Молекулярно-генетические исследования роли компонентов сигнального каскада ремоделирования актина в генезисе поведенческих нарушений drosophila melanogaster

На правах рукописи

ЗАХАРОВ Геннадий Александрович Молекулярно-генетические исследования роли компонентов сигнального каскада ремоделирования актина в генезисе поведенческих нарушений Drosophila melanogaster Специальность:

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011 2

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики Учреждения Российской академии наук «Института Физиологии им. И.П. Павлова, РАН»

Научный консультант: доктор биологических наук Савватеева-Попова Елена Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Самбук Елена Викторовна Санкт-Петербургский Государственный Университет, в.н.с. лаборатории биохимической генетики, кафедры генетики и селекции доктор биологических наук Родионов Александр Викентьевич Ботанический Институт им. В.Л. Комарова РАН, зав. лаб. биосистематики и цитологии Ведущее учреждение: Учреждения Российской академии наук «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН»

Защита диссертации состоится "" 201_ г. в часов на заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "_" 201_ г.

Учёный секретарь Диссертационного совета Д 212.232. доктор биологических наук Л. А. Мамон

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Современные данные биомедицины указывают на важную роль нарушений актинового цитоскелета в возникновении нейродегенеративных (НД) болезней старения, прионных заболеваний и канцерогенезе (Ramaekers, Bosman, 2004). Ремоделирование актинового цитоскелета также влияет на синаптическую пластичность – основу процессов обучения и памяти (Meng et al., 2002).

Одним из основных контролёров состояния актина в клетке является сигнальный каскад ремоделирования актина, передающий сигнал по цепочке: рецепторы нейротрансмиттеров – малые ГТФазы Rho-семейства – LIM-киназа 1 (LIMK1) – кофилин – актин. Важнейшим узлом этого каскада является LIM-киназа 1. После активации LIMK1 фосфорилирует кофилин и смещает соотношение G-актин/F-актин в сторону образования F-актина (Yang et al., 1998). С нарушениями функционирования каскада ремоделирования актина связано большое число нейродегенеративных заболеваний. Одним из самых известных геномных заболеваний, связанных с дисфункцией LIMK1, является синдром Уильямса (Jarvinen-Pasley et al., 2008).

Начальным звеном системы ремоделирования актина является глутаматергический сигнальный каскад (Shi, Ethell, 2006;

Yang et al., 1998).

Функционирование рецепторного компонента этого каскада – N-метил-D-аспартатных (NMDA) рецепторов – рассматривают как молекулярно-физиологическую основу процессов обучения и памяти (Cull-Candy et al., 2001). Гиперактивность этих рецепторов наблюдается при болезнях Альцгеймера (БА), Паркинсона (БП), Хантингтона (БХ) и других поражениях, сопровождаемых нейродегенерацией (Беспалов, Звартау, 2000).

Важным эндогенным лигандом NMDA-рецепторов служит метаболит кинуренинового пути обмена триптофана – кинуреновая кислота (KYNA) (Беспалов, Звартау, 2000). Метаболиты этого пути (кинуренины) участвуют в возникновении и развитии многих заболеваний, например воспалительных и дегенеративных болезней нервной системы (Лапин, 2004). Из них возбуждающим и нейродегенеративным действием обладают L-кинуренин и 3-гидроксикинуренин (3HK) (Maeda et al., 1997).

KYNA является единственным известным эндогенным протектором, защищающим клетку от действия возбуждающих кинуренинов (Beninger et al., 1986;

French et al., 1984).

Показано, что уровень LIMK1 в головном ганглии дрозофилы чётко коррелирует с содержанием кинуренинов (Лопатина et al., 2007). Считается, что на основе KYNA возможно создание лекарственных препаратов, способных воздействовать на NMDA-рецепторы и систему ремоделирования актина (Danysz, Parsons, 1998). Поэтому представляется важным исследовать влияние кинуренинов на сигнальный каскад ремоделирования актина. Возможным механизмом связи между содержанием LIMK1 и KYNA является специфическое взаимодействие KYNA с NMDA-рецепторами.

Механизм воздействия 3HK на LIMK1 и каскад ремоделирования актина в настоящий момент неизвестен.

В подавляющем большинстве случаев начало развития НД болезней происходит спонтанно. Ассоциированные с подобными расстройствами гены часто располагаются в районах хромосом со специфической архитектурой (Kim, Rossi, 2007). Поэтому большинство НД болезней старения способны возникать спорадически из-за нарушений целостности генетического аппарата (Minamide et al., 2000). Фактором запуска патологии могут являться различные стрессорные воздействия (Gilgun-Sherki et al., 2003).

Одним из самых хорошо изученных стрессорных воздействий является тепловой шок (ТШ), в ответ на который происходит активация системы белков теплового шока (БТШ/HSP, Heat Shock Protein) (Morimoto, 1993;

Wu, 1995). Компоненты актинового каскада также принимают участие в организации ответа на ТШ. Показано взаимодействие между LIMK1 и HSC70 (Giot et al., 2003). При стрессорных воздействиях наблюдается перемещение комплекса LIMK1-кофилин-актин в ядро (Савватеева-Попова et al., 2004), что может служить одной из основ для ремоделирования актина ядра и избирательного запуска транскрипции.

Одними из самых плохо изученных с биологической точки зрения воздействий являются электрическое и магнитное поля низкой интенсивности, способные оказывать заметное воздействие на живые организмы (Ghione et al., 2005). Экранирование живых объектов от естественного геомагнитного поля (нахождение в ослабленном геомагнитном поле, ОГМП) оказывает пагубное воздействие на нервную систему (Агаджанян, Макарова, 2005;

Бинги et al., 2006). Этот эффект нуждается в тщательном изучении (Труханов, 2003).

Влияние сигнального каскада ремоделирования актина на все вышеуказанные процессы удобно изучать с использованием модельных систем. Хорошим объектом для подобных целей является дрозофила, поскольку после завершения программы «геном человека» было выяснено, что 75% генов человека и дрозофилы обладают высокой степенью гомологии (Fortini et al., 2000). Кроме того, дрозофила имеет короткий жизненный цикл и ее содержание относительно недорого. Поэтому во многих случаях дрозофилу используют для выяснения механизмов этиологии болезней человека и скрининга лекарственных препаратов (Reiter, 1993).

Поскольку при многих нейродегенеративных заболеваниях нарушается локомоторное поведение, один из способов разработки лекарственных средств основан на поиске фармакологических агентов, корректирующих нарушения локомоции у просто организованных животных (Braungart et al., 2004). Однако для решения такой задачи необходимо определить фенотип большого числа особей до и после воздействия лекарственного агента, что в настоящий момент представляет более сложную техническую задачу, нежели генотипирование (Simon, 2010). В связи с этим, весьма актуальна задача разработки систем для автоматического тестирования локомоторного поведения дрозофилы.

Для исследований сигнального каскада ремоделирования актина у дрозофилы очень удобен локус agnostic, который был обнаружен в районе 11АB Х-хромосомы (Савватеева et al., 1978). Этот локус кодирует киназу LIMK1 и обрамлен протяжёнными АТ-богатыми повторами (Савватеева-Попова et al., 2004). Мутантом по этому локусу является agnts3 (Savvateeva, Kamyshev, 1981), у которого при ПЦР-картировании (Медведева et al., 2008) в 3’-области гена limk1 обнаружена инсерция длиной 1,7 т.п.н.

Природа этой инсерции в настоящий момент неизвестна. Локус agnostic в силу своего строения может служить удобной моделью геномных болезней, таких как синдром Уильямса (Медведева et al., 2008). Исследовать влияние кинуренинов на локомоторное поведение дрозофилы также удобно, поскольку у нее описаны мутации, блокирующие определённые стадии КПОТ и приводящие к накоплению соответствующих кинуренинов, что заменяет их искусственное введение (Summers et al., 1982;

Лопатина et al., 2007).

Цель и задачи работы Цель работы: Привести сравнительный анализ влияния различных стрессорных воздействий (тепловой шок и экранирование геомагнитного поля) на развитие локомоторных нарушений у линий дрозофилы, несущих мутации в рецепторной и эффекторной частях сигнального каскада ремоделирования актина, и выявить возможные механизмы формирования этих нарушений.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Создать установку и разработать программное обеспечение для автоматической видеорегистрации и анализа локомоторного поведения личинок дрозофилы 2. Исследовать влияние двух типов стрессорных воздействий (тепловой шок и экранирование геомагнитного поля) на локомоторное поведение нормальных и мутантных личинок, для чего использовать спонтанные и мутантные варианты локуса agnostic, а также мутантов по ферментам кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ) 3. Определить точное положение и нуклеотидную последовательность вставки в ген limk1 у мутанта agnts 4. Исследовать влияние стрессорных воздействий на уровень LIMK1 и белков системы БТШ 5. Исследовать механизм связывания агонистов и антагонистов NR1-субъединицы NMDA-рецептора и возможность влияния 3-гидроксикинуренина (3HK) на функции рецептора Научная новизна работы. Впервые исследован вклад экранирования естественного геомагнитного поля в развитие локомоторных расстройств у дрозофилы.

Показано, что это воздействие отличается от теплового шока как на поведенческом, так и на молекулярном уровне. Указаны предполагаемые мишени стрессорного воздействия, связанного с экранированием геомагнитного поля.

Впервые выявлены дефекты в структурных и регуляторных участках гена limk1, приводящие к изменениям параметров локомоции и пространственной ориентации при исследовательской активности. Также впервые выявлены дефекты локомоции личинок, связанные с нарушениями синтеза метаболитов КПОТ. Впервые установлено точное положение и характер вставки, в ген limk1 у мутанта agnts3.

Продемонстрирована важная роль стэкинг-взаимодействия при связывании антагонистов глицинового сайта NMDA-рецептора. Показано, что 3-гидроксикинуренин не способен специфически взаимодействовать с этим сайтом.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Фермент LIMK1 принимает участие в формировании локомоторного поведения личинок дрозофилы. Мутация agnts3 по гену limk1 приводит к падению уровня локомоторной активности.

2. Экранирование естественного геомагнитного поля оказывает на локомоторное поведение дрозофилы воздействие, отличающееся по механизму от теплового шока. В реализации ответа на это воздействие принимают участие белки LIMK1, алкогольдегидрогеназа (Adh) и fat body protein 2 (Fbp2).

3. Мутационно обусловленное накопление метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана, являющихся модуляторами глутаматергических рецепторов (начального звена сигнального каскада ремоделирования актина), также приводит к изменениям в локомоторном поведении и реакции на стрессорные факторы.

Практическая значимость работы. Реализован экспресс-метод регистрации локомоторных нарушений и выявления дефектов локомоторного поведения у личинок дрозофилы. Это создаёт предпосылки для разработки метода экспресс-оценки действия различных фармакологических агентов на локомоторное поведение дрозофилы.

Разработанные методы можно использовать для поиска лекарственных препаратов, корректирующих нарушения локомоторного поведения. Большая скорость и сравнительно невысокая цена исследований на дрозофиле делают ее практически идеальным объектом для предварительного экспериментального тестирования терапевтических средств. Препараты, прошедшие отбор на такой системе, можно переводить на следующий этап тестирования с использованием позвоночных животных.

Исследование влияния магнитного поля подтверждает, что экранирование магнитного поля является стрессорным воздействием, механизм которого, по видимому, напоминает оксидативный стресс и связан с митохондриальными нарушениями. Подобные данные представляют большую ценность для дальнейших исследований стрессорного влияния магнитного экранирования.

Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены на следующих конференциях: Политехнический симпозиум «Молодые учёные – промышленности северо-западного региона». Санкт-Петербург, 2004;

10-я Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология – наука 21 века». Пущино, 2006;

XVII WFN Word Congress on Parkinson diseases and related disorders. Amsterdam, 2007;

Международная школа-конференция посвященная 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашова «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов».

Санкт-Петербург, 2007;

Пятнадцатая конференция «Математика. Компьютер.

Образование». Москва, 2008;

The second Saint-Petersburg International conference on NanoBio Technologies. Saint-Petersburg, 2008;

IX East European Conference “Simpler Nervous Systems”. Saint-Petersburg, 2009;

Международный молодёжный научный форум «ЛОМОНОСОВ-2010». Москва, 2010;

21 съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Калуга, 2010.

Вклад автора. Адаптация установки для автоматической регистрации локомоторного поведения и постановка экспериментов по записи локомоторного поведения личинок производилась совместно с Т.Л. Паялиной. Секвенирование гена limk1 проведено совместно с А.В. Журавлевым и А.Н. Каминской. Двумерный электрофорез белков нервных ганглиев был проведен в совместных исследованиях в лаб. проф. М.Б. Евгеньева (Институт Молекулярной Биологии РАН, Москва).

Лично автором произведена адаптация и разработка программного обеспечения установки и статистическая обработка полученных результатов. Лично автором проведено исследование механизма связывания лигандов NR1-субъединицы NMDA-рецептора. Также автором проведен вестерн-блот анализ содержания белков LIMK1 и HSP70 в нервных тканях личинок. Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 202 страницах печатного текста, содержит таблиц и иллюстрирована 55 рисунками. В списке цитируемой литературы приведено 233 источника.

Материалы и методы В работе использовали следующие линии Drosophila melanogaster: линия дикого типа Canton-S (CS);

линия дикого типа Berlin, у которой при ПЦР-картировании обнаружены нарушения связывания праймеров на участке, соответствующем протеинкиназному домену и второй половине PDZ-домена гена limk1;

линия дикого типа Oregon- R, у которой обнаруживается отсутствие ПЦР-фрагмента на участке, куда попадают оба LIM-домена и часть PDZ-домена;

agnts3 — мутантная линия, несущая вставку 1.7-т.п.н. приблизительно в 500 п.н. от начала 3’-области гена limk1 (Медведева et al., 2008). Также использовали мутантов КПОТ (Лопатина et al., 2007): vermilion (v) (отсутствие кинуренинов и накопление триптофана), cinnabar (cn) (накопление KYNA);

cardinal (сd) (накопление 3HK).

Предъявления теплового шока проводили по стандартной методике (37 ОС, 30 мин), которая подробно описана в работе (Nikitina et al., 2003).

Для экранирования магнитного поля Земли совместно с ФГУ ЦНИИ КМ «Прометей» изготовлена цилиндрическая камера, покрытая экранирующим материалом, созданным на основе аморфного магнитомягкого сплава АМАГ 172.

Коэффициент экранирования по постоянному магнитному полю равен 30. Первая экспериментальная группа (ОГМП 1ч) находилась в экранирующей камере в течение часа. Вторая группа (ОГМП 12ч) находилась в экранирующей камере в течение 12 часов. После воздействия ОГМП личинок оставляли в течение 1 часа при температуре 25ОС и нормальном уровне магнитного поля, а затем использовали в эксперименте. Контрольную группу не подвергали воздействию ОГМП.

Для регистрации локомоторного поведения личинок дрозофилы применяли оригинальную автоматизированную установку, созданную автором совместно с Т.Л. Паялиной. Для обработки полученных данных использовали программное обеспечение, разработанное автором. Для каждой линии записывались траектории движения не менее 25 личинок. Для определения достоверности различий проводили дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису с последующим множественным сравнением средних рангов всех экспериментальных групп. Достоверность всех различий рассчитана на уровне значимости P 0.05.

Электрофорез в ПААГ и вестерн-блот проводили по стандартной методике (http://molbiol.ru/protocol/17_01.html). ПЦР и сиквенирование ДНК проводили в соответствии с указаниями производителей реагентов.

Неэмпирические квантово-химические расчёты были выполнены методом Хартри-Фока-Рутаана с использованием версии PC GAMESS 7f (Granovsky, 2006). Для проведения докинга использовали программные пакеты AutoDock 4 (Morris et al., 1998) и MGL-Tools 1.4 (Sanner, 1999) согласно прилагающейся инструкции.

Полученные результаты Сиквенирование 3'-области гена limk На первом этапе работы для определения точного положения и характера вставки в 3'-области гена limk1 у мутанта agnts3 было проведено сиквенирование этой области у линий CS и agnts3. Полученные последовательности выравнивались по оригинальной последовательности гена limk1 дрозофилы, взятой из базы данных FlyBase (www.flybase.org, CG1848, режим extended gene region).

Сиквенированная последовательность линии CS полностью совпадает с эталонной. Однако, у линии agnts3 в межгенной области, начиная с 10265-го нуклеотида от начала гена limk1, обнаруживается вставка, не имеющая гомологии с эталонной последовательностью (Рис. 1). С помощью программы Blast (ncbi.nih.gov/blast/) данная последовательность была идентифицирована как часть S-транспозона семейства TC1/Mariner. Дальнейший анализ базы FlyBase показал, что аналогичная вставка присутствует в эталонном геноме дрозофилы в интроне гена argonaute 2, в интроне гена jil-1 и за несколько сот н.п. до гена hsp70Bb.

Рисунок 1. Положение вставки в 3'-области гена limk1 у мутанта agnts3. Нумерация нуклеотидов приведена согласно базе данных FlyBase (www.flybase.org, CG1848, режим extended gene region).

Наличие подобной вставки может оказывать влияние как на экспрессию limk1 и близлежащих генов, так и на гены, в нетранслируемых областях которых находится доместицированный транспозон.

Анализ локомоторного поведения линий CS, Berlin, Or- R и agnts Для анализа локомоторного поведения личинок использовали такие параметры, как индекс активности (доля времени, проведённого в движении) и скорость побежки.

Данные параметры анализировались как по интегральным значениям (в течение всего времени эксперимента), так и в зависимости от времени, прошедшего с начала эксперимента.

Рисунок 2.Индекс активности (А) и скорость побежки (Б) личинок CS, Berlin, Or-R и agnts3. * отличие от CS, # - отличие от Berlin, & - различие между Oregon-R и agnts3 (дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису с множественным сравнением средних рангов, P0.05) Показано, что линия дикого типа CS характеризуется высокими значениями индекса активности и скорости побежки (Рис. 2). В то же время линии Berlin, Or- R и agnts демонстрируют существенные нарушения локомоторного поведения, что выражается в снижении индекса активности и скорости побежки.

При анализе динамики параметров локомоторной активности было показано, что более низкая общая подвижность Oregon-R связана с быстрым падением активности с течением времени, в то время как для Berlin и agnts3 пониженные значения индекса активности характерны в течение всего Рисунок 3. А – сравнение распределений треков личинок CS эксперимента (данные не Berlin, Oregon-R и agnts3 по классам. Б – образцы треков каждого приведены).

Далее, все записанные класса. * - отличие от CS;

# - отличие от Berlin, & - различие траектории движения (треки) между Oregon-R и agnts3, (двусторонний t-критерий для долей, визуально разделялись на P0.05 ) классов, в зависимости от степени заполнения экспериментальной камеры (Рис. 3Б).

Все линии, несущие полиморфизмы в гене limk1, также демонстрируют существенные изменения гистограммы распределения треков. Наблюдается уменьшение доли треков, полностью заполняющих экспериментальную камеру, что может свидетельствовать о дефектах способности к пространственному ориентированию (рис. 3А). Аналогичным способом проведён анализ влияния стрессорных факторов на локомоторное поведение.

Все имеющиеся данные, полученные при анализе локомоторного поведения, представлены в таблице 1. Поскольку исследование когнитивных нарушений у дрозофилы в лаборатории нейрогенетики проводится на самцах методом условно рефлекторного подавления ухаживания, для построения таблицы были выбраны только результаты, полученные на самцах.

Таблица 1. Локомоторное поведение личинок CS, Berlin, Oregon-R и agnts3.

agnts Параметр CS Berlin Oregon-R Нарушения в гене limk1 Нарушения связы При вания праймеров в Несет вставку ПЦР-картировании интроне 2 и рядом транспозона обнаруживается с интронами 3 и 4, семейства отсутствие Нет (учасок TC1/Mariner фрагмента, куда расположения длиной порядка попадают оба протеинкиназного 1.7-т.п.н. после LIM-домена и домена и половины гена limk часть PDZ-домена PDZ-домена Без Индекс локомоторной 0.34 0.15 * 0.15 * 0.12 * воз- активности дей Скорость побежки, мм/с 0.41 0.36 * 0.36 * 0. ствия Способность к Без Значительные Значительные Значительные пространственному дефек дефекты дефекты дефекты ориентированию тов ТШ Индекс локомоторной 0.31 активности Скорость побежки 0.39 0.39 0. Способность к пространственному дефекты ориентированию ОГМП Индекс локомоторной 0. 1ч активности Скорость побежки 0.43 0.39 0.37 0. Способность к пространственному Без дефектов Без дефектов ориентированию ОГМП Индекс локомоторной 0.61 0. 12ч активности Скорость побежки 0.49 0.34 0.39 0. Способность к пространственному Без дефектов Без дефектов ориентированию 1. При сравнении без воздействия линии Berlin, Oregon-R и agnts3 сравнивали с CS.

2. Достоверные различия отмечены символом «*» (критерий Краскела-Уоллиса с множественным сравнением средних рангов).

3. Оценку стрессорного воздействия проводили, сравнивая параметры локомоторного поведения после воздействия с параметрами локомоторного поведения той же линии, не подвергавшейся воздействию.

4. Для облегчения читаемости таблицы недостоверные изменения заменены знаком «».

5. Синим цветом отмечено изменение параметров более, чем на 10%. Изменение параметров более, чем на 50% отмечено красным.

Как видно из таблицы, личинки Berlin без воздействия по сравнению с CS обладают существенными дефектами локомоторного поведения, которые стабильно сохраняются в течение всего эксперимента. Достоверных изменений при действии ТШ не наблюдается. При воздействии ОГМП наблюдается незначительное увеличение скорости побежки. Таким образом, локомоторное поведение линия Berlin при действии стрессорных факторов не меняется. Личинки Oregon-R без воздействия также демонстрируют существенные нарушения локомоторной активности. По сравнению с CS у линии Oregon-R в 2 раза снижен индекс активности, в 1.2 раза – скорость побежки.

ТШ у этой линии увеличивает индекс активности в 2 раза и приводит к частичной нормализации локомоторного поведения. ОГМП не меняет численные параметры локомоции, однако приводит к нормализации пространственного ориентирования.

Линия agnts3 без воздействия проявляет существенные дефекты локомоторного поведения. Индекс активности у agnts3 в 2.5 раза меньше, чем у CS. Также у agnts нарушено распределение треков по классам, что может говорить о дефектах пространственного ориентирования. Заметных изменений при действии ТШ у agnts3 не наблюдается. ОГМП (как 1 ч, так и 12 ч) оказывает на локомоторную активность личинок agnts3 очень существенное действие: в 3-4 раза возрастает индекс активности, на 7% возрастает скорость побежки. Также воздействие ОГМП нормализует распределение треков по классам.

Таким образом, проведённые исследования продемонстрировали существенные дефекты локомоторного поведения линий Berlin, Or-R и agnts3 по сравнению с CS.

Кроме того, показано существенное влияние ОГМП на локомоторное поведение, отличное от влияния ТШ.

Анализ концентрации белков в головных ганглиях личинок Для определения концентрации LIMK1 и HSP70 в головных ганглиях личинок был проведён вестерн-блот анализ содержания белков, результаты которого представлены на рисунке 4. Перед нанесением проб была определена концентрации общего белка по методу Бредфорд. Затем проводили выравнивание концентраций с учётом данных фотометрирования.

Без воздействия линия agnts3 имеет более высокий уровень LIMK1, нежели CS, и сопоставимый с CS уровень HSP70. ТШ индуцирует HSP70 у обеих линий, приводит к увеличению уровня LIMK1 у CS, и незначительно снижает изначально высокий уровень LIMK1 у agnts3. ОГМП 1ч не оказывает заметного воздействия на уровень белков ни у линии CS, ни у линии agnts3. Однако, ОГМП 12ч оказывает на обе линии очень сильной действие, резко снижая уровень HSP70 как у CS, так и у agnts3. Кроме того, у agnts3 воздействие ОГМП 12ч сопровождается падением уровня LIMK1.

Таким образом, полученные результаты показывают принципиальное отличие действия ОГМП и ТШ на уровень белков LIMK1 и HSP70. В отличие от ТШ, ОГМП 1ч незначительно увеличивает уровень HSP70, а ОГМП 12ч, напротив, резко снижает его.

Также обнаружено отличие в действии ОГПМ и ТШ на уровень LIMK1. У CS воздействие ОГМП почти не оказывает влияния на LIMK1, а у agnts3 приводит к уменьшению изначально высокого уровня LIMK1.

Рисунок 4. Western-блот анализ концентрации белков HSP70 и LIMK1 в мозге самцов личинок CS и agnts3.

Наличие у agnts3 дополнительной изоформы HSP70 может говорить об изменениях в организации системы БТШ.

Для более точного определения уровня белков у agnts3 до и после воздействия в совместных исследованиях с лабораторией проф. М.Б. Евгеньева (Институт Молекулярной Биологии РАН, Москва) был проведён двумерный (2D) электрофорез гомогенатов головных ганглиев самцов личинок дрозофилы линий CS и agnts3.

После проведения фореза некоторые белки были выделены из геля и сиквенированы.

Обнаружено, что без воздействия ts у agn по сравнению с CS наблюдаются отличия в числе и уровне изоформ HSP (данные не приведены). Кроме того, у agnts3 отсутствует алкогольдегидрогеназа (Adh), но существенно выше уровень Fat Body Protein 2 (Fbp2) (Рис. 5).

Двумерный электрофорез белков agnts3 и CS после воздействия ТШ не выявил различий между линиями (данные не приведены).

После воздействия ОГМП 12ч у CS наблюдается индукция Fbp2 и уменьшение уровня HSP27. У agnts3 также наблюдается увеличение уровня Fbp2, однако при этом изменений в уровне HSP27 не происходит. Кроме того воздействие ОГМП на agnts3 приводит к индукции Adh, уровень которой восстанавливается до уровня дикого типа.

У CS воздействие ОГМП не влияет на Рисунок 5. Результаты двумерного электрофореза изначально высокий уровень Adh.

Таким образом, мутация в гене белков в головных ганглиях личинок CS и agnts3.

ts A1 — алкогольдегидрогеназа (Adh);

A2 – fat body limk1 у линии agn сопровождается сверхэкспрессией Fbp2 и пониженным protein 2 (Fbp2);

A3 – Polo-like киназа (Plk4/Sak);

уровнем Adh по сравнению с CS.

A4 – HSP27.

Воздействие ОГМП 12ч у CS приводит к индукции Fbp2, LIMK1 и HSP27, а у agnts3 – к индукции Fbp2 и Adh и падению уровня LIMK1.

Анализ локомоторного поведения линий с мутациями в ферментах КПОТ.

Поскольку метаболиты КПОТ могут оказывать влияние на LIMK1 и каскад ремоделирования актина, было проведено исследование влияния стрессорных факторов на локомоторное поведение мутантов КПОТ. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Локомоторное поведение личинок, несущих мутации в ферментах КПОТ.

Параметр CS v cn cd Нарушения в ферментах КПОТ Нарушен Нарушен фермент Нарушение фермента фермент кинуренин-3-гидро феноксазинонсинте триптофаноксиг ксилаза. тазы. Накопление в еназа. Накопление 3-гидроксикинуренин Нет Отсутствие нейропротективног а (3HK), который кинуренинов и о метаболита – вызывает накопление кинурениновой оксидативный стресс триптофана. кислоты (KYNA) и нейродегенерацию Без Индекс локомоторной 0.34 0.13 0.14 * 0. воз- активности дей Скорость побежки, мм/с 0.41 0.42 * 0.36 * 0. ствия Способность к Без пространственному дефек- Дефекты Дефекты Дефекты ориентированию тов ТШ Индекс локомоторной активности Скорость побежки 0.39 0.34 0. Способность к пространственному ориентированию ОГМП Индекс локомоторной 1ч активности Скорость побежки 0.43 0.38 0.37 0. Способность к пространственному Без дефектов ориентированию ОГМП Индекс локомоторной 0.61 12ч активности Скорость побежки 0.49 0.36 0.35 0. Способность к пространственному ориентированию Все обозначения аналогичны обозначениям в таблице 1.

Мутанты КПОТ демонстрируют ряд локомоторных нарушений, однако они менее выражены, чем у линий с полиморфизмами по локусу agnostic. Достоверных отличий по частоте побежек нет, также почти нет отличий по индексу активности.

Подобный результат достаточно легко объяснить, поскольку в первом случае мы имеем дело с нарушениями гена, оказывающего непосредственное влияние на транскрипцию, а в случае мутантов по ферментам КПОТ – с нарушениями синтеза эндогенных модуляторов активности. При этом сам фермент LIMK1 остаётся незатронутым. Линия v демонстрирует некоторые нарушения пространственного ориентирования. Численные отличия параметров локомоторной активности от линии CS невелики. Действие стрессорных факторов на индекс активности минимально. В целом, влияние этой мутации на локомоторное поведение невелико. Единственным заметным отличием является отсутствие характерной для CS реакции на ОГМП 12ч. Линия cn демонстрирует наиболее заметные дефекты по всем параметрам локомоторной активности. При этом личинки cn обладают высокой устойчивостью к действию стрессорных факторов, что проявляется в постоянстве значений индекса активности и характера распределения треков на классы. Линия cd в норме мало отличается от линии CS. Индекс активности, а также распределение треков личинок cd не отличается от дикого типа, а скорость побежки у cd даже больше, чем у CS. Однако при этом у cd наблюдается изменение локомоторного поведения в ответ на стрессорные факторы.

Исследование механизма связывания 3HK с NR1-субъединицей NMDA-рецептора Для выяснения возможности специфического связывания 3HK с NR1-субъединицей NMDAR методами квантовой химии и молекулярного докинга был исследован механизм связывания лигандов NR1-субъединицы. На модельной системе бензол+KYNA показано, что при связывании KYNA с Phe484 в NR1-субъединице существенную роль играет стэкинг-взаимодействие (взаимодействие -электронных облаков ароматических колец). Взаиморасположение KYNA и ароматического кольца Phe484 рецептора обеспечивает наличие стэкинг-взаимодействия с энергией порядка 6 ккал/моль. При галогенировании происходит увеличение энергии стэкинг взаимодействия, что объясняет более высокую афинность галогенпроизводных KYNA к NR1-субъединице.

Далее аналогичным методом была исследована возможность образования стэкинг-связи Phe484 с 3HK. Однако при подстановке оптимизированного димера 3HK Phe484 в связывающий сайт NR1-субъединицы оказалось, что в «закрытой» форме, соответствующей активному рецептору, размещение молекулы 3HK невозможно по стерическим причинам. Таким образом, 3HK не может быть специфическим агонистом NMDAR (Zakharov et al., 2007).

В случае «открытой» формы NR1-субъединицы, соответствующей связыванию антагониста и ингибированию NMDAR, молекула 3HK способна разместиться в связывающем сайте. Однако в этом случае образование водородных связей, приводящих к «открытой» форме NR1-субъединицы, невозможно в силу стерических ограничений (Рис. 6).

Таким образом, молекула 3HK не может стабилизировать «открытую» форму связывающего сайта NMDAR Рисунок 6. Пространственное расположение молекулы и, следовательно, не является его 3HK в связывающем сайте NMDA-рецептора (открытая антагонистом.

форма).

Заключение Личинки дикого типа CS характеризуются высокими значениями параметров локомоторной активности и хорошей способностью к пространственному ориентированию. ТШ и ОГМП 1ч не оказывают на них заметного действия. ОГМП 12ч не сказывается на способности к пространственному ориентированию, но при этом приводит к значительному (почти в 2 раза) увеличению индекса активности и скорости побежки. Это увеличение сопровождается резким спадом уровня HSP70, увеличением уровня LIMK1, индукцией Fbp2 (fat body protein 2) и заметным падением уровня HSP27.

Все линии с полиморфизмами по локусу agnostic характеризуются существенными нарушениями способности к пространственному ориентированию и пониженным значением индекса активности. Сопоставив полученные нарушения с результатами ПЦР-картирования, можно предположить, что нарушение части протеинкиназного и PDZ-доменов у линии Berlin, помимо изначального дефекта активности, сопровождается неспособностью менять поведение в ответ на стресс.

Таким образом, протеинкиназный домен LIMK1 необходим для обеспечения определённого уровня локомоторной активности и пространственного ориентирования.

Нарушение LIM и PDZ-доменов у линии Oregon-R сопровождается менее однозначными изменениями локомоторного поведения. Так, пониженное значение индекса активности у личинок этой линии обусловлено очень быстрым падением активности с течением времени. После ТШ происходит частичное восстановление как индекса активности, так и способности к пространственному ориентированию. Эти данные свидетельствуют, что изменения в LIM и PDZ доменах LIMK1 снижают спонтанную активность и способность к ориентированию при сохранении способности реагировать на стресс.

Обнаруженная нами инсерция S-транспозона после гена limk1 у мутанта agnts также приводит к весьма любопытным эффектам. Во первых, agnts3 проявляет дефект способности к ориентированию и имеет низкие значения индекса активности, что сопровождается сверхэкспрессией LIMK1, повышенным уровнем Fbp2 и отсутствием алкогольдегидрогеназы (Adh). Подобные эффекты также наблюдаются при митохондриальным стрессе (Fernndez-Ayala et al., 2010). Личинки agnts3 не меняют локомоторное поведение в ответ на ТШ, что свидетельствует о участии LIMK1 в организации ответа на ТШ. Воздействие ОГМП приводит к очень резкому изменению локомоторного поведения: возрастает индекс активности, полностью восстанавливается способность к пространственному ориентированию. Это сопровождается увеличением уровня Fbp2 и polo-like киназы (Plk4/Sak), при отсутствии изменений в уровне HSP27.

Кроме того, воздействие ОГМП на agnts3 приводит к резкому падению уровня HSP70, падению уровня LIMK1 и индукции Adh, уровень которой восстанавливается до характерного для дикого типа. У CS воздействие ОГМП не влияет на Adh.

Здесь важно заметить, что упомянутые выше белки принимают участие в ответе на разнообразные виды стресса. Показано (Kanellis et al., 1991), что Adh индуцируется в ответ на кислородное голодание. У дрозофилы нахождение в среде с этанолом приводит к увеличению уровня Adh и стимуляции локомоторной активности (Morozova et al., 2006). В работе (Fernndez-Ayala et al., 2010) описана разработанная на дрозофиле модель митохондриальных заболеваний человека. В этой модели показан дефицит дыхательной цепи, задержки в развитии и нейрологические аномалии. Также обнаружено увеличение уровня fbp2, hsp22 и hsp23. В исследованиях на фибробластах человека было показано (Куранова et al., 2010), что экранирование электромагнитного поля приводит к разупорядочиванию регулярной сетки митохондрий. Подобный эффект также наблюдается при кислородном голодании. HSP27 может использоваться как протектор при разнообразных нейрологических расстройствах. Сверхэкспрессия HSP увеличивает среднюю продолжительность жизни дрозофилы приблизительно на 30% (Wang et al., 2004) и увеличивает устойчивость к разнообразным стрессорным факторам. Polo-like кинза (Plk4/Sak) – нерецепторная киназа, которая необходима для формирования веретена деления (Bettencourt-Dias et al., 2005;

Goshima et al., 2007).

Plk4/Sak репрессируется белком p53 (который принимает участие в ответе на оксидативный стресс и радиоактивное повреждение (Jaklevic et al., 2008) что приводит к индукции апоптоза (Li et al., 2005).

Исходя из полученных данных можно предположить, что экранирование магнитного поля по характеру стрессорного воздействие напоминает окислительный, а не тепловой стресс. Более сильное воздействие ОГМП на мутанта agnts3 можно объяснить изначально пониженным уровнем Adh. Увеличение уровня Sak, не связанной напрямую с ответом на стрессорные воздействия, можно рассматривать как более отдалённый эффект воздействия ОГМП, связанный с изменением локомоторного поведения.

Поскольку первоначальной причиной всех наблюдаемых у мутанта agnts изменений является мутационное повреждение гена limk1, сопоставив более высокий уровень LIMK у agnts3 с к более сильным ответом на магнитное экранирование можно заключить, что LIMK1 является негативным регулятором ответа на ОГМП.

В отличие от мутаций по локусу agnostic, мутации по ферментам КПОТ не столь сильно сказываются на локомоторном поведении. Линия cn имеет наиболее значительные дефекты локомоторного поведения среди всех мутантов КПОТ. Данные изменения можно связать с повышенным содержанием KYNA. Однако при этом личинки cn крайне устойчивы к действию стрессорных факторов, что также можно связать с нейропротективным действием KYNA. Линия cd в норме оказывается довольно близкой к дикому типу, также как и v. Однако, при этом личинки cd сильнее реагируют на стрессорные воздействия. Подобный слабый эффект накопления 3HK на локомоторное поведение личинок хорошо согласуется с показанной неспособностью 3HK взаимодействовать с NR1 субъединицей и, таким образом, оказывать влияние на LIMK1 через глутаматергическую систему.

Выводы 1. Личинки линии дикого типа Berlin и Oregon- R по сравнению с линией дикого типа Canton-S (CS) обладают резко сниженным индексом активности и пониженной скоростью побежки, что можно объяснить нарушениями в гене limk1.

2. У мутанта agnts3 в нетранскрибируемой 3'-области гена limk1 обнаружена вставка S-элемента семейства TC1/mariner. Эта вставка может приводить к изменению пространственной организации ядра и уровня LIMK1, а также и воздействовать на гены, в которых находится доместицированный транспозон (hsp70bb, jil-1 и argonaute-2) 3. Мутация agnts3 приводит к крайне низкому уровню двигательной активности и резким нарушениям пространственного ориентирования личинок. Это сопровождается повышенным уровнем LIMK1, отсутствием алкоголь дегидрогеназы Adh и повышенным уровнем fat body protein 2 (Fbp2).

4. Ослабленное геомагнитное поле (ОГМП) оказывает на личинок дрозофилы стрессорное воздействие, отличающееся по механизму от теплового шока. ОГМП влияет на двигательную активность личинок CS, что сопровождается увеличением уровня LIMK1 и Adh, и падением уровня HSP27. У agnts3 ОГМП резко увеличивает уровень двигательной активности и нормализует пространственное ориентирование, что сопровождается падением изначально высокого уровня LIMK1, индукцией Fbp2, Adh и polo-like киназы (Plk4) при отсутствии изменения уровня HSP27.

5. LIMK1 является негативным регулятором ответа на ОГМП, поскольку более высокий уровень LIMK у мутанта agnts3 приводит к более сильному ответу на магнитное экранирование.

6. Мутации, затрагивающие ферменты кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ) – v, cn и cd – влияют на локомоторное поведение и приводят к изменению ответа на ТШ и ОГМП.

7. Нейротоксический метаболит КПОТ 3HK в релаксированной конформации не способен связываться с NR1-субъединицей NMDA-рецептора, о чем свидетельствуют данные компьютерного моделирования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи:

1. Роль стэкинг-взаимодействий в механизмах связывания глицинового сайта NMDA-рецептора с антагонистами и 3-гидроксикинуренином. Захаров Г.А., Попов А.В., Савватеева-Попова Е.В., Щёголев Б.Ф. // Биофизика, 2008, том 53, Вып. 1, стр. 22-29.

2. Molecular mechanisms for glycineb site NMDA-receptor binding with kynurenine metabolites: stacking-interactions. G. Zakharov, E. Savvateeva-Popova, A. Popov, B.

Shchegolev, P. Riederer. // J. Neuronal Transmission, 2007, Vol. 114, No. 7, p. CXIV 3. Влияние мутаций кинуренинового пути обмена триптофана у D. melanogaster на локомоторное поведение и экспрессию генов глутаматергической и холинергической системы. Захаров Г.А., Журавлев А.В., Паялина Т.Л., Камышев Н.Г., Савватеева-Попова Е.В. // Экологическая генетика, 2011, Т. IX, № 2, C. 65-73.

Тезисы:

1. Агонисты и антагонисты NMDA-рецептора. Неэмпирические квантовохимические расчеты.. Г.А. Захаров, Б.Ф. Щёголев. // Материалы семинаров политехнического симпозиума «Молодые учёные – промышленности северо-западного региона», 2004, стр. 84, 2. Квантовохимические расчёты основных агонистов NMDA-рецептора.

Г.А. Захаров, Б.Ф. Щёголев. // Материалы всероссийской межвузовской научно технической конференции студентов и аспирантов «33 неделя науки СПбГПУ», 2005, ч. 4, с 144, 3. Роль стэкинг-взаимодействий в механизме связывания антагонистов с глициновым сайтом NMDA-рецептора. Г.А. Захаров, Б.Ф. Щёголев. // Материалы всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов «34 неделя науки СПбГПУ», 2006, ч. 4, с 7.

4. Механизм управления NMDA-рецептором при помощи антагонистов глицинового сайта NR1-субъединицы. Г.А. Захаров, Б.Ф. Щёголев. // 10 Пущинская школа конференция молодых учёных «Биология – наука 21 века». Сборник тезисов., 2006, стр 11.

5. Методические аспекты исследования стэкинг-взамидействий различными методами квантовой химии. Г.А. Захаров, Б.Ф. Щёголев. // 35 неделя науки СПбГПУ, 2007, ч. 4, с 27.

6. G. Zakharov, A. Zhuravlev, B. Shchegolev, L. Sharagina, A. Popov, P. Riederer, E.Savvateeva-Popova “The possibility of kynurenine metabolites binding to ionotropic glutamate receptors and to calmodulin: data on molecular modeling and Drosophila kynurenic mutants” // XVII WFN Word Congress on Parkinson diseases and related disorders, Amsterdam., 2007, p. 7. Г.А. Захаров, Б.Ф. Щёголев Е.В. Савватеева-Попова, А.В. Попов. «Механизмы связывания glycineB сайта NR1 субъединицы NMDA-рецептора с кинуреновой кислотой (KYNA) и 3-гидроксикинуренином (3OHK)» // Международная школа конференция посв. 100 л. Со дня рожд. М.Е. Лобашова «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов», С.Петербург, 2007, стр. 51- 8. Захаров Г.А., Щёголев Б.Ф., Савватеева-Попова Е.В., Попов А.В. Компьютерное моделирование связывания лигандов с NMDA-рецепторами. // Пятнадцатая конференция Математика. Компьютер. Образование., Москва., 2008. стр. 171.

9. G.A. Zakharov, E.V. Savvateeva-Popova, A.V. Popov, B.F. Shchegolev. Drug design.

Stacking-interactions in ligand-receptor binding. // The second saint-Petersburg International conference on NanoBio Technologies, Saint-Petersburg., 2008, p. 181.

10. Гармай Ю.П., Захаров Г.А. Исследования конформационного пространства амилоидогенного пептида Ab 1-42 с использованием программного пакета MaxFolder // Сборник материалов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009", Москва., 2009.

Секция «Биоинженерия и биоинформатика», с. 3.

11. Zakharov G.A., Payalina T.L., Kamyshev N.G., Surma S.V., Stefanov V.E., Shchegolev B.F., Savvateeva-Popova E.V. Heat shock and hypomagnetic field: comparison of stress effects on larval locomotor behavior in Drosophila. //IX East European Conference “Simpler Nervous Systems”, 2009. p. 12. Захаров Г.А. Исследование воздействия теплового шока и экранирования электромагнитного поля на локомоторное поведение личинок Drosophila Melanogaster // Материалы Международного молодёжного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2010», стр. 13. Захаров Г.А., Паялина Т.Л., Камышев Н.Г., Щеголев Б.Ф., Савватеева-Попова Е.В.

Воздействие электромагнитного экранирования и теплового шока на локомоторное поведение личинок D. Melanogaster // 21 съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Калуга, 2010, стр. 14. Savvateeva-Popova E.V., Nikitina E.A, Tokmatcheva E.V., Medvedeva A.V., Kaminskaya A.N., Zhuravlev A.V., Zakharov G.A., Dolgaya Y.F. Drosophila model for studies of micro RNA regulation of limk1 gene, intermediate and long-term memory and chromatin organization // FENS Abstracts, 2010, vol. 5, p. 057.81.