Сульфатредуцирующие бактерии в экосистемах с экстремальными значениями рн
На правах рукописи
Герасимчук Анна Леонидовна СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ЭКОСИСТЕМАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ЗНАЧЕНИЯМИ рН 03.00.07 – Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена в Томском государственном университете
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Карначук О. В.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, зав. лабораторией Бонч-Осмоловская Е. А.
доктор биологических наук, профессор Вайнштейн М. Б.
Ведущая организация: Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН
Защита диссертации состоится 21 декабря 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117332, Москва, Проспект 60-лет Октября, д.7, корп. 2.
Факс (495)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат размещен на сайте: http://www.inmi.ru/dissovet.php Автореферат разослан 19 ноября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук: Т.В.Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние годы существенно возрос интерес к биоразнообразию и экологии микроорганизмов экстремальных местообитаний. Изучение экстремально кислых местообитаний (рН3) становится значимым, так как кислотность природных и техногенных экосистем часто является последствием микробной активности (Ehrlich, 1996;
Hallberg, Johnson, 2001;
Nordstrom, Southam, 1997;
Nordstrom, Alpers, 1999).
СРП, обнаруженные в кислых местообитаниях, в основном представлены спорообразующими организмами. Известны примеры выделения СРП рода Desulfosporosinus как с использованием культивирования (Johnson B.D., Hallberg, 2003), так и молекулярными методами (Ksel et al., 2001;
Nevin et al., 2003;
Saunders et al., 2005;
Winch et al., 2009;
Kimura et al., 2006 и др.) из кислых местообитаний, загрязненных металлами. Немногие полученные из таких экосистем чистые культуры были активны при рН4,9 (Johnson et al., 2006;
Kimura et al., 2006).
Изучение биоразнообразия СРП в кислых шахтных дренажах, загрязненных металлами, имеет большое практическое значение. В последние годы возрос интерес к изучению возможностей стимулирования активности аборигенной микрофлоры в загрязненных местообитаниях.
Целью подобных исследований является поиск новых путей развития биоремедиационных технологий. В связи с этим, данные о численности и биоразнообразии СРП в экосистемах, загрязненных стоками металлургических и горнодобывающих производств, представляют особую ценность.
Другим местообитанием, характеризующимся экстремальными условиями рН, являются глубоководные гидротермальные поля – области на поверхности океанического дна, характеризующихся выходами геотермальных растворов, обогащенных восстановленными соединениями серы, газами и тяжелыми металлами. Микробные сообщества глубоководных гидротерм представляют значительный интерес с точки зрения эволюции биосферы и, по мнению многих исследователей, являются аналогами сообществ, доминировавших на ранних этапах развития жизни на Земле (Заварзин, 2001;
Nisbet, 1986;
Walter et al., 1998;
Nisbet, Sleep, 2001).
Уникальное глубоководное гидротермальное поле Лост Сити, отличающееся от всех известных глубоководных гидротерм низкой температурой (40-90°С), щелочным рН (9-9.8)и составом гидротермального раствора, рассматривается некоторыми авторами как аналог экосистемы, где могли зародиться первые формы жизни (Proskurowski et al., 2008). Изучение биоразнообразия микробных сообществ флюидов и построек Лост Сити, проведенное американскими учеными (Brazelton et al., 2006) с помощью молекулярного клонирования, по мнению авторов, не показало присутствия организмов, способных восстанавливать сульфат. Однако наличие процессов сульфатредукции в поле Лост Сити показано методом измерения скоростей сульфатредукции (Леин и др., 2002;
Дулов и др., 2005) и посевом на элективные питательные среды (Дулов и др., 2005). В связи с этим, представляется важным поиск и идентификация СРП, обитающих в этой уникальной экосистеме.
Изучение структуры и разнообразия микробных сообществ природных экосистем долгое время было ограничено морфологическим описанием микроорганизмов, а физиолого-биохимические исследования проводились с чистыми культурами на лабораторных питательных средах. Однако лабораторное культивирование не дает полного представления о разнообразии микробного сообщества. Использование молекулярных методов, основанных на анализе универсального филогенетического маркера, гена 16S рРНК, а также некоторых функциональных генов, комбинируемых с физиологической характеристикой выделенных штаммов, позволяет более подробно изучить филогенетическое разнообразие микробных сообществ разнообразных экосистем (Harmsen et al., 1997;
Slobodkin et al., 2001;
Takai et al., 2003).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в выяснении филогенетического разнообразия микробного сообщества с целью поиска СРП в кислых осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе и микробных обрастаниях карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Определить численность сульфатредуцирующих микроорганизмов микробиологическими методами в осадках хвостохранилища.
2. Выделить культивируемые формы СРП из осадков хвостохранилища и изучить их физиологию и филогению.
3. Определить филогенетическое разнообразие микробного сообщества, диссимиляционно восстанавливающего сульфаты в осадках хвостохранилища, методами денатурирующего градиентного гель электрофореза и молекулярного клонирования генов 16S рРНК и функционального гена на сульфатредукцию dsrAB.
4. Определить филогенетическое разнообразие сульфатредуцирующих организмов в пробах микробных обрастаний карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования генов 16S рРНК и dsrAB.
Научная новизна работы. Впервые исследовано разнообразие и численность СРП в осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе с помощью традиционных микробиологических методов и методов, основанных на анализе последовательностей ДНК. Анализ разнообразия генов универсального филогенетического маркера 16S рРНК и функционального гена-маркера сульфатредукции dsrAB проведен методами ПЦР-амплификации и последующего разделения методами денатурирующего градиентного гель электрофореза (ДГГЭ) и молекулярного клонирования. Установлено, что микроорганизмы, способные к восстановлению сульфатов, представлены в исследуемом местообитании филотипами, родственными спорообразующим СРП рода Desulfosporosinus. Также обнаружены последовательности, родственные генам dsrAB некультивируемых микроорганизмов, существенно удаленных от всех Bacteria, для которых известна способность к диссимиляционной сульфатредукции и, вероятно, относящихся к неизвестным сульфидогенам. Комбинирование методов молекулярной биологии (ДГГЭ и молекулярное клонирование генов) и традиционных методов культивирования позволило наиболее подробно охарактеризовать сообщество микроорганизмов в кислых осадках хвостохранилища.
Из микрокосмов, полученных из проб осадков хвостохранилища на среде с лактатом и низким рН (2,5) с содержанием меди (II) 200 мг/л, выделена чистая культура Desulfosporosinus sp. DB, отличающаяся от известных представителей рода Desulfosporosinus умеренно-ацидофильным характером роста и устойчивостью к высоким концентрациям тяжелых металлов (меди, никеля, кобальта и кадмия). Изучена способность штамма образовывать сульфиды меди, показано накопление сульфидов в виде микрокристаллов на поверхности бактериальных клеток.
Исследовано бактериальное разнообразие в пробе микробного обрастания карбонатной постройки гидротермального поля Лост Сити.
Впервые в этом местообитании обнаружены гены dsrAB, родственные представителям СРП рода Desulfotomaculum. Параллельное клонирование генов 16S рРНК и dsrAB свидетельствует, что спорообразующие Firmicutes, родственные Desulfotomaculum, являются единственными организмами в сообществе микробного обрастания из Лост Сити, для которых вероятна способность к диссимиляционной сульфатредукции.
Личный вклад соискателя. Автор принимал участие в отборе проб с территории бывшего хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе, определении численности СРП и получении микрокосмов. Выделение чистой культуры и изучение ее физиологических характеристик проводилось совместно со студентами лаборатории биотехнологии и биоинженерии ТГУ. Изучение разнообразия микроорганизмов с помощью молекулярного клонирования генов проводились автором самостоятельно, ДГГЭ-анализ – совместно с магистрантом ТГУ Г.А. Стыкон. Филогенетический анализ микробных сообществ выполнен в партнерстве с научным руководителем – д.б.н. О. В.
Карначук. Формулирование целей, задач и обсуждение полученных результатов проводилось под руководством научного руководителя.
Практическая значимость работы. Данные о численности и разнообразии СРП в осадках хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе могут быть использованы при разработке технологий ремедиации, основанных на стимуляции аборигенного сообщества микроорганизмов, способных к переводу растворенных металлов в нерастворимую форму.
Чистая культура СРП, выделенная и охарактеризованная в ходе настоящей работы, обладает свойствами, важными с точки зрения использования в биотехнологиях осаждения металлов, а именно:
устойчивостью к металлам, ацидотолерантностью, способностью к использованию дешевых органических субстратов (этанола, глицерина).
Осаждение ионов меди в виде халькопирита и ковеллита в процессе роста штамма делает его перспективным для использования в технологиях биоремедиации. Штамм может быть рекомендован для тестирования в in situ и ex situ технологиях очистки стоков от металлов.
Результаты исследования микробного сообщества гидротермального поля Лост Сити позволили идентифицировать представителей СРП в изученной экосистеме.
Основные защищаемые положения:
1. Спорообразующим Desulfosporosinus принадлежит важная роль в процессе диссимиляционного восстановления сульфатов в осадках хвостохранилища, характеризующихся высоким содержанием металлов и низкими значениями рН.
2. Выделенный штамм СРП Desulfosporosinus sp. DB является перспективным для использования в технологиях биоремедиации загрязненных металлами и сульфатами экосистем.
3. Диссимиляционное восстановление сульфата в микробных обрастаниях карбонатных построек Лост Сити могут осуществлять родственные Desulfotomaculum организмы.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006);
11th International Symposium on Microbial Ecology (Vienna, Austria, 2006);
II International Conference on Environmental, Industrial, and Applied Microbiology Международной научной конференции (Seville, Spain, 2007);
«Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007);
6th International Copper Meeting «Copper and related metals in biology» (Alghero, Sardinia-Italy, 2008);
IV Молодежной школе-конференции c международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008);
Российской школе-конференции микроорганизмов и «Генетика биотехнология» (Москва-Пущино, 2008);
школе-семинаре «Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехнологии растений и микроорганизмов» (Томск, 2008), V Молодежной школе-конференции c международным участием аспекты современной «Актуальные микробиологии» (Москва, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 2 статьи и 9 тезисов докладов. Одна статья находится в печати.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и обсуждение, выводов и списка литературы.
Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и включают 39 рисунков и 18 таблиц.
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и биоинженерии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета под руководством д.б.н. О. В. Карначук. Молекулярное клонирование проведено во время стажировок в рамках Инновацонно-образовательной программы ТГУ и гранта РФФИ по программе «Мобильность молодых ученых» в Лаборатории генетики биодеградации и биотрансформации ГосНИИгенетика под руководством д.б.н. А. С. Яненко.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. О. В. Карначук, д.б.н. А. С. Яненко, д.б.н. Н. В. Пименову, к.б.н. Ю.А.
Франк, науч. сотр. А. Д. Новикову за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Искренне признательна д.б.н.
А. Ю. Леин и к.б.н. И. И. Русанову за любезно предоставленные пробы из глубоководного гидротермального поля, доктору Александру Лою (Университет Вены) за помощь в филогенетическом анализе генов dsrAB, доктору Дэвиду Бэнксу (Университет Ньюкасла) и доктору Бьорну Френгстаду (Норвежская геологическая служба) за анализ металлов в пробах осадков хвостохранилища, А. А. Миллеру за помощь в электронном микроскопировании, А. В. Козловой за проведение микроанализа осадков сульфида, О. В. Забудченко за проведение дифракционного анализа и помощь при построении дифрактограмм. Особая благодарность д.б.н. Т. Н.
Назиной, д.б.н. Е. А. Бонч-Осмоловской, д.б.н. А. Е. Ивановой, академику М.
В. Иванову, д.б.н. Д. Ю. Сорокину за помощь в формулировании положений автореферата диссертации. Автор приносит благодарность всем соавторам, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Объектом исследования служили микробные сообщества осадков хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе и микробные обрастания карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.
Месторождение «Новый Берикуль» расположено на территории Кемеровской области. Одной из основных ассоциированных сульфидных руд на месторождении является пирит, также присутствуют арсенопирит, галенит, сфалерит. Количество сульфида в среднем составляет 10%, из них на долю пирита – 6-7% (Геращенко, 2000). Процессы окисления отходов приводят к образованию многочисленных высачиваний, характеризующихся низким рН и высокой концентрацией растворенных металлов (Таблица 1). О присутствии в данном местообитании сообщества СРП свидетельствует измеренная скорость сульфатредукции, которая составила 30 нм S/(л сут) (Пименов, неопубликованные данные).
Гидротермальное поле Лост Сити расположено вблизи вершины массива Атлантис Срединно-Атлантического хребта на глубине 750–800 м.
Гидротермальные постройки высотой от нескольких сантиметров до 60 м состоят из арагонита, кальцита и брусита. Активные постройки омываются «мерцающими» теплыми (40–90°С) водами (рН 9), поднимающимися вдоль стенок построек. Карбонатные постройки в местах сочения флюида с поверхности покрыты нитевидными микробными обрастаниями, а вблизи грифончиков отлагаются ярко-белые желеподобные выделения, состоящие из микроорганизмов и карбонатов, образующих не литифицированную массу (Леин и др., 2002). Скорость сульфатредукции составляла 17-28 мг S/(л сут) (Леин и др., 2002;
Дулов и др., 2005).
Методы отбора проб. Пробы верхнего окисленного слоя осадков и придонной воды с территории бывшего хвостохранилища золотообогатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе были отобраны в июле 2006 г. (образцы Ха 115 и 116) и августе 2007 г. (Ха 201). Температуру, рН и электропроводность воды определяли на месте рН-метром HANNA HI 8314F. Определение концентрации ионов металлов проводилось в лаборатории Норвежской Геологической Службы методами масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS) и атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ICP AES). Концентрацию анионов определяли там же с помощью ионного хроматографа (Dionex 120 DX).
Части гидротермальной постройки Лост Сити, содержащей скопления микроорганизмов, были отобраны 28 августа 2005 г. в 50 рейсе НИС «Академик Мстислав Келдыш» с помощью глубоководного обитаемого аппарата Мир-2 на вершине гигантской постройки «Посейдон». Проба была доставлена на борт в специальном контейнере с плотно прилегающей титановой крышкой и заморожена при температуре -20 оС.
Методы, основанные на культивировании. Численность СРП определяли методом предельных разведений на жидкой пресноводной среде Видделя. Растворы витаминов, микроэлементов и органических веществ, доноров углерода и электронов, также готовили по методу Видделя и Бака (Widdel, Bak, 1992). Пенициллиновые флаконы доливали средой доверху, в качестве дополнительного микро-источника железа использовали стальную скрепку, которая также способствовала поддержанию низкого окислительно восстановительного потенциала среды за счет выделения катодного водорода и служила сайтом нуклеации при образовании сульфида железа.
Инкубировали при различных условиях рН (2 и 7) при температуре 28°С. В качестве доноров углерода и электронов в среду вносили лактат, этанол и ацетат. Использовали 3 ряда последовательных десятикратных разведений.
Подсчет СРП проводили ежемесячно. Рост определяли визуально, по почернению среды вследствие образования сульфида железа, а также по приросту сероводорода, измеряемого спектрофотометрически методом Пахмайера. Наиболее вероятное число клеток бактерий в образцах рассчитывали с использованием таблиц Мак-Креди (Koch, 1994).
Таблица 1. Концентрация некоторых анионов и катионов в пробах осадков хвостохранилища и флюиде гидротермального поля Лост Сити.
Ха Параметры Ха115 Ха116 Лост Сити* Т°С 20.9 20.4 16.6-17 40- рН 2.8 1.97-2.4 2.36-2.46 9-9, Cl, мг/л 10.2 15.2 20 19357- Br-, мг/л нд** 5.0 5.23 5. SO42-, мг/л 566- 8448 22876 Si+, мг/л нд 75.5 72.4 27. Al2+, мг/л нд 286 518 2+ Fe, мг/л 0. 2020 9100 Mg2+, мг/л 267 445 193 210- Ca2+, мг/л 502 357 343 840- + Na, мг/л 25.7 6.89 1.2 11010- Mn2+, мг/л нд 32.9 52.5 24. Cu2+, мг/л 0.0127-0. 12.6 35.2 12. 2+ Zn, мг/л 133 351 162 0.013-0. Pb2+, мг/л 1.27 8.49 0.5 0.0145-0. Ni2+, мг/л 4.29 4.88 4.9 0.00352-0. 2+ Co, мг/л 2.35 4.77 2.3 0.00825-0. Cd2+, мг/л нд 2.03 5.72 2. As+, мг/л нд 24.2 1910 * по литературным данным ** нет данных Накопительные культуры СРП получены путем пересевов на среду Видделя из серий предельных разведений для определения численности.
Лактат, ацетат и этанол использовали в качестве субстратов роста, культивирование проводили при +28 оС.
Для выделения чистой культуры использованы последние в серии разведений флаконы с заметным ростом СРП из осадков. Устойчивость к ионам металлов изучали, используя растворы CdCl2 х 2.5H2O, CuSO4 х 5H2O, NiCl2, CoCl2 х 6H2O различных концентраций. Для поддержания культуры в активном состоянии делали регулярные пересевы. Концентрацию биомассы в культуре определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).
Молекулярные методы. Выделение ДНК микроорганизмов из проб микробных обрастаний карбонатной постройки Лост Сити проводили в соответствии с модифицированной методикой Жоу (Zhou et al., 1996). Из осадков хвостохранилища ДНК выделяли набором реактивов MO BIO PowerSoil DNA Kit (MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA).
Для анализа микробного сообщества методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) проводили амплификацию гена 16S рРНК с праймерами BacV3f и 907R. ДГГЭ проводили, используя систему «Dcode System (Biorad laboratories, Hercules, CA, U.S.)». Применяли 8 % полиакриламидный гель с денатурирующими градиентами от 30 % до 65 % (100 % денатурирующий раствор содержал 7М мочевину и 40% формамид).
Добавляли 10 % APS и TEMED в качестве полимеризующих агентов. Лунки промывали ТАЕ. Электрофорез проводили 16 часов в ТАЕ-буфере при 60С и 100 V.
Для амплификации гена 16S рРНК использовали праймеры 27F и 1492R.
Амплификацию генов проводили с использованием Mastercycler (Eppendorf) по следующей программе: первоначальная денатурация при 95 оС в течение 20 сек;
последующие 6 циклов денатурация при 95 оС в течение 10 сек, отжиг праймеров при 45 оС в течение 20 сек, элонгация праймеров при 72 оС в течение 1.5 мин;
последующие 27 циклов денатурация при 95 оС в течение 10 сек, отжиг праймеров при 55 оС в течение 20 сек;
элонгация праймеров при 72 оС в течение 1.5 мин;
окончательная элонгация при 72 оС в течение мин.
ПЦР-амплификацию генов dsrAB осуществляли с использованием смеси вырожденных праймеров dsr1F и dsr4R (Wagner et al., 2005). Для амплификации генов dsrАВ опытным путем был установлен следующий цикл: после первоначальной денатурации в течение 1 мин при 95°С следовали 30 циклов: денатурация 10 сек при 95°С, отжиг праймеров 20 сек при 61°С, элонгация 1 мин при 72°С, на заключительной стадии элонгацию проводили 10 мин при 72°С. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1 % агарозном геле и экстрагировали с помощью набора реактивов DNA Extraction Kit (Fermentas).
Для молекулярного клонирования генов использовали набор реактивов InsT/AcloneTM PCR Product cloning Kit (Fermentas). Некоторое количество ПЦР-продуктов генов 16S рРНК и dsrAB клонировали в вектор pTZ57, и вводили путем электропорации в клетки E. coli sp. XL1. Трансформанты отбирали на среде LB с агаром, содержащей Xgal, IPTG и ампициллин.
Наличие встроенных фрагментов в клонах определяли с помощью ПЦР амплификации с праймерами на внутрениий участок вектора M13/pUC F и R.
Анализ полученных библиотек клонов 16S рРНК и dsrAB проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), Клоны, показавшие одинаковые рестрикционные профили после проведения электрофореза в 2% агарозном геле, объединяли в операционные таксономические единицы (OTU). Из каждой OTU отбирали случайным образом по одному клону для дальнейшего анализа последовательности.
Секвенирование последовательностей ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе Beckman Coulter CEQ 8000 в ГосНИИгенетика.
Анализ последовательностей ДНК проводили с использованием программы BioEdit и инструмента BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Филогенетический анализ проводили с использованием пакета ARB (http://www.arb-home.de). Филогенетические деревья были построены методом ближайшего соседа (neighbor-joining) для полных или близких к полным последовательностям.
Микроскопирование и микрофотосъемка. Фазово-контрастную микроскопию культур СРП проводили с помощью микроскопа AxioImager A1 (Carl Zeiss). Микрофотосъемку осуществляли при увеличении х1000 с использованием фотосистемы Axiocam HS и компьютерной программы AxioVision 4.
Ультраструктуру бактериальных клеток изучали методом трансмиссионной электронной микроскопии с использованием электронного просвечивающего микроскопа “JEM-100 CXII” (“JEOL”, Япония).
Анализ осадков сульфида проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips SEM515 с анализатором EDAX ECON IV и методом рентгено-фазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000.
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ОСАДКАХ ХВОСТОХРАНИЛИЩА Численность сульфатредуцирующих бактерий в осадках хвостохранилища. Максимальная численность СРП, зафиксированная в пробе осадков Ха115, составляла 9,5102 кл/мл (рис. 1а). Численность СРП в пробах осадков Ха 116 была значительно меньше и не превышала 9,5 кл/мл (рис. 1б). Максимальную численность СРП в пробе 115 обнаруживали при культивировании при низких значениях рН среды (рН 2) и повышенной концентрации ионов меди (начальная концентрация Cu(II) 200 мг/л).
(б) (a) рН= Ха рН7Cu Ха рН7Cu рН= рН=2 lo g к л е т о к с м - pH2Cu log клеток см - pH2Cu 2 1 0 Лактат Этанол Ацетат Лактат Этанол Ацетат Рис. 1. Численность СРП в осадках Ха115 (a) и Ха116 (б), определенная методом предельных разведений с различными донорами электронов, рН и концентрацией меди в среде.
Клонирование генов 16S рРНК и dsrAB из осадков хвостохранилища. Анализ микробного сообщества проводили по схеме, представленной на рисунке 2. Из пробы осадка Ха 201 была выделена тотальная ДНК и получена библиотека генов 16S рРНК, состоящая из клонов, объединенных в 46 OTU на основе рестрикционного анализа. Анализ полученных последовательностей показал, что бактериальная популяция относится к разным филогенетическим группам, включая классы Alpha- и Gammaproteobacteria и филумы Nitrospira, Firmicutes, Acidobacteria и Actinobacteria.
ДНК сообщества ДНК микрокосма гены dsrAB гены 16S рРНК (смесь DSR1F, DSR4R) (27F, 1492R, ДГГЭ-праймеры) Библиотеки клонов ДГГЭ Филогенетический анализ Рис. 2. Схема проведения анализа проб Ха 201, Ха115 и Ха Гены 16S рРНК, относящиеся к Gammaproteobacteria, составляли 60% микробного сообщества (рис. 3) и большей частью были представлены последовательностями, родственными культивируемым и некультивируемым представителям рода Acidithiobacillus (рис. 4). Во всех исследованных нами осадках обнаружены последовательности генов 16S рРНК, родственные A.
ferrooxidans, а в Ха116, кроме того, и A. caldus. Эти микроорганизмы могут играть важную роль в окислении арсенопирита и снижении рН среды.
Остальные полученные филотипы были не столь многочисленны.
Обнаруженные последовательности, относящие к Firmicutes, Alphaproteobacteria и Actinobacteria, составляли примерно по 10% от исследуемого микробного сообщества в составе библиотеки генов 16S рРНК (Рис. 3). Самыми немногочисленными были гены 16S рРНК, относящиеся к Nitrospirae (около 1,5%) и Acidobacteria (менее 5%).
% от общего числа клонов Gammaproteobacteria Firmicutes Actinobacteria Alphaproteobacteria Nitrospirae 16SрРНК эукариот Acidobacteria Рис. 3. Основные филогенетические группы, обнаруженные в пробе Ха 201 в результате анализа бактериальных генов 16S рРНК Acidithiobacteriaceae 100% Symbiobacterium sp.
90% % от общего числа клонов Acidospaera sp.
Митохондриальная РНК мхов 80% РНК хлоропластов папоротников 70% некультивируемые Actinobacteria 60% некультивируемые Alphaproteobacteria Acidobacteriaceae 50% Gluconobacter sp.
40% Bacillus sp.
30% Leptospirillum sp.
Gluconacetobacter sp.
20% Clostridium sp.
10% Acidithiobacillus sp.
Acidiphilium sp.
0% Ferrimicrobium sp.
Рис. 4. Разнообразие микроорганизмов в пробе Ха 201 на основе анализа генов 16S рРНК.
Следует отметить, что многие обнаруженные нами клоны показывали высокую степень гомологии с последовательностями некультивируемых микроорганизмов, выделенных из экстремально кислых экосистем, ассоциированных с Иберийским колчеданным поясом и рекой Рио Тинто в Испании (Garca-Moyano et al., 2007) и другими местообитаниями, связанными с кислыми шахтными дренажными водами.
Анализ библиотеки генов 16S рРНК, амплифицированных из нативной ДНК, не выявил наличия в пробе последовательностей, для представителей которых была бы известна способность к сульфатредукции. Однако нам удалось амплифицировать и клонировать один из ключевых генов на сульфатредукцию – ген диссимиляционной бисульфитредуктазы (dsrAB).
Была получена библиотека генов dsrAB. Обнаруженные нами филотипы группировались внутри трех отдаленных между собой кластеров (рис. 5).
Большая часть филотипов (82%) была родственна (уровень гомологии от до 90%) генам dsrAB некультивируемых микроорганизмов, полученных при анализе микробного разнообразия хвостохранилищ отходов добычи урана (Chang et al., 2001) (на рисунке 5 этот кластер обозначен B). Культивируемые организмы, принадлежащие к этому кластеру, не известны.
Несколько последовательностей (кластер А на рисунке 5) были наиболее близки гену dsrAB некультивируемого микроорганизма из кислых болот фенов в Германии (AY167476) (Loy et al., 2004). Мы не можем утверждать, что описанные выше обнаруженные нами последовательности генов dsrAB принадлежат организмам, диссимиляционно восстанавливающим сульфаты, так как существуют сообщения о присутствии этих генов у других сульфидогенных микроорганизмов, не способных к диссимиляционному восстановлению сульфата. Однако секвенирование уникальных последовательностей из библиотеки клонов dsrAB выявило присутствие филотипа (кластер C на рисунке 5), родственного гену dsrAB СРП Desulfosporosinus orientis.
Desulfovibrionaceae Desulfomicrobiaceae Desulfohalobium retbaense, AF Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, AF Desulfobacteraceae Desulfonatronum lacustre, AF Desulfomonile tiedjei, AF Firmicutes (with laterally acquired dsrAB) Desulfobacterium anilini, AF Desulfobulbaceae genus Thermodesulfobacterium Syntrophobacteraceae Desulfoarculus baarsii, AF CloneXa201_32r A CloneXa201_81b 10% CloneXa201_55b_OTU Acidic fen soil clone dsrSbI-75, AY Deep-sea sediment clone NTdV06, AB Wadden Sea sediment fosmid ws7f8, CT Wadden Sea sediment fosmid ws39f7, CT Desulfobacca acetoxidans, AY CloneXa201_13r CloneXa201_27r_OTU B CloneXa201_66b_OTU CloneXa201_25b Uranium mill tailings site clone UMTRAdsr82625, AY015500, AY Uranium mill tailings site clone UMTRAdsr8267, AY015502, AY Deep soil clone W38, DQ Deep soil clone W11, DQ Solid waste digester clone MSA01, AB Hot spring clone BSP102, AY Deep soil clone D70, DQ Hot spring clone BLV6, AY Desulfitobacterium dehalogenans, AF Desulfosporosinus orientis, AF C CloneXa201_57b Desulfotomaculum alkaliphilum, AF Desulfotomaculum halophilum, AY Pelotomaculum sp. MGP, AB Desulfotomaculum aeronauticum, AF Desulfotomaculum ruminis, U58118, U Desulfotomaculum putei, AF Desulfotomaculum nigrificans, AF Thermodesulfobium narugense, AB genus Archaeoglobus genus Thermodesulfovibrio Рис. 5. Филогенетическое дерево, показывающее положение клонов dsrAB из пробы Ха 201 осадков хвостохранилища.
ДГГЭ-анализ и клонирование генов 16S рРНК из накопительных культур. С целью анализа сообщества культивируемых форм, обладающих способностью восстанавливать сульфат, создавали микрокосмы, содержащие осадки хвостохранилища и питательную среду для СРП, которые потом анализировали с помощью разделения амплифицированных генов/фрагментов гена 16S рРНК методом клонирования или ДГГЭ.
После трех месяцев культивирования анаэробные микрокосмы, полученные из проб Ха 115, Ха 116 и Ха 201, показывали явные следы развития сульфатредукции. Осадок чернел, что вероятнее всего происходило в результате осаждения сульфидов железа и других металлов.
Анализ микробного сообщества в микрокосме Ха 201, полученного на среде Видделя с лактатом, содержащей 200 мг/л Сu (II) при начальном рН 2,5, изучали с помощью молекулярного клонирования генов 16S рРНК.
Филогенетический анализ библиотеки из 66 клонов показал, что филотипы всех OTU образовывали один кластер, ближайшими культивируемыми родственниками которого были виды Desulfosporosinus.
Филогенетический анализ филотипов из микрокосмов Ха115, разделенных методом ДГГЭ, также показал, что большинство обнаруженных последовательностей организмов, для которых известна способность к сульфатредукции, относилось к роду Desulfosporosinus (рис. 6).
Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена 16S рРНК филотипов, разделенных с помощью ДГГЭ, позволил обнаружить в микрокосмах Ха 115 и Ха 116 не только гены 16S рРНК организмов, способных осуществлять диссимиляционное восстановление сульфата, но и другие группы домена Bacteria. Прежде всего, нужно отметить филотипы, родственные железоокисляющим Acidithiobacillus ferrooxidans (рис. 6 ).
Большое количество филотипов, обнаруженных в Ха115, образовывало отдельный кластер внутри Peptococcaceae (рис. 6). Их ближайшим валидно описанным родственником была синтрофная бактерия Pelotomaculum isophtalicum, гомология последовательностей с которым составляла не более 91%. К этой же группе относилось большинство организмов, обнаруженных в микрокосмах Ха116.
Несколько филотипов, обнаруживаемых как в микрокосме Ха115, так и в Ха116, последовательности генов 16S рРНК которых относились к Firmicutes, попадало в группу организмов, ближайшим валидно описанным родственником в которой был Thermincola carboxydiphila. Гомология последовательностей T. carboxydiphila и филотипов из Ха116 и Ха115 не превышала 93%, поэтому физиологическая роль этой группы организмов, к которой относятся обнаруженные филотипы, остается невыясненной.
Способность получать энергию за счет диссимиляционной сульфатредукции к настоящему времени обнаружена у микроорганизмов, относящихся к семи различным филумам филогенетического дерева (Stahl et al., 2007). Самые многочисленные группы представителей сосредоточены в классе Deltaproteobacteria и отделе Firmicutes. Исключительной особенностью исследованных осадков хвостохранилищ является тот факт, что нам не удалось обнаружить в них ни одного представителя Deltaproteobacteria. Все полученные филотипы и выделенная чистая культура СРП относились к спорообразующим Firmicutes.
Рис. 6. Филогенетическое положение генов 16S рРНК, полученных при ДГГЭ-анализе из микрокосмов Ха115 и штамма Desulfosporosinus sp. DB. Более короткие последовательности добавлены с использованием parsimony analysis к дереву, построенному ранее методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Methanobacterium formicicum, AF169245 (не показан на дереве) был выбран в качестве удаленной группы.
ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩЕЙ БАКТЕРИИ И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ Из пробы осадков (Ха 201) хвостохранилища на месторождении «Новый Берикуль» в Кузбассе, характеризующихся низким значением рН (2.36-2.46) и высокой концентрацией ионов металлов (таблица 1) была получена накопительная культура СРП (рН 2.5, Сu2+ 200 мг/л), путем пересевов которой методом предельных разведений с постепенным повышением концентрации меди до 650 мг/л выделена чистая культура спорообразующих СРП, обозначенная как штамм DB. Культура представлена подвижными слегка изогнутыми палочками размером 2-50.7-1.5 мкм (рис. 7).
Филогенетический анализ последовательности гена 16S рРНК длиной 1473 п.о. (номер доступа в GenBank EU737112) поместил штамм в филум Firmicutes, род Desulfosporosinus (рис. 6).
Штамм способен к росту при начальных рН среды 2.0 и не растет при начальном нейтральном значении рН, что отличает его от валидно описанных представителей рода Desulfosporosinus, диапазон значений рН для роста которых составляет 6.1 – 8.3. В процессе роста происходило увеличение значения рН среды (до 5.5), частично это происходило за счет химических реакций вследствие присутствия в среде стальной скрепки, но дальнейшее повышение рН все же обусловлено жизнедеятельностью микроорганизмов. В эксперименте заметный прирост биомассы начинался после продолжительной лаг-фазы (20 суток) при значении рН 4.0.
Рис. 7. Микрофотография клеток штамма DB. Фазово-контрастная микроскопия.
В качестве органических субстратов для роста штамм использовал лактат, этанол, малат, ацетат, фумарат, пируват и глицерин. Менее активный рост наблюдается на глюкозе, сахарозе, изобутаноле, формиате, и фруктозе.
Слабый рост зафиксирован при внесении цитрата и никотиновой кислоты.
Бактерия не росла на пропионате и пропаноле.
Диапазон солености среды, при которой возможен рост штамма, составил от 0 до 3% NaCl с оптимумом в отсутствие хлорида натрия.
Штамм Desulfosporosinus sp. DB рос при добавлении к основной среде культивирования ионов никеля (II), кобальта (II), кадмия (II) и меди (II).
Визуальные наблюдения образования сульфидов (потемнение и образование нерастворимого осадка), а также микроскопирование культуры на разных стадиях культивирования выявило активный рост штамма в присутствии ионов никеля (II) в концентрации до 300 мг/л, 200 мг/л ионов кобальта (II), мг/л ионов кадмия (II) и ионов двухвалентной меди в концентрации до 5 г/л.
Указанные концентрации никеля и кобальта не являются предельными для роста штамма, в то время как дальнейшее повышение концентраций кадмия и меди лимитировало рост бактерий.
Изучение ультратонких срезов клеток, культивированных в среде с добавлением 200 мг/л ионов меди, выявило способность штамма накапливать на поверхности клеток микрокристаллов, предположительно сульфида меди (рис. 8). Рентгено-фазовый анализ показал, что в процессе роста штамма в присутствии ионов меди (200 мг/л) происходит накопление сульфидов меди.
Основными фазами, обнаруженными в осадках, были халькопирит (CuFeS2) и ковеллит (CuS) (Рис. 9).
A Б Рис. 8. Трансмиссионная электронная микроскопия срезов клеток Desulfosporosinus sp.
DB, культивированных в течение 41 суток с добавлением 200 мг/л ионов двухвалентной меди. Стрелками показаны образующаяся в клетке спора (А) и микрокристаллы на поверхности клетки (Б). Линейка 1 мкм.
1300 Ch Ch 900 Ch I (Counts) Ch 500 Ch Cv Cv Cv 400 Ch 200 Gr Cp Gr Gr Gr 100 Cp 5 0 0 10 20 30 40 50 60 100 10 20 30 40 50 60 2 T h e ta Рис. 9. Дифрактограммы осадков, полученных при росте Desulfosporosinus sp. DB в присутствии 200 мг/л Cu2+, 54 суток культивирования (1);
200 мг/л Cu2+, 41 сутки культивирования (2);
без добавления ионов Cu2+, 46 суток культивирования (3);
в контроле без добавления инокулята с внесением 200 мг/л меди (4) и контроле без инокулята с добавлением 100 мг/л Na2S и 200 мг/л меди (5). Сv – ковеллит, Сh – халькопирит, Cu – медь, Cc – халькоцит,Cp – куприт, Gr – грейгит Fe3S4.
Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ НА ГИДРОТЕРМАЛЬНОМ ПОЛЕ ЛОСТ СИТИ Определение структуры микробного сообщества с помощью Была создана библиотека 16S клонирования генов рРНК.
последовательностей генов 16S рРНК из 100 клонов. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов позволил выделить 75 OTU.
Секвенирование последовательностей генов 16S рРНК выявило присутствие последовательностей микроорганизмов, относящихся к Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Firmicutes, а также представителей с неопределенным таксономическим статусом, относящихся к так называемой группе «Candidate division OD1» (Рис. 10А).
100% Candidate division OD 80% % от числа клонов Alphaproteobacteria 60% Epsilonproteobacteria 40% Firmicutes 20% Gammaproteobacteria 0% A 100% Geosporobacter 90% Marinosulfomonas 80% Anaerovirgula 70% неизвестные Bacteria % от числа клонов 60% Rhodobacterales 50% Desulfotomaculum 40% Vibrio Alteromonas 30% Roseobacter 20% Sulfospirillum 10% Thiomicrospira 0% Б Рис. 10. (А) Структура микробного сообщества и (Б) состав микробного сообщества на основе анализа генов 16S рРНК.
Наибольшее число полученных клонов принадлежало роду Thiomicrospira класса Gammaproteobacteria (Рис. 10Б). Ближайшим валидно описанным родственником клонов, объединенных в OTU1, была последовательность гена 16S рРНК, родственная T. crunogena (93.8%).
Филогенетический анализ показал, что филотип принадлежал к отдельному кладу, включающему полученные ранее последовательности из карбонатных построек гидротермального поля Лост Сити (Brazelton et al., 2006).
Следующая по количеству группа клонов (OTU2) представлена последовательностями, близкими к класса Sulfurospirillum Epsilonproteobacteria, для которых характерна способность восстанавливать серу с использованием Н2 в качестве донора электронов (Finster et al., 1997).
То, что группа клонов OTU2 была второй по численности в нашей библиотеке клонов, а также тот факт, что Брэзелтон с соавторами (Brazelton et al., 2006) обнаружили значительное число похожих филотипов в пробах построек и флюидов, может указывать на потенциальную важность родственных Sulfurospirillum организмов в окислении Н2 в данной экосистеме.
Единственными представителями, которые могут обладать способностью к сульфатредукции, могут быть микроорганизмы, последовательности генов 16S рРНК которых относились к кластеру филотипов, родственных Desulfotomaculum (рис. 11). Этот кластер образован последовательностями клонов, гомология которых с генами 16S рРНК валидных Desulfotomaculum не превышает 90%.
Рис. 11. Филогенетическое дерево, отражающее положение Firmicutes и Bacteria c неопределенным таксономическим положением генов 16S рРНК. Дерево построено методом ближайшего родственника, масштаб показывает одну замену на 10 нуклеотидов.
Methanobacterium formicicum (не показан) выбран в качестве удаленной группы.
Полученные нами филотипы обозначены жирным шрифтом.
Выявление сульфатредуцирующих микроорганизмов методом клонирования генов dsrAB. Анализ библиотеки клонов dsrAB выявил присутствие нуклеотидных последовательностей, близкородственных гену DSM 11559 (гомология dsrAB Desulfotomaculum halophilum последовательностей ДНК составляла 73%) (рис. 12).
Thermodesulfobacterium species Desulfotomaculum subcluster Ib+Ic+Id+Ie Desulfobulbaceae Desulfoarculus Desulfobacca baarsii acetoxidans Moorella thermoacetica Syntropho Sulfate-reducing strain mXyS Desulfotomaculum subcluster If bacteraceae Desulfotomaculum halophilum Desulfobacterium anilini Desulfotomaculum alkaliphilum Desulfotomaculum sp. Lac LC clone dsr_ Desulfomonile tiedjei Desulfonatronum lacustre Desulfotomaculum subcluster Ia Desulfovibrionaceae Desulfitobacterium dehalogenans Other Desulfovibrio species 10% Desulfosporosinus Pelotomaculum orientis Desulfohalobium retbaense sp. MGP Desulfonatronovibrio Thermodesulfobium hydrogenovorans narugense Desulfomicrobiaceae Archaeoglobus species Desulfobacteraceae Thermodesulfovibrio species Рис. 12. Филогенетическое дерево DsrAB (FITCH distance matrix, основанное на аминокислотных последовательностях, транслированных из последовательностей нуклеотидов dsrAB длиной более 1750 пар оснований), показывающее положение клона 14 из микробных обрастаний Лост Сити. Частичная последовательность LC clone dsr_14 (показана пунктирной линией) встроена в дерево с использованием ‘ARB parsimony interactive option‘ пакета ARB. Масштаб показывает 10% расхождение последовательностей. Значения бутстреппинга (bootstrap values) показаны черными (90%) или белыми (от 75 до 90%) кружками. Ветви без кружков имеют значения бутстреппинга ниже 75%.
Эти данные согласуются с проведенным анализом генов 16S рРНК, в результате которого обнаружены последовательности, родственные гену 16S рРНК Desulfotomaculum halophilum и Desulfotomaculum alkaliphilum и свидетельствуют о том, что единственными способными к сульфатному дыханию микроорганизмами в микробных обрастаниях карбонатных построек глубоководного гидротермального поля Лост Сити могут быть спорообразующие СРП рода Desulfotomaculum.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наши исследования показали, что СРП могут существовать в экстремальных условиях низких рН и высоких концентраций ионов металлов в осадках хвостохранилища и щелочных значениях рН гидротермального поля Лост Сити. В исследованных пробах хвостохранилища нами обнаружены только спорообразующие Firmicutes, для которых известна способность получать энергию за счет восстановления сульфатов.
Представителей наиболее многочисленной и изученной группы Deltaproteobacteria не удалось зафиксировать ни одним из использованных методов. Таким образом, важной группой микроорганизмов, ответственной за восстановление сульфата в кислых экосистемах, содержащих высокие концентрации металлов, являются представители рода Desulfosporosinus и родственные им организмы. Источником сульфата в исследованной экосистеме может служить процесс окисления представителями Acidithiobacillus ferrooxidans сульфидов, поступающих с твердыми отходами хвостохранилища.
Выделенный и изученный нами ацидотолерантный штамм Desulfosporosinus sp. DB использует широкий круг субстратов, устойчив к высоким концентрациям металлов и способен к осаждению ионов меди в виде халькопирита и ковеллита, что делает его перспективным для обезвреживания загрязненных металлами экосистем.
Анализ генов 16S рРНК из пробы карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити позволил обнаружить последовательности, родственные генам 16S рРНК спорообразующих СРП рода Desulfotomaculum. У. Брэзелтон с соавторами (Brazelton et al., 2006) ставили под сомнение возможность осуществления сульфатредукции организмами, принадлежащими к этому кластеру, в силу значительного расхождения последовательностей, а также неудачных попыток амплифицировать ген dsrAB из тех же проб. Получение нами клонов гена dsrAB из проб мата свидетельствует о возможности протекания сульфатредукции в микробных обрастаниях карбонатных построек Лост Сити. Более того, полученные нами фрагменты последовательности гена характеризовались наибольшей гомологией с генами dsrAB диссимиляционной бисульфитредуктазы D. halophilum и D. alkaliphilum, что подтверждает гипотезу о том, что именно эта группа организмов ответственна за восстановление сульфата в карбонатных постройках и флюидах Лост Сити. Донором для развития СРП здесь может служить глубинный Н2, присутствующий в высоких концентрациях, а образующийся сероводород становится субстратом для развития бактерий рода Thiomicrospira.
Таким образом, сочетание методов молекулярного клонирования гена 16S рРНК и функционального гена на сульфатредукцию из тотальной ДНК природных образцов, ДГГЭ-анализ и молекулярное клонирование гена 16S рРНК культивируемых в селективных условиях микроорганизмов из исследованных местообитаний, а также выделение чистой культуры СРП и изучение ее свойств позволило наиболее полно охарактеризовать сообщество, ответственное за диссимиляционное восстановление сульфата в таких экстремальных экосистемах, как осадки хвостохранилища золотообагатительной фабрики на месторождении «Новый Берикуль» (Кузбасс) и микробные обрастания карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити.
ВЫВОДЫ 1. В осадках хвостохранилища золотоперерабатывающего завода на месторождении «Новый Берикуль» (Кузбасс), характеризующихся кислыми условиями среды и высокой концентрацией металлов, обнаружены сульфатредуцирующие микроорганизмы, максимальная численность которых в среде с добавлением металлов и низким значением кислотности среды (рН2) составляла 9.5102 кл/мл.
2. Определено бактериальное разнообразие в осадках хвостохранилища методами молекулярного клонирования генов 16S рРНК и dsrAB.
Обнаружены последовательности генов, родственные представителям Acidithiobacillus ferrooxidans, Ferrimicrobium acidiphilum, Actinobacteria, Acidiphilium sp., Acidobacteriaceae, Clostridium sp., Leptospirillum ferrooxidans, Gluconacetobacter sp., Bacillus sp. Клонирование генов 16S рРНК из осадков хвостохранилища не выявило последовательностей, родственных СРП.
Однако получены клоны генов dsrAB, родственные Desulfosporosinus, а также неизвестным сульфидогенным микроорганизмам.
3. Анализ культивируемого сообщества СРП из осадков хвостохранилища, проведенный методами денатурирующего градиентного гель-электрофореза и молекулярного клонирования, показал присутствие генов 16S рРНК организмов, родственных Desulfosporosinus. Выделена чистая культура Desulfosporosinus sp. DB, характеризующаяся умеренно-ацидофильным характером роста и устойчивостью к повышенным концентрациям ионов металлов.
4. Анализ микробных обрастаний карбонатной постройки глубоководного гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования гена 16S рРНК показал присутствие организмов, родственных Thiomicrospira sp., Sulfospirillum arcachonense, Marinosulfonomonas methylotropha, Anaerovirgula multivorans, Rhodobacterales, Alteromonas marina, Vibrio tubiashii, Geosporobacter subterrenus и Desulfotomaculum halophilum.
5. Молекулярное клонирование гена 16S рРНК и функционального гена dsrAB свидетельствует о том, что спорообразующие Firmicutes, родственные Desulfotomaculum, вероятно, являются единственными организмами в сообществе мата из гидротермального поля Лост Сити, которые могут осуществлять процесс диссимиляционной сульфатредукции.
6. Методы молекулярной биологии и традиционные микробиологические методы являются взаимодополняющими и позволяют наиболее полно охарактеризовать сообщество сульфатредуцирующих организмов в экстремальных экосистемах с экстремальными значениями рН.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи 1. O. V. Karnachuk, K. Sasaki, A. L. Gerasimchuk, O. Sukhanova, D. A.
Ivasenko, A. H. Kaksonen, J. A. Puhakka, and O.H. Tuovinen. Precipitation of Cu sulfides by copper-tolerant Desulfovibrio isolates. // Geomicrobiology J. 2008.
Vol. 25. P. 219-227.
2. О. В. Карначук, А. Л. Герасимчук, Д. Бэнкс, Б. Френгстадт, Г. А. Стыкон, З. Л. Тихонова, А. Х. Каксонен, Я А. Пухакка, А. С. Яненко, Н. В. Пименов.
Бактерии цикла серы в осадках хвостохранилища добычи золота в Кузбассе.
// Микробиология. 2009. Т. 78. № 4. с. 483-491.
3. Герасимчук А. Л., Шаталов А. А., Новиков А.Д., Буторова О. П., Пименов Н. В., Леин А. Ю., Яненко А. С., Карначук О. В. Поиск сульфатредуцирующих бактерий в пробах мата из гидротермального поля Лост Сити методом молекулярного клонирования. // Микробиология. 2010.
№1. В печати.
Тезисы 4. А. Л. Герасимчук, О. П. Буторова, Г. А. Стыкон, А. С. Лисина, З. Л.
Тихонова, У. Н. Полуэктова, О. С. Суханова, О. В. Карначук. Численность сульфатредуцирующих бактерий в рудничных водах, загрязненных отходами добычи золота и каменного угля. // II Международная молодежная школа конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Тезисы.
Москва, 2006. с. 9-10.
5. O. V. Karnachuk, N. V. Pimenov, S. K. Yusupov, Y. A. Frank, A. L.
Gerasimchuk, V. Dedinsky, A. H. Kaksonen, E. B. Lindstrm, M. V. Ivanov, J. A.
Puhakka, O. H. Tuovinen. Sulfate reduction in the oxic zone of mine tailings and metal-polluted sediments in boreal ecosystems. // In: Book of Abstracts. 11th International Symposium on Microbial Ecology. Vienna, Austria, August 20-25, 2006. P.A77.
6. O. V. Karnachuk, N. V. Pimenov, A. L. Gerasimchuk, G. A. Stykon, A. H.
Kaksonen, J. A. Puhakka, and O.H. Tuovinen. Diversity and activity of sulfate reducing prokaryotes in oxic mine tailings and metal-polluted sediments. // In:
Book of Abstracts. II International Conference on Environmental, Industrial, and Applied Microbiology. Seville, Spain, 28 November – 1 December, 2007. P.166.
7. А. Л. Герасимчук, Г. А. Стыкон, Н. В. Пермякова, Е. В. Дейнеко, О. В.
Карначук. Поиск АТФаз типа Р-1В в геномах сульфатредуцирующих прокариот. // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Тезисы. Москва, 2007. с. 27-29.
8. О. В. Карначук, А. Л. Герасимчук, Г. А. Стыкон, З. Л. Тихонова, Б.
Френгстадт, Д. Бэнкс, А. Х. Каксонен, Я А. Пухакка. Разнообразие культивируемых сульфатредуцирующих бактерий в осадках ветландов, загрязненных добычей и производством золота. // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Тезисы. Москва, 2007. с. 53-54.
9. O. Karnachuk, A. Gerasimchuk, G. Stycon, I. Lytovchenko, M. Solioz. How sulfidogenic bacteria handle copper: still a black box. // Copper and related metals in biology. 6th Intl. Copper Meeting. October 11-15, 2008, Alghero, Sardinia-Italy.
P. 107.
10. А. Л. Герасимчук, О. П. Буторова, Н. В. Пименов, О. В. Карначук.
Изучение разнообразия культивируемых и некультивируемых сульфатредуцирующих бактерий в местообитаниях, содержащих высокие концентрации металлов. // Актуальные аспекты современной микробиологии.
IV Молодежная школа-конференция c международным участием. Тезисы.
Москва, 2008. c. 13-14.
11. Герасимчук А. Л., Буторова О. П., Тихонова З. Л., Стыкон Г. А., Яненко А.
С., Карначук О. В. Выделение и изучение Desulfosporosinus sp. DB – перспективного для биогеотехнологии осаждения металлов. // Генетика микроорганизмов и биотехнология. Российская школа-конференция. Тезисы.
Москва-Пущино, 2008. c. 123-124.
12. О. П. Буторова, А. Л. Герасимчук, Л. Н. Еренко, А. В. Козлова, О. В.
Забудченко, А. А. Миллер, О. В. Карначук. Образование сульфидов металлов чистыми культурами сульфатредуцирующих бактерий, устойчивых к ионам меди. // Актуальные аспекты современной микробиологии. V Молодежная школа-конференция c международным участием. Тезисы. Москва, 2009. с.73 74.