетилхолин-связывающим белком (АХСБ) из моллюска Lymnaea stagnalis. АХСБ – водорастворимый белок, состоящий из пяти одинаковых субъединиц, имеет 25% гомологии по аминокислотной последовательности с 7ВД, является структурным гомологом внеклеточной части нАХР и взаимодействует с такими лигандами нАХР, как ацетилхолин, -конотоксины и -нейротоксины (Brejc et al., 2001). При анализе модели 7ВД, предложенной в работе (Fruchart-Gaillard et al., 2002), было замечено, что фрагмент (134-137)7ВД имеет гидрофобную природу и, возможно, контактирует с мембранным окружением рецептора. В то же время гомологичный участок молекулы АХСБ содержит только гидрофильные аминокислотные остатки Asp-Thr-Glu-Ser (Рис. 2). Было выдвинуто предположение, что замена четырех гидрофобных аминокислотных остатков фрагмента (134-137)7ВД на остатки гомологичного участка АХСБ будет способствовать увеличению растворимости и стабильности 7ВД.
Рис. 2.
Модель пространственной структуры нАХР. Сравнение модели субъединицы 7ВД и АХСБ. Схема введения мутаций в последовательность 7ВД. Розовыми стрелками показано расположение лиганд связывающих участков.
Гены 7ВД и 7ВД/DTES с дополнительными последовательностями, кодирующими 6 остатков His на С-конце молекулы домена, были клонированы в плазмиды на основе коммерческого вектора pET22b(+). Предварительные эксперименты показали, что при бесклеточной продукции практически весь препарат 7ВД накапливался в виде нерастворимого осадка ТС, в то время как ~20% синтезированного препарата 7ВД/DTES оставалось в растворе. Поэтому дальнейшая работа была продолжена с мутантным вариантом 7ВД/DTES.
Оптимизация бесклеточной системы для продукции 7ВД/DTES Для эффективной работы бесклеточной системы и увеличения выхода целевого продукта необходимо было определить оптимальные концентрации ионов Mg2+ и K+, а также плазмидной ДНК, содержащей последовательность 7ВД/DTES. Для подбора наилучших условий последовательно анализировали выход белка, синтезированного при разных концентрациях ацетата магния (от 7 мМ до 12 мМ) и ацетата калия (от 100 мМ до 180 мМ) и, определив оптимальные концентрации ионов магния и калия, подбирали концентрацию плазмидной ДНК (Рис. 3). Выход белка в каждом из экспериментов оценивали с помощью электрофоретического анализа продуктов трансляции в 12% ПААГ (Трис-трициновая буферная система с 0,1% SDS) с последующим денситометрическим анализом геля с помощью программы OptiQuant Version 3. В результате анализа эффективности синтеза 7ВД/DTES было установлено, что оптимальными концентрациями ионов магния, калия и плазмидной ДНК являются 9 мМ, 120 мМ и 0,3 мг/мл, соответственно (Рис. 3). Общее количество синтезированного препарата 7ВД/DTES при оптимальных условиях составило 1,53 мг с 1 мл трансляционной смеси.
Рис. 3. Анализ эффективности синтеза общего количества 7ВД/DTES в зависимости от концентрации ионов магния (А), ионов калия (Б), вектора pET-22b(+)/7ВД/DTES (В). Каждое значение получено на основе усреднения результатов двух повторных экспериментов, системная ошибка составляет не более 14%.
Количественное содержание 7ВД/DTES оценивали по сравнению с количеством очищенного препарата 7ВД/DTES.
Синтез 7ВД/DTES в растворимой форме Причиной преципитации и агрегации внеклеточного домена, возможно, служили неправильное формирование пространственной структуры, связанной с неправильным замыканием дисульфидных связей, и стремление домена рецептора к самопроизвольной пентамеризации, присущей 7ВД. Для решения проблем преципитации и агрегации мы применили несколько описанных в литературе подходов: подбор окислительно-восстановительных условий для правильного замыкания дисульфидных связей, синтез целевого белка в присутствии лиганда и синтез целевого белка в присутствии «мягкого» детергента. Для подбора оптимальных условий синтеза 7ВД/DTES в растворимой форме в ТС добавляли смесь восстановленной (GSH) и окисленной форм (GSSG) глутатиона в разных соотношениях (от 1:1 до 1:10), низкомолекулярный агонист нАХР карбамоилхолин (КБМХ) с концентрацией от 10 до 100 мМ и «мягкий» неионный детергент бридж 35 с концентрацией до 1%. Было показано, что добавление в трансляционную смесь GSH и GSSG с концентрацией 0,1 мМ и 0,5 мМ, соответственно, повышало долю растворимой фракции 7ВД/DTES до 50% (Рис. 4, II). Присутствие в ТС 20 мМ КБМХ также приводило к увеличению доли растворимой фракции домена до 50% (Рис. 4, III). Совмещение этих двух подходов не вызвало дополнительного увеличения выхода растворимого белка (Рис. 4, IV). Добавление в ТС детергента бридж-35 в концентрации 0,5% как агента, препятствующего самопроизвольной пентамеризации, привело к синтезу практически полностью растворимого белка (Рис. 4, V-VIII). Однако при дальнейшей очистке 7ВД/DTES из растворимой фракции ТС с помощью металл-аффинной хроматографии происходила полная преципитация целевого белка. Поэтому были подобраны условия ренатурации 7ВД/DTES из осадка ТС.
Рис. 4. Анализ с помощью электрофореза в 12% ПААГ синтеза 7ВД/DTES в различных условиях: I – контроль;
II – синтез в присутствии 0,1 мМ GSH/0,5 мМ GSSG;
III – синтез в присутствии 20 мМ КБМХ;
IV – синтез в присутствии смеси глутатионов и КБМХ;
V – синтез в присутствии 0,5% бридж-35;
VI – синтез в присутствии смеси глутатионов и детергента;
VII – синтез в присутствии КБМХ и детергента;
VIII – синтез в присутствии смеси глутатионов, КБМХ и детергента. 1 – трансляционная смесь, 2 – растворимая фракция ТС, 3 – нерастворимая фракция ТС.
Ренатурации 7ВД/DTES из осадка трансляционной смеси Были опробованы различные подходы для солюбилизации осадка ТС, включая как использование 8 М мочевины, 6 М гуанидингидрохлорида, так и 1% раствора «жесткого» анионного детергента лаурилсаркозина натрия (ЛС). Наибольшая эффективность солюбилизации 7ВД/DTES из осадка ТС была достигнута при использовании смеси 4М мочевины и 1% ЛС в присутствии дитиотрейтола (ДТТ).
Ренатурацию 7ВД/DTES осуществляли с помощью металл-аффинной хроматографии в результате промывки белкового препарата 7ВД/DTES, иммобилизованного на смоле Ni2+-Sepharose (GE Healthcare), буфером, содержащим смесь GSH/GSSG, с градиентным понижением концентрации мочевины и ЛС.
После этого ренатурированный белок элюировали ступенчатым градиентом имидазола (100 мМ и 500 мМ). Однако полученный белковый препарат 7ВД/DTES обладал низкой стабильностью в растворе. Тогда был использован вариант ренатурации, в котором 1% ЛС постепенно заменяли 0,2% раствором додецилмальтозида (ДДМ) или 0,2% додецилфосфохолина (ДФХ). После промывки смолы с иммобилизованным белковым препаратом буфером, содержащим соответствующий детергент и смесь GSH/GSSG, белок элюировали буфером со ступенчатым градиентом имидазола 100 мМ и 500 мМ, также содержащим соответствующий детергент.
В результате были получены стабильные (более 1 месяца при +4 °С) белковые препараты с конечным выходом 0,6 мг белка с 1 мл трансляционной смеси.
Препараты 7ВД/DTES в ДДМ и ДФХ были проанализированы с помощью гель фильтрации (Рис. 5 А). Было показано, что в случае использования ДДМ белок находился преимущественно в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов (Рис. 5 А). Использование ДФХ позволило получить гомогенный (90%) препарат 7ВД/DTES с диаметром частиц около 7 нм, что соответствует размеру мономера внеклеточного домена нАХР (диаметр ~5 нм) в комплексе с мицеллой ДФХ (диаметр ~4 нм). Анализ вторичной структуры 7ВД/DTES в растворе ДФХ методом КД-спектроскопии выявил преобладание -структуры, что соответствует теоретически рассчитанным данным (Рис. 5 Б).
Рис. 5. (А). Анализ препарата 7ВД/DTES в растворе детергентов ДФХ и ДДМ с помощью гель-фильтрации на смоле Superdex-200 (колонка Tricorn 5/200, GE Healthcare). (Б). КД-спектр 7ВД/DTES в растворе детергента ДФХ.
Способность 7ВД/DTES в растворе детергента ДФХ взаимодействовать со специфическими лигандами нАХР была исследована методом одномерной ЯМР спектроскопии с использованием 15N-меченого аналога химерного нейротоксина NTII/NTI, -нейротоксина длинного типа, и 15N-меченого аналога нейротоксина NTII из яда Naja oxiana, -нейротоксина короткого типа (Рис. 6). Растворы нейротоксинов в мицеллах детергента ДФХ титровали раствором домена рецептора в ДФХ и по ослаблению сигналов токсинов в 1D 15N-HSQC спектрах ЯМР судили о взаимодействии токсинов с 7ВД/DTES (Рис. 6). Описание изотермы связывания проводили с помощью уравнения Хилла, что позволило оценить коэффициент кооперативности n и эффективную константу взаимодействия нейротоксинов с внеклеточным доменом. Было показано, что каждая молекула домена специфически связывает две молекулы нейротоксина NTII/NTI с эффективной константой связывания ~ 4,8 ± 0,5 мкМ и сравнительно большой кооперативностью (коэффициент Хилла 1,8). Взаимодействие 7ВД/DTES с NTII происходило с константой связывания ~ 229 ± 15 мкМ, что свидетельствует о селективности взаимодействия полученного препарата внеклеточного домена нАХР по отношению к -нейротоксинам короткого и длинного типов, что соответствует биологическим свойствам природного рецептора.
Таким образом, была разработана новая эффективная система бесклеточной продукции внеклеточного домена 7нАХР, обладающего структурными и функциональными свойствами, близкими к свойствам природного рецептора.
Применение детергента ДФХ в процессе ренатурации домена из осадка ТС способствовало стабилизации белка в растворе, что позволило получить внеклеточный домен в биологически активной форме. Разработка данной системы бесклеточного синтеза открывает новые перспективы для структурно функциональных исследований взаимодействия нАХР с его лигандами.
Рис. 6. (А). 1D 15N-HSQC спектры ЯМР токсина NTII/NTI в присутствии мицелл детергента ДФХ при возрастающей концентрации 7ВД/DTES. (Б). Полученные изотермы связывания нейротоксинов NTII/NTI (показана черными точками) и NTII (показана незаполненными квадратами). Кривая разведения показана пунктирной линией.
Получение бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum (БР-ES) в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из E. coli Бактериородопсин – мембранный светочувствительный белок, который осуществляет перенос протона через плазматическую мембрану. Каждая молекула бактериородопсина состоит из двух компонентов: белка-опсина, имеющего в своем составе семь ТМ спиралей, и хромофора ретиналя. Бактериородопсин из E.
sibiricum был впервые описан в (Petrovskaya et al., 2010). Этот белок состоит из а.о. и имеет характерный спектр поглощения в видимой области с максимумом при длине волны 534 нм. Препараты БР-ES в нативной конформации имеют пурпурную окраску, что значительно упрощает идентификацию функционально-активной фракции белка при рекомбинантной продукции. БР-ES является структурным прообразом рецепторов семейства GPCR, которые рассматриваются как наиболее перспективные фармакологические мишени для разработки новых биомедицинских препаратов. Таким образом, разработка системы рекомбинантной продукции БР-ES является необходимым этапом для структурно-функциональных исследований самого бактериородопсина и имеет большое значение для исследования рецепторов семейства GPCR.
В данной работе была использована генетическая конструкция на основе коммерческого вектора pET32a(+), содержащая ген БР-ES с дополнительной гексагистидиновой последовательностью на С-конце молекулы, любезно предоставленная сотрудницей лаборатории биоинженерии белка ИБХ РАН Петровской Л.Е.
БР-ES синтезировали в бесклеточной системе в течение 20 часов в присутствии all-trans-ретиналя, после чего растворимую и нерастворимую фракции ТС анализировали с помощью электрофореза и иммуноблотинга. Было показано, что большая часть синтезированного белка (~ 80%) формирует нерастворимый осадок ТС. Как и в случае 7ВД/DTES, для увеличения выхода БР-ES была проведена оптимизация бесклеточной системы по концентрации ионов магния, калия, а также плазмиды. Было выявлено, что оптимальными концентрациями для синтеза БР-ES являются 8 мМ Mg(OAc)2, 70 мМ КOAc и 0,25 мг/мл плазмидной ДНК.
Оптимизация бесклеточной системы позволила увеличить общее количество синтезированного белка до 1,64 мг/мл ТС.
Синтез БР-ES в растворимой форме в присутствии детергентов Для бесклеточной продукции мембранных белков в растворимой форме наиболее часто применяют подход, основанный на добавлении в трансляционную смесь мицелл неионных детергентов, таких как бридж-35, бридж-58, бридж-78, бридж-98, тритон-Х100, твин-20. Для синтеза БР-ES в растворимой форме были опробованы все эти детергенты, а также цвиттеррионный детергент ДФХ, наиболее часто используемый детергент для структурных исследований мембранных белков методами ЯМР-спектроскопии, и неионный детергент ДДМ, способный поддерживать нативную структуру бактериородопсина, выделенного из мембран бактерий. Кроме того, во всех случаях в трансляционную смесь добавляли all-trans ретиналь до конечной концентрации 100 мкМ. Долю растворимого белка определяли с помощью денситометрического анализа после проведения гель электрофореза и иммуноблотинга растворимой и нерастворимой фракций ТС (Рис. 7 А).
Было показано, что использование детергентов бридж-35, бридж-58, бридж- и бридж-98 приводило к значительному повышению доли растворимого БР-ES, составляющей 65,2%, 73,2%, 63,8% и 70,7%, соответственно, от общего количества синтезированного белка. Добавление в ТС мицелл детергентов тритон-Х100 и твин 20 не приводило к заметному увеличению количества растворимого белка, в то время как добавление в ТС детергентов ДФХ и ДДМ существенно подавляло синтез белка (Рис. 7 А).
Несмотря на высокое содержание растворимой формы БР-ES, синтезированного в присутствии мицелл детергентов семейства бридж, ни в одном из экспериментов не наблюдалось изменения окраски ТС, что свидетельствовало об отсутствии функциональной активности у синтезированного белка. Видимо, молекулы БР-ES в присутствии мицелл этих детергентов не принимали нативной конформации и не взаимодействовали с all-trans-ретиналем, что было подтверждено спектрофотометрическим анализом.
Рис. 7. Подбор условий бесклеточного синтеза БР-ES в растворимой форме в присутствии различных мембраномоделирующих компонентов и all-trans-ретиналя. (А). Синтез в отсутствие и в присутствии мицелл различных детергентов. (Б). Синтез в присутствии ЛБН разного липидного состава. Количество белка, ассоциированного с ЛБН, рассчитывалось для фракций, элюированных буфером, содержащим 250 мМ имидазола, в результате очистки растворимой фракции ТС с помощью металл-афинной хроматографии. Каждое значение получено на основе усреднения результатов двух повторных экспериментов, системная ошибка составляет не более 13%. Количественное содержание БР-ES оценивали по сравнению с количеством очищенного препарата БР-ES в присутствии мицелл детергента бридж-98. В контрольном эксперименте ТС не содержала каких-либо мембраномоделирующих компонентов.
Синтез БР-ES в присутствии липид-белковых нанодисков Альтернативным подходом для синтеза мембранных белков в растворимой форме является использование липопротеиновых частиц или липид-белковых нанодисков (ЛБН) в качестве мембраномоделируюшего компонента ТС (Katzen et al., 2008). Каждый ЛБН представляет собой фрагмент бислойной мембраны дискоидальной формы (~150-200 молекул липидов), боковая поверхность которого экранирована от раствора двумя молекулами аполипопротеина (в этой работе использовали фрагмент (42-243) аполипопротеина А1 человека, так называемый MSP) (Рис. 8 А). Препараты липид-белковых нанодисков были любезно предоставлены лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН.
Для продукции БР-ES в растворимой форме был опробован подход, основанный на добавлении в ТС ЛБН. Были использованы ЛБН различного липидного состава, содержащие в качестве липидов либо димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ), либо димиристоилфосфатидилглицерол (ДМФГ), либо пальмитоил-олеилфосфатидилхолин (ПОФХ), либо смесь (4:1) ПОФХ и диолеилфосфатидилглицерола (ДОФГ). Во всех случаях в трансляционную смесь кроме ЛБН добавляли all-trans-ретиналь до конечной концентрации 100 мкМ. Было показано, что в присутствии ЛБН, независимо от их липидного состава, при синтезе БР-ES происходило окрашивание ТС в характерный пурпурный цвет (Рис. 8 Б). Спектрофотометрический анализ окрашенных растворимых фракций ТС выявил пик поглощения с максимумом при длине волны 534 нм (Рис. 8 В), что в свою очередь свидетельствовало о синтезе БР-ES в функционально-активной форме.
Рис. 8. (А). Схема организации липид-белковых нанодисков, содержащих мембранный белок.
Желтым и розовым цветом показаны молекулы липидов, молекулы аполипопротеина показаны в виде фиолетового тора, мембранный белок, встроенный в ЛБН, показан зеленым цветом. (Б) – фотография растворимой фракции ТС после синтеза БР-ES в присутствии ЛБН-ДМФХ, демонстрирующая характерную пурпурную окраску. (В). Спектрофотометрический анализ растворимых фракций ТС, содержащих синтезированный БР-ES в присутствии ЛБН различного липидного состава.
Денситометрический анализ гелей и мембран, полученных после гель электрофореза и иммуноблоттинга растворимой и нерастворимой фракций ТС, показал, что наибольший выход растворимого белка достигается при использовании ЛБН, состоящих из ненасыщенных липидов ПОФХ или из смеси липидов ПОФХ/ДОФГ (Рис. 7 Б). При использовании ЛБН, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ, выход растворимого белка был несколько ниже, чем в случае использования ЛБН, сформированных на основе ненасыщенных липидов.
Самый низкий выход растворимого белка наблюдался при использовании ЛБН, состоящих из насыщенных заряженных липидов ДМФГ. При этом необходимо отметить, что использование любого из четырех типов ЛБН обеспечивало сравнительно высокий выход активной формы БР-ES: от 0,4 мг/мл до 0,9 мг/мл ТС (Рис. 7 Б).
С помощью металл-афинной хроматографии было проведено аналитическое выделение БР-ES из растворимой фракции ТС. Электрофорез очищенных фракций показал, что большая часть БР-ES выделяется совместно с MSP, входящим в состав ЛБН, что указывает на ассоциацию бактериородопсина с мембраной ЛБН в процессе трансляции. Во всех случаях больше половины очищенных комплексов БР-ES/ЛБН содержалось во фракциях, элюированных буфером, содержащим мМ имидазола. При этом содержание БР-ES в этих фракциях составляло от 0,3 до 0,5 мг/мл ТС (Рис. 7 Б). Оставшаяся часть комплексов БР-ES/ЛБН содержалась во фракциях, элюированных более высокой концентрацией имидазола (500 мМ), что указывает на возможное встраивание нескольких копий молекул бактериородопсина в мембрану ЛБН.
С целью определения размеров комплексов БР-ES/ЛБН методом гель фильтрации был проведен анализ фракций, элюированных 250 мМ имидазола (Рис. 9). Анализ с помощью гель-фильтрации показал, что только в случае использования ЛБН, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ или ДМФГ, размер комплексов БР-ES/ЛБН незначительно увеличивается по отношению к размеру «пустых» нанодисков (10 нм), что соответствует литературным данным о размерах комплексов МБ/ЛБН. При использовании ЛБН, состоящих из ненасыщенных липидов ПОФХ или смеси ПОФХ/ДОФГ, размеры комплексов БР ES/ЛБН заметно превосходят размеры «пустых» ЛБН, причем в этих случаях хроматографические профили содержат дополнительные пики, соответствующие мономеру MSP (Рис. 9 Б). Вероятно, при встраивании БР-ES в ЛБН, сформированных на основе ненасыщенных липидов, происходит частичное разрушение изначальной структуры нанодисков с высвобождением молекул аполипопротеина и образованием более крупных мембранных комплексов, содержащих бактериородопсин. При этом стоит особо отметить, что до 80% очищенного бактериородопсина находится в функционально активной форме, независимо от липидного состава ЛБН, использованного при синтезе белка (Рис. 7 Б).
Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции бактериородопсина из E. sibiricum в растворимой форме. Было показано, что использование липид-белковых нанодисков, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ, позволяет получить препараты БР-ES/ЛБН, содержащие целевой белок в функционально-активной форме с выходом до 0,4 мг/мл ТС.
Рис. 9. Хроматографический анализ помощью гель (с фильтрации на смоле Superdex 200) ЛБН разного липидного состава до (А) и после (Б) синтеза БР-ES:
1 – ЛБН-ДМФХ, 2 – ЛБН-ДМФГ, 3 – ЛБН-ПОФХ, 4 – ЛБН-ПОФХ/ДОФГ.
Стрелками показан пик хроматографического профиля, соответствующий мономеру MSP.
Получение вольт-сенсорного домена К+-канала KvAP из Aeropyrum pernix в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из E. coli Потенциалозависимые каналы активируются при изменении ТМ электрического потенциала и играют ключевую роль в распространении нервных импульсов вдоль мембран нейронов, в возбуждении мышечных клеток, а также участвуют в поддержании осмотического баланса клетки. Большинство потенциалозависимых катионных каналов (H+, K+, Na+ и Сa2+) имеют в своем составе гомологичные вольт-сенсорные домены (ВСД), состоящие из четырех ТМ спиралей. Правильное функционирование этих доменов необходимо для жизни большинства животных, и именно ВСД являются мишенями для многих токсинов из ядов змей, моллюсков и членистоногих. Нарушение работы ВСД приводит к возникновению ряда нервных, мышечных и кардиологических заболеваний. В настоящее время аспекты структурной организации вольт-сенсорных доменов и механизмы их потенциалозависимой активации остаются малоизученными.
Исследования ВСД актуальны для создания новых терапевтических средств, направленных на лечение судорожных расстройств и аритмий.
Получение селективно меченого аналога ВСД-KvAP Получение белков, селективно меченных стабильными изотопами 13C и 15N, имеет большое значение для современных структурных исследований МБ методами ЯМР-спектроскопии. Использование систем клеточной продукции для этой цели малоэффективно из-за возможного перераспределения меченых субстратов в процессе жизнедеятельности клетки. Поэтому для получения селективно меченых белков все большей популярностью пользуются бесклеточные системы.
Возможность получения селективно меченых мембранных белков в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из E. coli была изучена на примере вольт-сенсорного домена потенциалозависимого K+ канала KvAP из археи Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP). Плазмидная конструкция на основе коммерческого вектора pET28a(+), содержащая ген, кодирующий последовательность ВСД-KvAP с дополнительной гексагистидиновой последовательностью на С-конце молекулы, была любезно предоставлена сотрудницей лаборатории биоинженерии белка ИБХ РАН Шингаровой Л.Н. ВСД-KvAP синтезировали в бактериальной бесклеточной системе в течение 20 часов. Анализ продуктов трансляции с помощью гель электрофореза и иммуноблотинга показал, что в процессе синтеза большая часть целевого белка образует нерастворимый осадок. Была проведена оптимизация бесклеточного синтеза ВСД-KvAP, и было показано, что оптимальными концентрациями ионов магния, калия и плазмиды являются 9 мМ, 110 мМ и 0, мг/мл, соответственно. Выход белка в оптимальных условиях составил 1,4 мг/мл ТС.
Селективно меченый вариант ВСД-KvAP был получен путем замены в ТС и питающем растворе аминокислоты аланин на 15N-меченый аналог аланина. Для проверки селективности включения изотопной метки по остаткам аланина синтезированный в виде осадка ТС препарат 15N-Ala-ВСД-KvAP был проанализирован методом гетероядерной 1H,15N ЯМР-спектроскопии (Рис. 10).
Белковый осадок ТС растворяли в трифторэтаноле (ТФЭ) и анализировали 1H,15N корреляционный ЯМР-спектр солюбилизированного белка. В спектре присутствовало 15 сигналов, соответствующих 15-ти остаткам аланина (Рис. 10).
Сравнение ЯМР-спектров 15N-Ala-меченого ВСД-KvAP со спектром тотально 15N меченого белка, полученного в результате экспрессии в E. coli и также растворенного в ТФЭ, выявило полное совпадение химических сдвигов для наблюдаемых кросс-пиков остатков аланина (Рис. 10), что свидетельствует о селективном включении изотопной метки 15N. Таким образом, было подтверждено, что в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта можно получать препараты мембранных белков, меченные стабильными изотопами по определенным аминокислотным остаткам.
Б Рис. 10. (А). Схематическое изображение молекулы ВСД-KvAP. (Б). 2D 1H,15N-HSQC ЯМР спектры ВСД-KvAP, растворенного в трифторэтаноле (ТФЭ). Красными контурами обозначен спектр 15N-Ala-ВСД-KvAP, полученного в бесклеточной системе, черными контурами - спектр N-ВСД-KvAP, полученного в результате экспрессии в E. coli. Спектры были получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С.
Синтез ВСД-KvAP в растворимой форме в присутствии детергентов Для синтеза ВСД-KvAP в растворимой форме были протестированы детергенты, которые использовались для получения БР-ES: ДФХ, ДДМ, бридж-35, бридж-58, бридж-78, бридж-98, тритон-Х100, твин-20. В ТС и питающий раствор добавляли детергенты до конечной концентрации 1%. Распределение продуктов трансляции между растворимой и нерастворимой фракциями ТС анализировали с помощью гель-электрофореза и иммуноблоттинга с последующим денситометрическим анализом. Было показано, что как и в случае с БР-ES детергенты ДФХ и ДДМ ингибировали синтез целевого белка, а использование детергентов твин-20 и тритон-Х100 не способствовало синтезу домена в растворимой форме. Использование мицелл детергентов бридж-58, бридж-78, бридж-98 в качестве мембраномоделирующего компонента ТС приводило к повышению доли растворимого белка до 50%. В присутствии мицелл детергента бридж-35 синтезировалось наибольшее количество ВСД-KvAP в растворимой форме (0,9 мг/мл), что составляло 79,5% от общего количества синтезированного белка (Рис. 11 А). Таким образом, для синтеза ВСД-KvAP в растворимой форме оптимальным является использование детергента бридж-35.
Рис. 11. Подбор условий синтеза ВСД-KvAP в растворимой форме. (А). Синтез в отсутствие и в присутствии мицелл различных детергентов. (Б). Синтез в присутствии ЛБН различного липидного состава. Количество белка, ассоциированного с ЛБН, рассчитывалось для фракций, элюированных буфером, содержащим 250 мМ имидазола, в результате очистки растворимой фракции ТС с помощью металл-афинной хроматографии. Каждое значение получено на основе усреднения результатов двух повторных экспериментов, системная ошибка составляет не более 16%. Количественное содержание ВСД-KvAP оценивали по сравнению с количеством очищенного препарата ВСД-KvAP, полученного из E. coli.
Препаративный синтез 15N-Ala-меченого ВСД-KvAP был осуществлен в присутствии бридж-35. Синтезированный белок выделяли из растворимой фракции ТС с помощью металл-аффинной хроматографии. Анализ с помощью электрофореза в 12% ПААГ очищенного белка показал, что большая часть препарата ВСД-KvAP представляет собой высокомолекулярные водорастворимые агрегаты (Рис. 12 А). Анализ 15N-Ala-ВСД-KvAP методом гетероядерной 1H,15N ЯМР-спектроскопии и сравнение 1H,15N-HSQC ЯМР-спектра этого белка со спектром тотально 15N-меченого домена в смеси детергентов ДФХ/ЛДАО, выделенного в нативном состоянии из мембран E. coli, подтвердил, что белок находится в неструктурированном состоянии (Рис. 12 Б, В). На это указывает отсутствие в спектре селективно меченого белка сигналов остатков аланина 72, 96 и 100, имеющих характерное положение в спектрах ВСД-KvAP с нативной структурой (Shenkarev et. al., 2010).
Таким образом, было показано, что молекулы ВСД-KvAP в результате бесклеточного синтеза в растворимом виде в присутствии мицелл детергента не принимают нативной конформации. Поэтому для продукции вольт-сенсорного домена в растворимой форме были опробованы липид-белковые нанодиски, которые были успешно применены для синтеза растворимого БР-ES в фукционально-активной форме.
Рис. 12. (А). Электрофоретический анализ ВСД-KvAP, синтезированного в присутствии мицелл детергента бридж-35. 1- маркер молекулярных масс, 2- препарат очищенного с помощью металл-афинной хроматографии ВСД-KvAP, 3- препарат ВСД-KvAP, выделенного из мембран E. coli. (Б). 2D 1H,15N-HSQC ЯМР-спектр 15N-ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран E. coli в нативной конформации. Кружочками обведены сигналы остатков аланина 72, 96 и 100, имеющие характерное положение в спектрах домена с нативной пространственной структурой. (В). 2D 1H,15N-HSQC ЯМР-спектр 15N-Ala-ВСД-KvAP в мицеллах бридж-35. Спектры получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С, pH 5,0.
Синтез ВСД-KvAP в присутствии липид-белковых нанодисков Как и в случае с БР-ES, для синтеза ВСД-KvAP в растворимой форме в трансляционную смесь в качестве мембраномоделирующего компонента добавляли ЛБН разного липидного состава: содержащие либо насыщенные липиды ДМФХ или ДМФГ, либо ненасыщенные липиды ПОФХ, или смесь ненасыщенных липидов ПОФХ/ДОФГ. Анализ продуктов трансляции с помощью гель-электрофореза и иммуноблоттинга с последующим денситометрическим анализом показал, что в присутствии любого из четырех типов ЛБН ВСД-KvAP синтезируется преимущественно в растворимой форме, при этом выход растворимого белка составляет до 1 мг/мл ТС (Рис. 11 Б).
Для оценки количественного выхода синтезированного белка, ассоциированного с ЛБН, проводили аналитическое выделение ВСД-KvAP из растворимой фракции ТС с помощью металл-афинной хроматографии. Очищенные фракции были проанализированы методом гель-электрофореза. Как и в случае с БР ES лишь ~ 50% от общего количества синтезированного белка было ассоциировано с аполипопротеином и содержалось во фракциях, элюированных 250 мМ имидазола (Рис. 12 Б). Эти фракции, содержащие ВСД-KvAP и MSP, были проанализированы с помощью гель-фильтрации (Рис. 13). Было показано, что только в случае использования ЛБН, состоящих из насыщенных липидов, размер комплексов ВСД KvAP/ЛБН был близок к размеру, ожидаемому для комплексов МБ/ЛБН (~ 10 нм).
Использование ЛБН, сформированных на основе ненасыщенных липидов, как и в случае бактериородопсина, приводило к высвобождению молекул аполипопротеина и формированию более крупных мембранных комплексов, содержащих целевой белок (Рис. 13). Таким образом, для синтеза в препаративных количествах селективно меченого ВСД-KvAP в растворимой форме были выбраны ЛБН, состоящие из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ. Стоит отметить, что согласно данным гель-электрофореза в отличие от препарата ВСД-KvAP/бридж-35 в препаратах ВСД-KvAP/ЛБН практически отсутствовали агрегаты домена.
Рис. 13. Хроматографический анализ помощью гель (с фильтрации на смоле Superdex 200) ЛБН разного липидного состава до (А) и после (Б) синтеза ВСД-KvAP:
1 – ЛБН-ДМФХ, 2 – ЛБН-ДМФГ, 3 – ЛБН-ПОФХ, 4 – ЛБН-ПОФХ/ДОФГ.
Стрелками показан пик хроматографического профиля, соответствующий мономеру MSP.
Препараты 15N-Ala-ВСД-KvAP, синтезированные в присутствии ЛБН/ДМФХ и ЛБН/ДМФГ и очищенные с помощью металл-афинной хроматографии, были проанализированы методом спектроскопии ЯМР (Рис. 14). Были получены 1H-15N TROSY ЯМР-спектры 15N-Ala-ВСД-KvAP, ассоциированного с ЛБН/ДМФХ и ЛБН/ДМФГ. Сравнение этих спектров со спектром тотально меченого 15N-ВСД KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного в нативном состоянии из мембран E.
coli, выявило отсутствие в спектрах селективно меченого домена сигналов остатков аланина, характерных для структурированного белка (Рис. 14).
1 Рис. 14. (А). Электрофоретический анализ 15N-Ala-ВСД-KvAP, синтезированного в присутствии ЛБН/ДМФХ. 1- маркер молекулярных масс, 2- препарат очищенного с помощью металл-афинной хроматографии ВСД-KvAP/ЛБН/ДМФХ. (Б). 2D 1H,15N-HSQC ЯМР-спектр N-ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран E. coli в нативной конформации. Кружочками обведены сигналы остатков аланина 72, 96 и 100, имеющие характерное положение в спектрах домена с нативной пространственной структурой. (В). 2D 1 H, N-TROSY ЯМР-спектр 15N-Ala-ВСД-KvAP в составе ЛБН/ДМФХ. ЯМР-спектры 15N-Ala ВСД-KvAP в составе ЛБН/ДМФГ и ЛБН/ДМФХ практически полностью совпадали. Спектры получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С, рН 5,0 (Б) и pH 7,0.
Видимо, нативная структура ВСД-KvAP не формировалась при встраивании молекулы домена в ЛБН. Это можно объяснить особенностями пространственной организации ВСД-KvAP (Рис. 10 А). Дело в том, что молекула домена содержит значительное количество заряженных аминокислотных остатков, которые стабилизируют пространственную структуру домена (связку из четырех ТМ спиралей) путем образования солевых мостиков (Рис. 10 А). Вероятно, именно заряженные группы ВСД-KvAP препятствуют встраиванию спиралей домена в мембрану ЛБН в ТМ ориентации, оставляя спирали домена в поверхностно связанном состоянии.
Ренатурация ВСД-KvAP из осадка трансляционной смеси Альтернативным подходом для бесклеточной продукции МБ в нативной конформации является синтез белка в виде осадка ТС в отсутствие каких-либо мембраномоделирующих компонентов с последующей ренатурацией. Для растворения осадка ТС, сформированного из синтезированного ВСД-KvAP, были опробованы мочевина и такие денатурирующие детергенты как додецилсульфат натрия (ДСН) и лаурилсаркозин натрия (ЛС). Ренатурацию проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок ТС, содержащий синтезированный ВСД KvAP, растворяли с помощью того или иного денатурирующего детергента с добавлением или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили с помощью металл-афинной хроматографии: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой Ni2+-Sepharose, затем постепенно понижали концентрацию мочевины, промывая смолу буфером, содержащим только денатурирующий детергент. После этого происходила постепенная замена денатурирующего детергента на ДФХ в результате промывки смолы буфером, содержащим ДФХ. Ренатурированный ВСД-KvAP элюировали в присутствии 0,2 % ДФХ ступенчатым градиентом имидазола (100 мМ, 300 мМ и 500 мМ).
Анализ препаратов ВСД-KvAP после ренатурации методом гель-электрофореза показал, что одновременное применение для растворения осадка ТС 8М мочевины и 2% ДСН являлось необходимым условием для получения ренатурированного белка в гомогенном виде (Рис. 15). Выход ренатурированного продукта составил 0,6 мг/мл ТС.
Рис. 15. Электрофоретический анализ в 12% ПААГ препаратов ВСД-KvAP, ренатурированных из осадка ТС. 1 препарат ренатурированного ВСД-KvAP, растворение осадка ТС осуществляли в 2% ЛС;
2- препарат ренатурированного ВСД-KvAP, растворение осадка ТС осуществляли в 2% ДСН;
3- препарат ренатурированного ВСД-KvAP, растворение осадка ТС осуществляли в смеси 8М мочевины и 2% ЛС;
4 препарат ренатурированного ВСД-KvAP, растворение осадка ТС осуществляли в смеси 8М мочевины и 2% ДСН.
Для анализа конформационного состояния ВСД-KvAP, ренатурированного в подобранных условиях, был синтезирован селективно 15N-меченый по остаткам аланина белок. Было проведено сравнение 1H,15N-HSQC ЯМР-спектров 15N-Ala ВСД-KvAP, ренатурированного из осадка ТС в присутствии мицелл ДФХ, со спектром 15N-ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран E. coli в нативном состоянии (Рис. 16). Практически полное совпадение химических сдвигов HN-групп остатков аланина в тотально и селективно меченых препаратах белка подтвердило успешную ренатурацию ВСД-KvAP. Однако, в отличие от спектров, наблюдаемых в ТФЭ, в спектрах ренатурированного селективно меченого белка присутствовало более 15-ти сигналов. Эти дополнительные сигналы не наблюдались в спектрах тотально меченого белка и, вероятно, соответствовали частично денатурированному состоянию ВСД-KvAP. Полученные результаты указывают на то, что часть молекул ВСД-KvAP в процессе ренатурации не перешла в нативную конформацию. Сравнение интенсивностей сигналов для двух форм ВСД-KvAP показало, что эффективность ренатурации составила ~ 70%.
Таким образом, была разработана успешная процедура ренатурации ВСД KvAP из осадка ТС. Применение ДФХ в процессе ренатурации позволило получить домен в мономерной растворимой форме со структурой, близкой к нативной, что было подтверждено методом ЯМР-спектроскопии.
Рис. 16. (А). 2D 1H,15N-HSQC ЯМР-спектр 15N-ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран E. coli в нативной конформации. Красными точками отмечены сигналы остатков аланина. (Б). 2D 1H,15N-HSQC ЯМР спектр 15N-Ala-ВСД-KvAP, ренатурированного из осадка, в присутствии мицелл ДФХ/ЛДАО. Отнесение сигналов в спектре 15N-Ala-ВСД-KvAP выполнено по аналогии со спектром тотально меченого домена.
Спектры получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С, pH 5,0.
ВЫВОДЫ Разработана эффективная система бесклеточной продукции внеклеточного 1.
домена нАХР человека 7 типа с выходом 0,6 мг с 1 мл трансляционной смеси.
Показано, что применение детергента додецилфосфохолина в процессе ренатурации домена из осадка трансляционной смеси способствует стабилизации домена в растворе и сохраняет его вторичную структуру. Показано, что ренатурированный внеклеточный домен нАХР обладает биологическими свойствами природного рецептора, а именно селективностью по отношению к нейротоксинам змей короткого и длинного типов.
Разработана эффективная система бесклеточной продукции бактериородопсина 2.
из Exiguobacterium sibiricum в растворимой форме. Показано, что использование липид-белковых нанодисков, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ, позволяет получить препараты БР-ES/ЛБН, содержащие бактериородопсин в функционально-активной форме с выходом до 0,4 мг с 1 мл трансляционной смеси.
Разработана эффективная система бесклеточной продукции вольт-сенсорного 3.
домена К+-канала KvAP в виде осадка трансляционной смеси. Показана возможность синтеза селективно-меченого препарата вольт-сенсорного домена.
Селективное включение изотопной метки подтверждено методами гетероядерной спектроскопии ЯМР.
Разработана эффективная система ренатурации вольт-сенсорного домена из 4.
осадка трансляционной смеси. Применение детергента додецилфосфохолина в процессе ренатурации позволило получить домен в мономерной растворимой форме со структурой, близкой к нативной, что было подтверждено методами ЯМР спектроскопии. Показано, что эффективность разработанного метода ренатурации составляет ~ 70%.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
Статьи:
1. Хабибуллина Н. Ф., Люкманова Е. Н., Копеина Г. С., Шенкарев З. О., Арсеньев А. С., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Разработка и оптимизация сопряженной бесклеточной системы синтеза трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ErbB3. Биоорганическая химия. 2010, 36(5), 654– 2. Люкманова Е. Н., Копеина Г. С., Шулепко М. А., Шенкарев З. О., Арсеньев А.
С., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Бесклеточная продукция внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора. Aсta Naturae. 2009, 1, 96-98.
Тезисы докладов:
3. Lyukmanova E.N., Kopeina G.S., Khabibullina N.F., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Mineev K.S., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P.
Cell-Free Production of Membrane Proteins for NMR Studies. Euromar and 17th ISMAR Conference. Florence, Italy. 2010, Сборник тезисов, с. 211.
4. Shulepko M.A., Lyukmanova E.N., Kopeina G.S., Shenkarev Z.O., Dolgikh D.A., Kasheverov I., Tsetlin V.I., Kirpichnikov M.P.. High level production of extracellular domain of nicotinic acetylcholine receptor in active pentameric form. J. Neurochem.
2009, 110(suppl.1): 81.
5. Копеина Г.С., Люкманова Е.Н., Шингарова Л.Н., Парамонов А.С., Шенкарев З.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение селективно меченого вольт-сенсорного домена потенциалозависимого ионного канала KvAP в бактериальной бесклеточной системе. Успехи современного естествознания. 2009, 12: 24.
6. Копеина Г.С., Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Бактериальная и бесклеточная продукция внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора.
Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии. Москва. 2009, Сборник тезисов, с. 247 – 249.
7. Kopeina G.S., Lyukmanova E.N., Shirokov V.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P.
Cell-free expression for production of eukaryotic proteins in a soluble form. 33rd FEBS Congress and 11th IUBMB Conference. Athens, Greece. FEBS J. 2008, (supp 1): 409.
8. Копеина Г.С., Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Продукция в бесклеточной системе внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора. XVI международный симпозиум «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Гурзуф, Украина. 2008, Сборник тезисов, с. 233-234.
9. Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О., Шулепко М.А., Копеина Г.С., Кашеверов И.Е., Крюкова Е.В., Лесовой Д.М., Бочаров Э.В., Косинский Ю., Цетлин В.И., Долгих Д.А., Арсеньев А.С., Кирпичников М.П. Нейротоксины яда змей и никотиновый ацетилхолиновый рецептор: исследование лиганд-рецепторных взаимодействий. XX Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии».
Москва. 2008, Сборник тезисов, с. 21.