Получение биологически активных продуктов с применением микробных трансгликозидаз
На правах рукописи
МАРКОСЯН АВЕТИК АШОТОВИЧ ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОДУКТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ МИКРОБНЫХ ТРАНСГЛИКОЗИДАЗ Специальность: 03.00.23 – «Биотехнология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2008
Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
Научный консультант: доктор биологических наук Абелян Варужан Амаякович
Официальные оппоненты: кандидат биологических наук, доцент Усанов Николай Глебович доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович
Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» Российской академии наук
Защита состоится 10 октября 2008 года в 14.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, д. 69. тел.: (347) 235-53-62, E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии УНЦ РАН и на официальном сайте http: // www. anrb. ru / inbio /dissovet / index. htm
Автореферат разослан 9 сентября 2008 г.
Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент Уразгильдин Р.В.
ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. Биокатализ и биотрансформация составляют одну из перспективных и ключевых направлений современной биотехнологии. Биокаталитические процессы обладают рядом преимуществ перед традиционным органическим синтезом и широко внедряются в различные области промышленности для направленного синтеза различных высокоценных соединений. При этом обеспечивается избирательность и стереоспецифичность катализируемых реакций (Березин и др. 1976;
Скрябин, Головлева, 1976;
Atkinson, 1995;
Sheldrake et al., 1998;
Abelyan, 2005;
Hou 2005;
Biocat – 2004, 2006).
Преимущества ферментов как промышленных катализаторов основаны на их способности проведения стерео- и региоселективных превращений без применения химических защитных групп, а также возможности осуществления труднореализируемых процессов с высоким выходом конечного продукта. Кроме того, применение биокатализаторов позволяет сократить стадии традиционного химического синтеза, обычно требующего несколько ступеней протекции и депротекции функциональных групп и таким образом существенно снизить экономические издержки. В некоторых случаях микробный катализ и трансформация являются единственно возможным подходом создания практически безотходных технологий и экологически чистых производств (Iizuka, Naito, 1981;
Anastas, Williamson, 1998;
Demain et al., 1999;
Anastas, Kirchhoff, 2002).
Однако в настоящее время существует определенная нехватка действительно эффективных биокатализаторов, пригодных для использования в промышленном масштабе, что вызывает настоятельную необходимость проведения новых исследований в данном направлении. Часто только это является препятствием для получения новых продуктов с новыми более уникальными свойствами.
В биокаталитических процессах особое место занимают ферменты с ярко выраженной трансгликозилирующей активностью, достаточно широко применяющиеся для получения различных высокоценных продуктов. Так, циклодекстрингликозилтрансфераза (ЦГТаза), фруктофуранозидаза, -глюкозилтрансфераза (изомальтулозсинтаза), -галактозидаза, мальтаза и другие используются для ферментативного синтеза циклодекстринов и их производных, фруктоолигосахаридов, лактосахарозы, эрлозы, галактоолигосахаридов, изомеров сахарозы и прочих. С другой стороны, при подборе соответствующих исходных материалов и определенных условий реакции их можно использовать для получения совершенно новых соединений или улучшения некоторых характеристик известных соединений (Best et al., 1994;
Demain et al., 1999;
Stanbury et al., 1999).
Таким образом, в настоящее время применение различных биокатализаторов, в частности с трансгликозилирующей активностью, является актуальным направлением работ для получения новых продуктов и модификации различных физиологически активных соединений с целью улучшения их функциональных свойств.
Цели и задачи работы. Основной целью являлись выделение и использование ферментов микробного происхождения с трансгликозилирующей активностью для направленной трансформации и модификации витаминов, углеводов, дитерпеновых гликозидов и бензо[h]хиназолинов с целью улучшения их характеристик и выработки новых продуктов.
Для осуществления указанной цели поставлены следующие задачи:
выделить и охарактеризовать культуры-микробов, в том числе их экстремофильные формы – активных продуцентов ЦГТазы, -фруктофуранозидазы и глюкозилтрансферазы;
изучить морфо-физиологические и биохимические свойства перспективных продуцентов;
изучить и оптимизировать условия биосинтеза перспективных микробных ферментов;
выделить, очистить наиболее перспективные ферменты и изучить их некоторые физико-химические и биохимические свойства;
разработать эффективные методы трансглюкозилирования L-аскорбиновой кислоты, бензо[h]хиназолинов и дитерпеновых гликозидов;
изучить и оптимизировать процесс получения изомальтулозы с применением свободной и иммобилизованной -глюкозилтрансферазы;
изучить и осуществить процесс получения фруктоолигосахаридов совместно с палатинозой с применением нативных и иммобилизованных -глюкозилтрансферазы и -фруктофуранозидазы.
Научная новизна работы. Из различных типов почв с применением оригинальной методики и направленной селекции выделены микробные штаммы активных продуцентов ЦГТазы, -фруктофуранозидазы и -глюкозилтрансферазы. Разработаны методы их очистки и иммобилизации.
Показано, что ЦГТазы экстремофильных форм микроорганизмов могут быть эффективными биокатализаторами в реакции трансглюкозилирования L-аскорбиновой кислоты и дитерпеновых гликозидов.
Впервые осуществлено трансглюкозилирование L-аскорбиновой кислоты с применением дрожжевой мальтазы в качестве биокатализатора.
Впервые с применением термофильной ЦГТазы осуществлено трансглюкозилирование бензо[h]хиназолинов.
Выявлена возможность получения изомальтулозы в проточных условиях.
С применением двух типов ферментов изучен и осуществлен эффективный процесс получения фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой.
Впервые показана возможность совместного получения трансглюкозилированных гликозидов стевиола и фруктозо-концевых олигосахаридов.
Осуществлен процесс получения высокочистых производных гликозидов Стевии с улучшенными вкусовыми характеристиками.
Практическая ценность. С использованием термофильной ЦГТазы разработан эффективный метод трансглюкозилирования L-аскорбиновой кислоты с получением моноглюкозилированного производного.
Предложен экономичный способ получения трансглюкозилированных гликозидов стевиола с содержанием функциональных фруктозо-концевых олигосахаридов.
Предложен высокоэффективный метод получения высокочистых производных гликозидов Стевии.
Предложен эффективный способ непрерывного получения изомальтулозы и фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой с применением иммобилизованных ферментов.
Методы получения трансглюкозилированных производных Стевии, изомальтулозы, трегалулозы и трансглюкозилированой L-аскорбиновой кислоты внедрены в производство в компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
Основные положения, выносимые на защиту:
из различных типов почв можно выделить культуры микроорганизмов, в том числе их экстремофильные формы – активных продуцентов ЦГТаз, -глюкозилтрансфераз, фруктофуранозидаз, они являются представителями различных групп микроорганизмов – неспороносных и спороносных бактерий и грибов;
для трансглюкозилирования различных соединений применимы ЦГТазы из определенных продуцентов, которые максимально эффективно могут осуществлять реакцию межмолекулярного трансгликозилирования;
при трансглюкозилировании бензо[h]хиназолинов -циклодекстрин может служить как эффективным донором, так и комплексообразователем – повышающим водорастворимость и доступность вещества для ферментативной модификации;
выделенные ферменты при выборе эффективного способа иммобилизации могут быть успешно использованы для синтеза различных трансгликозилированных соединений.
Личный вклад соискателя: выполнение экспериментальных работ и решение основных задач исследований, анализ и обобщение литературы по разрабатываемым вопросам, обобщение полученных результатов и оформление диссертации. Постановка основных задач и разработка методологий прорабатывались под руководством д.б.н. В.А.
Абеляна.
Публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 4-х научных работах.
Место выполнения работы. Работа выполнена на базе Центральной научно исследовательской лаборатории компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (бывшая «Stevian Biotechnology Corp. Sdn. Bhd.», Малайзия) (2003-2006 гг.). Вкусовые характеристики полученных подсластителей определялись на факультете науки и технологии университета «Universiti Kebangsaan Malaysia» (Малайзия).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части из 8 глав, заключения, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, включающего 275 ссылок, и приложений. Общий объем диссертации 144 страницы, включая 44 таблицы и 66 рисунков.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Культуры микроорганизмов продуцентов ферментов.
В качестве продуцентов ЦГТаз были использованы штаммы аэробных спорообразующих бактерий: мезофильные Bacillus macerans St-39 и Bacillus circulans St-40;
термофильные Bacillus stearothermophilus St-88 и B. stearothermophilus St-100;
галофильные Bacillus halophilus St-60;
а также гипертермофильный штамм Thermococcus sp. St-1954. В качестве продуцентов мальтазы использованы штаммы Saccharomyces cerevisiae St-50, St 51, St-52, St-53, St-54 и St-55;
-глюкозилтрансферазы - выделенные нами штаммы неспороносных бактерий Pseudomonas sp. St-1372 и Pseudomonas sp. St-1391;
фруктофуранозидаз - штаммы микромицетов Aspergillus niger St-0018 и Aspergillus foetidus St-0194.
2.2. Выделение культур-продуцентов.
Культуры продуцентов ЦГТаз. Для выделения культур-продуцентов использовали почвенные образцы из различных эколого-географических регионов Малайзии по ранее описанной методике (Абелян, 2001). Thermococcus sp. St-1954 получен из коллекции культур «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
Культуры продуцентов мальтаз Saccharomyces cerevisiae получены из коллекции культур компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
Культуры продуцентов -глюкозилтрансфераз и -фруктофуранозидаз выделены из почвенных образцов тропических лесов Малайзии (штаты: Сабах, Саравак, Негери Сембилан). Идентификация полученных штаммов проводилась на основе комплекса морфофизиологических и биохимических свойств.
Изучение морфо-физиологических и биохимических характеристик культур проводили с помощью дифференцирующих тестов, используемых при исследовании аэробных спорообразующих бактерий (Gordon et al., 1973;
Bergey’s Manual, 1984, 1986). Для определения потребности культур в различных источниках углерода и азота использовали ауксанографический метод (Proom, Knight, 1955).
Выращивание штаммов в глубинных условиях осуществляли на термостатированных качалках типа «Certomat IS» (Германия) и в ферментере «Biostat B» (Германия) на следующих питательных средах:
Культуры-продуценты ЦГТаз:
Мезофилы (г/л): Крахмал – 10.0;
кукурузный экстракт – 2.5;
(NH4)2SO4 – 5.0 и CaCO3 – 2.0 (pH 7.0-7.5;
39°С) (Абелян и др., 2002).
Галофилы (г/л): Картофельный крахмал– 20.0;
пептон – 10.0;
дрожжевой экстракт – 1.0;
NaCl – 120.0;
KCl – 2.0;
MgSO4x7H2O – 20.0 (pH 7.0-7.2;
37°С) (Абелян и др., 1995).
Термофилы (г/л): Крахмал – 7.0;
кукурузный экстракт – 5.0;
NH4Cl – 5.3;
CaCO3 – 2. (pH 7.0;
56°C) (Абелян и др., 2002).
Thermococcus sp. (г/л): Дрожжевой экстракт – 2.0;
NaCl – 20.0;
MgSO4x2H2O – 3.5;
MgCl2x6H2O – 2.75;
CaCl2x2H2O – 1.0;
KH2PO4 – 0.5;
KCl – 0.325;
NaBr – 0.05;
H3BO3 – 0.015;
SrCl2x6H2O – 0.0075;
(NH4)2Ni(SO4)2x2H2O – 0.002;
сера – 10.0;
Na2Sx9H2O – 0.48(pH 7.0;
85°C) (Tachibana et al., 1999).
Культуры-продуценты мальтаз:
S. cerevisiae (г/л): меласса – 140.0;
мочевина – 2.5;
(NH4)2HPO4-0.5 (pH 5.0-5.2;
29°С;
48ч).
Культуры-продуценты -глюкозилтрансфераз:
Pseudomonas sp. (г/л): меласса – 50.0;
(NH4)2HPO4 – 0.5 (pH 7.0;
30°С;
24ч).
Культуры-продуценты -фруктофуранозидаз A. niger / A. foetidus (г/л): сахароза – 20.0;
дрожжевой экстракт – 12.0;
карбоксиметилцеллюлоза – 2.0 (pH 5.0;
28°С;
24-48 ч) (Hidaka et al., 1988).
Циклизирующую активность ЦГТаз определяли по (Tilden, Hudson,1942), декстринизирующую активность по (Hale, Rawlins,1951), диспропорционирующую и дециклизирующую активность согласно (Akimaru et al.,1991).
Гомогенность нативных ферментов проверяли методом электрофореза в ПААГ с 2% ным ДДС-Na (Davis, 1964;
Laemmly, 1970). Для определения молекулярных масс в качестве стандартов использовали овальбумин 45 кДа, БСА 66 кДа, фосфорилазу 97 кДа и альдолазу 158 кДа («GE Healthcare», США).
Для определения -глюкозилтрансферазной активности фермент инкубировали в 20% (в/в) растворе сахарозы при рН 5.5 и температуре 29°С в течение 15 мин. За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента катализирует образование 1 мкмоля палатинозы за 1 мин.
Определение мальтазной активности проводили согласно (Полыгалина и др., 2003).
Определение -фруктофуранозидазной активности проводили модифицированным методом (Sirisansaneeyakul et al., 2000). За единицу -фруктофуранозидазной активности принимали количество фермента, которое высвобождало 1 мкмоль глюкозы за 1 мин в условиях эксперимента.
Количественное определение ЦД проводили с помощью ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 Series», (США) на колонке «Zorbax-NH2» (5 мкм, 4.6x250 мм). Применяли подвижную фазу ацетонитрил-вода=70:30 об/об (скорость 2 мл/мин), в качестве детектора используя дифференциальный рефрактометр (Абелян и др., 2002).
Определение аскорбиновой кислоты и ее глюкозилированных производных проводили методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 series» (США) с применением колонки «Zorbax SB С18» (5 мкм, 4.6x150мм) и воды с pH 2.2 (фосфорная кислота) в качестве подвижной фазы. Скорость протока 1мл/мин. В качестве детектора использовали УФ детектор при 245нм.
Определение бензо[h]хиназолинов и их производных проводилось методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 series» (США) в следующих условиях: колонка – «Zorbax ODS» ( мкм, 4.6x250 мм);
подвижная фаза – ацетонитрил-вода (50:50, об/об);
скорость протока мл/мин;
детектор – УФ-детектор при 210 нм.
Определение гликозидов Стевии и их производных проводилось методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 series» (США) в следующих условиях: колонка – «Zorbax NH2» ( мкм, 4.6 x 250 мм);
подвижная фаза – ацетонитрил-вода (70:30, об/об);
скорость протока мл/мин;
детектор – УФ-детектор при 210 нм.
Количественное определение отдельных фруктоолигосахаридов, палатинозы и трегалулозы осуществляли методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 series» (США) в следующих условиях: колонка – «Zorbax NH2» (5 мкм, 4.6 x 250 мм);
подвижная фаза – ацетонитрил-вода (70:30, об./об.);
скорость протока 2 мл/мин;
детектор - дифференциальный рефрактометр.
ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ Культуры-продуценты ЦГТаз. Изучение штаммов показало, что они имеют в целом близкие морфо-биохимические свойства. Галофильный штамм B. halophilus St-60 образует кремовые, гладкие, блестящие, округлые с ровными краями колонии. Вегетативные клетки палочковидные, однородные. Споры средние, сферические, терминального расположения и раздувают клетку.
По основным морфо-биохимическим характеристикам термофильные штаммы B.
stearothermophilus St-88 и St-100 схожи. Они ферментируют рибозу, маннозу, глюкозу, мальтозу, маннит и глицерин. Не ферментируют ксилозу, рамнозу, арабинозу, сахарозу, галактозу, лактозу, раффинозу, инулин, дульцит, сорбит. Гидролизуют крахмал, гиппурат, казеин и желатин, не гидролизуют тирозин и эскулин. Усваивают цитрат. Клетки палочковидные, грамположительные. Споры эллипсоидные, терминального и паратерминального расположения. На пептон-кукурузном агаре образуют кремовые, влажно блестящие, плоские, гладкие колонии с волнистыми краями, в среду не врастают.
Культуры-продуценты -глюкозилтрансфераз. По основным морфо-биохимическим характеристикам штаммы Pseudomonas sp. St-1372 и St-1391 схожи. На питательном агаре через 3 дня инкубирования в термостате при температуре 28°С вырастают круглые, выпуклые колонии с ровными краями и диаметром 1-3мм. Поверхность колоний гладкая, опалесцирующая, серо-белого цвета.
Культуры-продуценты -фруктофуранозидаз. Штаммы A. niger St-0018 и A. foetidus St-0194 характеризовались по морфо-культуральным признакам (Билай, Коваль, 1988).
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ Характеристика ЦГТаз. Основные характеристики ЦГТаз приведены в табл. 1.
Галофильная ЦГТаза синтезирует только -ЦД и оптимальное значение pH находится несколько выше чем у мезофильных ЦГТаз. Термофильные ЦГТазы функционируют при более высоких значениях температуры и в качестве основного ЦД образуют преимущественно -ЦД. ЦГТаза из Thermococcus sp. St-1954 отличается более высокой термостабильностью (110°С) и оптимальной температурой циклизации 90°С. Она способна осуществлять трансферазную реакцию в отношении многих соединений, но особенно важна ее высокая трансферазная активность в отношении гликозидов Стевии.
Таблица Некоторые характеристики ЦГТаз Мол. Опт. рН Термоста Продуцент масса, темпе- Опт. рН стабиль- Основной ЦД бильность, °С кДа ратура, °С ность B.macerans St-39 74 50-55 55 5.5 5.0-9. B. circulans St-40 88 50-55 55 4.0-4.5 5.0-8. B. stearothermophilus St-88 65 60-65 70 6.0-6.5 5.5-8. B. stearothermophilus St-100 68 65-70 70 6.0-6.5 6.0-9. B. halophilus St-60 70 50 50 6.5-7.0 6.0-9. Характеристика -глюкозилтрансфераз. Фермент из штамма Pseudomonas sp. St 1372 образовывал изомальтулозу с большим выходом, чем фермент Pseudomonas sp. St-1391.
Оптимальное значение pH у фермента из штамма Pseudomonas sp. St-1391 несколько выше чем у -глюкозилтрансферазы из Pseudomonas sp. St-1372.
Таблица Некоторые характеристики -глюкозилтрансфераз Pseudomonas sp.
Выход, % Опт.
темпе- Km Vmax Продуцент Изомаль- Трега- Опт. рН ратура, (мМ) (мМ/мин) тулоза гулоза °С Pseudomonas sp. St-1372 85 8 29 5.5 50 Pseudomonas sp. St-1391 78 11 29 6.0 80 Характеристика -фруктофуранозидаз. Основные характеристики использованных ферментов приведены в табл. 3.
Таблица Некоторые характеристики -фруктофуранозидаз Синтез ФОС, % Мол. Опт. рН Термоста- Опт.
Продуцент масса, темпе- стабиль бильность, °С рН кДа ратура, °С ность К Н ФН A. niger St-0018 90 55 65 5.5 5.0-7.5 21.3 30.8 8. A. foetidus St-0194 82 55 65 6.0 4.5-7.5 34.0 9.9 Примечание: К-кестоза;
Н-нистоза;
ФН-фруктозилнистоза.
ГЛАВА 5. ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАНИЕ L-АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ Изучены особенности получения 2-О--D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты (АК-2Г) с применением ЦГТаз различных групп микроорганизмов, а также дрожжевых мальтаз.
Среди изученных ЦГТаз наибольшей эффективностью обладают ферменты из термофильных штаммов, при которых количество трансферных продуктов достигает 52-57%.
ЦГТаза из галофильного штамма способна только незначительному трансглюкозилированию. При этом для всех ферментов наиболее подходящим донором глюкозных единиц является -ЦД. Дальнейшие эксперименты проводили с ЦГТазой B.stearothermophilus St-88.
С увеличением исходной концентрации субстратов до 50% скорость реакции существенно ускоряется и увеличивается количество трансферных продуктов. Весовое соотношение АК :
-ЦД = 1:3 является оптимальным.
Влияние количества фермента. С увеличением количества фермента до 500 единиц на 1 г АК наблюдалось увеличение скорости реакции и общего выхода трансферных продуктов. Дальнейшее увеличение приводило к снижению количества высокомолекулярных производных и общему снижению степени трансформации.
Влияние рН и температуры. Оптимальный рН находился в пределах 5.5-6.0, что несколько ниже, чем это установлено для реакции циклизации (рН 6.0-6.5). Оптимальная температура трансглюкозилирования находилась в пределах 60°С, что является также оптимальным значением процесса получения ЦД с применением этого фермента.
С увеличением продолжительности реакции повышается степень трансглюкозилирования. Типичная ВЭЖХ-грамма трансглюкозилирования АК с помощью ЦГТазы B.stearothermophilus St-88 приведена на рис.1.
Таким образом, показано, что среди ЦГТаз фермент B.stearothermophilus St-88 является наиболее эффективным биокатализатором при трансгликозилировании аскорбиновой кислоты с использованием -ЦД в качестве донора глюкозильных единиц. Следует отметить, что в качестве донора с успехом могут быть использованы также мальтодекстрины.
Выявлено, что мальтазы дрожжей также способны осуществлять трансглюкозилирование АК.
Рис.1. Типичная ВЭЖХ-грамма продуктов трансглюкозилирования аскорбиновой кислоты ЦГТазой B.stearothermophilus St-88 за 24 ч (A) и 48 ч (B).
С целью осуществления процесса в проточных условиях изучали возможность иммобилизации ЦГТазы B. stearothermophilus St-88 на различных носителях методами адсорбции, ковалентного связывания и включения (Абелян 1989;
2001) Наилучшие результаты по остаточной активности получены при иммобилизации фермента методом включения в различные природные гели. Удовлетворительные результаты получены также при использовании метода адсорбции на различных ионнообменных смолах. Однако в обоих случаях иммобилизация не обеспечивала высокую жизнеспособность биокатализатора. В этом отношении метод ковалентного связывания ЦГТазы с активированным силикагелем дает возможность осуществлять реакцию трансглюкозилирования в проточных условиях в течение 90 суток.
В оптимальных условиях реакции степень трансглюкозилирования достигает до 65%, что примерно на 10-15% выше, чем у известных технологий. Разработан достаточно эффективный метод очистки и кристаллизации конечного продукта. Процесс успешно внедрен в крупномасштабное производство в компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
ГЛАВА 6. ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАНИЕ ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ Цель наших исследований состояла в изучении возможности повышения эффективности процесса с использованием более высоких температур, улучшении пищевой характеристики продукта превращением остаточных мальтодекстринов в смесь фруктозо концевых олигосахаридов, а также получении высокочистых производных с наилучшими вкусовыми характеристиками.
В качестве биокатализатора использовали ЦГТазу, продуцируемую культурой Thermococcus sp. St-1954.
Оптимальный рН процесса составляет 5.5. Оптимальная температура процесса находилась в пределах 70-75°С, т.е. несколько ниже, чем для циклизирующей активности (90°С). Увеличение количества вносимого фермента и количества сухих веществ приводит к ускорению процесса трансгликозилирования. Весовое соотношение гликозидов и крахмала в пределах 1.0 : 2.0 – 1.0 : 0.2 не оказывало существенного влияния на степень трансгликозилирования. Однако, чем выше концентрация крахмала, тем ниже степень сладости получаемого продукта и наоборот. С коммерческой точки зрения соотношение компонентов 1:1 (вес/вес), приводящее к сладости продукта в пределах 160-170, является наиболее приемлемой. При 70°С и соотношении субстратов 1:1, реакция практически заканчивается за 18-20 часов (рис.2).
А, % 4 8 12 16 20 24 Время, час Рис.2. Степень трансформации (A,%) в зависимости от продолжительности реакции.
Образовавшийся продукт содержит значительное количество (15–20%) мальтоолигосахаридов. Для улучшения функциональных и вкусовых свойств продукта было предложено трансформировать образовавшиеся мальтоолигосахариды в фруктозо-концевые олигосахариды (ФКО). С этой целью после 12 часов процесса трансгликозилирования гликозидов Стевии к реакционной смеси добавляли сахарозу в количестве 60% от расчетного количества мальтоолигосахаридов и продолжали реакцию в течение 6 часов при тех же условиях. Типичная ВЭЖХ-грамма образовавшихся ФКО представлена на рис 3.
Рис.3. Типичная ВЭЖХ-грамма ФКО образовавшихся в результате трансформации остаточных мальтоолигосахаридов под действием ЦГТазы Thermococcus sp. St-1954.
С целью получения продукта с большим содержанием высокоценных моно- и диглюкозилированных производных стевиозида реакционную смесь полученную после трасглюкозилирования подвергали дополнительной обработке -амилазой и очищали на специфическом адсорбенте «Diaion HP-20».
Таким образом, показана возможность применения высоких температур для трансглюкозилирования сладких гликозидов Стевии. Разработанный метод позволяет в 2- раза сократить время реакции без какого-либо ухудшения качества продукта, что приводит к существенному экономическому эффекту. Также впервые предложено трансформирование остаточных мальтоолигосахаридов в ФКО, что значительно улучшает функциональные и вкусовые свойства полученного продукта. Предложен также метод очистки гликозилированных производных с наилучшими вкусовыми характеристиками, в частности моно- и диглюкозилированного стевиозида. Процессы успешно внедрены в крупномасштабное производство в компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
ГЛАВА 7. ТРАНСГЛЮКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕНЗО[h]ХИНАЗОЛИНОВ Изучена возможность трансгликозилирования бензо[h]хиназолинов под действием различных ферментов, таких как ЦГТаза, пуллуланаза, -амилаза, -галактозидаза и фруктофуранозидаза.
Бензо[h]хиназолины со свободными гидроксильными или кетоновыми группами синтезированы в лаборатории синтеза спирогетероциклических соединений Института тонкой органической химии НАН РА.
Трансгликозилирование осуществляли в гетерогенных условиях с использованием соответствующих доноров в водных средах или в двухфазных системах.
В условиях эксперимента образование какого либо производного не было идентифицировано в случае пуллуланазы, -амилазы, -галактозидазы и фруктофуранозидазы. С другой стороны ЦГТаза осуществляла трансгликозилирование как в гетерогенных, так и двухфазных системах. При этом были использованы ЦГТазы различных групп микроорганизмов: из мезофильных B. macerans St-39 и B. circulans St-40;
термофильных B.stearothermophilus St-88, B.stearothermophilus St-100, а также галофильного штамма B. halophilus St-60. Среди них только ЦГТазы термофильных штаммов проявляли способность к трансглюкозилированию бензо[h]хиназолинов. Наиболее эффективной была ЦГТаза, продуцируемая B.stearothermophilus St-88, а среди бензо[h]хиназолинов наиболее склонными к трансглюкозилированию оказались соединения МА-4215 и МА-4217. В качестве доноров гликозильных единиц применяли крахмал, мальтодекстрин, а также -, - и -ЦД.
Выявлено, что вследствие незначительной водорастворимости во всех случаях степень трансглюкозилирования была очень низкой и находилась в пределах 10-15%.
Для более эффективного трансглюкозилирования проводили предварительное комплексообразование с -ЦД. При данном методе наблюдалось увеличение количества трансглюкозилированных производных примерно на 30%. Вероятно это связано с тем, что ЦД образует комплекс с бензо[h]хиназолинами с сравнительно большей растворимостью в воде и одновременно выступает в качестве донора глюкозильных единиц. Это создает благоприятные условия для трансглюкозилирования.
С увеличением исходной концентрации субстратов до 40% реакция существенно ускоряется и увеличивается количество трансферных продуктов. Весовое соотношение бензо[h]хиназолин :
-ЦД = 1:3 является оптимальным.
Влияние количества фермента. С увеличением количества вносимого фермента до 150 единиц на 1 г бензо[h]хиназолинов наблюдалось увеличение скорости реакции и общего выхода трансферных продуктов. Дальнейшее увеличение не влияло на эффективность процесса.
Влияние рН и температуры. Оптимальный рН находился в пределах 5.5-6.0, температура – 60°С, что является также оптимальным значением процесса циклизации для данного фермента. С увеличением продолжительности реакции повышается степень трансглюкозилирования. Однако, после 72 ч реакции общее количество трансферных продуктов почти не увеличивалось.
Типичные ВЭЖХ-граммы продуктов реакции приведены на рис. 4.
Рис. 4. Типичная ВЭЖХ-грамма продуктов трансглюкозилирования соединения МА- ЦГТазой B.stearothermophilus St-88. (А) исходная смесь, (В) реакционная смесь после 36ч и (C) 72ч протекания реакции.
Таким образом, впервые осуществлен ферментативный синтез глюкозилированных бензо[h]хиназолинов. Показано, что при правильном подборе соответствующих условий реакция может протекать с достаточной эффективностью. Полученные производные водорастворимы, что очень важно при приготовлении лекарственных средств.
ГЛАВА 8. ПОЛУЧЕНИЕ ПАЛАТИНОЗЫ (ИЗОМАЛЬТУЛОЗЫ) Изучены особенности образования палатинозы из сахарозы с использованием свободной и иммобилизованной -глюкозилтрансферазы вновь выделенных штаммов Pseudomonas sp. St-1372 и Pseudomonas sp. St-1391 – продуцентов внутриклеточного фермента.
Выявлено, что трансформация имеет четкую зависимость от рН и достигает своего максимума при рН 5.5-6.0. Оптимальная температура для обоих ферментов находилась около 29°С. С увеличение концентрации субстрата вплоть до 60%, увеличивается степень трансформации и, соответственно выходы палатинозы и трегалулозы, в то время как при низких концентрациях образуются значительные количества фруктозы и глюкозы. С увеличением количества фермента до 15 ед/г сахарозы повышается степень конверсии в случае с обоими катализаторами. Дальнейшее увеличение не приводит к какому-нибудь заметному эффекту. С увеличением продолжительности реакции увеличивается степень трансформации и реакция практически заканчивается через 24 часа.
Однако, с технологической точки использование очищенных или полуочищенных ферментных препаратов связано с существенно большими затратами, поэтому была изучена возможность применения иммобилизованных целых клеток в качестве биокатализатора.
С этой целью иммобилизацию клеток осуществляли методом включения в различные гели, такие как полиакриламид (ПААГ), триацетат целлюлозы, агар, каррагинан и альгинат кальция. Для ионного прикрепления и адсорбции клеток на различных носителях, последние смешивали с 0.5 г клеток в 10 мл деионизированной воды и при 4°С перемешивали в течение 18 часов. Биокатализатор тщательно промывали деионизированной водой. Наилучшие результаты получены при их включении в 2%-ный гель альгината кальция.
Для осуществления эффективного синтеза палатинозы с применением иммобилизованных клеток определены оптимальные параметры реакции. Установлено, что аналогично интактным клеткам, иммобилизованные формы проявляют свою наилучшую активность в пределах рН 5.5-6.5 с оптимумом при рН 6.0, т.е. на 0.5 единиц больше, чем в случае с интактными клетками. Кроме того, после иммобилизации область значений рН для эффективного ведения процесса расширилась. Оба биокатализатора проявляли свою максимальную активность при 30°С. При более высоких температурах наблюдалось существенное падение ферментативной активности. Однако данное падение было более резким для интактных клеток.
Непрерывное получение палатинозы осуществляли в условиях 4-х секционного биореактора сплошного заполнения.
Для определения оптимальной рабочей температуры, была исследована зависимость между скоростью протока раствора субстрата и образованием палатинозы при различных температурах. Наилучшие результаты получены при температурах 30-35°С. При более низких температурах, хотя и обеспечивается высокая стабильность, для полного превращения субстрата в продукт требуется слишком много времени.
Изучена динамика инактивации биокатализатора в условиях четырехсекционного биореактора. Для этого раствор 50%-ной сахарозы (рН 6.0) при 30°С и удельной скорости 0. час-1 пропускали через колонки снизу вверх. Через определенные отрезки времени определяли количество образовавшейся палатинозы на выходе каждой колонки. Выявлено, что иммобилизованные клетки во всех секциях «активизируются» в течение 7-8 суток, а на 24-е сутки их активность выше первоначальной в среднем 1.46-1.70;
1.50-1.74;
1.58-1.78 и 1.66-1.81 раза для первой, второй, третьей и четвертой секций соответственно (табл.4).
Данная «активация» может быть результатом роста клеток или их акклиматизацией к применяемым условиям, а различие между эффективностями начальных и конечных колонок - различной стабильностью иммобилизованных клеток в растворах сахарозы и палатинозы.
Они более стабильны в растворе продукта, чем субстрата.
Таблица Изменение активности иммобилизованных клеток Pseudomonas sp. St-1372 (а) и St- (б) во времени в секциях Соотношение Относительная активность, % активностей Секция, Исходная через 8 через № A1/A0 A2/A сут. (A1) сут. (A2) (A0) а б а б а б а б а б 1 48 41 82 78 70 70 1.70 1.95 1.46 1. 2 50 43 83 80 75 80 1.66 1.78 1.50 1. 3 55 49 87 87 87 87 1.58 1.74 1.58 1. 4 60 55 100 100 100 100 1.66 1.81 1.66 1. Время полужизни катализатора на основе иммобилизованных клеток Pseudomonas sp.
St-1372 и St-1391 составляет около 70 и 65 суток соответственно. Процесс с применением иммобилизованных клеток Pseudomonas sp. St-1372 внедрен в производство в компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
ГЛАВА 9. ПОЛУЧЕНИЕ ФРУКТООЛИГОСАХАРИДОВ СОВМЕСТНО С ПАЛАТИНОЗОЙ Изучены особенности получения ФОС с применением -фруктофуранозидаз A. niger St 0018 и A. foetidus St-0194 и улучшение диетических свойств полученного продукта трансформацией остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу под действием глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp. St-1372.
Влияние рН и температуры. Ферменты сильно ингибировались при щелочных значениях рН реакционной среды. Оптимум рН составил 5.5 и 6.0 для фруктозофуранозидаз A. niger St-0018 и A. foetidus St-0194, соответственно.
Трансферазная реакция на 40%-ной сахарозе для обоих ферментов наиболее эффективно протекает в пределах температур 50-65°С с оптимумом при 55°С.
Концентрация субстрата. При низких концентрациях субстрата наблюдается образование преимущественно глюкозы и фруктозы, т.е. протекает реакция гидролиза.
Эффективность трансфруктозилирования увеличивается с повышением исходной концентрации субстрата. Одновременно уменьшается количество моносахаридов и увеличивается выход трансферных продуктов. В случае с ферментом A. foetidus St-0194 не выявлено образования фруктозил-нистозы (табл.5).
Влияние количества фермента. С увеличением количества вносимого фермента наблюдалось определенное ускорение реакции и повышение выхода трансферных продуктов. Оптимальным является количество фермента 3-5 ед на 1 г сахарозы при продолжительности реакции около 24 ч.
Продолжительность реакции также играет важную роль для эффективного трансфруктозилирования. Для изучения динамики накопления отдельных продуктов реакцию осуществляли при 55°С в течение 24 ч с использованием 55%-ного раствора сахарозы и 2.5 ед фермента на 1 г сахарозы.
Таблица Влияние концентрации сахарозы на образование ФОС -фруктофуранозидазой Трансферные продукты, % Общий Фруктозил выход ФОС, % Сахароза, % Глюкоза Сахароза Нистоза 1-Кестоза нистоза А Б А Б А Б А Б А Б А Б 10 40.7 38.5 17.1 33.1 19.7 25.3 21.0 3.1 1.5 - 42.2 28. 20 33.6 36.4 16.2 29.8 20.4 30.1 25.2 3.7 4.6 - 50.2 33. 40 31.7 31.5 11.7 29.4 23.9 33.0 27.3 6.1 5.4 - 56.6 39. 50 30.2 30.7 10.5 26.5 24.6 34.9 28.8 7.9 5.9 - 59.3 42. 60 26.4 28.6 8.0 25.3 29.2 37.7 29.4 8.4 6.8 - 65.6 46. Примечание: (А) A. niger St-0018;
(Б) A. foetidus St- В случае с ферментом A. niger St-0018 в начале реакции происходит образование преимущественно 1-кестозы, концентрация которой достигает своего максимума примерно через 5 ч после начала реакции. В дальнейшем ее количество постепенно снижается, в то время как накопление более высокомолекулярных производных продолжается. Количество нистозы нарастает вплоть до 14 ч, после чего также постепенно снижается. С другой стороны, синтез фруктозил-нистозы начинается после 5 ч реакции и за 24 ч ее содержание в реакционной смеси достигает 8.0%. Однако, оно может быть существенно выше при использовании более высоких концентраций фермента. Общее количество ФОС достигает своего максимума через 5 ч реакции и остается практически неизменным вплоть до 14 ч процесса;
меняется только соотношение продуктов. В дальнейшем содержание кестозы, нистозы и фруктозил-нистозы несколько снижается, в то время как количество сахарозы остается неизменным.
Типичные ВЭЖХ-граммы продуктов реакций с применением -фруктофуранозидаз A.
niger St-0018 и A. foetidus St-0194 представлены на рис. 5.
Рис. 5. Типичная ВЭЖХ-грамма продуктов трансфруктозилирования -фруктофуранозидазой A. niger St-0018 (А) и A. foetidus St-0194 (В).
Непрерывное получение ФОС. Для непрерывного получения ФОС клетки A. niger иммобилизовали методом включения в 2%-ный альгинат кальция. Полученный биокатализаторы использовали без дополнительной обработки или после дополнительной сшивки полученных гранул полиэтиленимином, а затем –глутаровым альдегидом (Kida et al., 1988). Выявлено, что иммобилизация в 2%-ном альгинате приводит к наибольшему сохранению исходной активности. Операционная стабильность полученного биокатализатора в непрерывных условиях находится в пределах 180-200 суток.
Трансформация остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу. Для превращения остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу использовали иммобилизованные клетки Pseudomonas sp. St-1372. Для этого, полученную на выходе биореактора с иммобилизованными клетками с -фруктофуранозидазной активностью смесь фруктоолигосахаридов пропускали через вторую колонку, заполненную иммобилизованными клетками Pseudomonas sp. (при 29°С). Удельную скорость устанавливали в пределах 0.2-0.3 час-1. В указанных условиях практически вся остаточная сахароза превращалась в палатинозу и трегалулозу.
Типичная ВЭЖХ-грамма полученного сиропа представлена на рис.6.
Рис.6. Типичная ВЭЖХ-грамма продуктов трансформации остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу иммобилизованными клетками Pseudomonas sp. (А), исходная смесь;
(В), смесь после трансформации.
Таким образом, разработан эффективный метод получения сиропа ФОС с применением свободных и иммобилизованных клеток A. niger St-0018 и A. foetidus St-0194 с фруктофуранозидазной активностью. Впервые показана возможность превращения остаточной сахарозы в палатинозу и трегалулозу, которые существенно улучшают качественные характеристики ФОС и могут расширить области их применения. Процесс с применением иммобилизованных клеток A. niger St-0018 и Pseudomonas sp. St-1372 внедрен в производство в компании «PureCircle Sdn. Bhd.» (Малайзия).
ВЫВОДЫ 1. В результате микробиологических анализов образцов различных типов почв с применением метода накопительной культуры выделены перспективные культуры микроорганизмов – активных продуцентов ЦГТаз, -глюкозилтрансфераз и фруктофуранозидаз.
2. На основе комплекса микробиологических исследований морфо-физиологических и биохимических особенностей культуры активных продуцентов трансфераз идентифицированы как представители родов Bacillus, Pseudomonas и Aspergillus.
3. Изучены и оптимизированы условия биосинтеза наиболее перспективных ЦГТаз, глюкозилтрансфераз и -фруктофуранозидаз, в том числе экстремофильных форм.
4. Показано, что реакция межмолекулярного трансглюкозилирования наиболее выраженно проявляется у ЦГТаз термофильных штаммов.
5. Установлено, что при трансглюкозилировании аскорбиновой кислоты наиболее эффективным донором глюкозных единиц является -ЦД.
6. Выявлено, что трансглюкозилирование бензо[h]хиназолинов протекает с наибольшей эффективностью при их предварительном комплексообразовании с -ЦД.
7. Выявлено, что ЦГТаза осуществляет эффективное Thermococcus sp.
трансглюкозилирование сладких гликозидов Stevia rebaudiana Bertoni при высоких температурах в присутствии крахмала в качестве донора глюкозных единиц. Разработан эффективный метод получения высокочистых гликозилированных производных стевиозида. Остаточные мальтодекстрины могут быть трансформированы в фруктозо концевые олигосахариды под действием ЦГТаз.
8. Исследованы особенности получения изомальтулозы из высококонцентрированных растворов сахарозы под действием свободной и иммобилизованной форм глюкозилтрансфераз Pseudomonas sp. Установлено, что степень и эффективность процесса находятся в строгой зависимости как от концентрации субстрата и фермента, так и от внешних факторов: рН, температуры и длительности реакции.
9. Установлена возможность биокаталитического получения фруктоолигосахаридов под действием свободной и иммобилизованной форм -фруктофуранозидаз A.niger из концентрированных растворов сахарозы. Выявлено, что остаточная сахароза с успехом может быть превращена в палатинозу под действием -глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Циклодекстрингликозилтрансферазы высокоактивного штамма Bacillus stearothermophilus St-88 рекомендуются для производства ферментативно модифицированной L аскорбиновой кислоты в присутствии -ЦД в качестве донора.
2. Метод предварительного комплексообразования с -ЦД перед трансглюкозилированием рекомендуется для биокаталитической модификации нерастворимых в воде органических соединений со свободными гидроксильными или кетоновыми группами.
3. Термофильная циклодекстрингликозилтрансфераза Thermococcus sp. St- рекомендуется для организации производства высокочистых трансглюкозилированных гликозидов Stevia rebaudiana Bertoni и их смеси с фруктозо-концевыми олигосахаридами.
4. -Глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp. St-1372 и St-1391 рекомендуются для организации производства изомальтулозы в проточных и непрерывных условиях.
5. -Фруктофуранозидазы, продуцируемые штаммами Aspergillus niger St-0018 и Aspergillus foetidus St-0194 и -глюкозилтрансферазы Pseudomonas sp. St-1372 рекомендуются для организации производства фруктоолигосахаридного сиропа совместно с палатинозой.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Markosyan A.A. Transglycosylation of L-ascorbic acid by free and immobilized cyclomaltodextrin glucanotransferases, Electronic Journal of Natural Sciences of National Academy of Sciences of RA, 2005, V.2(5), p.15-19.
2. Markosyan A.A. Synthesis of Palatinose. Electronic Journal of Natural Sciences of National Academy of Sciences of RA, 2005, V.2(5), p.20-23.
3. Маркосян А.А., Абелян Л.А., Адамян М.О., Акопян Ж.И., Абелян В.А.
Трансгликозилирование L-аскорбиновой кислоты. Прикл. биохим. и микробиол., 2007, т.43, №1, с.42-46.
4. Маркосян А.А., Абелян Л.А., Адамян М.О., Экажев З.Д., Акопян Ж.И., Абелян В.А.
Получение фруктоолигосахаридного сиропа из сахарозы совместно с палатинозой и трегалозой. Прикл. биохим. и микробиол., 2007, т.43, №4, с.424-431.