авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков е1 и е2 вируса гепатита с

На правах рукописи

Фарафонова Татьяна Евгеньевна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫСОКОКОНСЕРВАТИВНЫХ ФРАГМЕНТОВ ОБОЛОЧЕЧНЫХ БЕЛКОВ Е1 И Е2 ВИРУСА ГЕПАТИТА С 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Колесанова Екатерина Федоровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Шумянцева Виктория Васильевна кандидат биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН

Защита диссертации состоится «28» июня 2007 года в 12:30 часов на заседании Диссертационного совета Д.001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

Автореферат разослан « » мая 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Вирус гепатита С (ВГС) является основной причиной парентерального (трансфузионного) гепатита, ранее называвшегося гепатитом ни А ни В. У большинства инфицированных (80%) гепатит С протекает в хронической форме и может вызывать цирроз и первичный рак печени. В настоящее время вакцина, предотвращающая заражение вирусом гепатита С, не разработана, а лечение интерфероном (в комбинации с рибавирином или без него) эффективно только лишь для ~40% больных хроническим гепатитом С и имеет в большинстве случаев серьезные побочные эффекты [Bartenschlager et al., 2000].

Оболочечные белки ВГС играют важную роль на ранних стадиях жизненного цикла вируса. Эти белки отвечают за взаимодействие с рецепторами и участвуют в процессах слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны, сборки вирусной частицы в клетке и высвобождения из клетки.

Несмотря на накопленные сведения о свойствах и функциях оболочечных белков и возможных рецепторах для ВГС, механизмы связывания вируса с поверхностью клетки, проникновения вирусной частицы в клетку-хозяина, а также сборки и высвобождения вирусной частицы из клетки все еще не установлены. Имеется крайне мало информации об участках оболочечных белков ВГС, ответственных за эти процессы. По этой причине изучение структуры и функций оболочечных белков ВГС и их фрагментов остается актуальной проблемой.

Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая вариабельность его оболочечных белков. Выделяют два гипервариабельных участка оболочечного белка Е2 (HVR1 и HVR2), которые являются иммунодоминантными;

антитела против них способны нейтрализовать проникновение вируса в клетку. Однако эти антитела специфичны лишь к одному или нескольким квазивидам вируса и не обеспечивают защиту организма от иных генетических вариантов ВГС.

Существование эпитопов вируснейтрализующих антител вне гипервариабельных участков подтверждают многочисленные экспериментальные данные [Farci et al., 1996;

Shimizu et al., 1994;

Mario et al., 1996;

Rodda et al., 1996], однако ни в одной работе структуры таких эпитопов не были определены. По этой причине необходим поиск эпитопов оболочечных белков ВГС вне гипервариабельных участков.

Наибольший интерес представляют участки оболочечных белков, являющиеся консервативными для большинства квазивидов вируса. Такие участки могут быть ответственными за взаимодействие вируса с клеточными рецепторами и проникновение вируса внутрь клетки, и потому могут вызвать выработку вируснейтрализующих антител для различных генетических вариантов ВГС.

Таким образом, структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС является актуальной задачей. Информация о функционально значимых и антигенно активных фрагментах оболочечных белков ВГС необходима для разработки иммуногенных конструкций, способных вызывать выработку вируснейтрализующих антител.

Цель работы - структурная характеристика функционально значимых участков оболочечных белков ВГС и определение антигенности высококонсервативных участков этих белков в составе искусственных конструкций.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) провести поиск и анализ описанных в литературе функционально значимых участков оболочечных белков и составить структурно-функциональную карту оболочечных белков ВГС;

2) выявить высококонсервативные фрагменты оболочечных белков ВГС, способные взаимодействовать с гепарином – предполагаемым рецептором ВГС;

3) синтезировать пептиды, соответствующие высококонсервативным участкам оболочечных белков ВГС, и получить пептидные иммуногенные конструкции;

4) получить антипептидные антитела и тестировать их на взаимодействие с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2.

Научная новизна. В работе впервые:

проведен поиск и анализ структурно- и функционально значимых a.

аминокислотных остатков и целых фрагментов оболочечных белков ВГС и составлена структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС;

картированы сайты специфического взаимодействия с гепарином в b.

составе четырех высококонсервативных участков оболочечного белка Е2 ВГС;

показана антигенность четырех СR5 и c. (CR1, CR4, CHR) высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС в составе конъюгатов с белками-носителями и одного фрагмента (CR5), конъюгированного с полимером - полиосидонием, получены гипериммунные сыворотки, содержащие антипептидные антитела против этих фрагментов;

показана способность антипептидных антител, специфичных к d.

фрагментам CHR и CR5, взаимодействовать с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС;

получены высокоантигенные синтетические Т-В-эпитопные пептидные e.

конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС и способные вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС.

Практическая значимость исследования Составленная структурно-функциональная карта может быть использована при изучении структурно-функциональных взаимоотношений оболочечных белков ВГС, взаимодействия оболочечных белков с молекулами поверхности клетки, эпитопном картировании, конструировании синтетических вакцинных конструкций. Карта позволяет установить функциональную значимость того или иного фрагмента или аминокислотного остатка (а.к.о.) для жизнедеятельности ВГС, его консервативность, возможные аминокислотные замены в пределах данного фрагмента (позиции), а также функции и консервативность близлежащих а.к.о. или участков оболочечных белков.

Картированные в оболочечных белках ВГС участки взаимодействия с гепарином могут быть использованы для поиска лигандов, блокирующих взаимодействие вирусной частицы ВГС с клеткой-хозяином, и разработки терапевтических средств против ВГС.

Обладающие антигенностью высококонсервативные фрагменты (ВКФ) оболочечных белков, исследованные в данной работе, могут быть использованы в разработке синтетической пептидной конструкции для кандидатной вакцины против ВГС. Проявление антигенных свойств у фрагмента CR5 в конъюгате с полиоксидонием свидетельствует о возможности применения синтетических фрагментов оболочечного белка ВГС и полиоксидония (в качестве эффективного адъюванта) в разработке вакцины против ВГС.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих симпозиумах и конференциях: 5-ой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт Петербург, 2001), 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), 3rd International and 28th European Peptide Symposium «Bridges Between Disciplines» (Prague, 2004), International Conference “Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine” (Moscow, 2004).

Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 5 апреля 2006 года.

Публикации Материалы диссертационной работы опубликованы в 4 статьях и 6 публикациях сборников докладов научных конференций.

Структура и объем диссертации Материалы диссертации изложены на 178 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 272 источника, приложения.

Работа иллюстрирована 5 таблицами и 15 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту 1) Составлена структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС, которая может быть использована в дальнейшем изучении этих белков.

2) ВКФ CR3, CR4, PRR1 и CHR оболочечного белка Е2 могут быть ответственными за взаимодействие с гепарином представителем гликозаминогликанов (ГАГ) – одним из предполагаемых рецепторов ВГС.

3) ВКФ в составе синтетических конструкций способны стимулировать образование антител, взаимодействующих с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Пептиды с последовательностями NH2-CPTDCFRKH-CONH2 и NH2 LPALSTGLIHLHQNIVDVQ-CONH2 были синтезированы в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А.

Овчинникова) РАН. Конъюгат пептида NH2-LPALSTGLIHLHQNIVDVQ CONH2 с полиоксидонием получен и любезно предоставлен ведущим научным сотрудником ГНЦ РФ Института иммунологии ФМБА С.А. Медведевым.

Препараты оболочечных белков Е1Е2 и Е2 любезно предоставлены доктором J.

Dubuisson, Институт Биологии, Лилль, Франция.

Программное обеспечение. Профили физико-химических и антигенных свойств оболочечного белка Е2 ВГС строили при помощи программного пакета ANTHERPROT 2000 V5.2 (http://antheprot-pbil.ibcp.fr/ Documentation _antheprot.html). Т-хелперные эпитопные мотивы выявляли с использованием обновленного программного обеспечения SYFPEITHI (http://syfpeithi.

Обработку bmiheidelberg.com/Scripts/MHCServer.dll/-EpitopePrediction.htm).

данных проводили с помощью программного продукта «Microsoft Excel 2003».

Для иммуноферментного анализа (ИФА) использовали полистирольные 96-луночные планшеты с плоским дном с высокой сорбционной емкостью фирмы «Costar» (США) и типа Covalink фирмы «Nunk» (Дания).

Синтез пептидов проводили твердофазным методом в ручном варианте путем наращивания цепи с С-конца. В качестве носителя использовали насадки для игл типа DKP (емкостью 1 мкмоль) с Lys-Pro-спейсером для синтеза биотинилированных пептидов и насадки типа D-series Lantern Rink-amide мкмоль) фирмы В качестве (емкостью 8 “Mimotopes” (Австралия).

конденсирующего реагента использовали либо диизопропилкарбодиимид в присутствии 1-оксибензотриазола, либо, на некоторых стадиях, соли фосфония или мочевины в присутствии 1-оксибензотриазола и диизопропилэтиламина.

Реакции присоединения аминокислот проводили по стандартным протоколам [Atherton and Sheppard, 1989].

Выявление сайтов связывания гепарина в составе ВКФ оболочечных белков ВГС проводили методом пептидного сканирования с лиганд ферментным анализом с использованием биотинилированных октапептидных, а также более длинных фрагментов ВКФ. Пептиды тестировали на взаимодействие с гепарином, присоединенным к поверхности лунок планшетов «Covalink-NH» с помощью 1-этил-3’(3’-диметиламинопропил)карбодиимида (КД) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Реакцию проводили в PBST (0,01 М фосфат натрия, 0,8% хлорид натрия, 0,02% хлорид калия, 0,05% Tween 20, рН неспецифическое взаимодействие блокировали добавлением в 7,2-7,4), реакционную смесь объему) молока жирности.

50% (по 0,5%-ной Взаимодействующие с гепарином биотинилированные пептиды детектировали по связыванию их с конъюгатом стрептавидина и пероксидазы и образования окрашенного продукта пероксидазной реакции из косубстрата 2,2’-азино-бис(3 этилбензиазолин-6-сульфоната аммония Оптическую плотность (ABTS).

измеряли при длине 405 нм на многоканальном фотометре Multiscan Plus (“Labsystems”, Финляндия).

Конъюгацию пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА), овальбумином (ОВА) и миоглобином (МГ) проводили с использованием глутарового альдегида гидроксисукцинимидного эфира (ГА), N- 3 малеимидобензойной кислоты (МБС), диметилсуберимидата (ДМС) и КД по стандартным методикам [Van Regenmortel and Muller, 1999]. Электрофорез конъюгатов в полиакриламидном геле проводили по методу Laemmli (1970).

Количество остатков пептидов в молекулах конъюгатов определяли методом SELDI-масс-спектрометрии.

Получение сывороток и препаратов иммуноглобулинов класса G (IgG) от иммунизированных животных. Кроликов (типа шиншилла, самцов в возрасте от 4 до 5 месяцев) иммунизировали путем 4х-кратного подкожного введения 0,8 мг конъюгата в смеси с полным (ПАФ) или неполным (НАФ) адъювантом Фрейнда (АФ) с интервалом в 2 недели между инъекциями.

Повторный курс иммунизации проводили путем двукратного подкожного введения конъюгата с интервалом в 2 недели: первая иммунизация смесью 1 мг конъюгата в PBS (0,01 М фосфат натрия, 0,8% хлорид натрия, 0,02% хлорид калия, рН 7,2-7,4) с ПАФ, вторая – 0,5 мг конъюгата в PBS с НАФ. Забор крови проводили через две недели после последней иммунизации. Препарат IgG получали из сыворотки крови высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония. Осадок растворяли и диализовали в течение 48 часов против 4 смен раствора 0,15 М NaCl (рН 8,0).

Мышей (белых беспородных самцов в возрасте от 12 до 18 недель) иммунизировали путем 4-кратного внутрибрюшинного введения 20 мкг конъюгата или свободного пептида в смеси с ПАФ или НАФ с интервалом в недели между инъекциями. Забор крови проводили методом декапитации через дней после последней иммунизации.

Сыворотку крови кроликов и мышей хранили в виде аликвот при -20°С.

Тестирование сывороток крови и препаратов IgG на наличие специифических антител проводили методом ИФА. Для проведения анализов использовали полистирольные 96-луночные планшеты для ИФА с плоским дном с высокой сорбционной емкостью (“Costar”, США), облученные УФ светом, и планшеты типа “Covalink-NH” со свободными NH-группами для ковалентного связывания антигенов (“Nunc”, Дания).

Для неспецифической адсорбции антигена в лунки планшета для ИФА вносили по 100 мкл раствора антигена (20мкг/мл) в 0,05М карбонат бикарбонатном буфере (КББ) (рН 8,4 - 8,5). Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.

Для адсорбции биотинилированных пептидов в лунках планшета для ИФА предварительно сорбировали стрептавидин (“ICN”, США, 1мкг/лунку) из КББ, затем вносили вносили 100 мкл раствора биотинилированных пептидов (10мкг/мл) в PBSТ, и после 3-ч инкубации при 37о С промывали 3 раза PBST.

Для ковалентной пришивки антигена за счет аминогруппы пептида NH группы лунок планшета Covalink-NH модифицировали цианур-хлоридом (в мкл раствора (1 мг/мл) в 0,1М Nа-фосфатном буфере инкубация 5 мин при комнатной температуре). После отмывки PBS в лунки планшета вносили мкл раствора пептида (25 мг/мл), инкубировали ночь при комнатной температуре и промывали лунки 0,1М Nа-фосфатным буфером с добавлением 1% MgSO4.

Для ковалентного присоединения за счет карбоксильной группы пептида в лунки планшета Covalink-NH вносили 100 мкл смеси, содержащей водный раствор пептида, преинкубированный 5 мин при комнатной температуре с равным объемом раствора КД и NHS в КББ (молярное соотношение КД:NHS:пептид 10:10:1, конечная концентрация пептида 25 мг/мл) и инкубировали ночь при комнатной температуре, далее отмывали PBST.

Для адсорбции оболочечного белка Е2 и гетеродимера Е1Е2 ВГС в лунках планшета для ИФА предварительно сорбировали лектин подснежника (1мкг/лунку), затем вносили раствор препаратов оболочечного белка Е2 или гетеродимера Е1Е2 (9-10 мкг/лунку) в PBST, неспецифическое взаимодействие блокировали добавлением в реакционную смесь 50% (по объему) молока 0,5% ной жирности.. Планшеты инкубировали 2 ч при температуре 37°С при перемешивании, промывали PBST.

В лунки планшета, сенсибилизированные антигеном, вносили по 150 мкл блокирующего буфера (PBS с 50% (по объему) молока 0,5%-ной жирности) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. В лунки вносили 100 мкл раствора сыворотки с различным разведением блокирующим буфером с 0,5% Tween 20 и инкубировали 1,5 ч при 37°С при перемешивании.

Планшет промывали PBST 3 раза и добавляли конъюгат перокзидазы хрена с антителами козы против IgG кролика или мыши в разведении 1:2000 для антикроличьего и 1:10000 для антимышиного конъюгата в буфере для разведения сывороток, инкубировали 1 час при 37°С, промывали планшет PBSТ 3 раза. Регистрацию взаимодействия антител с антигенами проводили при помощи цветной реакции, как описано выше. Оптическую плотность при нм измеряли на многоканальном спектрофотометре Spectroscan (“Thermolabsystems”, Финляндия–США).

Концентрацию белка определяли методом Лоури [Lowry et al., 1951].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС.

Структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС была получена путем наложения известных из литературы к началу 2007г и выявленных нами функционально важных участков и а.к.о. на составленную ранее [Sobolev et al., 2000] консенсусную последовательность оболочечных белков ВГС. Данная карта представляет собой таблицу, где каждая строка соответствует одному аминокислотному остатку консенсусной (а.к.о.) последовательности. 1-й столбец таблицы содержит номер позиции а.к.о. в консенсусной последовательности, 2-й столбец - номер позиции а.к.о. в полипротеине ВГС изолята Н77 генотипа 1а (общепринятая международная нумерация и используемая в данной работе, если не указано особо), 3-й столбец - а.к.о., чаще всего встречающийся в данной позиции (доминирующий). В 4-м столбце в соответствующих строках перечислены а.к.о., встречающиеся в данной позиции помимо доминирующего а.к.о. Частота встречаемости каждого а.к.о. показана верхним индексом. А.к.о., встречающиеся менее чем в 5% последовательностей, обозначены строчными буквами. Ячейки, соответствующие позициям с частотой встречаемости доминирующих а.к.о.

более 95%, закрашены темно-серым цветом. Светло-серым цветом закрашены ячейки, соответствующие позициям, в которых а.к.о. заменяется на остаток со сходными физико-химическими свойствами [Henikoff and Henikoff, 1992], и встречаемость этих остатков в сумме составляет 95% и более. В 5-й столбец таблицы в соответствующие строки и группы строк внесены данные о функциональной значимости отдельных а.к.о. и целых фрагментов. В этом столбце также отмечены протяженные высококонсервативные и гипервариабельные фрагменты оболочечных белков ВГС. В таблице 1 показаны два фрагмента струткурно-функциональной карты, соответствующих двум участкам белка Е2. Помимо двух известных гипервариабельных фрагментов HVR1 и HVR2, в оболочечных белках ВГС были выявлены еще 5 вариабельных фрагментов (VR – variable region;

выделены синим шрифтом). Два из них (VR и VR4) расположены в белке E1 (248-258 и 290-303, соответственно), два других (VR5 и VR6) - в белке Е2 (570-580 и 706-713) и один в белке р7 (VR7, 765-774).

Данная карта позволяет установить функциональную значимость того или иного фрагмента или а.к.о. для жизнедеятельности ВГС, его консервативность, возможные аминокислотные замены в пределах данного фрагмента (позиции), а также функции и консервативность близлежащих а.к.о.

или участков оболочечных белков. Карта является эффективным инструментом при изучении структурно-функциональных свойств оболочечных белков ВГС, взаимодействия оболочечных белков с молекулами поверхности клетки, эпитопном картировании, конструировании синтетических вакцинных конструкций.

Таблица 1. Фрагмент структурно-функциональной карты оболочечного белка Е №поз. в Аминокислотный остаток (а.к.о.) кон домин встречающийся сен H77 ирую позиции помимов данной Функция а.к.о. и фрагментов полипротеина сус (1а) щий доминантного е Q 419 412 sntdrhkylea L взаимодействия с CD81** 420 413 vpsqif I64 V34 m n k l f 421 (Owsianka et al., 2001) N95 Участок, важный для 422 415 hgyktsriqpd T92 S5 w i a p n k h 423 N 424 417 agedstih сайт гликозилирования, гликозилирование а.к.о. модулирует* G98 проникновение вирусной частицы в клетку, но не влияет на 425 418 apvtsd образование гетеродимера Е1Е2(Goffard et al., 2005) S89 R7 t i l n g c 426 W97 ако, важный для взаимодействия с CD81 (Owsianka et al., 2006) 427 420 srltqge H 428 421 eyrnldq I 429 422 vfltaed N 430 423 dseth сайт гликозилирования, гликозилирование а.к.о. важно для R84 S14 g k w q p n l e проникновения вирусной частицы в клетку, но не влияет на 431 образование гетеродимера Е1Е2 (Goffard et al., 2005) T 432 425 avsnrmige A 433 426 stgpd L 434 427 nsqvrpm N 435 428 sdpki C98 С644 (Yagnik et al., 2000) 436 429 qeywrf N 437 430 dsrytmki D75 E11 A11 p m g t s n сайт гликозилирования (Goffard et al., 2005) 438 S 439 432 tyrpgn взаимодействия с CD81** (Owsianka L 440 433 ipfch N50 Q22 D9 H8 K5 s t e y r g 441 T 442 435 cnpmia G 443 436 ws F61 W37 l s r i 444 L57 I25 V14 f m p g a 445 Участок, важный для A 446 439 vthsg Участок взаимодействия с CD81 (Drummer et al., 2006) A48 G35 S16 v p r 447 L 448 441 vp F 449 442 lismvp et al., 2001) Y 450 443 hcfa T30 A22 Y15 H11 V8 s f r i q k l n 451 H57 R13 N11 K7 s y t q p l d c 452 K58 R24 N9 S6 y q m g e 453 F 454 447 liscy N97 сайт гликозилирования, гликозилирование а.к.о. не влияет на образование 455 448 dsp S68 A28 t f d p v r гетеродимера Е1Е2, но важно для проникновения вирусной частицы в клетку 456 S 457 450 tplfca (Goffard et al., 2005) G 458 451 rwd C98 С486 (Yagnik et al., 2000) 459 452 aywsmlig P88 S6 t v r l e a 460 P78 T9 S 6 a q n l h 478 I79 L18 v y t s f 479 T51 S23 E11 G7 q r a v n l k 480 Y74 H22 d l c v t r q p n 481 A56 E16 T10 V9 i d g s n k y l c 482 HVR2 (Hijikata et al, 1991) N23 E21 D15 T13 K10 V6 R5 g q s m p a h a h 483 P42 G30 N17 = s r t i a h q k 484 = =65 P20 s n v g t l d k h a r 485 = =86 G5 i v t s n r l a 486 сайт гликозилирования, гликозилирование а.к.о. модулирует* = 487 = pnrlswq =97 проникновение вирусной частицы в клетку, но не влияет на 488 = platrg =99 образование гетеродимера Е1Е2 (Goffard et al., 2005) 489 = rp =85 V13 i t e 490 = =80 T16 s h a p n 491 = =33 S25 N19 G9 d r a h q k t p l e 492 G30 S28 D14 =6 P5 I5 n e v t r l a q 493 L29 P27 S19 E15 = q g t i v d a r m 494 VR D86 E10 g a v n s k 495 Q65 M16 H9 E5 d l 496 R73 K25 g t s p e ГАГ-связывающий 497 P 498 484 sla Участок, важный для Y 499 485 hse взаимодействия с CD81** C98 С 500 486 wsytrp (Yagnik et al., 2000) (Clayton et al., 2002;

Flint et al., W 501 487 vsrc 2000;

Owsianka et al., 2001) участок H 502 488 rqwsg Y 503 489 hcni P58 A32 S7 v h c 504 P 505 491 sltq K46 R46 Q6 n p i f 506 Поиск гепарин-связывающих участков в высококонсервативных фрагментах оболочечных белков ВГС Гепарин является представителем гликозаминогликанов (ГАГ), которые могут участвовать в проникновения ВГС в клетку в качестве рецепторов [Yagnik et al., 2000, Takikawa et al., 2000]. Мы предположили, что сайты взаимодействия с ГАГ в оболочечных белках ВГС должны быть консервативными, чтобы обеспечить изолят-неспецифическое взаимодействие вируса с рецептором. Поскольку в оболочечных белках Е1 и Е2 не было выявлено стандартных мотивов связывания с гепарином, поиск гепарин связывающих участков был проведен в высококонсервативных фрагментах (ВКФ), выбранных из консенсусной аминокислотной (а.к.) последовательности полипротеина ВГС и содержащих не менее 2 положительно заряженных а.к.о (в табл. 2 закрашены), с использованием биотинилированных октапептидов, перекрывающих ВКФ.

Таблица 2. Консервативные участки оболочечных белков Е1 и E Консерват № соответ-ствующих Белок Позиция1 Регион2 Последовательность ивность пептидов E1 315-324 CR1 GHRMAWDMMM 94% A3-A E2 418-430 GLR GSWHINRTALNCNDS 52% A6-A E2 484-490 PRR1 PYCWHYAP 66% E2 502-521 CR2 VCGPVYCFTPSPVVVGTTDR 86% E2 549-556 PRR2 WFGCTWMN 88% E2 581-590 CR3 CPTDCFRKHP 92% A28-A E2 611-622 CR4 YPYRLWHYPCTV 75% A31-A A E2 654-663 CHR LEDRDRSELS 49% E2 682-704 CR5 LPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYG 59% A36-A – первая и последняя позиции указаны в соответствии с полипротеином ВГС изолята Н77 генотипа 1а;

– регионы обозначены в соответствии с Sobolev et al., 2000;

– а.к.о., встречающиеся в 95% и более последовательностей, подчеркнуты, положительно заряженные а.к.о закрашены серым цветом;

– номера перекрывающихся октапептидов, соответствующих ВКФ;

– пептид A51 содержал 10 а.к.о.

В качестве положительного контроля (С1-С6) использовали пептиды, представляющие собой известные сайты взаимодействия с ГАГ из других белков [Drake et al., 1993;

Cardin et al., 1986;

Lawler et al., 1991;

Knaus et al., 1990].

Результаты тестирования пептидов показали слабое (рис. 1) взаимодействие с гепарином пептида из фрагмента СR3 (А30) и более сильное взаимодействие с гепарином пептидов из участка CR4 (А31-35).

A 3, 2, 1, 0, 3 5 7 9 11 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 C2 C4 C К о н тр о л ь н ы е Н о м ер п еп ти д о в п ептид ы Рис. 1 Взаимодействие пептидов с гепарином Мы обратили внимание, что участок 610-620 (рис. 2), включающий ВКФ CR4 белка Е2, пептиды из которого взаимодействовали с гепарином (выделен жирным шрифтом), имеет сходство с 11-членным фрагментом этого же белка, содержащим участок PRR1 (9 из 11 а.к.о. общие для обоих фрагментов, причем из них звездочкой располагаются в одинаковой 7 (отмечены *) последовательности). Структурно-функциональная карта показала, что фрагменту PRR1 в последовательности белка с N–конца предшествует положительно заряженный остаток аргинина, который встречается в 84% последовательностей или заменяется в 14% последовательностей на остаток лизина. Это позволило нам предположить, что фрагмент PRR1, более протяженный с N-конца (481DQRPYCWHYAP490), может взаимодействовать с гепарином.

* ** * ** * D Y P Y R L W H Y P C CR PRR1 481D Q R P Y C W H Y A P Рис. 2 Гомология фрагментов CR4 и PRR1 белка Е2.

Кроме того, участку с также предшествуют CHR N-конца высококонсервативные остатки аргинина (консервативность этих остатков RGERCDLEDRDR составляет а в целом фрагмент 98-99%), характеризуется наличием консервативных гидрофильных а.к.о. Мы предположили, что фрагмент 648-659 также может взаимодействовать с гепарином. Для подтверждения этих предположений были синтезированы три биотинилированных пептида с последовательностями: N1–DYPYRLWHYPC;

N2– все они проявили гепарин DQRPYCWHYAP;

N3–RGERCDLEDRDR;

связывающую активность, сравнимую с таковой пептидов положительного контроля (рис. 3).

3, пе пт ид ы :

A 3 N 1 – D Y P Y R LW H Y P C ;

N2 – DQ RPYC W H YAP;

2, N 3 – R G ER C D LED R D R 2 А 2 0 - о т рица т е л ь ны й С 1 и С 4 - по л о ж ит е л ь ны й 1, ко нт р о л ь 0, N1 N2 N3 A 20 C1 C н о м е р п е п т и дов Рис. 3 Взаимодействие пептидов N1, N2 и N3 с гепарином.

Изучение антигенных свойств ВКФ оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС.

Выбор ВКФ и синтез соответствующих им пептидов.

Для изучения антигенности в составе синтетических конструкций были выбраны пять ВКФ (CR1, CR3, CR4, CR5 и CHR), которые могут участвовать в процессе проникновения ВГС в клетку-мишень и которые, соответственно, могли бы вызвать образование к себе вируснейтрализующих антител. CR3, CR и CHR были выявлены как участки связывания гепарина (антигенность участка, соответствующего удлиненному с N-конца PRR1, в составе конъюгата с овальбумином была изучена ранее [Оленина, 2002]). В участке CR предполагается локализация «пептид слияния» оболочечного белка Е2 с мембраной эндосомы клетки-мишени [Drummer and Poumbourios, 2004]. Кроме того, в этом участке предсказываются Т-хелперные эпитопные мотивы. Участок CR1 белка Е1 представлял интерес как обладающий антигенной активностью в составе целого гетеродимера Е1Е2 и индуцирующий образование антител у лиц, инфицированных ВГС [Zibert et al., 1999, Olenina et al., 2002].

Были синтезированы 9 пептидов, а.к. последовательности которых содержат пять выбранных ВКФ (табл. 2). В состав указанных пептидов, помимо собственно ВКФ, были включены дополнительные а.к.о. Cys, Lys или Ser (показаны обычным шрифтом), обеспечивающие присоединение к белку носителю и/или имеющие функцию мостика между пептидом и белком носителем, либо обеспечивающие циклизацию пептида путем образования S-S мостика (два остатка Cys на N- и C-концах пептида). Для лучшего моделирования структуры фрагмента в составе молекулы белка карбоксильные группы пептидов амидировали, а -амино-группы, если они не использовались для конъюгации с носителем, ацетилировали. Правильность синтеза пептидов подтверждена методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Таблица 2 Пептиды, содержащие ВКФ оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС, и их характеристика К2, Мол.масса Масса моле № пе- % пептида кулярных А.к. последовательность1 ВКФ пти расчетная, ионов на спек да Да трограмме П1 NH2-CPTDCFRKH-CONH2 CR3 97 1202,5 1205, 2559, П2 NH2-LPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYG-CONH2 CR5 59 2564, 2579(+Na+) 1424, П3 NH2-CDLEDRDRSELC-CONH2 CHR 38 1424, 1422,5(окисл.) П4 NH2-PYRLWHYPCT-CONH2 CR4 94 1334,5 1334, 1331,74(-H2O) П7 NH2-CDLEDRDRSEL-CONH2 CHR 38 1349,5 1349, 1371,75(+Na+) 1356.7(-H2O) П8 NH2-DLEDRDRSELK-CONH2 CHR 38 1374,5 1374. 1396.69(+Na+) 1813, 1835,8(+Na+) П9 NH2-SPALSTGLIHLHQNIVD-CONH2 CR5 63 1814, 1851,8(+К+) П10 Ас-SPALSTGLIHLHQNIVD-CONH2 CR5 63 1856,1 1855, 1250,9/1266, П13 Ас-GHRMAWDMС-CONH2 CR1 96 1234, 1234,4/1250, – последовательность, соответствующая консенсусной последовательности включенного в пептид ВКФ, выделена жирным шрифтом;

– консервативность последовательности ВКФ, включенной в состав пептида;

– массы молекулярных ионов после обработки пептида 2-меркаптоэтанолом.

Получение синтетических конструкций, включающих ВКФ Синтезированные пептиды были включены в состав конструкций (табл.

3), содержащих в качестве источника Т-хелперных эпитопов различные белки носители [Van Regenmortel and Muller, 1999]. В качестве одного из носителей пептида П2 использовали полиоксидоний (ПО), синтетический полимер, обладающий выраженной иммуномодуляторной активностью и успешно применяемый в качестве адъюванта в субъединичных вакцинах [Петров Р.В. и др., 1999]. Количество остатков пептида в одной молекуле конъюгата определяли с помощью анализа и SELDI-масс-спектрометрического аминокислотного анализа для конъюгата П2-ПО.

Таблица 3 Синтетические конструкции и их характеристика N № животного Синтетическая ВКФ Мол.масса (группы)1 Конъюгата конструкция П1-ДМС-БСА 1-I 67549 0, CR П1–ГА-БСА 1-II 88493,5 17, 2-I П2–ГА-БСА CR5 79870,5 5, 2-II П3–ГА-БСА 3-I 81231,1 9, CHR П3–ГА-ОВА 3-II - П4–ДМС-БСА 4-I 67195,6- 0, CR П4–ГА-БСА 4-II 83574,1 12, П7–МБС-БСА 5 79161.7 8. 20075,0 (2,1/1) П7–МБС-МГ 6 43455,3 2,8 (6,1/2) 65900,7 (9,5/3) П8–ГА-БСА 7 79081.8 8, CHR 20506,9 (2,5/1) 26341,4 (6,6/1) П8–ГА-МГ 8 37866,1 2,5 (3,2/2) 53739,0 (2,1/3) 77489,2 (6,8/4) П9–ГА-БСА 9 78530,0 6. СR П10–КД-БСА 10 73196,6 3. 1, П2–ПО 11 П13- МБС-БСА 13 CR1 73106,1 4, - 1-I -4-II – номера иммунизированных кроликов (римская цифра указывает цикл иммунизации), 5-13 - номера групп иммунизированных мышей;

– усредненная молекулярная масса конъюгата по данным SELDI-MS (Да);

- N - среднее количество молекул пептида на 1 молекулу белка в конъюгате;

- данные определены методом аминокислотного анализа.

Получение антипептидных антител к фрагментам CR3, CR4, CR5 и CHR у кроликов.

Основной задачей данного этапа работы являлось определение способности ВКФ оболочечных белков ВГС в составе искусственных конструкций вызывать образование антител специфичных к целым белкам. Для этого необходимо было получить достаточное количество антипептидных антител для анализа их специфичности. Поэтому в качестве подопытных животных были выбраны кролики для получения антител против конъюгатов П1-ДМС-БСА, П2–ГА-БСА, П3–ГА-БСА, П4–ГА-БСА. Из сывороток крови иммунизированных кроликов выделяли IgG и тестировали их на способность к специфическому взаимодействию с соответствующими пептидами методом ИФА. Анализ проводили с использованием пептидов, ковалентно связанных с поверхностью лунок планшетов. После первого цикла иммунизации антипептидные антитела во фракциях IgG, полученных из сывороток крови иммунизированных кроликов, не были обнаружены.

Был проведен повторный цикл иммунизации. Поскольку одной из причин отсутствия антител к П1 и П4 может быть малое количество молекул пептида, связавшееся с одной молекулой белка-носителя в конъюгатах П1-ДМС-БСА и П4-ДМС-БСА (табл. 3), для повторного цикла иммунизаций использовали конъюгаты этих же пептидов с БСА, полученные с помощью ГА, с бльшим содержанием остатков пептида (табл. 3). В конъюгате П3-ГА-БСА содержание остатков пептида оптимально. Отсутствие иммунного ответа на пептид П может быть результатом электростатического взаимодействия пептида с поверхностью молекулы белка-носителя, прилегающей к месту пришивки пептида [Bahraoui et al., 1986]. Поэтому для второго курса иммунизации использовали конъюгат пептида П3 с ОВА. Из-за сложности работы с пептидом П2 (низкая растворимость в водных растворах самого пептида и его конъюгатов) для повторного цикла иммунизации была использована та же конструкция П2–ГА-БСА.

После второго курса иммунизации нам удалось получить антитела к фрагменту CR4;

титр антипептидных антител в препарате IgG из сыворотки кролика 4-II составлял 1:2700. Однако полученные антипептидные антитела не взаимодействовали ни с оболочечным белком Е2, ни с гетеродимером Е1Е2.

Следовательно, в составе оболочечного белка Е2 данные фрагменты имеют иную конформацию, чем в составе конъюгата с БСА.

К фрагментам CR3, CHR и CR5 антипептидные антитела у кроликов получить не удалось даже после второго цикла иммунизации. Вероятно, для получения антипептидных антител против фрагментов CR3 и CR4, способных специфично взаимодействовать с белком Е2, необходима разработка принципиально иных иммуногенных конструкций. CR3 и CR4 содержат в своем составе много а.к.о., имеющих боковые функциональные группы, обычно используемые для конъюгации с носителями (Asp, Lys, Cys), которые не должны быть затронуты при конъюгации, так как они, располагаясь в середине или почти в середине фрагментов, могут быть важны для взаимодействия с антителами. Возможной причиной неудачи в получении антител к участку CR может быть высокая гидрофобность содержащего этот фрагмент пептида П2.

Более короткие и менее гидрофобные пептиды, содержащие часть фрагмента CR5, образовывали растворимые конъюгаты. Другой причиной как в случае CR5, так и в случае CHR, где замена носителя в конъюгате с П3 не привела к выработке специфических антител, может быть индивидуальная толерантность животного. В этом случае необходимо исследовать иммунный ответ в группах животных. Для таких масштабных исследований в качестве подопытных животных были выбраны мыши.

Получение антипептидных антител к фрагментам CR1, CR5 и CHR у мышей.

Для иммунизации мышей были использованы конъюгаты пептидов, содержащих фрагменты CHR, укороченный СR5 и СR1 (табл. 3, группы 5-13).

Четыре группы мышей были использованы для проверки антигенности П (содержащего полноразмерный CR5) в составе конъюгата П2 с полиоксидонием (П2-ПО). Первая группа (табл. 4, группа №11) была иммунизирована П2-ПО с АФ, вторая (группа №11а) – П2-ПО без АФ. Две контрольные группы были иммунизированы соответственно пептидом П2 в смеси с ПО и пептидом П2 с АФ.

Значения титров антител к различным фрагментам для каждой антисыворотки и среднее геометрическое значение тиров антител в группе приведены в таблице 4.

Таблица 4 Титры антипептидных антител в сыворотках мышей № Иммуногенная ВКФ Титры антипептидных антител Тср группы конструкция 1 2 3 4 П7–МБС-БСА 5 900 8100 100 300 - П7–МБС-МГ 6 100 100 100 100 100 CHR П8–ГА-БСА 7 100 100 900 300 П8–ГА-МГ 8 2700 100 100 100 900 П9–ГА-БСА 9 100 100 100 100 100 П10–КД-БСА СR5 10 300 100 100 300 П2–ПО + АФ 11 450 50 150 450 450 П2–ПО 11а 50 450 150 150 450 П13-МБС-БСА 13 CR1 24300 218700 8100 24300 - - Тср- среднее геометрическое значений титров в группе.

Из полученных данных следует, что включение ВКФ CHR, CR1 и CR5 в конъюгаты с белками-носителями позволяет получить антипептидные антитела к указанным фрагментам. Однако иммунный ответ зависит от ориентации пептида, структуры носителя и сшивающего реагента и от индивидуальных особенностей функционирования иммунной системы иммунизируемого животного. Из исследованных фрагментов наиболее иммуногенным оказался CR1, который проявлял наибольшую иммуногенность среди ВКФ и в составе ВГС у больных гепатитом С [Zibert et al., 1997;

Olenina et al., 2002]. Наиболее эффективными носителями для получения иммуногенных конструкций с использованием исследованных пептидов оказались БСА и ПО, а сшивающими реагентами – МБС и КД.

Определение специфичности антипептидных антител к препаратам оболочечных белков ВГС.

Сыворотки крови мышей, содержащие антипептидные антитела, были анализированы методом твердофазного ИФА на способность взаимодействовать с полноразмерным оболочечным белком Е2 или гетеродимером Е1Е2. Оболочечные белки инкубировали с сыворотками (в разведении 1:50), содержащими антипептидные антитела. Из рис. 4 видно, что из 25 антисывороток пять содержали антитела, взаимодействующие с полноразмерным белком Е2 и с гетеродимером Е1Е2. Это антисыворотки, полученные против конъюгатов пептидов, соответствующих фрагментам CHR и CR5.

А 0, Е Е1Е 0, 0, 0, 0, 0, 5- 5- 5- 7- 7- 7- 8- 8- 10- 10- 10- 10- 11- 11- 11- 11- 11a- 11a- 11a- 11a- 11a- 13- 13- 13- 13- номер сыворотки Рис. 4 Взаимодействие антител из сывороток мышей групп 5,7,8,10,11а,11 и с оболочечными белками ВГС Таким образом, конъюгация пептидов, соответствующих слабо или практически не иммуногенным в составе целых оболочечных белков ВГС ВКФ, с белками-носителями позволяет получить иммуногенные конструкции, способные вызывать выработку организмом специфических антипептидных антител. Пептид, содержащий предсказываемые Т-хелперные эпитопные мотивы, вызывал образование специфических антител и в виде конъюгата с полимерным адъювантом полиоксидонием. Это указывает на принципиальную возможность разработки конструкций для кандидатной вакцины против гепатита С на основе отдельных синтетических фрагментов оболочечных белков ВГС.

Получение синтетических пептидных Т-В эпитопных конструкции на основе ВКФ оболочечных белков ВГС.

Синтез Т-В эпитопных конструкций Анализ оболочечного белка Е2 с использованием обновленного программного обеспечения SYFPEITHI позволил выявить консервативный фрагмент оболочечного белка Е2, содержащий Т-хелперные мотивы. Было высказано предположение, что этот фрагмент может быть использован как источник Т-хелперных эпитопов в искусственной иммуногенной пептидной конструкции. Данный фрагмент был включен в состав двух пептидных конструкций (пептид 14 и пептид16), где в качестве В-эпитопа выступает другой ВКФ оболочечного белка Е2 ВГС (рис. 5а), а также были получены конъюгаты этих пептидов с БСА с использованием ГА. (рис 5б).

линкер Т-эпитоп В-эпитоп а) Пептид линкер Пептид16 Т-эпитоп В-эпитоп б) Пептид 14–ГА-БСА линкер Т-эпитоп В-эпитоп P Пептид 16–ГА-БСА линкер Т-эпитоп В-эпитоп Р Рис. 5 Т-В эпитопные конструкции: а) пептидной природы;

б) конъюгированные с БСА.

Получение антител к Т-В-эпитопным конструкциям и определение их специфичности.

Иммунизация мышей Т-В-эпитопными конструкциями проводилась в двух вариантах: с добавлением АФ и без него. Нумерация групп мышей в соответствии с материалом для иммунизации приведена в таблице 5.

Результаты тестирования антисывороток мышей этих 6 групп (табл. 5) показали, что в результате иммунизации все мыши (за исключением мыши № в группе 16а) с разной эффективностью развили иммунный ответ к целой соответствующей конструкции (в таблице значения титров выделены жирным шрифтом). Показано, что обе пептидные конструкции способны в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем и даже без адъюванта индуцировать образование специфических антипептидных антител. Тестирование антисывороток на специфичность к Т- и В-эпитопным фрагментам показало, что эффективность образования антител к отдельным фрагментам зависела от использования адъюванта при иммунизации. В целом конструкция 14 оказалась более иммуногенной, чем конструкция, представленная пептидом 16.

Эффективность образования антител к соответствующему антигену убывает в ряду групп 14-15-16-14а-17-16а. Однако в случае иммунизации конструкциями, содержащими пептид 16, выше эффективность образования антител к В эпитопу.

Таблица 5 Титры антипептидных антител в сыворотках мышей иммунизированных Т-В-эпитопными конструкциями Титры антител и их среднее геометрическое в группе Препарат для № иммуни-зации к пептиду 14 к пептиду 16 к пептиду b 1 100 2 100 Пептид 14 - 14а 3 100 без АФ 4 100 5 100 1 100 2 2700 Пептид 14 185 14 3 100 + АФ 4 900 5 900 1 30 2 300 П14-ГА-БСА 366 15 3 900 + АФ 4 2700 5 300 1 900 2 30 Пептид 16 4 16а 3 30 без АФ 4 100 5 30 1 2700 2 900 Пептид 16 1397 16 3 2700 + АФ 4 900 5 900 1 16000 П16-ГА-БСА 25 17 2 100 + АФ 3 100 Взаимодействие анти-Т-В-эпитопных антител с препаратами оболочечных белков ВГС.

Тестирование сывороток крови методом ИФА на наличие антител, способных взаимодействовать с полноразмерным белком, показало, что из сывороток четыре и содержат антитела, (14-5, 15-3, 15-5 17-1) взаимодействующие с белком Е2, и три (14-5, 15-3 и 16-5) – антитела, взаимодействующие с гетеродимером Е1Е2 ВГС (рис. 7). С белком реагировали антитела только из тех сывороток крови, которые были получены после иммунизации конструкциями с АФ. Ни в одной из сывороток, полученных после иммунизации без использования АФ, антител против оболочечных белков не выявлено.

А 4 0, E Е 1Е 0, 0, 0, 0, 0, 14- 14- 14- 14- 14- 14а- 14а- 14а- 14а- 14а- 15- 15- 15- 15- 15- 16- 16- 16- 16- 16- 16а- 16а- 17- 17- 17- н ом ер сы воротки Рис. 7 Взаимодействие антител из сывороток мышей, иммунизированных Т-В эпитопными конструкциями, с оболочечными белками ВГС Высокая иммуногенность синтетических пептидных конструкций даже в отсутствие адъюванта подтверждает наличие Т-хелперной эпитопной активности у включенного в состав этой конструкции предсказанного Т эпитопного мотива. Иммунный ответ с образованием специфических антипептидных антител наблюдался практически у всех иммунизированных животных, что свидетельствует о широкой специфичности данного Т эпитопного мотива по отношению к МНС II. Важно отметить, что показана специфичность антипептидных антител из четырех сывороток к полноразмерному оболочечному белку Е2 и трех к гетеродимеру Е1Е2 ВГС.

Подобные конструкции из фрагментов оболочечных белков ВГС были получены впервые. В дальнейшем такие конструкции могут быть модифицированы и улучшены с целью получения антител с большей связывающей активностью в отношении полноразмерных оболочечных белков ВГС.

ВЫВОДЫ 1. Составлена структурно-функциональная карта оболочечных белков вируса гепатита С.

2. Определены четыре линейных фрагмента оболочечного белка Е2, взаимодействующие с гепарином – возможным рецептором ВГС.

3. Показано, что высококонсервативные фрагменты оболочечных белков ВГС, включенные в состав искусственных иммуногенных конструкций, проявляют антигенные свойства и способны вызывать образование специфических антител, взаимодействующих с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е 4. Получены высокоантигенные синтетические Т-В-эпитопные пептидные конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС и способные вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Olenina L.V., Kuzmina T.I., Sobolev B.N., Kuraeva T.E., Kolesanova E.F., Archakov A.I. Identification of glycosaminoglycan-binding sites within hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 // Journal of Viral Hepatitis. – 2005. – V. 12.

№6. - P. 584-593.

Оленина Л.В., Кузьмина Т.И., Соболев Б.Н., Кураева Т.Е., Колесанова Е.Ф., 2.

Арчаков А.И. Разработка лабораторно-экспериментальных образцов искусственной вакцины против вируса гепатита С. Иммуногенность высококонсервативных участков оболочечного белка Е2 в составе синтетических конструкций // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2003. - T. 9, № 7. - С. 51-53.

3. Kuraeva T.E. Olenina L. V., Kuzmina T.I., Alyoshina E.Yu., Kolesanova E.F., Archakov A.I. Immunogenicity of highly conserved fragments of hepatitis C virus envelope proteins E1 and E2 // In: Peptides - Bridges Between Disciplines, Proceedings of the Third International and Twenty-Eight European Peptide symposium. Flegel, M.;

Fridkin,M.;

Gilon, C. and Slaninova J. (Eds.). - 2005. P.172-173.

4. Sobolev B.N., Kolesanova E.F., Olenina L.V., Kuraeva T.E., Rudik A.V., Poroikov V.V., Archakov A.I.. Hepatitis C virus functional mapping database:

an instrument in subunit vaccine design. // In: Peptides - Bridges Between Disciplines, Proceedings of the Third International and Twenty-Eight European Peptide symposium. Flegel, M.;

Fridkin,M.;

Gilon, C. and Slaninova J. (Eds.). 2005. - P. 213-214.

Кураева Т.Е., Соболев Б.Н., Алешина Е.Ю., Кузьмина Т.И., Колесанова 5.

Е.Ф. Антигенная характеристика высококонсервативных участков оболочечных белков вируса гепатита С. // Медицинская иммунология.

Сборник докл. пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001». - Санкт-Петербург, 2001. Том 3, №2. - С. 231.

Кураева Т. Е., Оленина Л. В. Получение антипептидных антител против 6.

консервативного участка оболочечного белка вируса гепатита С // Сборник докл. конф. Биология наука XXI века: 6-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 20-24 мая 2002 г.). - Пущино, 2002. - Т. 1. – С.

270.

7. Olenina L.V., Kuzmina T.I., Sobolev B.N., Ivanov Yu.D., Gnedenko O.V., Nikolaeva L.I., Kuraeva T.E., Kolesanova E.F., Archakov A.I. Highly conservative sites of HCV envelope proteins: Possible functional role and immunogenic properties // In: Int. Conference “Genomics, Proteiomics and Bioinformatics for Medicine”. Book of Abstracts. - Moscow, 2002. - Р.94.

8. Kuraeva T.E. Olenina L. V., Kuzmina T.I., Alyoshina E.Yu., Kolesanova E.F., Archacov A.I. Immunogenicity of highly conserved fragments of hepatitis C virus envelope proteins E1 and E2 // Материалы Междунар. симп. «3rd International and 28th European Peptide Symposium» - Prague, 2004. - V. 10.

№8. - Р. 94.

9. Sobolev B.N., Kolesanova E.F., Olenina L.V., Kuraeva T.E., Rudik A.V., Poroikov V.V., Archakov A.I.. Hepatitis C virus functional mapping database:

an instrument in subunit vaccine design Материалы Междунар. симп. «3rd International and 28th European Peptide Symposium» - Prague, 2004. - V. 10., №8. - Р. 112.

10. Sobolev B.N., Kuraeva T.E., Olenina L.V., Kolesanova E.F., Rudik A.V., Poroikov V.V., Archakov A.I. Hepatitis c virus epitope mapping database (HCVMAP): an instrument in subunit vaccine design // In: Int. Conference “Genomics, Proteiomics and Bioinformatics for Medicine”. Book of Abstracts. Moscow, 2004 - Р. 5.13.

Список сокращений а.к.о. – аминокислотный остаток АФ – адъювант Фрейнда БСА - бычий сывороточный альбумин ВГС - вирус гепатита С ВКФ – высококонсервативный фрагмент ГА - глутаровый альдегид ГАГ - гликозаминогликаны ДМС – диметилсуберимидат ИФА - иммуноферментный анализ КД – 1-этил-3’(3’-диметиламинопропил)карбодиимид МБС – N- гидроксисукцинимидный эфир 3-малеимидобензойной кислоты МГ – миоглобин лошади ОВА – овальбумин ПО - полиоксидоний DKP – Lys-Pro-дикетопиперазин HVR - гипервариабельный участок (hypervariable region) IgG – иммуноглобулины класса G, IgА – иммуноглобулины класса А MALDI-TOF – matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight времяпролетная [масс-спектрометрия] с лазерной десорбцией-ионизацией с помощью матрицы NHS - N-гидроксисукцинимид PBS – фосфатно-солевой буфер PBST – фосфатно-солевой буфер с твином усиленная SELDI – (surface-enhanced laser desorption-ionization) поверхностная лазерная десорбция-ионизация (в масс-спектрометрии белков)

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.