Молекулярная детекция и новые фенотипические свойства термофильных бактерий родов thermoanaerobacter и caldanaerobacter
На правах рукописи
КОЗИНА Ирина Владимировна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ И НОВЫЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ THERMOANAEROBACTER И CALDANAEROBACTER Специальность 03.00.07-микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2008
Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН
Научный консультант: доктор биологических наук Е.А. Бонч-Осмоловская
Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор А.С. Яненко доктор биологических наук А.Н. Ножевникова
Ведущая организация: Биологический факультет Московского Государственного Университета им М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится «13» октября 2008 г. в ч.
на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, к.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им.С.Н. Виноградского РАН
Автореферат разослан сентября 2008. г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Интерес к термофильным микроорганизмам, которые активно исследуются последние два десятилетия, определяется задачами как фундаментального, так и прикладного характера. Последние в основном связаны с наличием у термофильных прокариот термостабильных ферментов и возможностью их применения в различных областях биотехнологии. Многие микробиологические и биохимические исследования посвящены органотрофным термофильным бактериям, в том числе обладающим способностью к гидролизу различных биомолекул. К ним относятся анаэробные умеренно-термофильные органотрофные бактерии, впервые описанные как представители рода Clostridium, но затем отнесенные к родам Thermoanaerobacterium и Thermoanaerobacter (Lee, 1993). В настоящее время в род Thermoanaerobacter входит 14 видов, выделенных из различных мест обитания:
горячих источников (Zeikus et al., 1979), цианобактериальных матов (Бонч Осмоловская и др., 1997), вулканических озер (Slobodkin et al., 1999), высокотемпературных нефтяных пластов (Cayol et al., 1995) и др. Это умеренные термофилы, облигатные анаэробы с бродильным типом метаболизма, способные в процессе брожения восстанавливать различные неорганические акцепторы электронов – серу, тиосульфат, окисное железо. Экстремально- термофильные организмы, первоначально отнесенные к этому роду (Xue et al., 2001;
Kim et al., 2001), впоследствии реклассифицированы как представители нового рода Caldanaerobacter (Fardeau et al., 2004). Представители родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter оказались способными к синтезу протеиназ с новыми, ценными для биотехнологии свойствами (Riessen et al., 2001, Jang et al., 2002). Однако можно предположить, что разнообразие метаболических свойств и биотехнологический потенциал этих микроорганизмов еще далеко не исчерпаны. Это делает актуальным детальное исследование распространения и метаболического разнообразия термофильных бактерий, относящихся к родам Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter.
Цель работы. Целью данной работы являлось исследование распространения и разнообразия бактерий рода Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter молекулярно биологическими методами.
Основные задачи исследования состояли в следующем:
1. Разработка методов молекулярной детекции и/или идентификации термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter;
2. Детекция термофильных бактерий рода Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных культурах и природных образцах;
3. Идентификация изолятов, фенотипически сходных с Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter, но имеющих новые для этих родов свойства;
4. Выделение и характеристика новых представителей этих таксонов;
5. Характеристика ферментативных активностей и/или генов, кодирующих новые ферменты, у бактерий группы Thermoanaerobacter/Caldanaerobacter.
Научная новизна. Впервые разработаны олигонуклеотидные зонды для детекции и идентификации бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter.
Доказана их высокая специфичность, что позволяет детектировать представителей Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter непосредственно в накопительных культурах и природных образцах, а также идентифицировать штаммы без необходимости культивирования.
Полученные результаты расширяют представление о распространении и физиологии термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter.
В то время как все известные ранее виды родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter являлись нейтрофилами с минимальным рН роста 4.7, нами были идентифицированы как представители рода Thermoanaerobacter два анаэробных ацидофильных штамма, способные развиваться при рН 3.5. Впервые бактерии рода Thermoanaerobacter были обнаружены в пробах из глубоководных гидротерм.
Впервые для термофильных прокариот установлена способность микроорганизмов родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter к гидролизу агарозы.
Установлено, что некоторым представителям рода Caldanaerobacter свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода.
Сравнительное исследование генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии, проведённое с помощью ПЦР с разработанными нами праймерами, показало их своеобразие у представителей Caldanaerobacter на фоне единства организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов.
Полученные данные подтверждаются результатами анализа полных геномов анаэробных кабоксидотрофов.
Практическая ценность работы. Разработанные нами олигонуклеотидные зонды позволяют идентифицировать представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных и чистых культурах, минуя стадии определения фенотипических дескрипторов, а также детектировать их в природных образцах.
Полученные данные важны для развития представлений о распространении и физиологии родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter. Разработанный нами метод может быть использован для экспресс-детекции изолятов, в том числе при поиске представителей новых филогенетических групп.
Описанные нами агаролитические штаммы могут быть использованы для получения термостабильной агаразы с целью ее применения в молекулярной биологии для освобождения нуклеиновых кислот и белков из тугоплавких агарозных гелей.
Разработанные нами методы детекции генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии могут быть использованы для исследования экологии и распространения водородобразующих СО-трофов.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Международном Конгрессе «Экстремофилы-2002» (Италия, Неаполь, 2002), 1-ом Международном FEMS Конгрессе Европейский микробиологов (Словения, Любляна, 2003), ХV Международной зимней молодежной научной школе (Москва, 2003), VII Международной конференции «Термофилы-2003 (Экзетер, Англия), V Международном Конгрессе «Экстремофилы-2004» (США, Мэрилэнд, 2004), VIII Международной конференции «Термофилы-2005» (Серферс Парадайс, Австралия, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 9 тезисов, 1 статья находится в печати.
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей глав, обсуждения и выводов, изложенных на страницах печатного текста и включает таблиц и рисунков.
Место проведения работы и благодарности. Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Некоторые этапы работы были выполнены в лаборатории Центра Биоинженерии РАН под руководством к.б.н. Банниковой Г.Е.
Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов был проведен совместно с к.б.н.
А.В. Лебединским (ИНМИ РАН). Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполняли совместно с к.б.н. Н.А. Черных (ИНМИ РАН). Анализ последовательностей 16S рРНК чистых культур микроорганизмов, а также ПЦР продуктов проводили совместно с к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр Биоинженерии РАН) и к.б.н. Т.П. Туровой (ИНМИ РАН). Электронную микроскопию чистых культур микроорганизмов выполнила Н.А. Кострикина (ИНМИ РАН).
Автор выражает благодарность к.б.н. Н.А. Черных за помощь в освоении молекулярных методов, а также к.б.н. А.В. Лебединскому за постоянное внимание, советы и помощь на всех этапах молекулярной работы. Особенно признателен автор научному руководителю д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за интересную тему, обсуждение результатов, ценные советы и замечания на всех этапах работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе использовали чистые и накопительные культуры анаэробных термофильных микроорганизмов из коллекции Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН, а также природные образцы из гидротермальных источников кальдеры Узон и Долины гейзеров на Камчатке.
В качестве реперных организмов использовали типовые штаммы Thermoanaerobacter siderophilus (DSM 12299T), Thermoanaerobacter sulfurophilus (DSM 11584T), Thermoanaerobacter wiegelii (DSM 10319T), Thermoanaerobacter mathranii (DSM 11426T), Thermoanaerobacter italicus (DSM 9252T), Caldoanaerobacter subterraneus subsp. subterraneus (DSM 13054T), Caldoanaerobacter subterraneus subsp.
yonseiensis (DSM 13777T), Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis (DSM 15242T);
Caldanaerobacter subterraneus subsp. pacificus (DSM 12653T), Moorella glycerinii (DSM 11254T ), Thermoterrabacterium (=Carboxydothermus) ferrireducens (DSM 11255T) и Thermotoga maritima (DSM 3109T).
В исследованиях генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии использовали СО-окисляющие бактерии Carboxydothermus hydrogenoformans (DSM 6008T), Carboxydocella thermautotrophica (DSM12356T), Thermosinus carboxydivorans (DSM 14886T), Thermincola carboxydiphila (DSM 17129T) и Thermolithobacter carboxydivorans (DSM 7242T), а также Bacillus subtilis ВКМ B-720 в качестве отрицательного контроля.
Условия культивирования. Культивирование анаэробных термофильных бактерий проводили в герметично закрывающихся флаконах объемом 10 мл на модифицированной среде Пфеннига, приготовленной согласно методам анаэробной техники (Hungate, 1966;
Жилина, Заварзин, 1978) и содержащей (г/л): NH4Cl – 0.33;
KH2PO4 – 0.33;
MgCl – 0.33;
СaCl2 х6 Н2О – 0.33;
NaHCO3 – 1.0;
Na2Sх9 Н2О –0.5;
резазурин 0.001;
дрожжевой экстракт – 0.05 - 0.5;
1 мл /л раствора микроэлементов (Pfennig, Lippert, 1966), 1 мл/л раствора витаминов (Wolin et al., 1963).
Для органотрофных представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в качестве субстратов добавляли мальтозу или сахарозу (2.0 г/л;
рН среды 6.5-7.0);
культивирование проводили в атмосфере N2 или CO2.
Накопительные и неидентифицированные чистые культуры выращивали анаэробно согласно ранее описанной методике на среде 1 (минеральный фон среды Пфеннига, микроэлементы, витамины;
Prokofeva, 2000) с различными донорами и акцепторами электронов. Органические субстраты добавляли в концентрации 3 г/л;
железоредуцирующие микроорганизмы культивировали на той же среде с добавлением 10 г/л пептона и 0.2 г/л дрожжевого экстракта;
Fe(III) добавляли в среду в виде оксида Fe(III) (конечная концентрация 90 мM), Штаммы, выделенные из морских местообитаний, выращивали на среде 2 следующего состава (г/л): KCl – 0.325;
MgCl – 2.75;
MgSO4 – 3.45;
NH4Cl – 0.25;
СaCl2 ·2H2O – 0.15;
K2HPO4 – 0.15;
NaCl - 18;
NaHCO3 - 1;
Na2S – 0.25;
микроэлементы, 1 мл/л;
витамины, 1 мл/л;
в среду добавляли 2 г/л мальтозы и 2 г/л тиосульфата или 10 г/л серы и, при необходимости, дрожжевой экстракт, рН среды был от 6.8 до 7.0.
Ацидофильные штаммы и накопительные культуры растили на среде 1 с рН от 3.5 до 5.7.
Карбоксидотрофные штаммы культивировали на среде 1 с добавлением 0.5 г/л дрожжевого экстракта в атмосфере 100% окиси углерода, рН 6.8-7.0. Накопительную культуру GB2 растили на морской среде с СО в газовой фазе (Sokolova, 2001).
Все чистые и накопительные культуры инкубировали при 60°С, кроме накопительных культур К44, 432, 416, Kar (70°С), штамма 2707 (80°С) и штамма (55°С).
Микроскопические методы. Культуры наблюдали в световом микроскопе с фазово-контрастным устройством при увеличении 90х10 (ЛОМО АУ-12, Россия).
Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием ультрамикротома LKB 3R и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Tokyo, Japan).
Подбор ПЦР-праймеров и зондов. ДНК, выделяли из чистых и накопительных культур и природных образцов, амплификацию генов 16S рРНК проводили с прямым бактериальным праймером Bact 8F и обратным универсальным обратным праймером 1492R (Lane, 1991). Праймеры, специфичные к генам СО-дегидрогеназ (СО-ДГ) и гидрогеназы и к генному кластеру, включающему гены гидрогеназы и СО-ДГ, разрабатывали на основания выравнивания с помощью программы MultAlin (Corpet, 1988) фрагментов последовательноcтей геномов Carboxydothermus hydrogenoformans DSM 6008T (номер NC_007503 в базе данных GenBank) и Rhodospirillum rubrum UR (U65510).
Для разработки олигонуклеотидных зондов использовали нуклеотидные последовательности 16S рДНК всех валидных видов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter, взятые из базы данных GenBank. Поиск зондов проводили с помощью программы ProbeDesigner (Субботина и др., 2003;
Лебединский и др., 2007). Специфичность выбранных зондов дополнительно проверяли, используя программу NCBI BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).
Молекулярно-биологические методы. Выделение и очистку геномной ДНК из биомассы бактерий проводили по методу Мармура (Marmur, 1961). ПЦР проводили по стандартному протоколу Boehringer Mannheim с небольшими модификациями, используя прибор Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler модель 480 или многоканальный амплификатор ДНК Терцик ("ДНК-технология", Россия). Гель электрофорез и перенос по Саузерну проводили, следуя общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984). Гибридизацию с олигонуклеотидными зондами и детекцию сигнала проводили согласно протоколам из лабораторного руководства Boehringer Mannheim (http://www.roche-applied-science.com/fst/products.htm?/prod_inf/manuals/dig_man/dig_toc.htm) с небольшими модификациями;
все реактивы были производства Boehringer Mannheim.
Гибридизацию проводили в течение 12 часов при температуре, рассчитанной по формуле Tm-10°С, где Tm=81.5+16.61М+0.41[G+C]-820/n.
Для тестирования специфичности зондов в качестве контролей использовали ПЦР-продукт, полученный с праймерами Bact 8F и 1492R (Lane, 1991) на ДНК типовых штаммов ряда видов родов Thermoanaerobacter: T. siderophilus, T.
sulfurophilus, T. wiegelii (1я группа), T. mathranii, T. italicus (2я группа) и Сaldanaerobacter subterraneus subsp. yonseiensis, С. subterraneus subsp. pacificus, С.
subterraneus subsp. tengcongensis (3я группа). ПЦР продукты ДНК штаммов, относящихся к различным группам, служили отрицательными контролями для зондов на группы рода Thermoanaerobacter. Продукты амплификации, полученные на ДНК Moorella glycerinii и Thermoterrabacterium ferrireducens, служили отрицательным контролем для родового зонда и зондов на каждую из групп.
При подборе условий проведения ПЦР с праймерами, специфичными к генам СО-дегидрогеназ и гидрогеназы и к генному кластеру, включающему гены гидрогеназы и СО-ДГ, использовали ДНК Carboxydothermus hydrogenoformans в качестве положительного контроля и Bacillus subtilis как отрицательный контроль.
Секвенирование 16S рДНК и генов СО-ДГ проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™Terminator v. 3.0 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant.
Филогенетические деревья генов 16S рРНК и генов СО-ДГ исследуемых бактерий были построены с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, De Wachter, 1994).
Определение агаразной активности. Клетки агаролитических штаммов и остатки агара отделяли в процессе центрифугирования в течение 20 минут при об/ мин, и супернатант использовали для определения агаразной активности. Осадок отмывали 0.1 M ацетатом натрия и затем центрифугировали в течение 20 минут при 12000 об/мин. Все процедуры проводили при комнатной температуре (20-25°С).
Содержание белка определяли с Coomassie Blue (метод Бредфорда). Агаразную активность измеряли путем определения концентрации восстанавливающих сахаров с динитросалициловой кислотой (DNSA).
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Детекция представителей родов Thermoanaerobacter и Cadanaerobacter с помощью олигонуклеотидных зондов 2.1.1. Проверка специфичности зондов Анализ филогенетического положения и структуры рода Thermoanaerobacter с помощью пакета программ TREECON показал (рис. 1.), что род хорошо обособлен от других родов и может быть подразделен на три филогенетические группы. Первая подгруппа включала T. wiegelii, T. siderophilus, T. sulfurophilus, T. brockii, T. kivui, T.
ethanolicus, T. acetoethylicus, T. thermohydrosulfuricus;
вторая подгруппа T.
thermocopriae, T. mathranii и T. italicus;
третья подгруппа T. tengcongensis, T.
yonseiensis и T. subterraneus. Анализ последовательностей 16S рДНК выявил, что третьей подгруппе рода Thermoanaerobacter близкородственен грамположительный СО-окисляющий, Н2-образующий термофил Carboxydobrahium pacificus (Sokolova et al., 2001). Позднее виды третьей подгруппы были выделены в новый род Caldanaerobacter, состоящий из одного вида и четырех подвидов: Caldoanaerobacter subterraneus subsp. subterraneus, C. subterraneus subsp. tengcongensis, C. subterraneus subsp. yonseiensis, C. subterraneus subsp. pacificus (Fardeau et al., 2004).
Были подобраны следующие зонды, специфичные для рода Thermoanaerobacter в целом и для трех его подгрупп (табл. 1).
Таблица 1. Олигонуклеотидные зонды на род Thermoanaerobacter и группы его видов Группа, являющаяся мишенью Зонд название последовательность нуклеотидов, 5' 3' Род Thermoanaerobacter Tab 827 GCTTCCGCDYCCCACACCTA Первая группа видов Tab_1 844 TTAACTACGGCACGRAATGCTTC Вторая группа видов Tab_2 424 CACTAMYGGGGTTTACAACC Третья группа видов Tab_3 184 TCCTCCATCAGGATGCCCTA (ныне род Caldanaerobacter) 10% 99 T. wiegelii T. sulfurophilus 100 T. siderophilus 100 T. ethanolicus T. acetoethylicus 95 T. thermohydrosulfuricus T. kivui T. brockii subsp. lactiethylicus T. brockii subsp. finnii T. brockii T. italicus 97 T. thermocopriae T. mathranii Caldanaerobacter subterraneus subsp. subterraneus C. subterraneus subsp. tengcongensis C. subterraneus subsp. pacificus C. subterraneus subsp. tengcongensis Clostridium thermoamylolyticum Thermoanaerobium "lactoethylicum" Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes Dictyoglomus thermophilum Ammonifex degensii Thermoterrabacterium ferrireducens Thermaerobacter marianensis Moorella thermoacetica 98 Desulfotomaculum nigrificans Sporotomaculum hydroxybenzoicum Desulfotomaculum thermobenzoicum Thermosyntropha lipolytica 99 Syntrophomonas wolfei Syntrophospora bryantii 100 Anaerobranca horikoshii Dehalococcoides ethenogenes Clostridium butyricum E.coli Рис. 1 Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, показывающее положение и структуру родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter Для проверки специфичности зондов их гибридизовали с типовыми штаммами видов рода Thermoanaerobacter, принадлежащих к различным группам, и с представителями близких к роду Thermoanaerobacter родов Moorella и Thermoterrabacterium (сейчас Carboxydothermus) ferrireducens в качестве отрицательных контролей (рис. 2).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Рис.2 Идентификация представителей рода Thermoanaerobacter после электрофореза продуктов ПЦР, а полученных с праймерами Bact 8F и Univ 1492 R (а), с помощью 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11 12 родоспецифичного зонда Tab (б), и группоспецифичных зондов Tab_1 844 (в), Tab_2 424 (г) и Tab_ 184 (д). Дорожки: М - маркер б молекулярного веса (2000, 1200, 800, 400, 200, 100 п.н.);
1 - T. sulfurophilus;
2 - T. italicus;
3 – C. pacificus;
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4 - штамм B5;
5 - штамм K14;
6 - штамм K67;
7 - штамм 518;
8 - штамм 711;
9 - штамм 761;
10 - накопительная культура 816;
в 11 - Moorela glycerini;
12 - Thermoterrabacterium 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 (Carboxydothermus) ferrireducens;
13 - H2O.
г 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 д Общегрупповой зонд прореагировал со всеми ПЦР-продуктами, полученными с бактериальными праймерами на ДНК всех представителей рода Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter. C ПЦР-продуктами, полученными с использованием ДНК отрицательных контролей, зонд сигнала не дал.
Зонд Tab_1 844, специфичный к первой группе рода Thermoanaerobacter, дал положительный сигнал с ампликоном T. sulfurophilus. С ПЦР-продуктами отрицательных контролей зонд не реагировал.
Зонд Tab_2 424, специфичный ко второй группе рода Thermoanaerobacter дал положительный сигнал с T. italicus. С ПЦР-продуктами отрицательных контролей зонд не реагировал.
Зонд Tab_3 184, специфичный к третьей группе рода Thermoanaerobacter дал положительный сигнал с C. subterraneus sub sp. pacificus. С отрицательными контролями зонд не реагировал.
Таким образом, результаты гибридизации подтвердили специфичность зондов и послужили основанием для их использования при анализе природных проб и накопительных культур. Разработанный нами метод позволил достоверно детектировать бактерии родов Thermoanaerobacter и Сaldanaerobacter, а также определять их принадлежность к одной из внутриродовых групп видов.
2.1.2. Идентификация чистых культур микроорганизмов С помощью ПЦР с бактериальными праймерами и последующей гибридизации с разработанными зондами были проанализированы неидентифицированные штаммы анаэробных термофильных микроорганизмов, морфологически сходных с Thermoanaerobacter. Полученние ПЦР-продукта с использованием бактериальным праймеров показало, что все исследуемые штаммы относятся к бактериям. Метод гибридизации с олигонуклеотидными зондами позволил не только отнести ряд штаммов к роду Thermoanaerobacter, но и установить принадлежность штаммов к той или иной из трех групп (табл. 2).
Таблица 2. Идентификация анаэробных термофильных бактерий путем гибридизации с олигонуклеотидными зондами на роды Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter Источник Фенотипичес- ПЦР с Bact Гибридизация с зондами Штамм выделения кие 8F и Univ 1492R Tab 827 Tab_1 Tab_2 Tab_ особенности 844 424 B5 Байкал Способность к + + + - гидролизу агарозы K14 Камчатка « + + + - K67 Камчатка « + + - - + 518 Восточное Рост на морской + + + - тихоокеанск среде, оптимум ое поднятие pH 6.0, минимум pH 3. 711 Камчатка, Температурный + + + - Долина оптимум 55 C, Гейзеров, оптимум pH 5.7, осадки минимум pH 3. 761 Камчатка, Температурный + - н.о. н.о. н.о.
Оранжевое оптимум 60 C, поле, оптимум pH 5.0, осадки минимум pH 3. 2707 Остров Анаэробный + + - - + Кунашир рост на СО с образованием H 107 Морские Рост на морской + + + - гидротермы среде Примечание. «+», положительная реакция;
«-», отсутствие положительной реакции;
"н.о.", не определяли.
Было показано, что два организма, способных к гидролизу агарозы, относятся к первой группе рода Thermoanaerobacter, а один - к третьей группе этого рода (ныне род Caldanaerobacter). Способность к гидролизу агарозы – свойство, впервые обнаруженное у термофильных анаэробов.
Все известные до сих пор виды рода Thermoanaerobacter являлись нейтрофилами с минимальным рН роста 4.7. Мы обнаружили, что к роду Thermoanaerobacter относятся два анаэробных ацидофильных штамма, которые способны расти при рН 3.8 (штамм 518, выделенный из глубоководных гидротерм, и штамм 711, полученный из гидротерм Камчатки). Два штамма (518 и 107), выделенные из гидротерм Восточно-Тихоокеанского поднятия, оказались представителями 1-ой группы рода Thermoanaerobacter. Ранее представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter не обнаруживали в глубоководных гидротермах;
единственным исключением является Caldanaerobacter subterraneus subsp. pacificus. Этот же организм отличался способностью к анаэробному росту с СО, сопряженному с образованием водорода из воды (Sokolova et al., 2001). Такой же тип метаболизма свойственен и штамму 2707, который был идентифицирован нами как представитель рода Caldanaerobacter.
2.1.3. Детекция представителей Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных культурах и природных образцах Присутствие представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных культурах железовосстанавливающих, СО-окисляющих и ацидофильных органотрофных термофильных прокариот было исследовано с помощью ПЦР с бактериальными праймерами и гибридизации с олигонуклеотидными зондами, приведенными выше (табл. 3).
Таблица 3. Детекция бактерий р. Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в анаэробных накопительных культурах, полученных в различных условия Обозначение Источник Фенотипические особенности ПЦР с Гибридизация с накопитель- Bact 8F и зондом Tab ной культуры Univ 1492R 816 Камчатка, вулкан Рост на дрожжевом экстракте с + Мутновский S, Т 60 °С, рН 3, GB2 Гуайамская Анаэробный рост на СО с + впадина образованием H Kar Камчатка Анаэробный рост на СО с + образованием H 746 Камчатка, Рост на ацетате в присутствии + Оранжевое поле, Fe(III),Т 60 C, pH 4, осадки K44 Камчатка, Долина Восстанавление Fe(III) в + + Гейзеров присутствии H2, Т 70° С, рН 6. 416 Курильские острова Восстанавление Fe(III) в + присутствии H2, Т 70° С, рН 6. Курильские острова Восстанавление Fe(III) в + 432 присутствии H2, Т 70°С, рН 6.8, Во всех исследованных накопительных культурах присутствовали бактерии.
Однако при гибридизации с зондом Tab 827, общим для родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter, положительный сигнал был получен лишь с ПЦР-продуктом из одной железовосстанавливающей накопительной культуры (К44). Таким образом, в остальных термофильных накопительных культурах исследуемые процессы осуществляют иные, чем Thermoanaerobacter и Caldoanaerobacter организмы, что делает перспективным их последующее выделение и характеристику.
Метод гибридизации с зондами на роды Thermoanaerobacter-Caldoanaerobacter был использован для обнаружения представителей этих родов в образцах из гидротермальных источников кальдеры Узон и Долины Гейзеров на Камчатке.
Продукт амплификацииДНК, выделенной из этих проб, с бактериальными праймерами был получен в 13 образцах из 20 проанализированных. При анализе продукта ПЦР методом гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами, описанными выше, положительные сигналы с зондом на Thermoanaerbacter Caldanaerobacter были получены в трёх образцах. В этих же образцах детектировались представители первой группы рода Thermoanaerobacter (табл. 4).
Таблица 4. Детекция бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в пробах из наземных горячих источников Обозначение Характеристики Гибридизация с зондами природного места отбора пробы Tab 827 Tab_1 образца Узон 1222 рН 5.3, 56 °С - н.д.
1208 рН 5.5, 63 °С + + 1209 рН 6.7, 74 °С + + 1211 рН 5.0, 68 °С + + 1212 рН 6.0, 83 °С - н.д.
1213 рН 5.5, 77 °С - н.д.
1220 рН 5.9, 57 °С - н.д.
NTP1 рН 7.0, 99 °С - н.д.
47K рН 7.4, 99 °С - н.д.
Долина Гейзеров 1310 рН 8.3, 71 °С - н.д.
1311 рН 8.2, 78 °С - н.д.
1307 рН 8.4, 57 °С - н.д.
Примечание: н.д. - нет данных (гибридизация не проводилась).
Таким образом, представители рода Thermoanaerobacter были обнаружены в природных пробах с рН от 5.0 до 6.7 и температурой от 63 до 74 °С, что соответствует физиологическим характеристикам рода. Все детектированные микроорганизмы относились к I группе рода Thermoanaerobacter, что свидетельствует о ее широкой распространенности в наземных горячих источниках.
2.2. Характеристика представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter, обладающих новыми свойствами У идентифицированных нами методом гибридизации с олигонуклеотидными зондами представителей группы Thermoanaerobacter - Caldanaerobacter был выявлен ряд новых свойств: способность к гидролизу агарозы, рост на СО с образованием Н2.
Микроорганизмы, обладающие этими свойствами были исследованы нами детально.
2.2.1. Характеристика представителей родов Thermoanaerobacter и Caldoanaerobacter с агаролитической активностью Путем гибридизации с олигонуклеотидными зондами агаролитические штаммы В5 и К14 были идентифицированы как представители первой группы рода Thermoanaerobacter. Анализ последовательности генов 16S рРНК показал, что штамм В5 относится к виду Thermoanaerobacter wiegelii (99.8 % сходства), а штамм К наиболее близок к Thermoanaerobacter sulfurophilus (99.6% % сходства).
Принадлежность штамма К67 к роду Caldanaerobacter, установленная на основании гибридизации с группоспецифичными зондами, была подтверждена анализом последовательности гена 16S рРНК, показавшим 95.1- 96.3 % сходства с представителями рода Caldanaerobacter, что позволило отнести изолята K67 к новому виду этого рода.
В настоящее время род Caldoanaerobacter представлен четырьмя подвидами одного вида – Caldoanaerobacter subterraneus (Fardeau et al., 2004). Бактерии вида C.
subterraneus выделены из подземных местообитаний или из глубоководных гидротерм. Штамм К67 является первым представителем рода Cadlanaerobacter, выделенным из наземных гидротерм (из пробы цианобактериального мата источника Термофильный кальдеры Узон).
Ряд фенотипических признаков штамма К67 является общим для рода Caldoanaerobacter (табл. 5). Однако от подвидов C. subterraneus его отличает более низкий температурный оптимум и максимум роста, иной спектр используемых субстратов и одновременное образование водорода, этанола и лактата при брожении глюкозы. Процент ДНК-ДНК гибридизации штамма К67 с С. subterraneous subsp.
tencongensis составлял 51+0.5 %, а с типовым штаммом C.subterraneus subsp.
subterraneus (DSM 13054T) - 21+0.5 %, что подтверждает принадлежность штамма К67 к новому виду. Положение штамма К67 на филогенетическом дереве показано на рис.3.
Таблица 5. Диагностические признаки штамма К67 и других видов рода Caldoanaerobacter Признак С. С. С. С. Штамм К subterraneus subterraneus subterraneus subterraneus subsp. subsp. subsp. subsp.
tencongensis yonsiensis pacificus subterraneus Форма и Палочки Тонкие Ветвящиеся Одиночные Одиночные размер клеток одиночные длинные палочки или двойные палочки, или в палочки палочки иногда цепочках двойные 0.3 0.5 х 2 -15 µm Наличие - + - + жгутиков Температура, 50/75/80 50/75/85 50/70/80 40/65-75/80 50/62-70/ °C мин./опт./макс pH 5.5/7.0/9.0 4.5/6.5/9.0 5.8/6.8-7.2/7.6 5.7/7.0-7.5/9.2 4.8/6.8/8. мин./опт./макс Субстраты Сахара, Сахара, Сахара, СО в Сахара, пептиды, присутствии полисахариды пептиды, полисахариды необходим полисахариды, пептона, пептиды, для полисахариды дрожжевой неоходимы ацетата, или роста тугоплавкая дрожжевой дрожжевой необходим агароза экстракт экстракт экстракта;
дрожжевой сахара, экстракт полисахариды, пептиды NaCl% 0/0.2/2.5 0/0/4 -/2-2.5/- 0/0/3 0/0.5/ мин/опт/макс рост на СО - - + - Основные Ацетат, Лактат, ацетат, Ацетат, СО2, Ацетат, Ацетат, продукты этанол, СО2, этанол, СО2, L-аланин, лактат, Н2, метаболизма Н2 лактат, Н2, СО2, этанол.
СО Г+Ц состав 33 37 33 38.4-41 32-34. ДНК, мол.% Рис. 3. Положение штамма К67 на филогенетическом дереве, построенном на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.
2.2.2. Описание нового вида Caldanaerobacter uzonensis К67Т Caldanaerobacter uzonensis (uzo.nen’sis N.L. masc adj. uzonensis, выделенный из Кальдеры Узон, Камчатка).
Клетки представлены палочками размером 0.3-0.5 х 2 -15 мкм, одиночными или в парах. Рост происходит в интервале температур 50-76 °С с оптимумом при 62-70 °С и в диапазоне рН 4.8-8.0 с оптимумом при 6.8. Строгий анаэроб, органогетеротроф, способен расти на различных сахарах, полисахаридах и пептидах. Использует лактозу, арабинозу, глюкозу, сахарозу, галактозу, ксилозу, декстрин, пируват, декстрозу, трегалозу, пептон, фруктозу, сорбит, крахмал. Слабый рост наблюдается на пектине, целлюлозе (фильтровальная бумага). Не растет на рамнозе, казеине, цистеине, рибозе, ксилане (рис. 4). Тиосульфат стимулирует рост, восстанавливаясь в сероводород. В процессе брожения на пептоне происходит восстановление слабокристаллического оксида Fe(III).Элементная сера, сульфат, сульфит, нитрат не восстанавливаются и на рост не влияют. Основными продуктами метаболизма при брожении на глюкозе являются ацетат, лактат, Н2, СО2, этанол.
Типовой штамм К67 Т (DSMZ 18923T, VKM В-2408T) выделен из цианобактериального мата источника Термофильный Кальдеры Узон, Камчатка.
Рис. 4. Использование крахмал субстратов штаммом кератин К сорбит фруктоза целлобиоза хитин ксилан пептон рибоза тригалоза декстроза целлюлоза пируват цистеин декстрин пектин казеин ксилоза галактоза сахароза рамноза глюкоза арабиноза лактоза фон 0 50 клетки, х 2.2.3 Способность штаммов рода Caldanaerobacter к росту на СО Штамм 2707 был идентифицирован как представитель рода Caldanaerobacter.
Это второй член этого рода, помимо Caldanaerobacter subterraneus subsp. pacificus (Sokolova et al., 2001;
Fardeau et al., 2004), способный к росту на СО с образованием водорода. Анализ последовательности гена 16S рРНК подтвердил принадлежность штамма 2707 к роду Caldoanaerobacter. Высокий уровень сходства последовательности 16S рРНК (98.6 %) и высокий уровень ДНК-ДНК гибридизации (80±0.5%) с С. subterraneus ssp. subterraneus позволяет отнести штамм 2707 к виду С.
subterraneus. Таким образом, способность к анаэробному росту с СО характерна для ряда штаммов этого вида.
2.3 Характеристика агаразной активности штаммов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter Штаммы К67 и В5 хорошо росли на среде с агарозой (от 0,3 до 2% ) как единственным субстратом роста. Однако наилучший рост наблюдался при добавлении от 1 г/л до 3г/л галактозы. Агаролитическую активность измеряли при различных концентрациях агарозы в среде, с внесением дополнительного субстрата и без него. Наибольшая активность наблюдалась при выращивании на 0.6% агарозе в присутствии 3 г/л галактозы. Из трех агаролитических штаммов (К67, К14 и В5) наиболее активным агаролитиком оказался штамм T. wiegelii В5. В процессе его роста агаролитическая активность была детектирована как в супернатанте, так и в осадке неразложившейся агарозы. Через 2-3 дня культивирования агаролитическая активность в супернатанте достигала 0.12-0.17 ед/мл;
в осадке она обычно не превышала 18–20% от активности в супернатанте. Для выделения агаразы использовали культуральную жидкость штамма В5. Для выделения активного белка был использован препаративный электрофорез. После фильтрования и концентрирования был получен раствор фермента с суммарной активностью 18.8 ед.
при содержании белка 50 мкг (удельная активность 376 ед/мг).
Характеристика термостабильной агаразы. Молекулярная масса агаразы Thermoanaerobacter B5 была определена с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и составила около 67 кДа. Изоточка фермента оказалась равна 4.2. Ферментативная активность проявлялась в диапазоне рН от 3.5 до 7.0 с максимумом при рН 5.2 (рис. 5). Ферментативная активность наблюдалась в интервале температуры от 50 до 80oC с максимумом при 70oC (рис.
6). При инкубации при 90oC в течение 60 мин агаразная активность не уменьшалась.
Рис. 5. Влияние pH на активность агаразы штамма T. wiegelii B5 (в 100 мM буфере ед/мг Na2HPO4-лимонная кислота) За единицу агаразной активности принимают такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 мкмоля галактозы за 1 мин.
3 4 5 6 7 8 pH Таким образом, нами была выделена первая термостабильная агараза, продуцируемая анаэробной термофильной бактерией Thermoanaerobacter wiegelii штамм В5.
Рис. 6. Влияние температуры на ед/мг агаразную активность T. wiegelii B 30 40 50 60 70 C 2.4. Исследование карбоксидотрофии у представителей рода Caldoanaerobacter и детекция генов ферментного комплекса, ее обуславливающего Анаэробное окисление СО с образованием водорода известно для нескольких мезофильных бактерий;
наиболее изучена среди них фототрофная альфа протеобактерия Rhodospirillum rubrum (Kerby et al., 1995). Первым термофильным микроорганизмом, способным к осуществлению этого процесса был Carboxydothermus hydrogenoformans (Svetlichny et al., 1991). Из клеток C.
hydrogenoformans были выделены и очищены три Ni-содержащие СО-дегидрогеназы.
СО-дегидрогеназа 1 оказалась частью ферментного комплекса, осуществляющего окисление СО с образованием Н2 и генерацией трансмембранного потенциала. СО дегидрогеназа 2 участвует в восстановлении НАДФ. СО-дегидрогеназа 3 входит в энзиматический комплекс, осущестляющий ассимиляционный синтез ацетил-КоА из C-1 единиц ( Svetlitchny et al., 2001;
Dobbek et al., 2001;
Sobo et al., 2002;
Svetlitchny et al., 2003). При анализе полного генома Carboxydothermus hydrogenoformans помимо генов cooS1, cooS2, cooS3 обнаружено присутствие еще двух генов, кодирующих анаэробные СО-ДГ с неизвестным пока функциями (cooS4, cooS5), а также показано значительное сходство генных кластеров, включающих ген cooS1 C.
hydrogenoformans и ген cooS R. rubrum (у R. rubrum этот генный кластер получил название кластера coo). Оба эти генных кластера содержат, помимо генов cooS, ген cooF ферредоксин-подобного переносчика электронов и гены мембраносвязанной гидрогеназы, состоящей из нескольких субъединиц, включая ген каталитической единицы cooH.
Предположив, что ключевую роль в процессе гидрогеногенной карбоксидотрофии играет энзиматический комплекс, кодируемый генным кластером соо, мы решили проверить его присутствие у способных к этому процессу представителей рода Caldanaerobacter, а также у других гидрогеногенных карбоксидотрофов, имеющихся в коллекции лаборатории. Для этого нами были разработаны пары праймеров cooS-I_160F - cooS-I_1804R на основе консенсусной последовательности нуклеотидов генов СО- дегидрогеназ cooS R. rubrum и cooS1 C.
hydrogenoformans, пара праймеров cooH_35F - cooH_963R на основе консенсусной последовательности нуклеотидов генов гидрогеназы cooH этих организмов, а также для выявления возможного присутствия этих генов в составе единых генных кластеров, пара праймеров cooH_963F - cooS-I_160R, из которых один отжигался бы на гене СО-ДГ, а другой - на гене гидрогеназы cooH (табл. 6).
Таблица 6. Праймеры, использовавшиеся для ПЦР-амплификации coo генов Названия Нуклеотидные последовательности, 5’- Мишень cooS-I_160F CCYTGTCGYATCGATCCMTTTGGC + Ген CO-дегидрогеназы cooS-I cooS-I_1804R AATAACCGCCCASCAARTCYTTSGC cooH_35F ATGTGGCCCTKGAAGAGCCGATGTA + Ген гидрогеназы cooH cooH_963R CCAGTTCATATARGTKGGWACSCGC cooH 963F GCGSGTWCCMACYTATATGAACTGG + Кластер генов cooH … cooS-I cooS-I_160R GCCAAAKGGATCGATRCGACARGG cooF_475F ATGCTGGTRGATTMCGAAAGYTATCG + Субкластер генов cooF – cooS-I cooS-I_1304R GCAATRCCYTGAATGTTRCCGTTAA cooS-II_140F GCTGCCGSCACTGCCTGCARGGC + Ген CO-дегидрогеназы cooS-II cooS-II_1840R GGAGCTTWTCGGCCGCKGWYTCGGG cooS-III_267F YGGMGCTTCYGCSTGGACCATTG + Ген CO-дегидрогеназы cooS-III cooS-III_1723R TTACCGCTCATRGCTTCMGGRGCYG cooS-IV_167F GGATMGACCCYTTYGGRGAAGGA + Ген CO-дегидрогеназы cooS-IV cooS-IV_864R GGTACARCAWATCCCRGCAASATTG cooS-V_142F CAGCTYTGCWSTAAYGGTCCTTGCGTC + WATRGTAGCTTTYTGTTCCAT Ген CO-дегидрогеназы cooS-V cooS-V_1663R cooS-II_1226R TGAGAGCATTGATGATGGCTTCCG Ген CO-дегидрогеназы cooS-II cooS-III_1256R CCAGCTACAACTTTATGTTTAACC Ген CO-дегидрогеназы cooS-III Кроме того, на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов cooS2, cooS3, cooS4 и cooS5 СО-ДГ Carboxydothermus hydrogenoformans и генов родственных им СО-ДГ других организмов были разработаны пары праймеров для поиска подобных генов у гидрогеногенных карбоксидотрофов (табл. 6).
Полученные на первом этапе результаты показаны на рис. 7, из которого видно, что у представителей рода Caldanaerobacter выявить гены СО-ДГ не удалось.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М Рис. 7. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР с праймерами на гены СО-ДГ. 1 - Carboxydothermus hydrogenofomans, 2 - Bacillus subtilis;
а 3 - Thermolithobacter carboxydivorans;
;
4 - Carboxydocella thermautotrophica;
;
СО-ДГ I СО-ДГ II 5 - Thermolithobacter carboxydivorans;
;
6 - Caldanaerobacter subterraneus subsp.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М pacificum JMT;
7 - Caldanaerobacter subterraneus subsp yonseiensis;
8 - Carboxydothermus ferrireduсens(ранее Thermoterrabacterium ferrireduсens);
б 9 -H2O;
10 - Carboxydothermus hydrogenofomans;
11 -Bacillus subtilis;
;
СО-ДГ III СО-ДГ IV 12 - Thermolithobacter carboxydivorans;
;
13 - Carboxydocella thermautotrophica;
;
14 - Thermosinus carboxydivorans;
;
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9М 15 - Caldanaerobacter subterraneus subsp.
pacificus;
16 - Caldanaerobacter ;
subterraneus subsp yonseiensis;
17 - Carboxydothermus ferrireduсens(ранее в Thermoterrabacterium ferrireduсens);
18 - H2O;
М - маркер молекулярного веса СО-ДГ В то же время гены СО-ДГ типа cooS1 выявились у гидрогеногенных карбоксидотрофов Thermolithobacter carboxydivorans и Thermosinus carboxydivorans.
На основании вновь определённых нуклеотидных последовательностей нами были разработана ещё одна пара праймеров на генный субкластер cooF - cooS1. Все полученные результаты представлены в таблице 7.
Таким образом, наши результаты показали своеобразие генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии у представителей рода Caldanaerobacter на фоне единства их организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов. В дальнейшем анализ полного генома С. subterraneus subsp. pacificus подтвердил иную, чем у Carboxydothermus, организацию генного кластера, ответственного за процесс гидрогеногенной карбоксидотрофии у представителей род Caldanaerobacter.
Таблица. 7. Детекция генов, обуславливающих способность к анаэробному окислению СО с образованием водорода у коллекционных штаммов термофильных представителей Firmicutes cooS-I_160F cooF_475F cooH_35F cooH_963F cooS-II_140F cooS-III_267F cooS-IV_167F CooS-V_142F cooS-I_1304R cooH_963R cooS-I_160R cooS-II_1840R cooS-III_1723R cooS_IV_864R CooS-V_1663R cooS-I_1804R Carboxydothermus + + + + + + + + hydrogenofomans Carboxydothermus - ND - - +(97.1) +(98.2) +(99.5) +(97.3) ferrireducens Thermosinus +(88) +(88) +(83) +(83) - - - carboxydivorans Carboxydocella - +(89) +(83) +(81) - - - thermautotrophica Thermincola carboxydiphila - +(72) - +(73*) - - - Thermolithobacter +(89) +(88) +(82) +(82) - - - carboxydivorans Caldanaerobacter - - - - - - - subterraneus subsp.
pacificum Caldanaerobacter - - - - - - - subterraneus ‘Caldanaerobacter uzonensis’ - ND - - - - - K Caldanaerobacter - ND - - + (ND) - - subterraneus subsp.
tengcongensis Caldanaerobacter - ND - - - - - subterraneus subsp.
yonseiensis Bacillus subtilis - ND - - - - - Примечания: Жирным шрифтом выделены гидрогеногенные карбоксидотрофы. В скобках указаны результаты blastN-поиска в геноме Carboxydothermus hydrogenofoman ЗАКЛЮЧЕНИЕ Примененный нами метод гибридизации с олигонуклеотидными зондами позволил не только отнести ряд штаммов к группе Thermoanaerobacter Caldanaerobacter, но и дифференцировать штаммы по принадлежности к родам или одной из двух групп внутри рода Thermoanaerobacter. Полученные результаты расширяют представления о распространении и физиологических свойствах исследуемой группы термофильных прокариот. Впервые нами были обнаружены представители рода Thermoanaerobacter в глубоководных гидротермах Восточно Тихоокеанского поднятия. Обнаружено, что к роду Thermoanaerobacter, ранее включавшему только нейтрофилов, относятся два ацидофильных штамма, способных расти при рН 3.5.
Установлено, что три штамма, относящиеся к родам Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter, способны к гидролизу агарозы (свойство, впервые обнаруженное у термофильных анаэробов). Ранее микроорганизмы с агаролитической активностью выделяли из морских местообитаний, где источником агара как субстрата для них служили морские красные водоросли. Наши данные указывают на то, что агаролитические прокариоты могут населять также наземные горячие источники, где субстратами для них могут являться полисахариды цианобактерий, образующих цианобактериальные маты (Герасименко и др., 1983;
Намсараев и др., 2006).
Агаролитическая активность бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter охарактеризована на примере штамма В5, идентифицированного нами как Thermoanaerobacter wiegelii. Фермент отличается высокой удельной активностью, высоким температурным оптимумом и может быть использован в препаративной молекулярной биологии.
Реклассифицированный французскими исследователями род Caldanaerobacter до настоящего времени содержал только один вид. В данной работе описана анаэробная термофильная бактерия (штамм К67), выделенная из горячего источника Камчатки, представляющая второй вид рода Caldanaerobacter - Caldanaerobacter uzonensis, sp nov.
Способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода свойственна многим термофильным прокариотам (Sokolova et al., 2002, 2004 a,b, 2005, 2006, 2007). Мы установили, что способный как к росту на СО, так и к органотрофному росту штамм 2707, выделенный из гидротерм Камчатки, относится к роду Caldanaerobacter. Таким образом, это второй представитель этого рода, способный к анаэробному росту на СО с продукцией водорода.
Анализ функциональных генов, обуславливающих способность к росту на СО с образованием водорода у ряда анаэробных филогенетически разнообразных представителей Firmicutes позволил установить ключевую роль в этом процессе генного кластера, кодирующего ферментный комплекс СО-дегидрогеназы и гидрогеназы. Разработанный нами метод может быть применен для экологических исследований природных образцов и накопительных культур. Кластирование генов специализированной гидрогеназы и CO-дегидрогеназы может рассматриваться как специфический признак и геномный маркер филогенетически разнообразных гидрогеногенных карбоксидотрофов.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что род Thermoanaerobacter может быть разделен на три филогенетические подгруппы, одна из которых была впоследствии реклассифицирована как новый род Caldanaerobacter.
2. Разработан метод идентификации и детекции представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter., основанный на ДНК-ДНК гибридизации на мембранах с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов.
3. Установлено присутствие бактерий рода Thermoanaerobacter в глубоководных гидротермах Восточно- Тихоокеанского поднятия.
4. Среди идентифицированных представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter обнаружены штаммы, обладаюшие новыми для этих родов свойствами - способностью к гидролизу агарозы (Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter) и ацидотолерантностью (Thermoanaerobacter), что расширяет представления о физиологии этих родов.
5. Впервые выделены термофильные агаролитические бактерии.Они идентифицированы как представители родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter.
Описан новый вид Caldanaerobacter uzonensis, являющийся вторым видом этого рода.
6. Охарактеризована агаролитическая активность штаммов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter – первых продуцентов термостабильной агаразы.
7. Установлено, что некоторым представителям рода Caldanaerobacter свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода.
8. Показано своеобразие генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии у представителей рода Caldanaerobacter на фоне единства их организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов.
Список публикаций 1. Субботина И.В., Черных Н.A., Лебединский А.В., Кубланов И.В., Бонч-Осмоловская E.A..
Олигонуклеотидные зонды для детекции представителей рода Thermoanaerobacter. Микробиология.
2003.Т. 72. С. 374-382.
2. Банникова Г.А., Субботина И.В., Лопатин С.В., Варламов В.В., Бонч-Осмоловская Е.А..
Агаролитические термофильные бактерии р. Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter и характеристика термостабильной агаразы из Thermoanaerobacter wiegelii B5. Прикл. биохим.
микробиол., 2008. Т. 44. С. 404-409.
3. Kozina I., Hodges M., Lee K., Wagner I., Wiegel J., Slobodkin A., Tourova T., Bonch Osmolovskaya E., Sokolova T. Isolation of Caldanaerobacter strains from terrestrial hot springs and description of Caldanaerobacter uzonensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., in press 4. Kublanov I.V., Prokofeva M.I., Subbotina I.V., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A.
Anaerobic thermophilic, moderately acidophilic bacteria from Kamchatka hot springs. Book of abstracts «The 4th International Congress on Extremophiles» September 22-26, 2002, Naples, Italy.
5. Subbotina I.V., Chernyh N.A., Lebedinskii A.V., Kublanov I.V., Bonch-Osmolovskaya E.A.
Oligonucleotide probes for the detection and identification of the members of the genus Thermoanaerobacter. Book of abstracts «The 4th International Congress on Extremophiles» September 22-26, 2002, Naples, Italy.
6. Субботина И.В., Черных Н.А., Лебединский А.В., Бонч-Осмоловская Е.А.
Олигонуклеотидные зонды для детекции представителей рода Thermoanaerobacter. Тезисы стендовых сообщений XV международной зимней научной школы «» 10-14 февраля 2003 г. Москва, 2003, стр.
7. Kublanov I.V., Prokofeva M.I., Subbotina I.V., Turova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A.
Moderately acidophilic, thermophilic, anaerobic bacteria from Kamchatka hot springs.//Book of abstracts «Ist FEMS Congress of European Microbiologists», June 29- July 3, 2003. Slovenia, 2003.- P.
180.
8. Subbotina I.V., Chernyh N.A., Lebedinskii A.V., Kublanov I.V., Bonch-Osmolovskaya E.A.
Detection of members of the genus Thermoanaerobacter using oligonucleotide probes.// Book of abstracts «Ist FEMS Congress of European Microbiologists», June 29- July 3, 2003. Slovenia, 2003.- P. 181.
9. Lebedinsky A.V., Subbotina I.V., Chernyh N.A., Sokolova T.G., Robb F.T., Bonch-Osmolovskaya E.A. Molecular markers of hydrogenogenic carboxydotrophy.// 10th International Symposium on Microbial Ecology, Cancun, Mexico, August 22 - 27 2004. Abstracts, p. 258.
10. Lebedinsky A., Subbotina I., Chernyh N., Sokolova T., Robb F., Bonch-Osmolovskaya E. Is the metabolism of diverse hydrogenogenic carboxydotrophs determined by specific-type carbon monoxide dehydrogenases and hydrogenases?//Book of abstracts «The Vth International Congress on Extremophiles», September 12-23, 2004.- P. 54.
11. Slepova T.V., Subbotina I.V., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Sokolova T.G.
Carboxydocella sporoforma sp. nov., a novel anaerobic, thermophilic, CO-utilizing hydrogenogenic bacterium from a Kamchatka hot spring.// Book of abstracts «The Vth International Congress on Extremophiles», September 12-23, 2004.-P. 113.
12. Lebedinsky A.V., Subbotina I.V., Slepova T.V., Chernyh N.A., Sokolova T.G., Occurrence of coo-Type Gene Clusters in Phylogenetically Diverse Thermophilic CO-Oxidizing H2-Producing Prokaryotes.// Thermophiles 2005, 8th Int. Conf. on Thermophiles Research, Gold Coast, Australia, September 18-22, 2005, Program and Abstracts, Griffith University, P46, pp. 125-126.