Повышение противоопухолевой активности цитокина trail путем изменения аминокислотного состава белка
На правах рукописи
ЯГОЛОВИЧ АННА ВАЛЕРЬЕВНА ПОВЫШЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНА TRAIL ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКА Специальность: 03.01.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Научные руководители: профессор, д.б.н. Д.А.Долгих к.б.н. М.Э. Гаспарян
Официальные оппоненты: д.б.н. Купраш Дмитрий Владимирович к.б.н. Дугина Вера Борисовна
Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН
Защита состоится 24 февраля 2011 г. в … ч. … мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан « … » …………….. 201… г.
Учёный секретарь диссертационного совета, М.Г. Страховская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Цитокин TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) был обнаружен в 1995 году на основе гомологии последовательности с другими членами семейства TNF (Tumor Necrosis Factor). Он экспрессируется в клетках в виде трансмембранного белка II типа. В результате расщепления протеазами внеклеточный домен TRAIL высвобождается из клетки в свободном растворимом тримерном виде.
Рекомбинантный растворимый TRAIL способен вызывать апоптоз в культурах клеток из широкого спектра человеческих опухолей, не затрагивая нормальные клетки. Благодаря этому свойству препарат рекомбинантного цитокина TRAIL рассматривается в качестве многообещающего потенциального терапевтического средства для лечения раковых заболеваний.
Изначально препарат рекомбинантного белка TRAIL был получен в бактериях и содержал гистидиновый таг на С-конце молекулы (His/TRAIL). Позднее было показано, что препарат TRAIL с гистидиновым тагом образует многомерные агрегаты и проявляет значительную токсичность на гепатоцитах. В дальнейшем был получен препарат TRAIL (а.o. 114-281) без тагов, который состоял только из активных тримерных молекул и практически не проявлял токсичности. Однако этот препарат был экспрессирован с добавлением инициаторного метионинового кодона и обладал потенциально высокой антигенностью, поскольку при экспрессии белков в бактериях N-концевой метионин расщепляется не полностью. Таким образом, получение качественного препарата рекомбинантного внеклеточного домена цитокина TRAIL (а.о. 114-281) без дополнительных искусственных последовательностей, без N-концевого метионина и с высоким выходом белка является важной задачей для успешного применения TRAIL в терапии раковых заболеваний.
Терапевтический потенциал TRAIL оказался ограничен в связи с тем, что многие первичные опухоли резистентны к TRAIL. Несмотря на интенсивные исследования, механизмы, лежащие в основе эффективности и селективности действия TRAIL, окончательно не выяснены. Одной из причин является сложный механизм взаимодействия TRAIL с его пятью рецепторами, из которых лишь два, DR4 и DR5 (рецепторы смерти), способны проводить сигнал апоптоза. Связывание TRAIL с рецепторами-«ловушками» DcR1 и DcR2 или растворимым рецептором остеопротегерином (OPG) не приводит к клеточной гибели, однако они также играют важную роль в регуляции TRAIL индуцированного апоптоза. Рецепторы DcR1 и DcR2 ингибируют TRAIL индуцированный апоптоз, конкурируя с рецепторами смерти DR4 и DR5 за связывание с TRAIL или препятствуя передаче сигнала апоптоза. Для выяснения роли каждого из рецепторов DR4 и DR5 в механизме TRAIL-индуцированного апоптоза ранее методом фагового дисплея были получены DR4 и DR5-селективные мутантные варианты TRAIL, содержащие по 6 аминокислотных замен. Другие DR4 и DR5-селективные мутантные варианты TRAIL (D218H и D269H) были получены с помощью алгоритма автоматического дизайна FOLD-X. Все ранее охарактеризованные мутантные варианты в той или иной степени избирательно связывались с рецепторами DR4 или DR5, однако сохраняли высокое сродство к рецепторам-«ловушкам» DcR1 и DcR2. Повышение селективности лиганда к рецептору DR5 наряду с повышением биологической активности позволит увеличить спектр потенциального применения цитокина TRAIL в терапии раковых заболеваний.
Цель исследования. Повышение селективности цитокина TRAIL к рецептору смерти DR5 путем введения комбинации DR5-специфических мутаций в структуру белка и получения рецептор-специфичных мутантных вариантов DR5-A и DR5-B;
определение их констант диссоциации при связывании с пятью рецепторами TRAIL и исследование биологической активности всех препаратов на различных линиях раковых клеток для создания эффективных средств терапии опухолевых заболеваний.
Основные задачи исследования.
1. Получить эффективную экспрессионную конструкцию для продукции рекомбинантного цитокина TRAIL в виде гибридного белка с тиоредоксином в E. сoli, разработать методику очистки и ренатурации гибридного белка тиоредоксин/TRAIL и очистки целевого белка TRAIL.
2. Охарактеризовать физико-химические свойства и исследовать биологическую активность полученного препарата TRAIL 3. Получить и очистить новые мутантные варианты TRAIL, специфичные к рецептору смерти DR5.
4. Определить константы связывания TRAIL дикого типа и его рецептор специфичных мутантных вариантов с пятью рецепторами TRAIL методом поверхностного плазмонного резонанса.
5. Провести сравнительный анализ биологической активности TRAIL дикого типа и его мутантных вариантов в различных линиях раковых клеток.
Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе были разработаны новые эффективные методы экспрессии и очистки рекомбинантных препаратов TRAIL и новых DR5-специфичных мутантных вариантов DR5-A и DR5-B. Разработанные методы позволяют очистить до 300 мг (300 мг из телец включения и 75-100 мг из цитоплазматической фракции белков) высокоактивного целевого белка TRAIL из 1 литра культуры клеток, что позволяет рассматривать препарат как потенциальное противоопухолевое средство, пригодное для клинических испытаний.
Кроме того, в данной работе получены новые мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5 B. Показано, что они обладают наибольшей специфичностью к рецептору DR5 по сравнению с ранее описанными рецептор–специфичными мутантными вариантами.
Наряду с высокой аффинностью к рецептору DR5, они практически не связывались с рецептором DR4 и с рецепторами-«ловушками» DcR1 и DcR2. Кроме того, мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B в несколько раз эффективнее вызывали апоптоз в DR5 зависимых линиях раковых клеток, что делает их потенциальными кандидатами для терапии опухолей, резистентных к TRAIL дикого типа.
Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», 12-15 апреля 2006 г., Москва, Россия;
2) Первый студенческий симпозиум по биоинженерии, 27-31 октября 2006 г., Москва, Россия;
3) XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007», 20-23 апреля 2007 г., Москва, Россия;
4) IV Международная конференция "Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия", 3 декабря 2007 г., ЦВТ ХимРар, Химки, Московская обл., Россия;
5) XVI Евроконференция по апоптозу, 6-9 сентября 2008 г., Берн, Швейцария, 6) III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика – 2010", 21-25 июня 2010 г., Москва, Россия, 7) VII Конференция «Митохондриальная Физиология - 2010» 27 сентября – 1 октября 2010 г., Обергургль, Тироль, Австрия, 8) XIV Российский онкологический конгресс, 23-25 ноября 2010 г. Москва, Россия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи, 8 тезисов конференций и 1 патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работы изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков, 5 таблиц. Список литературы включает 269 источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Экспрессия и очистка рекомбинантного цитокина TRAIL в E.coli Синтез гена TRAIL (114-281) и клонирование его в экспрессионный вектор.
Последовательность ДНК, кодирующая внеклеточную часть цитокина TRAIL (а.о. 114 281), была синтезирована из 20 перекрывающихся олигонуклеотидов (длиной 37-43 н.) с помощью ПЦР. Полученный ген был клонирован в плазмидный вектор pET-32a, предназначенный для продукции в E. coli гибридных белков с тиоредоксином на N-конце, целевым белком на С-конце и соединяющим их линкером, содержащим сайт узнавания энтеропептидазы и последовательность из шести гистидиновых остатков для аффинной очистки (Рис. 1). Преимущество данной генетической конструкции заключается в том, что получаемый рекомбинантный белок не содержит дополнительных тагов. Результатом является очищенный цитокин TRAIL с природной третичной структурой и нативным N концом.
Рис. 1. Схематическое изображение гибридного белка Trx/TRAIL.
Экспрессия слитного белка Trx/TRAIL в E.coli. Для экспрессии гибридного белка Trx/TRAIL был выбран штамм E. coli BL21(DE3) (генотип F- OmpT hsdSВ (rB- mB-) gal dcm(DE3)), предназначенный для работы с системами экспрессии, основанными на активности промотора бактериофага Т7. Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирующим вектором pET-32a/TRAIL. Оптимальную концентрацию индуктора ИПТГ (изопропил--тиогалактопиранозид) подобрали в предварительных экспериментах (Рис. 2). Наибольший уровень экспрессии гибридного белка Trx/TRAIL (150 мг со 100 мл культуры E. coli) был достигнут при индукции клеток с помощью 0. мМ ИПТГ при росте в богатой среде TB в течение 24 часов при 27°C (Рис.2, дорожка 2).
Ренатурация и очистка и гибридного белка Trx/TRAIL. В результате экспрессии был получен гибридный белок Trx/TRAIL молекулярной массой 36 кДа ( кДа TRAIL и 17 кДа тиоредоксин с линкером), который на 90% находился в составе телец включения (данные не показаны). Получение целевого белка проводили с помощью ренатурации нерастворимого гибридного белка Trx/TRAIL в составе телец включения.
Рис. 2. Подбор концентрации ИПТГ для индукции экспрессии гибридного белка Trx/TRAIL в штамме E.coli.
BL21(DE3). Пробы анализировали в 12% ДСН-ПААГ.
Процедура ренатурации включала растворение телец включения в растворе 6М гуанидина и дальнейший рефолдинг путем постепенного перевода белка в буфер, содержащий 0.7 М аргинина, 0.5 М хлорида натрия и 100 мМ трис-гидрохлорида (pH 8.0) и 1 мМ ДТТ, до конечной концентрации 0.8-1.0 мг/мл. Повышение концентрации белка способствовало ухудшению правильного сворачивания. После этого раствор белка инку бировали в течение 3-4 часов при комнатной температуре или в течение 16 часов при 4°C.
Вышеперечисленные условия (рН, концентрация солей, время инкубации) были оптимальными для рефолдинга и позволили получить выход до 60% белка после диализа против буфера, содержащего 300 мМ хлорида натрия, 20 мМ трис-гидрохлорида (рН 7.8), 1 мМ ДТТ и 0.02% азида натрия (Табл. 1). Гибридный белок Trx/TRAIL, полученный в результате ренатурации, был очищен методом металл-аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Ni Sepharose High Performance (Рис. 3).
Расщепление гибридного белка Trx/TRAIL и очистка целевого белка TRAIL.
Расщепление гибридного белка Trx/TRAIL проводили с помощью рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека (L-HEP) при концентрации белка 1.0 мг/мл.
Энтеропептидаза расщепляла 98% гибридного белка Trx/TRAIL при молярном отношении фермент-субстрат 1:30000 в течение 16 часов при комнатной температуре. Оптимальный состав буфера для расщепления Trx/TRAIL энтеропептидазой включал 100 мМ хлорида натрия и 50 мМ трис-гидрохлорида (рН 8.0). Увеличение времени расщепления (более часов) приводило к расщеплению тиоредоксина с 17 кДа до15.4 кДа (Рис. 3), что соответствует расщеплению после аминокислотного остатка 143 тиоредоксина. Для удалении остаточной активности L-HEP после расщепления раствор белка пропустили через колонку с СИТ-агарозой. TRAIL отделили от тиоредоксина методом металл аффинной хроматографии на колонке с никелевой агарозой Ni-NTA.
Рис. 3. Очистка TRAIL после расщепления белка Trx/TRAIL энтеропетидазой. Пробы белковых препаратов анализировали в 12 % ДСН ПААГ.
M – маркеры молекулярных масс;
1 – Trx/TRAIL после ренатурации и очистки на Ni Sepharose;
2 – препарат после расщепления белка Trx/TRAIL энтеропептидазой;
3 – фракция очищенного TRAIL после элюции c колонки Ni-NTA 35 мМ имидазолом, 4 – фракция белков после элюции 250 мМ имидазолом.
Тиоредоксин способен связываться с никелевой агарозой за счет наличия последовательности из шести гистидинов. TRAIL также способен связываться с никелевой агарозой, но с меньшей аффинностью, чем тиоредоксин. TRAIL элюировали буфером, содержащим 35 мМ имидазола, тогда как тиоредоксин начинал элюироваться при содержании имидазола более 100 мМ (Рис. 3).
Полученный раствор белка диализовали против буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия и 150 мМ хлорида натрия (рН 7.5), стерилизовали путем пропускания через стерильный фильтр и хранили при 4°С. Итоговый выход белка составил 41 мг из мл культуры клеток (Табл. 1). Полученный препарат очищенного цитокина TRAIL сохранял стабильность и биологическую активность в течение не менее 3 лет при хранении как в растворенном, так и в лиофилизованном виде.
Таблица 1. Этапы очистки TRAIL из 100 мл клеточной культуры.
Этап очистки Целевой белок, мг Выход белка, % Растворение телец включенияа 150 Ренатурация Trx/TRAIL 90 Очистка Trx/TRAIL на Ni-NTA High 85 Performance Расщепление Trx/TRAIL 80 (44 мг TRAIL) 90. энтеропептидазой Очистка TRAIL на Ni-NTA Superflow 41 a Тельца включения промыли ресуспендированием в 50 мл лизис-буфера, содержащего 20 мМ трис гидрохлорида, (рН 7.5), 10 мМ ЭДТА, 1% Тритона Х-100 и центрифугированием при 30000g в течение 20 мин, 4С. Отмытые тельца включения растворили в 25 мл буфера, содержащего 0.1М трис-гидрохлорид (рН 8.6), 30 мМ ДТТ и 6М гуанидин-гидрохлорид, и инкубировали в течение часов при комнатной температуре, после чего удалили нерастворившийся материал центрифугированием при 80000g, 4С, 30 минут.
После переноса полученного белка TRAIL на PVDF-мембрану с помощью ПААГ электрофореза и электроблоттинга, определили его N-концевую аминокислотную последовательность (VRERGP). Полученная последовательность совпала с последовательностью аминокислотных остатков 114-119 человеческого цитокина TRAIL, что подтвердило идентичность рекомбинантного аналога.
Помимо получения белка TRAIL дикого типа путем ренатурации телец включения, мы также очистили TRAIL из растворимой фракции. Этот препарат имел аналогичную биологическую активность и коэффициент седиментации, что и полученный методом ренатурации. В связи с этим дальнейшие эксперименты проводили с препаратом, полученным из телец включения, поскольку его выход был примерно в 6 раз больше, чем у препарата, очищенного из цитоплазматической фракции (Табл. 3).
2. Исследование физико-химических свойств и биологической активности препарата рекомбинантного TRAIL Исследование препарата рекомбинантного TRAIL методом аналитического ультрацентрифугирования. Для определения структуры и гомогенности полученного белка TRAIL был проведен седиментационный анализ на ультрацентрифуге Spinco E (Beckman Coulter). Данные аналитического ультрацентрифугирования показали, что 98% полученного препарата рекомбинантного белка TRAIL состоит из тримерных молекул (Рис. 4). Это говорит о потенциальной эффективности препарата, так как TRAIL индуцирует апоптоз, находясь в тримерном состоянии. Препарат белка оставался гомогенным даже при высокой концентрации белка (1 мг/мл), фракция высокомолекулярных агрегатов не превышала 3%.
Рис. 4. Седиментограмма рекомбинантного белка TRAIL.
Анализ проводился при 60000 об/мин в стандартных кюветах объемом 0.4 мл. Кривые регистрировали на 1, 10, 20, 45, 54, 60, 74 и 86 минуте (кривые слева направо, соответственно) по поглощению при 280 нм. Радиус (по оси Х) вычисляли от верха до дна кюветы.
Расчет распределения значений S производился по методу наименьших квадратов исходя из характера смещения средней точки седиментационных кривых, с использованием программы SEDFIT.
Вычисленный коэффициент седиментации S20,w=4.49±0.04 соответствовал молекулярной массе 57439 Да в приближении сферической глобулы. Вычисленная масса находится в соответствии с теоретической молекулярной массой тримерного TRAIL Да. Это свидетельствует о том, что рекомбинантный TRAIL в растворимом виде представляет из себя глобулу.
Кристаллизация рекомбинантного TRAIL. Очищенный препарат TRAIL обладал способностью формировать кристаллы при концентрации выше 0.7 мг/мл при 4С в буфере для хранения, содержащем 150 мМ хлорида натрия и 50 мМ фосфата натрия (рН 7.5). Кристаллы появлялись на второй неделе хранения при концентрации белка 1.5 мг/мл и имели вид правильной призмы с тройной симметрией размерами до 0.6х0.6х0.2 мм (Рис.
5 А). При концентрации белка 0.7 мг/мл в буфере, содержащем 50 мМ хлорида натрия и 50 мМ трис-гидрохлорида (рН 7.5), формировались кристаллы меньшего размера (данные не показаны). Анализ кристаллов методом рентгеновской спектроскопии показал разрешение дифракционной решетки 3.0 (Рис. 5 Б). Кристаллы относятся к пространственной группе P31 с параметрами единичной ячейки a=b=72.5, c=141.5, ==90° и =120°.
Биологическая активность рекомбинантного TRAIL. Препарат рекомбинантного тримерного TRAIL индуцировал частичную гибель клеток линии HeLa через 8 часов инкубации (Рис. 6). При более длительной инкубации (24 часа) TRAIL в концентрации 100 нг/мл вызывал 36% апоптоза (данные не показаны). Ингибитор синтеза белка эметин значительно усиливал действие TRAIL в клетках HeLa (Рис. 6). После 8 часовой инкубации полумаксимальная гибель клеток наблюдалась при концентрации TRAIL 10 нг/мл в присутствии эметина (0.3 мкг/мл). Максимальный эффект (90-100% клеточной гибели) наблюдали при концентрации TRAIL 100 нг/мл в присутствии эметина.
Рис. 5. Рентгеноструктурный анализ кристаллов TRAIL.
Кристаллы рекомбинантного TRAIL выращивали в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия (рН 7.5) и 150 мМ хлорида натрия при концентрации белка 1.5 мг/мл и 4С.
Кристаллы достигали размеров 0.6х0.6х0.2 мм (А). Анализ кристаллов TRAIL методом рентгеновской спектроскопии с использованием Cu K излучения на детекторе MAR- показал разрешение дифракционной решетки 3.0 (Б).
Рис. 6. Индукция апоптоза рекомбинантным TRAIL в линии клеток HeLa.
Клетки инкубировали с серийными разведениями TRAIL в течение часов. Для ингибирования синтеза белка вместе с TRAIL добавляли эметин (0.3 мкг/мл). Индукцию апоптоза определяли методом подсчета клеток с фрагментированными и конденсированными ядрами.
Клеточная гибель имела характерные признаки апоптоза: уменьшение объема клеток, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация и фрагментация ядер и др.
(данные не показаны). Пан-каспазный ингибитор zVADfmk предотвращал клеточную гибель (данные не показаны). Уровень некроза (детектированный окрашиванием йодидом пропидия) не превышал 5% во всех экспериментах.
Цитотоксичность препарата TRAIL проверяли на клеточной культуре первичных фибробластов и на мышах. Препарат рекомбинантного цитокина TRAIL был нетоксичен для первичных фибробластов кожи в концентрации до 5000 нг/мл в присутствии и отсутствии эметина. Он также был нетоксичен для мышей при внутривенных инъекциях в дозе 30 мг/кг веса в день в течение 7 дней.
Апоптоз, вызванный TRAIL, полностью подавлялся при гиперэкспрессии онкобелка Bcl-2 в клетках HeLa-Bcl-2, как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора синтеза белка эметина (Рис. 7). Ингибиторы микротрубочек таксол и колцемид, а также ингибитор актиновых микрофиламентов цитохалазин Д усиливали действие TRAIL и позволяли преодолеть защиту, связанную с гиперэкспрессией Bcl-2. В клетках HeLa-Bcl- в присутствии ингибиторов цитоскелета TRAIL вызывал апоптоз (около 40% клеточной гибели), уровень которого был сопоставим с уровнем апоптоза в исходной линии HeLa без ингибиторов (около 30% клеточной гибели). Усиление действия TRAIL ингибиторами цитоскелета сохранялось и в условиях подавления синтеза белка эметином (Рис. 7 Б).
Сигнальный путь при TRAIL-зависимом апоптозе включает образование лиганд рецепторного комплекса, в который входит ряд белков цитоплазмы, включая каспазу-8.
Далее следует протеолитическая самоактивация каспазы-8, расщепление белка Bid, его транслокация в митохондрии, выход цитохрома с (и других про-апоптозных белков) из митохондрий в цитоплазму, образование апоптосомы, в которой происходит активация каспазы-9 и других каспаз, осуществляющих финальные стадии апоптоза.
Рис.7. Апоптоз, вызванный TRAIL с цитоскелетными ингибиторами в клетках HeLa (светлые столбцы) и HeLa-Bcl-2 (штрихованные столбцы).
Клетки инкубировали с TRAIL (500нг/мл) без эметина в течение 24 ч (А) или в комбинации с ингибитором синтеза белка эметином (0,3 мкг/мл) в течение 8 ч (Б).
Ингибиторы цитоскелета колцемид (0,5мкг/мл), таксол (10мкМ), и цитохалазин Д (1мкг/мл) добавляли одновременно с TRAIL. Апоптоз определяли методом подсчета клеточных ядер с конденсированным хроматином после окрашивания красителем Хёхст 33342 (1 мкг/мл). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение не менее трех независимых экспериментов.
В данной работе гиперэкспрессия Bcl-2 в клетках HeLa блокировала TRAIL индуцированный выход цитохрома с из митохондрий. В этих клетках выход цитохрома с наблюдался лишь при обработке клеток HeLa Bcl-2 цитокином TRAIL в комбинации с ингибиторами цитоскелета (Рис. 8). Преодоление блокирующего действия Bсl- ингибиторами цитоскелета может быть связано с активацией более ранних этапов апоптоза, с инактивацией Bcl-2 или с изменением механизма выхода цитохрома с. Кроме того, каспаза-8 способна напрямую процессировать и активировать каспазу-3, которая,атакуя митохондрии, вызывает Bcl-2-независимый выход цитохрома с.
Рис. 8. Выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму клеток HeLa и HeLa-Bcl-2 в процессе TRAIL-индуцированного апоптоза.
Клетки инкубировали с TRAIL (500нг/мл), эметином (0,3 мкг/мл) и таксолом (10мкМ) (в указанных экспериментах) в течение 24 часов. Цитохром с окрашивали с помощью специфических моноклональных антител. Стрелками показаны клетки, из которых цитохром с вышел в цитоплазму.
Однако в присутствии ингибиторов цитоскелета не наблюдалось усиления TRAIL индуцированного процессинга прокаспазы-8, а также протеолиза ее субстрата Bid (данные не показаны). Это свидетельствует о том, что под действием ингибиторов цитоскелета не происходит активации ранних этапов TRAIL-индуцированного апоптоза. Ранее было показано, что ингибиторы микротрубочек (прежде всего таксол) способны инактивировать Bcl-2, вызывая его фосфорилирование. Для проверки этой возможности были исследованы способы индукции апоптоза в клетках HeLa, связанные с воздействием стауроспорина (неселективного ингибитора протеинкиназ) и кратковременного истощения АТФ. Однако защитный эффект Bcl-2 не ослаблялся ни при воздействии стауроспорина, ни при кратковременном истощением АТФ в присутствии ингибиторов цитоскелета (данные не показаны). По-видимому, стимулирующее действие ингибиторов цитоскелета на выход цитохрома с связано не с инактивацией Bcl-2, а с изменением механизма выхода цитохрома с из митохондрий в цитоплазму. Учитывая, что таксол и колцемид входят во многие современные схемы химиотерапии опухолей, их совместное применение с препаратом рекомбинантного TRAIL открывает широкие перспективы для лечения опухолей, резистентных к традиционной терапии.
3. Получение и исследование рецептор-специфических мутантных вариантов TRAIL Для исследования механизмов TRAIL-индуцированного апоптоза в ряде лабораторий были получены DR4- и DR5-специфичные мутантные варианты TRAIL, имеющие в различной степени сниженную аффинность к рецепторам DcR1, DcR2 и OPG.
В данной работе получены два новых DR5-специфичных мутантных варианта TRAIL DR5-A и DR5-B, обладающие повышенной селективностью к рецептору DR5 и высокой биологической активностью. Новые варианты DR5-A и DR5-B были разработаны на основе ранее описанного варианта DR5-8, полученного методом фагового дисплея, и D269H, полученного с помощью алгоритма автоматического дизайна FOLD-X (Табл. 2).
Вариант DR5-8 обладал лучшей селективностью, чем D269H. Однако аффинность связывания варианта D269H с рецептором DR5 была в несколько раз выше по сравнению с вариантом DR5-8. Для повышения селективности без потери аффинности к рецептору DR5 мы разработали вариант DR5-A путем введения мутации D269H в аминокислотную последовательность варианта DR5-8, содержащего 6 других аминокислотных замен (Табл. 2). Анализ исходных данных показал, что аминокислотный остаток D267 не играет существенной роли в повышении селективности. Замена D267Q в варианте DR5- приводила к незначительному повышению аффинности и биологической активности.
Таблица 2. Аминокислотные замены в различных мутантных вариантах TRAIL.
Варианты Аминокислотные замены Ссылки TRAIL wt TRAIL - - - - - - DR4-8 Y189A - Q193S N199V K201R Y213W S215D * DR5-8 Y189N R191K Q193R H264R I266L D267Q - * D269Н - - - - - - D269H ** Данная DR5-А Y189N R191K Q193R H264R I266L D267Q D269H работа Данная DR5-В Y189N R191K Q193R H264R I266L - D269H работа * Kelley, R. F., Totpal, K., Lindstrom, S. H. et al. (2005). Receptor-selective mutants of apoptosis-inducing ligand 2/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand reveal a greater contribution of death receptor (DR)5 than DR4 to apoptosis signaling. J. Biol. Chem. 280: 2205-2212.
** Van der Sloot, A.M., Tur, V., Szegezdi, E., et al. (2006). Designed tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand variants initiating apoptosis exclusively via the DR5 receptor. Proc Natl Acad Sci USA 103:8634 8639.
Для прояснения роли остатка D267 на основе варианта DR5-A был получен вариант DR5 B, содержащий обратную замену Q267D, как у TRAIL дикого типа (Табл. 2). Таким образом, в данной работе мы получили два новых мутантных варианта DR5-A и DR5-В, а также описанные ранее варианты DR4-8, DR5-8 и D269H для сравнения рецептор специфичных свойств различных вариантов TRAIL. Все мутации вводили методом сайт направленного мутагенеза.
Экспрессия и очистка мутантных вариантов TRAIL. Экспрессию рекомбинантных мутантных белков D269H, DR5-8, DR4-8, DR5-A и DR5-B проводили в виде гибридных белков с тиоредоксином аналогично TRAIL дикого типа. Однако в отличие от TRAIL дикого типа, который на 90% экспрессировался в нерастворимом виде, гибридные мутантные белки Trx/D269H, Trx/DR5-8, Trx/DR4-8, Trx/DR5-A и Trx/DR5-B на 60-70% экспрессировались в растворимом виде (данные не показаны). Введение мутаций в аминокислотную последовательность TRAIL привело к повышению растворимости белка в 3-5 раз. Возможно, повышение растворимости связано с тем, что все вводимые мутации расположены на поверхности молекулы TRAIL и являются более гидрофильными по сравнению с аминокислотными остатками дикого типа.
Гибридные мутантные белки Trx/D269H, Trx/DR5-8, Trx/DR4-8, Trx/DR5-A и Trx/DR5-B были очищены из растворимой фракции с помощью металл-аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Ni Sepharose High Performance. Расщепление и очистку рекомбинантных мутантных белков D269H, DR5-8, DR4-8, DR5-A и DR5-B проводили аналогично TRAIL дикого типа. Итоговые выходы очищенных препаратов представлены в Табл.3.
Таблица 3. Итоговый выход очищенных препаратов вариантов TRAIL из цитоплазматической фракции белков (из 100 мл культуры клеток).
Варианты TRAIL Дикий тип DR4-8 DR5-8 D269H DR5-A DR5-B Выход очищенного 7.5 14 15 14.5 16 белка, мг Данные седиментационного анализа показали, что рекомбинантные мутантные белки D269H, DR5-8, DR4-8, DR5-A и DR5-B на 98% состоят из тримеров и имеют относительную молекулярную массу 57-60 кДа. Седиментограммы мутантных вариантов TRAIL аналогичны TRAIL дикого типа (Рис.4).
4. Определение констант диссоциации при связывании различных вариантов TRAIL с пятью рецепторами.
Константы диссоциации для прямого связывания каждого из вариантов TRAIL с рецепторами определяли методом поверхностного плазмонного резонанса. Рецепторы наносили на сенсорный чип с высокой плотностью (6000-8000 рез. ед.) для получения удовлетворительного сигнала от вариантов лиганда. Для предварительной оценки по нМ высокоочищенных вариантов TRAIL (TRAIL дикого типа и его мутантные варианты DR5-8, D269H, DR5-A и DR5-B) одновременно наносили на 6х6-канальный сенсорный чип с пятью иммобилизованными рецепторами DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG (Рис. 9).
Рис. 9. Сенсограммы связывания вариантов TRAIL с пятью рецепторами, полученные методом поверхностного плазмонного резонанса.
После регистрации сигналов чип регенерировали и сенсограммы регистрировали одновременно для пяти концентраций вариантов TRAIL в диапазоне от 15 до 250 нМ (с двукратным инкрементом). Сенсограммы анализировали методом нелинейного регрессионного анализа в соответствии с моделью связывания 1:1 программного обеспечения ProteOn Manager Version 2.0.1 (Bio-Rad) для определения скоростей диссоциации. Константы диссоциации KD вычисляли из констант скоростей реакций по формуле KD = koff/kon для пяти различных концентраций.
Вычисленные значения KD для TRAIL дикого типа находятся в соответствии с данными, полученными ранее. Анализ сенсограмм показал полное отсутствие связывания мутантных вариантов DR5-A и DR5-B, так же как и DR5-8, с рецепторами DR4 и DcR1, тогда как значение KD варианта D269H для связывания с этими рецепторами лишь увеличилось в 18.5 и 8 раз, соответственно, по сравнению с TRAIL дикого типа (Табл. 4).
В то же время, константа диссоциации варианта D269H для связывания с рецептором DR была в 4 и 9 раз ниже, чем KD дикого типа и DR5-8, соответственно. Введение мутации D269H в вариант DR5-8 приводило к снижению KD при связывании с рецептором DR полученного варианта DR5-A в 3.5 раза без потери селективности к другим рецепторам.
Аффинность всех этих мутантных вариантов TRAIL по отношению к рецептору DcR была лишь немного ниже, чем TRAIL дикого типа. Однако введение обратной мутации Q267D в вариант DR5-A (вариант DR5-B) привело к значительному повышению селективности, практически не повлияв на аффинность к рецептору DR5 (Табл. 4).
Аффинность мутантного варианта DR5-B к рецепторам DcR2 и OPG была в 280 и 223 раза ниже, соответственно, по сравнению с TRAIL дикого типа.
Таблица 4. Константы диссоциации при связывании различных вариантов TRAIL с пятью рецепторами, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса.
KD,10-9 M Варианты TRAIL DR5 DR4 DcR1 DcR2 OPG 0.51 ± 0.028 0.46 ± 0.014 1.09 ± 0.069 0.36 ± 0.009 0.99 ± 0. Дикий тип 0.13 ± 0.003 8.47 ± 0.335 8.69 ± 0.628 0.73 ± 0.014 5.26 ± 0. D269H 1.18 ± 0.017 НС НС 3.32 ± 0.048 10.9 ± 0. DR5- 0.33 ± 0.005 НС НС 4.18 ± 0.082 12.2 ± 0. DR5-A 101 ± 7. 0.71 ± 0.013 НС НС DR5-B 143 ± 13* 221 ± 19* НС 3.26 ± 0.010 2.49 ± 0.950 2.10 ± 0.075 21.0 ± 0. DR4- НС, Нет связывания.
Стандартное отклонение вычисляли путем аппроксимации кривых сенсограмм с помощью программного обеспечения ProteOn Manager Version 2.0.1 software (Bio-Rad) по критерию хи-квадрат.
• KD определяли по равновесным графикам (Рис. 10).
Рис. 10. Кривые связывания мутантного варианта DR5-B с рецепторами DcR2 и OPG (A) и графики зависимости равновесного связывания (Req) от концентрации мутантного варианта DR5-B (Б), полученные методом ППР. Цветными линиями показаны концентрации DR5-B от 62.5 нМ до 1 мкМ и OPG от 125 до 2000 нМ.
Для этих случаев были характерны высокие значения скорости диссоциации комплексов рецептор-лиганд. Достоверное значение KD при связывании с рецептором OPG вычисляли только путем измерения равновесного связывания. Значение KD при связывании с рецептором DcR2 вычисляли как кинетическим, так и равновесным методом. Оба метода продемонстрировали приблизительно одинаковый результат (Рис. 10, Табл. 4).
Полученные данные свидетельствуют, что аминокислотный остаток D267 в комбинации с заменами мутантного варианта DR5-A играет важную роль во взаимодействиях TRAIL с рецепторами DcR2 и OPG. Таким образом, данные по связыванию вариантов TRAIL с рецепторами, полученные методом поверхностного плазмонного резонанса, свидетельствуют о том, что мутантный вариант DR5-B обладает наибольшей селективностью по отношению к рецептору DR5 по сравнению с остальными мутантными вариантами TRAIL.
5. Исследование индукции апоптоза рецептор-селективными мутантными вариантами TRAIL Биологическую активность различных вариантов TRAIL определяли на нескольких линиях раковых клеток с различной селективностью и чувствительностью к TRAIL-индуцированному апоптозу. Это клетки линии карциномы матки человека HeLa, экспрессирующие рецепторы DR4 и DR5 приблизительно в равных количествах, и практически не экспрессирующие рецепторы DcR1 и DcR2;
клетки острой Т-лейкемии человека Jurkat, экспрессирующие преимущественно рецептор DR5;
клетки монобластической лейкемии человека U937, экспрессирующие преимущественно рецепторы DR5 и DcR2;
клетки миелоидной лейкемии К562, экспрессирующие все четыре рецептора. Индукцию апоптоза вариантами TRAIL во всех линиях клеток определяли методом МТТ. Мутанты DR5-A и DR5-B сравнивали с TRAIL дикого типа и с ранее описанными мутантными вариантами DR5-8, DR4-8 и D269H.
В клетках HeLa варианты DR5-A и DR5-B индуцировали апоптоз в несколько раз эффективнее, чем TRAIL дикого типа, и их эффективность приблизительно совпадала с эффективностью варианта D269H (Рис. 11 А, Табл. 5). Значение эффективной концентрации ЕС50 для индукции апоптоза вариантом DR5-8 была сравнима с TRAIL дикого типа, однако максимальный эффект был ниже. DR4-специфичный вариант DR4- индуцировал апоптоз лишь в небольшой (около 25%) фракции клеток, однако отличался высоким значением ЕС50 наравне с вариантом DR5-B (EC50 = 1.6 нг/мл и EC50 = 1.5 нг/мл, соответственно), хотя вариант DR5-B индуцировал апоптоз в 78% клеток.
Рис. 11. Биологическая активность TRAIL дикого типа и DR5-селективных мутантных вариантов в линиях клеток HeLa, Jurkat, K562 и U937.
Индукцию апоптоза вариантами TRAIL определяли методом МТТ. Для повышения чувствительности клеточных линий HeLa и U937 к TRAIL-индуцированному апоптозу в среду для культивирования добавляли эметин (0.05 и 0.25 мкг/мл, соответственно).
Таблица 5. Значения ЕС50 для апоптоза, индуцированного вариантами TRAIL в различных линиях клеток.
HeLa** K562 Jurkat U937** Варианты TRAIL EC50, апоптоз EC50, апоптоз EC50, апоптоз EC50, апоптоз нг/мл % нг/мл % нг/мл % нг/мл % Дикий тип 6.2 ± 0.5 93 ± 6 0.22 ± 0.02 60 ± 4 0.28 ± 0.03 37 ± 3 0.27 ± 0.03 22 ± D269H 2.1 ± 0.2 91 ± 6 0.23 ± 0.03* 85 ± 7 0.17 ± 0.02 43 ± 3 0.27 ± 0.03 25 ± DR5-8 6.0 ± 0.6 45 ± 3 0.27 ± 0.02 27 ± 3 0.15 ± 0.02 48 ± 4 0.15 ± 0.02 43 ± DR5-A 2.2 ± 0.2 86 ± 7 0.73 ± 0.06 34 ± 3 0.07 ± 0.01 56 ± 5 0.09 ± 0.01 43 ± DR5-В 1.5 ± 0.1 78 ± 6 1.11 ± 0.07 35 ± 3 0.07 ± 0.01 53 ± 5 0.08 ± 0.01 50 ± DR4-8 1.6 ± 0.2 25 ± 3 0.23 ± 0.02 62 ± 7 0.71 ± 0.06 26 ± 3 0.26 ± 0.02 14 ± Результаты показаны в виде среднего значения ± среднеквадратичная ошибка не менее трех независимых экспериментов.
* Значение EC50 вычисляли для концентрации TRAIL до 25 нг/мл.
** В клетках HeLa и U937 TRAIL-индуцированный апоптоз вызывали в присутствии 0. мкг/мл и 0.25 мкг/мл эметина, соответственно.
Полученные данные свидетельствуют о том, что TRAIL-индуцированный апоптоз в клетках HeLa протекает посредством рецептора DR4 наравне с рецептором DR лишь в части клеточной популяции, тогда как в большей части популяции DR4-зависимый путь ингибирован.
В линии клеток Jurkat варианты DR5-A и DR5-B индуцировали апоптоз более эффективно, чем TRAIL дикого типа и варианты DR4-8, DR5-8 или D269H (Рис. 11 Б, Табл.
5). Как и в линии HeLa, мутантный вариант DR4-8 индуцировал апоптоз лишь в 26% клеток линии Jurkat. Эффективность варианта DR4-8 в наших экспериментах была в 2.5, 4.2 и 4.7 раз ниже по сравнению с TRAIL дикого типа и вариантами D269H и DR5-8, соответственно.
Действие вариантов TRAIL на линии клеток К562 было более сложным. Эти клетки экспрессируют все четыре рецептора, однако, в некоторых лабораториях клетки К562 проявляли резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу. В других лабораториях клетки К562 были достаточно чувствительны к TRAIL. Наши данные находятся в соответствии с этими наблюдениями. В наших экспериментах вариант DR4- продемонстрировал эффективность наравне с TRAIL дикого типа и вызывал до 60% клеточной гибели (Рис. 11 В). По данным ППР, вариант DR4-8 обладал сниженной аффинностью к рецепторам DR4 и DcR1 в 7.0 и 2.5 раза, соответственно (Табл. 4).
Возможно, высокая эффективность варианта DR4-8 в клетках К562 связана с преодолением защитного действия рецептора-«ловушки» DcR1, который ингибирует клеточную гибель, соревнуясь за связывание с лигандом TRAIL. DR5-специфичные варианты DR5-8, DR5-A и DR5-B имели сниженную эффективность (Рис. 11 В).
Полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках К562, использованных в нашей работе, апоптоз протекает преимущественно посредством рецептора DR4.
Вариант D269H в высоких концентрациях (до 400 нг/мл) демонстрировал еще более высокую эффективность в клетках К562, чем TRAIL дикого типа (до 85% клеточной гибели) (Рис. 11 В). Индукция апоптоза DR5-специфичным вариантом D269H в клетках линии K562 была достаточно неожиданной. Возможно, причиной его эффективного действия является сниженная аффинность к рецепторам DR4 и DcR1 (в 18.4 и 7.9 раз, соответственно) (Табл. 4). Кроме того, не стоит исключать возможность того, что вариант D269H преодолел внутренний блок DR5-индуцированного апоптоза в клетках К562 за счет чрезвычайно высокой аффинности к рецептору DR5.
Цитотоксическая активность вариантов DR5-8, DR5-A и DR5-B в линии клеток U937 была значительно выше, чем TRAIL дикого типа. Эти варианты демонстрировали повышенный максимальный ответ (почти вдвое) и сниженные значения EC50 (1.8, 3.0 and 3.4, соответственно). Цитотоксическая активность мутантного варианта D269H в клетках линии U937 была подобна TRAIL дикого типа (Рис. 11 Г). Так как вариант D269H обладает высокой аффинностью к рецептору DcR2, сопоставимой с TRAIL дикого типа, вероятно, он может обеспечивать связывание рецептора DcR2 наряду с рецептором DR5 в составе комплекса DISC, в результате чего происходит ингибирование активации инициаторных каспаз. Новые мутантные варианты DR5-A и DR5-B обладают сниженной аффинностью к рецептору DcR2. Вероятно, это является причиной их повышенной эффективности в клетках линии U937 по сравнению с TRAIL дикого типа и вариантами DR5-8 или D269H. Для подтверждения этого предположения требуется исследование процесса формирования комплекса DISC с различными вариантами TRAIL.
Цитотоксическая активность мутантных вариантов TRAIL также была исследована на линии клеток HeLa с гиперэкспрессией Bcl-2. Так же, как и TRAIL дикого типа, ни один из полученных вариантов не преодолевал Bcl-2-индуцированный блок апоптоза (Рис. 12). Кроме того, мы исследовали эффект вариантов TRAIL на линиях клеток HeLa и HeLa-Bcl-2 в комбинации с ингибиторами цитоскелета цитохалазином Д и таксолом и с ингибитором синтеза белка эметином. Все мутантные варианты TRAIL не утратили способности преодолевать блок Bcl-2 в комбинации с ингибиторами цитоскелета (Рис. 12). Следует отметить, что таксол, в отличие от цитохалазина Д, полностью заменял эметин, усиливая апоптоз в комбинации со вcеми вариантами TRAIL. Более того, действие таксола не суммировалось с действием эметина (Рис. 12).
Рис. 12. Индукция апоптоза вариантами TRAIL в линии клеток HeLa-Bcl-2 в комбинации с ингибиторами цитоскелета цитохалазином Д и таксолом.
Клетки инкубировали с различными вариантами TRAIL в присутствии эметина (0. мкг/мл) в течение 8 часов или в отсутствие эметина в течение 24 часов. Ингибитор роста микротрубочек таксол (10 мкМ) и ингибитор актиновых микрофиламентов цитохалазин Д (1 мкг/мл) добавляли одновременно с вариантами TRAIL. Апоптоз определяли методом подсчета клеточных ядер с конденсированным хроматином. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение не менее трех независимых экспериментов.
Ранее усиление апоптоза при совместном действии TRAIL и эметина объясняли ингибированием NF-B-зависимой экспрессии антиапоптотических белков. Однако природа полученного нами эффекта требует дополнительного исследования.
Вышеперечисленные данные свидетельствуют об исключительной сложности экспрессии и функционирования рецепторов TRAIL в различных типах клеток.
Результаты, полученные в настоящей диссертационной работе, свидетельствуют о том, что мутантные варианты DR5-A и DR5-B более специфичны по отношению к рецептору DR5 и демонстрируют повышенную биологическую активность по сравнению с мутантными вариантами DR5-8 и D269H. Новые DR5-специфичные мутантные варианты TRAIL могут служить удобным инструментом для изучения роли различных рецепторов в механизме TRAIL-индуцированного апоптоза в линиях раковых клеток и являются потенциальными средствами для терапии опухолей, не чувствительных к TRAIL дикого типа.
ВЫВОДЫ 1. Разработаны методы экспрессии и очистки белка TRAIL и его рецептор-специфичных мутантных вариантов.
2. Методом аналитического ультрацентрифугирования показано, что полученные препараты TRAIL и его мутантных вариантов высоко гомогенны и на 98% состоят из тримерных молекул.
3. Методом поверхностного плазмонного резонанса определены константы диссоциации при связывании TRAIL дикого типа и его рецептор-специфичных мутантных вариантов с рецепторами смерти DR4 и DR5 и с рецепторами-«ловушками» DcR1, DcR2 и OPG.
4. Показано, что полученные мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B обладают высокой аффинностью к рецептору смерти DR5, практически не связываются с рецепторами DR4 и DcR1, а их сродство к рецепторам DcR2 и OPG в 20 и 100 раз ниже, соответственно, по сравнению с TRAIL дикого типа.
5. Показано, что введение мутации Asp269His в вариант DR5-8 усиливает сродство к рецептору DR5 в 3.5 раза без потери селективности к другим рецепторам, а аминокислотный остаток Asp267 ухудшает взаимодействие TRAIL с рецепторами «ловушками» DcR2 и OPG.
6. Показано, что DR5-специфичные мутантные варианты TRAIL DR5-A и DR5-B в несколько раз эффективнее вызывают апоптоз в DR5-чувствительных линиях раковых клеток по сравнению с TRAIL дикого типа.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:
1. Gasparian, M.E., Ostapchenko, V. G., Yagolovich, A. V., Tsygannik, I. N., Chernyak, B. V., Dolgikh, D. A., Kirpichnikov, M. P. (2007). Overexpression and refolding of thioredoxin/TRAIL fusion from inclusion bodies and further purification of TRAIL after cleavage by enteropeptidase. Biotechnol. Lett. 10:1567-1573.
2. Гаспарян М. Э., Домнина Л. В., Иванова О. Ю., Изюмов Д. С., Ломакин А. Ю., Попова Е. Н., Яголович А. В., Плетюшкина О. Ю., Долгих Д. А., Черняк Б. В. (2008). Ингибиторы цитоскелета в комбинации с TRAIL индуцируют апоптоз в резистентных клетках карциномы HeLa c гиперэкспрессией белка Bcl-2. Биохимия 73:440-445.
3. Gasparian, M. E., Chernyak, B. V., Dolgikh, D. A., Yagolovich, A. V., Popova, E. N., Sycheva, A. M., Moshkovskii, S. A., Kirpichnikov, M. P. (2009). Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5. Apoptosis 6:778-787.
Тезисы конференций:
1. Горожанина А.В. (2006). Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Apo2L/TRAIL в E.coli и исследование его биологической активности на культуре клеток HeLa. XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2006», Москва. Тезисы докладов. с.62-63.
2. Яголович А.В. (2006). Увеличение аффинности рекомбинантного человеческого цитокина Apo2L/TRAIL по отношению к рецептору DR5/TRAIL-R2 путем внесения мутаций в генетическую последовательность лиганда. Первый студенческий симпозиум по биоинженерии, Москва. Тезисы докладов, с. 41-42.
3. Яголович А.В. (2007). Экспрессия в E.coli и очистка мутантного варианта рекомбинантного человеческого цитокина DR5-Apo2L/TRAIL. XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2007», Москва.
Тезисы докладов. с. 75.
4. Яголович А.В., Долгих Д.А., Гаспарян М.Э. (2007). Высокий уровень экспрессии и очистка мутантного варианта TRAIL-DR5 человеческого цитокина TRAIL с повышенной специфичностью к рецептору DR5/TRAIL-R2. IV Международная конференция "Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия". ЦВТ ХимРар, Московская обл., г.Химки, Тезисы докладов, с. 45.
5. Yagolovich, A.V., Chernyak, B.V., Dolgikh, D.A., Gasparian, M.E. (2008). Receptor selective mutants of TRAIL to DR5. 16 Euroconference on Apoptosis. Bern, Switzerland.
Abstracts, р. 60.
6. Яголович А.В., Долгих Д.А., Гаспарян М.Э. (2010). Исследование селективности и биологической активности мутантных вариантов противоопухолевого цитокина TRAIL DR5-A и DR5-B с повышенной специфичностью к рецептору DR5. III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика – 2010", Москва.
Сборник материалов, т. 3, с. 370.
7. Gasparian, M.E., Yagolovich, A.V., Popovа, E.N., Dolgikh, D.A., Chernyak, B.V. (2010).
Cytoskeleton inhibitors stimulate apoptosis induced by TRAIL or TNFa in HeLa cells overexpressing Bcl-2. FEBS workshop Mitochondrial physiology, Innsbruck, Austria. Abstracts, p. 109-110.
8. Яголович А.В., Гаспарян М.Э. (2010) Разработка противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантного цитокина TRAIL и его мутантов DR5-A и DR5-B с повышенной специфичностью к рецептору смерти DR5. XIV Российский онкологический конгресс, Москва. Материалы конгресса, с.347-348.
Патент:
Гаспарян М.Э., Яголович А.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Способ получения мутантного белка TRAIL человека. Роспатент № 2405038, Патентная заявка № от 29.07.2009.