Идентификация и характеристика новых днк-лигаз из гипертермофильных архей (
На правах рукописи
СМАГИН ВЛАДИМИР АНАТОЛЬЕВИЧ Идентификация и характеристика новых ДНК-лигаз из гипертермофильных архей (03.01.04 - биохимия)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА-2011
Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Учреждения Российской академии наук Центра «Биоинженерия» РАН
Научный консультант: доктор биологических наук Равин Николай Викторович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Турова Татьяна Павловна доктор химических наук Тишков Владимир Иванович
Ведущая организация:
Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Защита диссертации состоится «02» июня 2011 г. в 14 часов на заседании Совета Д 002.247.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.
Баха РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект 33, корп. 1.
Автореферат разослан «» апреля 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы ДНК-лигазы являются одними из ключевых ферментов метаболизма ДНК и принимают участие в процессах репликации, репарации и рекомбинации. Они присутствуют у эукариот, бактерий и архей, и могут быть разделены на два семейства в соответствии с используемыми кофакторами, - АТФ-зависимые ДНК-лигазы (EC 6.5.1.1) и НАД – зависимые лигазы (ЕС 6.5.1.2). ДНК лигазы катализируют присоединение 5’-P донорного конца к 3’-OH акцепторному концу в результате трех последовательных реакций переноса. АТФ-зависимые ДНК-лигазы найдены в бактериофагах, археях, эукариотах и эукариотических вирусах, в то время как НАД+ -зависимые ДНК-лигазы встречаются в основном у бактерий. Все известные в настоящее время эукариотические и архейные ДНК лигазы, а также лигазы из бактериофагов и вирусов, являются АТФ зависимыми и содержат специфические мотивы в их аминокислотных последовательностях.
Археи являются одноклеточными организмами, обитающими, как правило, в экстремальных условиях окружающей среды, характеризующихся высокой или низкой температурой, экстремальными значениями рН и т.п. Одной из важнейших эволюционно древних групп архей являются термофилы. Основные пути метаболизма у архей и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации, включая ДНК-лигазы, более близок к эукариотическому. Таким образом, ДНК лигазы архей, в особенности гипертермофильных, представляют собой модель для изучения ДНК-лигаз эукариот, в частности, в качестве объектов структурных исследований.
ДНК-лигазы архей могут использовать в качестве кофактора АТФ, но, в отличие от ДНК-лигаз эукариот, некоторые лигазы гипертермофильных архей могут также использовать и НАД+. Эти данные позволяют предположить, что некоторые архейные ДНК-лигазы могут представлять неспециализированные предковые ферменты, являющиеся эволюционными предшественниками специализированных ДНК-лигаз бактерий и эукариот. Таким образом, ДНК-лигазы термофильных архей, являющихся эволюционно-древними организмами, представляют собой интересную модель для изучения фундаментальных проблем эволюции семейства ДНК-лигаз.
Наконец, важной особенностью ДНК лигаз термофильных архей является устойчивость этих ферментов к высоким температурам, открывающая, как и случае термостабильных ДНК-полимераз, перспективы их практического применения в молекулярной диагностике и генетической инженерии.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является выделение и характеристика новых ДНК-лигаз из двух эволюционно удаленных друг от друга гипертермофильных архей, - эуриархеи штамма 1519 и кренархеи штамма Acidilobus aceticus 1904.
Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Молекулярная идентификация и определение филогенетического положения штамма термофильных архей 1519.
2. Выделение и секвенирование генов ДНК-лигазы LigTh1519 из штамма 1519 и ДНК-лигазы LigAc1904 из Acidilobus aceticus 1904.
3. Создание штаммов Escherichia coli – продуцентов рекомбинантных ДНК-лигаз LigTh1519 и LigAc1904, выделение и очистка ферментов.
4. Проведение биохимической характеристики рекомбинантных ДНК лигаз, включающей определение зависимости активности от температуры и значения рН, концентрации солей, термостабильности, определение используемых нуклеотидных кофакторов.
Научная новизна и практическая значимость работы Идентифицированы и охарактеризованы две новые ДНК-лигазы гипертермофильных архей, - кренархеи Acidilobus aceticus и эуриархеи Thermococcus sp 1519. Созданы системы экспрессии этих лигаз в клетках E. coli, позволяющие получать рекомбинантные ферменты для функциональной характеристики и структурных исследований.
Установлено, что обе ДНК-лигазы являются АТФ-зависимыми и, в отличие от всех ранее охарактеризованных ДНК-лигаз архей рода Thermococcus, не способны использовать в качестве «энергетического» кофактора НАД+.
Практическая значимость работы обусловлены перспективами применения термостабильных ДНК-лигаз для молекулярно-биологических исследований в самых различных областях деятельности, от медицины до криминалистики. Так, наряду с ПЦР, для детекции и амплификации специфических последовательностей ДНК, в том числе полиморфизмов ДНК, используется метод лигазной цепной реакции (ЛЦР). Этот метод известен уже давно и активно применяется в диагностической практике, например в США, в России он практически не используется, в значительной степени из-за отсутствия термостабильных ДНК-лигаз на Российском рынке. Новая ДНК-лигаза LigAc1904 является перспективной для использования в ЛЦР. Другой областью использования термостабильных лигаз является их использование для «сборки» синтетических генов из олигонуклеотидов проводимой при повышенной температуре для снижения вероятности образования неспецифических продуктов лигирования. Для этого может быть использована ДНК-лигаза LigTh1519.
Апробация работы Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), международной конференции “Thermophiles-2007” (Берген, Норвегия, 2007), Международной конференции BioMicroWorld (Севилья, Испания, 2007).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Получено 2 патента РФ на изобретения.
Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста и включают 46 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов: “Введение”, “Цель и задачи работы”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты”, “Обсуждение”, “Выводы”, “Cписок публикаций по теме диссертации”, “Cписок цитируемой литературы”, который содержит 3 отечественных и 140 иностранных источника.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи штамма Определение филогенетического положения штамма Штамм архей 1519 был выделен В.А. Светличным из проб с гидротермального поля Гуаймас в Атлантическом океане, отобранных В.Ф. Гальченко в ходе рейса №12 НИС «Академик М. Келдыш» (1986 г.).
Оптимальная температура роста 85оС, оптимальный рН среды 6.2-6.4.
Идентификацию микроорганизма проводили молекулярными методами, по последовательности генов 16S рибосомной РНК. Для этого ген 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием универсальных праймеров 8F и 1491R, и секвенировали полученный фрагмент. Сравнение последовательности гена 16S рРНК штамма 1519 с представленными в GenBank последовательностями показало, что штамм 1519 относится к отделу Euryarchaeota, классу Thermococci, порядку Thermococcales, семейству Thermococcaceae и роду Thermococcus, в котором наиболее близкородственными ему организмами являются Thermococcus gammatolerance и Thermococcus kodakaraensis с 99% уровнем сходства последовательностей генов 16S рРНК.
Клонирование и экспрессия гена ligTh Анализ представленных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов ДНК-лигаз архей семейства Thermococcaceae, выявил несколько консервативных участков, два из которых были использованы для создания пары специфических праймеров. С их помощью на суммарной ДНК Thermococcus sp. 1519 был амплифицирован фрагмент длиной около 600 п.н., последовательность которого имела высокую гомологию с генами АТФ-зависимых ДНК-лигаз архей. Полная последовательность гена ДНК-лигазы ligTh1519 была определена методом «инверсного» ПЦР.
Анализ последовательности предсказанного продукта гена ligTh показал, что LigTh1519 состоит из 559 аминокислот и имеет высокую степень гомологии с другими АТФ-зависимыми ДНК-лигазами архей, в том числе с лигазой Thermococcus kodakaraensis (91%), Thermococcus fumicolans (89%), Pyrococcus abyssi (82%). Сравнение последовательности LigTh1519 с базой данных консервативных доменов CDD выявило трехдоменную организацию этой ДНК-лигазы, - N-концевой ДНК связывающий домен (Pfam04675), нуклеотидил-трансферазный домен (Pfam01068) и C-концевой ОВ-fold домен (Pfam04679).
Ген ligTh1519 клонировали в экспрессионном векторе pQE (Qiagen), таким образом, что синтезируемый рекомбинантный белок LigTh1519 дополнительно содержал на N-конце шесть аминокислотных остатков гистидина. Экспрессию LigTh1519 проводили в штамме E. coli DLT1270, дополнительно содержащем плазмиду pRARE-2 (Novagen), обеспечивающую синтез тРНК для кодонов, редко используемых E. coli.
Рекомбинантный белок LigTh1519 очищали с помощью металл-афинной хромотографии (Рис. 1).
Рисунок 1. Экспрессия 1 2 3 45 LigTh1519 в E.coli и очистка 120 белка. Приведены результаты SDS-PAGE анализа белковых препаратов:
86 Дор. 1 и 4, - маркеры мол. веса, размеры указаны в кД, LigTh1519 2, - белковый препарат из клеток штамма DLT1270/pRARE, содержащего pQE30- LigTh1519, до индукции синтеза LigTh1519, 3, - то же, что на дор. 2, но через 3 часа после индукции синтеза 34 LigTh1519 внесением в среду 1мМ ИПТГ, 5, - очищенный препарат LigTh Для определения функциональных свойств лигазы LigTh1519 был использован метод, основанный на определении способности исследуемого белка лигировать когезивные концы ДНК фага. Эти концы имеют длину 12 нт и образуют стабильный дуплекс при нормальной температуре реакции (45-50С). ДНК фага лямбда обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BstEII и инкубировали с LigTh1519. Если тестируемый фермент обладает лигазной активностью, то из двух концевых BstEII - фрагментов длиной 8453 нт. и 5678 нт., образуется фрагмент длиной 14131 нт., что легко можно детектировать с помощью электрофореза в агарозном геле. Представленные на Рис. 2 результаты показывают, что рекомбинантный белок LigTh1519 действительно проявляет активность АТФ-зависимой ДНК-лигазы. Отметим, что лигирование остальных (не концевых) рестрикционных фрагментов не наблюдалось ни в описанном эксперименте с BstEII, ни в случае обработки ДНК фага рестриктазой HindIII, образующей липкие концы длиной 4 нт.
Рисунок 2. Анализ способности LigTh1519 лигировать фрагменты, образованные при обработке ДНК фага эндонуклеазой BstEII.
1 - маркер молекулярной массы ДНК (длины фрагментов указаны в т.п.н.);
2 - ДНК фага после обработки рестриктазой BstEII;
3 - Препарат BstEII-фрагментов ДНК фага после инкубации с лигазой LigTh1519 в буфере, содержащем 1мМ АТФ.
4 - тоже, что на дорожке 3, но без добавления АТФ в буфер для лигирования.
Перед нанесением на электрофорез препараты ДНК были прогреты в течение мин. при 70С. Справа стрелками показаны концевые BstEII-фрагменты A ( п.н.) и B (8453 п.н), а также продукт их лигирования, С (14131 п.н.).
Влияние температуры, рН и концентрации солей на активность ДНК лигазы LigTh Полуколичественное определение лигазной активности LigTh проводили, измеряя эффективность «зашивания» однонитевого разрыва в двунитевом фрагменте ДНК. В качестве субстрата использовали ДНК дуплекс, образованный в результате отжига трех синтетических олигонуклеотидов, - LA30, LA40 и LA80 (Рис. 3). В олигонуклеотид LA- вводили радиоактивную метку на 5’-конце. В результате «зашивания» однонитевого разрыва ДНК-лигазой радиоактивно-меченый праймер LA соединялся с LA40, что приводило к образованию радиоактивно меченного олигонуклеотида LA70 длиною 70 нт. Определяли зависимость активности LigTh1519 от рН буфера, концентраций NaCl и MgCl2, а также температуры.
Рисунок 3. Структура синтетического субстрата, использованного для определения эффективности лигирования однонитевого разрыва. Положение 32Р – радиоактивной метки, введенной на 5’- конец олигонуклеотида LA30, указано звездочкой.
Лигаза LigTh1519 активна в широком диапазоне концентраций NaCl, от 0 до 200мМ. Оптимум достигается при довольно высоких концентрациях и находится в районе 75-100 мМ NaCl (Рис. 4). Высокие концентрации NaCl, 500мМ и более, полностью ингибируют активность фермента. Представленные на Рис. 4 результаты показывают, что LigTh1519 активен в широком диапазоне значений рН (7,0-10,7), с оптимумом реакции при рН ~ 10.0. Активность фермента резко падает при рН ниже 7.0. В этом отношении LigTh1519 отличается от ДНК-лигазы Thermococcus fumicolans, проявляющей активность в узком диапазоне значений pH (6.5 -7.0).
Рисунок 4. Зависимость активности лигазы LigTh1519 от концентрации NaCl (левая панель) и рН (правая панель).
А – Результаты электрофоретического анализа продуктов лигирования в полиакриламидном геле (показана радиоавтография геля). Верхняя полоса (LA70*) соответствует продукту лигирования, нижняя (LA30*) – одному из субстратов.
Б – диаграмма, показывающая относительную эффективность лигирования (соотношение интенсивностей полос продукт/субстрат).
Мы установили, что для лигазной активности LigTh1519 необходимо наличие в среде двухвалентного катиона (Mg+), причем фермент активен в широком диапазоне концентраций MgCl2 (2-80 мМ), с оптимумом при довольно высокой концентрации, в районе 50 мМ (Рис. 5). Интересно, что столь высокие концентрации двухвалентного металла не оказывают ингибирующего действия на фермент, в отличие от лигазы T. fumicolans, активность которой максимальна при 2 мМ MgCl2 и резко снижается при концентрации выше 5 мМ.
ДНК лигаза LigTh1519 проявляет активность в широком диапазоне температур. Хотя оптимальная температура реакции составляет 70С (Рис.
5), фермент активен при температурах от 50 до 75С, а, возможно, и выше, поскольку при температурах выше 70С денатурация субстрата не позволяет проводить определение активности фермента.
Термостабильность LigTh1519 оценивали, инкубируя фермент в реакционном буфере (без АТФ) при 80С или 94С, затем определяли активность фермента стандартный методом.
Рисунок 5. Зависимость активности лигазы LigTh1519 от концентрации MgCl (слева) и температуры реакции (справа).
Мы установили, что фермент теряет около половины своей активности в течение 20 минут при 80С (Рис. 6) и 5 минут при 94С. Так как температура роста Thermococcus sp. 1519 составляет 85оС, то возникает вопрос о том, что может служить причиной низкой термостабильности.
Одной из возможных причин может быть наличие в составе рекомбинантного белка использованного для очистки N-концевого 6 гистидинового тага и нескольких дополнительных аминокислот, являющихся следствием клонирования. Мы решили проверить это предположение, протестировав термостабильность рекомбинантного белка без гистидинового тага. Для этого ген ligTh1519 был клонирован в экспрессионном векторе рQE60, обеспечивающем продукцию «природного» белка без дополнительных последовательностей.
Рекомбинантный вектор вводили в штамм E. coli DLT1270/pRARE. После индукции экспрессии ДНК-лигазы был приготовлен препарат клеточного экстракта, содержащий немодифицированный LigTh1519. Для частичной очистки препарата от термолабильных белков и инактивации ДНК-лигазы E. coli, клеточный экстракт препарат был прогрет в течении 20 мин при 70оС и для определения термостабильности лигазы. Хотя полученные результаты (Рис. 6) показали более высокую термостабильность (время полуинактивации при 80оС составило 30-35 минут), фермент по-прежнему быстро инактивировался при температуре, нормальной для роста микроорганизма. Возможными причинами могут быть различия фолдинга белка в E. coli и археях Thermococcus и/или наличие в клетках Thermococcus дополнительно стабилизирующих белок факторов.
Рисунок 6. Термостабильность лигазы LigTh1519 при 80. В реакциях использовали рекомбинантный белок с 6-гистидиновым тагом (слева) и белок, не содержащий N-концевого 6-гистидинового тага (справа).
Определение специфичности ДНК-лигазы LigTh1519 в отношении кофактора Известно, что некоторые ДНК-лигазы архей, в частности, представителей рода Thermococcus, могут наряду с АТФ использовать в качестве «энергетического» кофактора и НАД+, что может быть обусловлено особенностями эволюции ДНК-лигаз архей. Поэтому мы протестировали возможность использования этого кофактора ДНК-лигазой LigTh1519. Поскольку выделенный из E. coli фермент, вследствие наличия в препарате предаденилированной фракции, проявлял активность и в отсутствии добавленного в реакцию АТФ, первой задачей было получение препарата без предаденилированной фракции, активность которого строго зависела бы от внесения кофактора в реакцию. Это является необходимым условием для исследования использования НАД+ в качестве кофактора, так как эффективность его использования лигазой LigTh1519 может быть гораздо ниже, чем в случае с АТФ.
Фермент предварительно инкубировали в стандартных реакционных условиях с немеченым субстратом без добавления нуклеотидного кофактора, для того, чтобы преаденилированная фракция лигазы израсходовала АМФ, ковалентно связанный в активном центре. Затем в реакцию вносили радиоактивно-меченый субстрат и кофактор в различных концентрациях. Из данных, представленных на Рис. 7 видно, что этот подход позволил существенно снизить «фоновую» лигазную активность препарата в отсутствии добавленного кофактора, что повысило чувствительность метода. Отметим, что в этом эксперименте было также установлено, что лигаза LigTh1519 активна в широком диапазоне концентраций АТФ, от 0.1 до 100 µМ, а более высокая концентрация АТФ (1 мМ) оказывает ингибирующий эффект.
Рисунок 7. Удаление преданилированной фракции в препарате лигазы LigTh1519.
Дорожка 1- контроль без фермента;
дор. 2-1000 µМ АТФ без фермента;
дор. 3 - LigTh1519 без кофактора;
дор. 4- 7 - LigTh1519, различные концентрации АТФ (дор. 4-1000 µМ, дор. 5 -100 µМ, дор. 6 - 10 µМ, дор. -1 µМ АТФ).
В следующем эксперименте с помощью описанного выше метода мы тестировали способность лигазы LigTh1519 использовать НАД+ в качестве кофактора. Для этого во вторую реакцию, проводимую после выработки предаденилированной фракции фермента, вместо АТФ вносили НАД+ в различных концентрациях. В результате этого эксперимента (Рис. 8) в присутствии НАД+ не было выявлено достоверного лигирования (образования продукта LA70*) в сравнении с контролем без добавления кофактора. Сравнивая полученные результаты с данными контрольного лигирования в присутствии АТФ, можно сделать вывод, что если НАД+ и используется в качестве кофактора, то с эффективностью не менее чем на порядок ниже, чем АТФ.
Рисунок 8. Тестирование способности LigTh1519 использовать в качестве кофактора НАД+.
Дорожка 1- контроль без фермента, с 1000 µМ НАД+, дор. 2- LigTh без кофактора;
дор. 3- 6 - LigTh1519, различные концентрации НАД+ (дор. 3-1000 µМ, дор. 4 -100 µМ, дор.
5 - 10 µМ, дор. 6 -1 µМ НАД+), дор - LigTh1519 с 10 µМ ATФ.
На дорожках 8 и 9 представлен результат лигирования того же субстрата с использованием НАД+ зависимой ДНК-лигазы T. aquaticus (дор. 8 – 1 ед. Taq-лигазы без НАД+, дор. 9 – 1 ед. Taq-лигазы с 1000 µМ НАД+).
Выделение и характеристика ДНК-лигазы из гипертермофильной археи рода Acidilobus Определение и анализ последовательности гена ligAc Штамм 1904 относится к отделу Crenarchaeota, классу Thermoprotei, порядку Acidilobales, семейству Acidilobaceae, роду Acidilobus и был описан как представитель вида Acidilobus aceticus (Prokofeva et al., 2000).
Анализ представленных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов ДНК-лигаз архей порядка Desulfurococcales выявил несколько консервативных участков, два из которых были использованы для создания пары «консервативных» праймеров. С помощью этих праймеров на суммарной ДНК Acidilobus sp 1904 был амплифицирован фрагмент длиной около 250 п.н., последовательность которого имела высокую гомологию с генами АТФ-зависимых ДНК-лигаз архей. Полная последовательность гена ДНК-лигазы ligTh1519 была определена методом «инверсного» ПЦР.
Предсказанная длина лигазы LigAc1904 составила аминокислотных остатков, молекулярная масса - 67,6 кДа. LigAc имеет гомологию с другими АТФ-зависимыми ДНК-лигазами архей, в том числе с лигазами Staphylothermus marinus (63%), Aeropyrum pernix (62%) и Hyperthermus butylicus (62%). Как и LigTh1519, лигаза LigAc1904 содержит три домена, - N-концевой ДНК-связывающий домен, нуклеотидил трансферазный домен и C-концевой ОВ-fold домен.
Клонирование гена ligAc1904, экспрессия и очистка рекомбинантного белка На следующем этапе ген ligAc1904 клонировали в экспрессионном векторе pQE30 (Qiagen), в результате чего был получен рекомбинантный экспрессионный вектор pQE30-LigAc1904.
Экспрессию LigAc1904 проводили в штамме E. coli DLT1270, дополнительно содержащем плазмиду pRARE-2 (Novagen). Этот штамм, содержащий рекомбинантную плазмиду pQE30-LigAc1904, выращивали на шейкере при 37С до достижения OD600 ~ 0.5, затем индуцировали синтез рекомбинантного белка внесением ИПТГ до 1мМ. Выделение и очистку лигазы LigAc1904 осуществляли методом металл-афинной хроматографии, в результате был получен препарат рекомбинантного белка LigAc (Рис. 9).
Рисунок 9. Экспрессия LigAc1904 в E.coli и очистка белка.
Приведены результаты SDS-PAGE анализа белковых препаратов:
1 и 4, - маркеры молекулярного веса, размеры указаны в кД, 2, - суммарный белковый препарат, выделенный из клеток штамма DLT1270/ pRARE, содержащего плазмиду pQE30 LigAc1904, до индукции синтеза LigAc1904, 3, - то же, что на дорожке 2, но через 3 часа после индукции синтеза LigAc1904, 5, - очищенный препарат LigAc1904.
Лигирование когезивных концов ДНК фага лигазой LigAc1904.
Для определения функциональных свойств лигазы LigAc1904 на первом этапе мы использовали метод, основанный на определении способности исследуемого белка лигировать когезивные концы ДНК фага. ДНК фага лямбда обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BstEII и инкубировали с LigAc1904. Представленные на Рис. 10 результаты показывают, что рекомбинантный белок LigAc1904 действительно проявляет активность АТФ-зависимой ДНК-лигазы. Высокая эффективность лигирования наблюдалась как в присутствии, так и в отсутствии вносимого в реакцию АТФ (Рис. 10, дор. 3), что свидетельствует о наличии значительной фракции предаденилированного фермента в препарате. Также установлено, что высокие концентрации АТФ (1мМ, дор. 4) ингибируют лигазную активность. Как и в случае LigTh1519, лигирование остальных (не концевых) рестрикционных фрагментов не наблюдалось ни в описанном эксперименте с BstEII, ни в случае обработки ДНК фага рестриктазой HindIII, образующей липкие концы длиной 4 нт.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рисунок 10. Анализ способности LigAc1904 лигировать фрагменты, образованные при обработке ДНК фага эндонуклеазой BstEII.
1 - маркер молекулярной массы ДНК (длины фрагментов указаны в т.п.н.);
2 - ДНК фага после обработки BstEII;
3 - BstEII после инкубации с лигазой LigAc1904 (без кофактора);
дор. 4- 9, - BstEII после инкубации с лигазой LigAc1904, различные концентрации АТФ (дор. 4-1000 µМ, дор. 5 -100 µМ, дор. 6 - 10 µМ, дор. 7 -1 µМ, дор. 8 – 0.1 µМ, дор. 9 – 0.01 µМ АТФ).
дор. 10, - BstEII после лигирования Т4 ДНК-лигазой (без АТФ) дор. 11, - BstEII после лигирования Т4 ДНК-лигазой (0.1 мМ АТФ) Перед нанесением на электрофорез препараты ДНК были прогреты в течение мин. при 70С. Справа стрелками показаны концевые BstEII-фрагменты A ( п.н.) и B (8453 п.н), а также продукт их лигирования, С (14131 п.н.).
Влияние температуры, рН, концентрации солей на активность ДНК лигазы LigAc Полуколичественное определение лигазной активности LigAc проводили на полученном в результате отжига трех олигонуклеотидов фрагменте ДНК, содержащим однонитевой разрыв в одной из цепей (Рис.
3). Определяли зависимость активности LigTh1519 от рН буфера, концентраций АТФ, NaCl и MgCl2, а также температуры.
Представленные на Рис. 11 результаты показывают, что лигаза LigAc1904 активна при низких концентрациях NaCl с оптимумом активности при 25мМ, при увеличении концентрации NaCl наблюдался ингибирующий эффект. Оптимум для LigTh1519 достигался при более высоких концентрациях и находится в районе 75-100 мМ NaCl, а слабое ингибирующее действие NaCl проявлялась только при концентрациях выше 200мМ. Более высокий оптимум концентрации NaCl и меньшая чувствительность LigTh1519 к высоким концентрациям натрия, по сравнению с LigAc1904 может объясняться особенностями местообитаний этих микроорганизмов. Так, Acidilobus 1904 был выделен из пресного горячего источника, а Thermococcus sp. 1519 – из глубоководной морской гидротермы. Вероятно, внутриклеточные концентрации ионов натрия у этих архей коррелируют с внеклеточными.
Штамм Acidilobus 1904 является умеренным ацидофилом с оптимумом роста при значении рН среды 3,8. В отличие от экстремальных ацидофилов эта архея, видимо, поддерживает нейтральный внутриклеточный рН, что соответствует данным о том, что LigAc проявляет активность в диапазоне рН 6,6-8,2 (оптимум 6.8), а при значении рН ниже 6,6 активность резко падает до нуля (Рис. 11).
NaCl pH Рисунок 11. Зависимость активности лигазы LigAc1904 от концентрации NaCl (левая панель) и рН реакционного буфера (правая панель).
Мы установили, что для лигазной активности LigAc1904 необходимо наличие в среде двухвалентного катиона Mg2+, причем фермент активен в диапазоне концентраций MgCl2 от 5 до 25 мМ (Рис. 12). ДНК лигаза LigAc1904 проявляла активность в широком диапазоне температур. Хотя оптимальная температура реакции составляла 65-70С (Рис. 13), фермент активен при температурах от 50 до 70С, а, возможно, и выше, поскольку при температурах выше 70С денатурация субстрата не позволяет проводить определение активности фермента.
Рисунок 12.
Зависимость активности лигазы LigAc от концентрации MgCl Термостабильность LigAc1904 оценивали, инкубируя фермент в реакционном буфере (без АТФ) при 94С, затем активность фермента определяли в стандартной реакции при 70С. Мы установили, что фермент терял половину своей активности в результате инкубации в течение мин. при 94С (Рис. 13). При температуре 80С снижение активности фермента не наблюдалось по крайней мере в течение 1 часа. Таким образом, в отличие от ДНК-лигазы LigTh1519, параметры термостабильности LigAc1904 соответствуют оптимальной температуре роста Acidilobus aceticus, составляющей 85С.
Рисунок 13. Зависимость активности лигазы LigAc1904 от температуры и (левая панель) и термостабильность фермента при 94С (правая панель).
Определение специфичности ДНК-лигазы LigAc1904 в отношении кофактора В следующем эксперименте была протестирована возможность использования в качестве альтернативного нуклеотидного кофактора НАД+. Как и в случае с ДНК лигазой LigTh1519, для уменьшения уровня лигирования без добавления кофактора, фермент был предварительно проинкубирован в стандартных реакционных условиях без добавления нуклеотидного кофактора с немеченым субстратом, для того, чтобы преаденилированная фракция лигазы израсходовала АМФ, ковалентно связанный в активном центре. Затем в реакцию добавлялся радиоактивно меченный субстрат и кофактор в различных концентрациях. В результате этого эксперимента (Рис. 14) не было выявлено лигазной активности фермента (образования продукта LA70*) при использовании НАД+ (дор 3 6) в сравнении с контролем без добавления кофактора (дор. 2). Сравнивая полученные результаты с данными контрольного лигирования в присутствии АТФ (дор. 7), можно сделать вывод, что если НАД+ и используется в качестве кофактора, то с существенно более низкой эффективностью, чем АТФ.
1 2 3 4 5 6 7 8 Рисунок 14. Тестирование способности LigAc1904 использовать в качестве кофактора НАД+.
Дорожка 1- контроль без фермента, дор. 2- LigTh1519 без кофактора;
дор. 3- 6 LigAc1904, различные концентрации НАД+ (дор. 3-1000 µМ, дор. 4 -100 µМ, дор. 5 - 10 µМ, дор. 6 -1 µМ НАД+), дор 7 - LigAc1904 с 100 µМ ATФ.
На дорожках 8 и 9 представлен результат лигирования того же субстрата в течение 3 ч. при 45 С с использованием НАД+ зависимой ДНК-лигазы T.
aquaticus (дор. 8 –Taq-лигаза без НАД+, дор. 9 – Taq-лигаза с 1000 µМ НАД+).
Потенциальные области практического применения ДНК-лигаз LigTh1519 и LigAc Одной из основных областей практического применения термостабильных ДНК-лигаз является амплификация ДНК в лигазной цепной реакции, ЛЦР. Проведение ЛЦР требует высокой термостабильности фермента при температурах денатурации ДНК (90 94С), что позволяет использовать для этих целей ДНК-лигазу LigAc1904, но делает проблематичным применение LigTh1519. Однако, LigTh обладает другим полезным свойством, - он обеспечивает лигирование лишь фрагментов ДНК, имеющих протяженные (12-нт в случае BstEII фрагментов фага ), но не короткие (4-нт концы HindIII фрагментов фага ) липкие концы. Поэтому, одним из перспективных применений нового фермента может быть «сборка» синтетических генов из олигонуклеотидов.
Проведение реакции лигирования при повышенной температуре (60-70С) должно повысить эффективность «сборки» фрагмента ДНК из олигонуклеотидов за счет снижения вероятности образования неспецифических продуктов лигирования в результате отжига случайным образом слипшихся коротких комплиментарных участков олигонуклеотидов, использованных для синтеза гена. Термостабильность LigTh1519 и ее способность лигировать лишь протяженные липкие должны снизить вероятность образования неспецифических продуктов при «сборке» генов с ее применением.
Зависимость от кофактора и эволюция ДНК-лигаз Особенностью некоторых ДНК-лигаз эуриархей, представляющих порядок Thermococcales, является возможность использования наряду с АТФ в качестве нуклеотидного кофактора НАД+. Способностью использовать НАД+ обладают все три ранее охарактеризованные ДНК лигазы представителей рода Thermococcus (T. kodakaraensis, T. fumicolans и T. onnurineus), а также ДНК-лигаза из близкородственной им археи Pyrococcus abyssi. Мы также исследовали возможность использования LigTh1519 и LigAc1904 в качестве кофактора НАД+. Однако, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что если эти ферменты и используют НАД+ в качестве кофактора, то, как минимум, на порядок менее эффективно, чем АТФ.
АТФ- и НАД+ - зависимые ДНК-лигазы обладают низкой гомологией аминокислотных последовательностей, но имеют общее каталитическое ядро. На основании этого было выдвинуто предположение, что АТФ зависимые лигазы архей и эукариот, и НАД+ - зависимые ДНК-лигазы бактерий могли эволюционировать от общего «универсального» предкового фермента посредствам приобретения структурных элементов белка, взаимодействующих либо с -фосфатом АТФ, либо с никотинамидрибонуклеозидом НАД+ (Keppetipola and Shuman, 2005).
Наиболее близкими к «универсальным» ферментам могут быть лигазы с двойной кофакторной специфичностью (АТФ/НАД+). Все ранее охарактеризованные ДНК-лигазы эуриархей рода Thermococcus являлись такими «АТФ/НАД+» ферментами, что позволяло рассматривать их как предка бактериальных НАД+ - зависимых ДНК-лигаз (Sun et al., 2008). Мы показали, что ДНК-лигаза Thermococcus sp. 1519 не использует НАД+, т.е.
способность использовать этот кофактор не является общим свойством ДНК-лигаз архей рода Thermococcus. Анализ построенного нами филогенетического дерева ДНК-лигаз архей (Рис. 15) показывает, что (АТФ/НАД+) лигазы с двойной кофакторной специфичностью встречающиеся в двух линиях эуриархей, - Thermoplasmatales и Thermococcales, не образуют отдельных филогенетических ветвей, соответствующих использованию или не использованию НАД+, а встречаются в различных группах, включающих как «только АТФ», так и «АТФ/НАД+» лигазы. Такое распределение предполагает либо неоднократное независимое возникновение способности использовать НАД+ в разных линиях эуриархей, либо наличие такой способности у их общего предка, которая была потеряна в ходе эволюции ДНК-лигаз архей по направлению к специализированным АТФ-зависимым ферментам, и сохранилась лишь у отдельных организмов. В пользу второго объяснения свидетельствуют также данные о том, что потеря способности использовать НАД+ наряду с АТФ может быть следствием даже единичных мутаций (Ferrer et al., 2008), а также то, что Thermococcales являются одной из “базовых” ветвей эуриархей, наиболее близких к общему предку крен- и эуриархей (Brochier-Armanet et al. 2008).
Thermococcus sp AM 0. 98 Thermococcus gammatolerans 66 Thermococcus sp 100 Thermococcus kodakaraensis Thermo Thermococcus onnurineus 62 coccales 66 Thermococcus fumicolans 97 Thermococcus sibiricus Thermococcus barophilis Pyrococcus furiosus 34 Pyrococcus horikoshii эуриархеи Pyrococcus abyssi Arachaeoglobus fulgidus Methanosarcina barkeri Methanosarcina mazei 60 Methanosarcina acetivorans Methanopyrus kandleri 100 Methanosphaera stadtmanae Methanothermobacter thermautotrophic 47 Methanococcus maripaludis Methanocaldococcus jannaschii Methanospirillum hungatei 100 Haloarcula marismortui Natromonas pharaonis 100 Ferroplasma acidarmanus 99 Thermo Ferroplasma acidiphilum 100 plasmatales Picrophilus torridus Thermoplasma acidophilum 63 Desulfurococcus kamchatkensis 50 Aeropyrum pernix кренархеи Acidilobus sp 73 Sulfolobus tokodaii Sulfolobus acidocaldarius Acidianus ambivalens 100 Sulfolobus shibatae Sulfolobus solfataricus Рисунок 15. Филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей ДНК-лигаз архей построено методом присоединения соседей с использованием пакета программ TREECON. В качестве внешней группы использована ДНК лигаза крысы. Названия архей порядков Thermococcales и Thermoplasmatales, ДНК-лигазы которых способны использовать как АТФ, так и НАД+, выделены серым;
способных использовать АТФ, но не НАД+, - отмечены рамкой.
ВЫВОДЫ 1. Проведена молекулярная идентификация штамма 1519 термофильных архей, в результате которой показана его принадлежность к роду Thermococcus.
2. Клонированы и секвенированы гены ДНК-лигазы LigTh1519 из штамма 1519 и ДНК-лигазы LigAc1904 из Acidilobus aceticus 1904.
3. Созданы штаммы Escherichia coli – продуценты рекомбинантных ДНК лигаз LigTh1519 и LigAc1904, выделены и очищены препараты ферментов.
4. Установлено, что рекомбинантная ДНК-лигаза LigTh1519 может осуществлять АТФ-зависимое лигирование однонитевых разрывов в ДНК. Оптимальные условия лигазной реакции достигались при концентрации NaCl - 75 мМ, MgCl2 - 50 мM, АТФ в диапазоне 10- мкМ, pH в диапазоне 7.0-10.0 и температуре 70С. Лигаза теряет около половины своей активности за 5 минут при 94С.
5. Установлено, что рекомбинантная ДНК-лигаза LigAc1904 может осуществлять АТФ-зависимое лигирование однонитевых разрывов в ДНК. Оптимальные условия лигазной реакции достигались при концентрации NaCl - 25 мМ, MgCl2 - 10 мM, АТФ в диапазоне 1 100мкМ, pH в диапазоне 6.8-7.0 и температуре 65С. Лигаза теряет около половины своей активности за 30 минут при 94С.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2008) Выделение и характеристика новой термостабильной ДНК-лигазы из архей рода Themococcus. Прикладная биохимия и микробиология, т.45, №5, с. 523-528.
2. Bezsudnova E.Y., Kovalchuk M.V., Mardanov A.V., Poliakov K.M., Popov V.O., Ravin N.V., Skryabin K.G., Smagin V.A., Stekhanova T.N., Tikhonova T.V. (2009) Overexpression, purification and crystallization of a thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus sp. 1519. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65(Pt 4), 368-371.
3. Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2010) Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Thermococcus, способ ее получения и нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая эту ДНК-лигазу. Патент РФ № 2405823 от 10.12.2010г.
4. Смагин В.А., Марданов А.В., Прокофьева М.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2011) Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Acidilobus. Патент РФ № 2413767 от 10.03.2011г.
5. Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2007) Новая термостабильная ДНК-лигаза из гипертермофильной археи рода Themococcus. Тезисы Международного конгресса «Биотехнология:
состояние и перспективы развития», Москва.
6. Ravin N.V., Smagin V.A., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovkaya E.A.
(2007) Molecular cloning and characterization of thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus. Abstracts of the International conference “Thermophiles-2007”, Bergen, Norway.
7. Mardanov A.V., Smagin V.A., E.A. Bonch-Osmolovskaya, N.V. Ravin (2007) Isolation of new thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus. Abstracts of the II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld2007), Seville, Spain.